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青岛科技大学研究生学位论文 d n a 探针在固体电极上的固定以及对转基因植物产品的检测 摘要 本论文主要用电化学方法对d n a 探针在电极表面的固定作了研究，并以亚 甲基蓝( m b ) 为杂交指示剂，将制备的电化学d n a 生物传感器用于转基因植物 产品外源基因的检测。 论文主要由四部分组成，第一部分综述了转基因植物产品的发展和d n a 探 针在电极表面的固定方法及杂交指示剂；第二、三部分分别研究了铝离子膜和锆 离子膜在d n a 探针固定过程中所起的作用，通过m b 在电极上一些电化学参数 比如峰电流、峰电位的变化发现，金属离子膜极大地改善了电极的表面性质，使 d n a 探针容易在电极上固定和杂交。优化了d n a 探针在电极表面的固定和杂交 条件，并将传感器用于转基因植物产品外源基因b a r ，c p 4e p s p s ，n p ti i 等的 检测；第四部分采用天然聚合物壳聚糖作为修饰剂，由于壳聚糖可以和d n a 的 磷酸基紧密地络合，探针可以很好的在电极表面固定。用电化学方法对传感器进 行了表征和条件的优化，制得的电化学d n a 生物传感器性能较好，并应用于了 转基因植物产品外源基因n p t i i 和n o s 基因p c r 扩增产物的检测。最后对论文 的主要内容作了总结。 关键词d n a 电化学生物传感器铝离子锆离子壳聚糖转基因植物产品检测 伏安法 d n a 探针在围体电极卜的固定以及对转基因植物产品的检测 t h ei m m o b i u z a 0 no ft h ed n ap r o b eo nt h e s o u de l e c t r o d e sa n dt h ed e t e c n 0 nt 0t h e p r o d u c t s0 ft h et r a n s g e n i cp l a n t a b s t r a c t i n t h i sp a p e f ，t h ei m m o b i l i z a t i o no ft h ed n a p r o b eo nt h es o l i de l e c t r o d ew a s i n v e s t i g a t e dm a i n l yu s i n ge l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d w i t hm e t h y l e n eb u l e ( m b ) a s h y b r i d i z a t i o ni n d i c a t o r , t h ee l e c t r o c h e m i c a ld n ab i o s e n s o rw a sp r e p a r e da n du s e dt o d e t e c tt h ep r o d u c t so ft h et r a n s g e n i cp l a n t t h ep a p e ri sm a d eu po f f o u rp a r t s f i r s t l y , as u m m a r yr e f e r r i n gt ot h e d e v e l o p m e n to ft h et r a n s g e u i cp l a n t ，a n dt h em e t h o d so ft h ei m m o b i l i z a t i o no ft h e d n a p r o b eo nt h ee l e c t r o d ea n dt h eh y b r i d i z a t i o ni n d i c a t o rw a sr e v i e w e d t h es e c o n d p a r ta n dt h et h i r dp a r ta r et h ei n v e s t i g a t i o no nt h er o l eo fa l u m i n u mi o na n dz i r c o n i u m i o nd u r i n gt h ec o u r s eo ft h ei m m o b i l i z a t i o no ft h ed n a p r o b e a f t e rt h eu n d e r s t a n d i n g o nt h ec h a n g e so fe l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r so fm bs u c ha st h er e d o xp e a kc u r r e n t s ， p o t e n t i a l s ，a td i f f e r e n tm o d i f i e de l e c t r o d e s ，w ef o u n db o t ho ft h e mi m p r o v et h e p r o p e r t i e s o ft h ee l e c t r o d e s i g n i f i c a n t l y , a n d m a k et h ei m m o b i l i z a t i o na n d h y b r i d i z a t i o ne a s i l y o nt h es u r f a c eo ft h ee l e c t r o d e t h ec o n d i t i o n sf o rt h e i m m o b i l i z a t i o na n dh y b r i d i z a t i o no f t h ed n a p r o b ew e r eo p t i m i z e da n dt h eb i o s e n s o r s w e r eu s e dt od e t e c ts o m et r a n s g e u e si nt h et r a n s g e n i cp l a n t s p a r tf o u ri n v o l v e st h eu s e o fc h i t o s a n ，w h i c hi san a t u r a lc a t i o n i cp o l y m e ra n dc a nf o r mas t r o n gc o m p l e xw i t h 1 1 青岛科技大学研究生学位论文 t h ep h o s p h a t eg r o u po fd n a t h es e n s o rp r e p a r e db yf i x i n gd n ao nt h ec h i t o s a nf i l m w a sc h a r a c t e r i z e d b y e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sa n dt h ec o n d i t i o n sf o rt h e i m m o b i l i z a t i o na n dh y b r i d i z a t i o no fd n aw e r ea l s oo p t i m i z e da n dt h eb i o s e n s o rw a s u s e dt od e t e c tt h en 盯i ig e n ea n dp e ra m p l i f i e ds a m p l eo fn o sg e n e t h er e s u l t s s h o wt h a tt h i ss e n s o rc a nb eu s e di n p r a c t i c a lw i t hg o o dp r o p e n y a tl a s t ，t h e c o n c l u s i o no ft h et h e s i si sl i s t e d k e yw o r d sd n ae l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r , a l u m i n u mi o n ，z i r c o n i u mi o n ， c h i t o s a n ，t r a n s g e n i cp l a n t ，v o l t a m m e t r y i i i 符号说明 c v ：循环伏安 c ： 溶液浓度m o l l c ：表观电容f c m 2 d p v ：微分脉冲伏安 e ：峰电位v e d 。：氧化峰电位v e d 。：还原峰电位v e 0 ：式电位v e p ：氧化峰还原峰电位差值v j 。：电容电流斗a ：氧化峰电流a f d c 还原峰电流“a k ：还原峰电流差值a m ：质量 g p h ：溶液酸度 t ：时间s t ：温度 v ：扫描速度m v s v1 2 扫描速度的平方根( r o w s ) 1 胆 v ：溶液体积l 青岛科技大学研究生学位论文 第一章文献综述 1 1 转基因植物产品的意义和存在的问题 转基因作物( g e n e t i c a l l y m o d i f i e dc r o p s ，g m c ) 指经遗传基因修饰了的生物体。 自1 9 8 3 年问世以来至今已有2 0 余年的历史，而其在世界范围内大面积推广种植 也有1 0 余载了。到目前为止，全世界共有4 5 个国家2 5 万多例转基因植物进入 田问试验，涉及烟草、棉花、水稻等6 0 多种植物和1 0 种性状眠自1 9 9 2 年转基 因作物首次商品化种植以来，世界转基因植物作物种植面积增长迅速，从1 9 9 6 年的1 7 0 万公顷猛增到2 0 0 3 年6 月的6 7 7 0 万公顷，8 年间增长了4 0 多倍：其中， 我国转基因作物作物的种植面积达1 5 0 万公顷，占世界的3 ，居世界第四位【2 】。 由于世界人口，特别是发展中国家人口的不断增长，如何使粮食也能与人口 的增加同步甚至超越人口的增长是一个全世界关心的问题。这个问题由于越来越 多的土地退化及气候变化引起的频繁自然灾害而更趋严重。基因工程技术，特别 是转基因技术将是解决2 1 世纪不断增加的人口对粮食需求造成压力的有效手段 或重要途径。转基因技术不仪可望提高粮食或作物产量，还可提高农作物品质。 例如，全球每年由于维生素a 缺乏症而导致5 0 万人失明，1 0 0 万儿童死亡，这 类事件主要发生在以稻米为主食的发展中国家。瑞士科学家i n g op e 仃y k u s 领导的 研究组运用基因工程技术培育出一种成为“金稻”的水稻，它是一种具有高含量维 生素a 原物质的水稻，有可能解决维生素a 缺乏症这个世界性大难题。 转基因技术还可能大大缩短作物生长期或使农作物高产。例如，西班牙科学 家p e n a 等从拟南芥菜中提取一种基因插入柑橘树，是原来要5 - - 6 年才成熟的柑 橘树在一年内开花结果。 转基因农作物大多作为食品或饲料提供人们或动物食用。因此，用转基因生 物制成的转纂因食物( g m f ) 的安全是社会公众普遍关注的重大问题。转基因食品 的安全性是转基因生物的安全的核心问题之一。有关农业转基因生物及其产品的 食用安全性问题概括来说有以下几点： d n a 探针曲：闹体电极i 的b 1 定以及对转基因植物产品的榆测 ( 1 ) 毒性问题尽管迄今还没有具有说服力的研究报告表明g m f 的毒性， 但由于转摹因作物可能产生“非预期后果”，凶此其加t 成的食品可能存在潜在的 健康风险。例如，巴西豆过敏事件( 1 9 9 6 ) ，转基凶马铃薯引起大鼠器官生长异 常( 1 9 9 8 ) ，r r 大豆中不明基因( 2 0 0 1 ) ，星联b t 玉米事件( 2 0 0 0 ) ，美国转基 因玉米污染人d ( 2 0 0 2 ) 等都表明转基因作物及食品并不安全。 ( 2 ) 过敏性反应问题过敏性反应即医学上的变应原性风险，它同免疫系 统有密切关系。而转基因作物可能诱发或加重变应原性风险。这足由于农作物中 引入外源性目的基因后，会使转基因生物带上新的遗传密码而产生种新的蛋白 质，这些蛋白质可能引起食用者或接触者出现过敏反应。近年来转基因食物引起 过敏时有发生，特别是b t 玉米和r r 大豆导致过敏症发生的频率增大。 ( 3 ) 抗药性问题由于技术限制，外来基因转化进入生物体的成功率很低， 必须有一套检测转基因试验是否成功的方法。为此，在转化靶标基因( 如b t 基因) 的同时转入特定抗生素抗性( a n t i b i o t i cr e s i s t a n c e ) 基因作为标记基因( m a r k e r g e n e s ) ，然后将处理过的细胞在培养基中培养，存活下来的细胞就一定含有抗生 素抗性基因。而抗生素都是用来治疗各种非常严重疾病的药物，如氨苄青霉素常 用于治疗肺炎、支气管炎、白喉等。已有几种转基因作物是用卡那霉素抗性基因 作为标记基因，这种基因只要有单一突变也可产生氨基丁卡霉素抗性。而氨基丁 卡霉素被认为是人类医药中的“保留”或“急救”抗生素，是国际医药界储备的应急 “救危”药物，而现在却为g m o 捷足先登，并滥用于多种g m o 作为标记基因， 广泛在环境中释放，在各种动物机体内产生抗性。 ( 4 ) 有益成分问题研究发现，外来基因会以一种人们日前还不甚了解的 方式破坏食物中的有益成分。英国伦理与毒性中一t 3 的实验报告称，与一般天然大 豆相比，在两种耐除锈剂或抗除草剂的转基因大豆中具有防癌功能的异黄酮成分 分别减少了1 2 o 和1 4 。在炎热干燥气候条件下，r r 转基因大豆发生大规模茎 干爆裂事件，大豆体内木质素含量增加，而大豆生长激素中的含量比普通大豆要 低1 2 1 4 ，这意味着大豆营养质量下降。 ( 5 ) 免疫力问题转基因生物及其产品有可能降低动物乃至人类的免疫能 力，从而对人类的健康安全甚至生存能力产生影响。1 9 9 8 年8 月英国科学家披露， 青岛科技人学研究生学位论文 实验白鼠在食用转基因大豆后，器官生长异常，体重减轻，免疫系统遭受破坏。 在承认需要认真面对转基因技术可能会带来对生态环境和健康等方面危险 的同时，更要充分注意转基因技术在培育抗病毒、抗旱和富有营养的作物方面具 有独特的巨大潜力，这些转基因作物町望大幅度减少目前困扰着全球8 亿到1 0 亿入口的营养不良状况。2 0 0 1 年7 月联合国开发计划署发布的第1 2 期 2 0 0 1 年 人类发展报告认为，转基因生物可能带来生态环境和健康方面的风险，但只要 做到政策得当、法规适宜、监督严格、评估科学，完全有希望使负面影响得到有 效控制。对转基因生物的风险问题不能忽视，要长期坚持对基因生物安全性问题 的研究，并要对转基因生物的产品做出明显标记，以便让顾客事先知情而可自由 选择。 1 2 转基因植物产品的检测方法 1 2 1p c r 检测法 p c r 即聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 。p c r 是一种选择性扩增 特定d n a 片段的核酸合成技术。其基本原理是，首先将待测目标基因序列作为 模板d n a ，经高温变性成为单链d n a ( s s d n a ) ，在低温和适宜的反应条件下根据 模板序列设计的两条寡核苷酸引物( p r i m e r ) 分别与模板d n a 两条单链上相应的 一段互补序列相互结合而在局部形成杂交链。由于反应溶液中存在有较大浓度的 脱氧腺苷三磷酸( 御) ，脱氧胞苷三磷酸( d c t p ) ，脱氧鸟苷三磷酸( d g t p ) 和脱 氧胸仟三磷酸( d r r p ) 等四种脱氧核糖( d n t p ) ，在d n a 聚合酶的作用f ， 使得引物从5 端向3 端延伸。然后，不断循环重复以上过程，使目标基因片段以 几何倍数扩增。循环次数根据p c r 反应体系中的模板量以及扩增产物的大小而决 定。 1 22e l i s a 检测法 酶联免疫吸附分析法( e u s a ) 可以检测转基因产品，其基础是抗原- 抗体特异 性免疫反应。e l i s a 是把抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合在 d n a 探针在吲体电极上的蒯定以及对转摹冈植物产品的检测 起，用酶作为标记物或指示剂，进行抗原或抗体定件、定量测定的- 项综合技 术。该技术将抗原或抗体吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板、磁珠等的表面， 抗原与抗体反应后，将固相与液相分离，除去游离的抗原或抗体，向结合的抗原 或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物。 e l i s a 榆测法的突出优点在于：灵敏度高，检测浓度可达i n g m i _ ，1 0n g m l ； 专一f 生强、重复性好；快速，结果可在几个小时内得到；枪测对象广，一般不受 抗原形态的影响；适用于处理大批样品；具有自动化及试剂俞的发展潜力。 12 3 基因芯片检测法 基因芯片，又称d n a 芯片，d n a 微阵列( d n a m i c r o a r r a y ) ，它由成千上万 种呈网格状密集排列的基因探针高度集成。通过已知碱基序列的d n a 片段，来 结合碱基互补序列的单链d n a ，从而确定相应的序列，通过这种方式柬识别特异 基因或其广：物等。基因芯片是基于核酸探针互补杂交技术原理而研制的，但与常 规杂交方法相比，从所用试剂、检测步骤、所需仪器、结果判断、检测灵敏度和 检测基因的种类都有很大差异。 基因芯片技术主要包括芯片微阵列制备、样品制备、杂交洗涤、信号的检测 和分析等几个基本技术环节。事先对支持物( 基片) 表面进行特定处理使其带卜 正电荷或能和核酸探针共价连接的化学基团，将寡聚核苷酸片段或c d n a 用高精 度点样仪喷或点到基片表面制成基因芯， 。制备好的基因芯片，再与荧光标记的 目标核酸进行杂交，并通过专门的高灵敏度扫描仪检测杂交信号。 基因芯片使用高精确的点样仪，一次实验能同时检测几十、几百、至成p 二 万个基因，即高通量检测：使用高灵敏度和定量的扫描仪提高了检测的灵敏度和 精确度，结果判断更具科学性，大大提高了检测速度和自动化程度，节约了时间 和相对成本。 1 24d n a 生物传感器 d n a 生物传感器经过几_ f 年的发展，至今方兴未艾，技术和种类也日新月异。 从信息转换原理区分d n a 传感器，主要有d n a 电化学传感器，d n a 光学传感 4 青盼科技人学研究生学位论殳 器和d n a 压电传感器。 ( 1 ) d n a 光学传感器 d n a 光学传感器包括光纤d n a 传感器 1 、s p rd n a 传感器即l 、化学发 光d n a 传感器 8 】、荧光d n a 传感器【9 1 0 j 、拉曼光谱d n a 传感器【1 q 和光寻电位 式d n a 传感器等。 光纤d n a 传感器是d n a 生物传感器中发展最晚、技术最新的一类。光纤 d n a 传感器的基体传感器是石英光纤，其作用机理是在石英表面接上个连接 物，然后将s s d n a 连接在光纤端面上，与互补d n a 杂交后通过光学信号( 荧光、 颜色等、的变化对d n a 进行检测。为了达到检测的目的，需要加入杂交指示剂， 其目的是为了引起荧光强度的变化。常用的杂交指示剂有吖啶染料、演化乙锭及 其衍生物。 表面等离子体共振( s p r l 技术通常将单链d n a 分子固化在几十个纳米厚的 金属( 金、银1 膜表面，d n a 杂交会引起反射光的光强度变化或角度变化，通过对 光强度或角度变化的检测可对d n a 进行定量的分析，其主要用于分子杂交的快 速检测。该传感器简化了杂交的检测过程，提高了传感器的重复利用，但选择性 较差，且仪器昂贵。 ( 2 ) d n a 压电生物传感器 d n a 压电生物传感技术是把电子学、声学和生物学等学科结合在一起的新型 d n a 检测技术。该技术利用石英谐振器表面质量的变化和频率成负相关系，将单 链的d n a 探针固定在电极表面上，然后浸入含有被测目标c d n a 分子的溶液中， 当电极上的s s d n a 探针与溶液中的互补序列的目标s s d n a 分子杂交，压电生物 传感器的振荡频率就会发生变化。压电生物传感器可以进行定量分析，可以做到 定量固定s s d n a 探针，定量检测杂交目标d s d n a 。压电生物传感器是一种非常 灵敏的质量传感器，可以检测到亚纳克级的物质。o k a h a t a 等【1 2 1 首先利用压电传 感器发现了固定在石英晶体表面的基因杂交引起了共振频率的明显变化，并利用 这一现象，制各了首个压电d n a 传感器。浚技术不需要任何标记物，仪器简单、 操作方便，且检测器体积小，便于携带，是目前d n a 传感器研究的前沿和重点。 ( 3 ) d n a 电化学生物传感器 d n a 搛引 l 州体电榭一的罔定以及埘转基圳植物产品的幢测 d n ai b 化学生物传感器是电化学、电分析化学与分了p 物学相交叉的一项新 技术，为生命科学的研究提供了一种新方法。d n a 电化学i i 物传感器因其仪器简 单、分析速度快、灵敏度高等优点1 f u 引起越来越多的重视，已成为h 前研究最多 的一类d n a 生物传感器，发展十分迅速 1 3 - 1 4 j 。具体来说，d n a 电化学生物传感 器测定d n a 的整个过程包括以下四步：一是单链d n a 的固定，这是一个有关表 而的问题，即要将s s d n a 连接或者固定到个固体l 极的表面，形成d n a 修饰 电极。_ ：是杂交过程，d n a 修饰电极放入被测溶液，当互补的目标s s d n a 与之 相遇时，它们将在电橄表面杂交形成d s d n a ，这一过程中必须控制合适的杂交条 件。i 是杂交的指示，即如何将杂交信息转化为可测定的电化学信号。叫是电化 学信号的检测，可将电流、电压或电导电阻作为检测信号。s s d n a 在电极表面 的固定化和杂交的指示是此类传感器的两大关键问题，以r 将对d n a 电化学牛 物传感器作主要综述。 1 3d n a 电化学生物传感器 13 1d n a 电化学生物传感器的原理 d n al 乜化学牛物传感器的工作原理是：在适当的条件下，固定在电极表向上 的已知序列的单链d n a 片段( d n a 探针) ，溶液。p 的待测d n a 发生杂交，利 用岍条互补的单链d n a ( s s d n a ) 问的特异性相互作用，形成双链d n a ( d s d n a ) 。 n j 时借助丁能够识别s s d n a 和d s d n a 的杂交指示剂在杂交前后的电化学信号的 改变，米检测目标基因；或者将待测基因片段固定在电掀表面，然后与溶液中的 已标定杂交指示剂的d n a 探针进行杂交，来榆测待测基冈序列。 般而占，在 一定范围内，指示剂的响应信号与待测d n a 的物质的量成线性关系，据此来检 测d n a 的含量，达到定量测量的m 的。d n a 电化学生物传感器的t 作原理如图 i - 1 所示。 青岛科技大学研究生学位论文 基寒魄缀 小盘 u固定化 魏殳襁示荆 厂一 泉奄厦席 n 咚啦。 u 吲娥鼬 、一一 nq 潞珏 d n 电化学杯记撑钟 u 蜘婚 + 电化学饺术检测 图卜1d n a 电化学生物传感器的工作原理图 f i g 1 1p r i n c i p l eo f d n ae l e c t r o c h e r o i c a lb i o s e n s o r 1 3 2d n a 探针在电极表面的固定 d n a 探钊在电极表面的固定是d n a 电化学生物传感器制作中的首要问题 i ”i ，固化量和活性直接影响传感器的灵敏度，为了把d n a 牢固连接在电极表面， 往往需要借助有效的物理或化学方法。就目前研究者所采用的d n a 固定方法而 言，大致可分为以下几类： ( 1 ) 吸附法这种方法是将d n a 直接或恒电位吸附到电极表面。w a n g 等 1 15 - 1 9 1 采用恒电位吸附法将d n a 或肽核酸( p n a ) 探针固定到碳糊电极上，对肿 瘤抑制基因p 5 3 进行检测，获得了满意的结果。h a s h i m o t o 等 2 0 - 2 1 1 将抛光处理后 的平面热解石墨电极直接插入1 0 0 含有d n a 探针的n a c l 溶液中3 0m i n ，d n a 即被吸附至石墨电极表面，再用1 0 0 的水洗去多余的d n a 。a b r u n a 等恻则在 金的微电极表面滴上s s d n a ，自然晾干后用水洗去多余的d n a 来进行固定。 e r d e m 等【2 3j 利用电位吸附法在碳糊电极表面固定了自己合成的单链寡聚核苷酸， 并用该探钳与乙肝病毒的相关d n a 序列进行杂交。 通过一些聚阳离子化合物与d n a 的静电作用固定：在一定实验的电位范围、 d h 值下，导电聚合物吡咯膜( p p y ) i + 1 于其表面的正电荷，d n a 可以稳定的吸附在 p p y + 1 7 从而被固定。徐春等【2 4 1 将阳离子聚合物壳聚糖吸附在玻碳电极表面，通过 黧o d n a 探针在固体电极i ：的吲定以及对转基凶植物产品的榆测 壳聚糖与d n a 骨架上带负电荷的磷酸根的静电吸引作用而将d n a 固定。周家宏 等【2 5 l 报道了一种简单的长链d n a 固定方法：他们将抛光处理后的金电极浸入0 2 的聚赖氨酸溶液中4h ，将聚赖氨酸吸附到电极k ，再通过静电作用将小牛胸腺 d n a 固定到聚赖氨酸修饰电极上。用该方法制备的d n a 修饰电极可以研究d n a 与一些分子的相互作用。 吸附法是一种简单的d n a 固定方法，固定化速度快，不需要什么特殊的试 剂，也无须对核苷酸进行修饰衍生化。但是吸附固定的d n a 在高盐浓度的环境 中易从电极表面解脱，所以不宜在高盐浓度下使用，而且它是多点的吸附甚至 d n a 可能平躺在支持物表面，因而d n a 固定化密度较小，并且多个作用点固定 d n a 使d n a 片段运动自由度减小，在杂交反应中影响其与互补d n a 的杂交效 率。 ( 2 ) 共价键合法 共价键合法是在电极表面修饰一层含有特殊基团的物质f 如巯基，胺基，羟基 等1 ，在基底电极上形成一层自组装膜，使基底电极表面功能化，然后利用这些官 能团能够和s s d n a 端链上的某些基团形成化学键的性质，将d n a 探针固定在基 底电极一k 。这种固定方法可以在电极表面得到稳定的自组装膜作为d n a 传感器 的探针。 k e l l y 等【2 6 】利用玻碳电极为基体电极，经过氧化后以n 一乙基一n 0 二甲氨基1 丙基碳化二甲胺盐酸( e d c ) 和n l 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 作活化剂，在电极表 面引入活性基团后以共价结合的方式将含有2 0 m e t 的寡核苷酸片段固定在电极 表面上。m i k k e l s e n 2 7 】等采用碳糊电极作为基体电极，修饰了十八烷基胺，然后在 高浓度的d n a 水溶性碳化二亚胺体系中，使d n a 键合到电极表面，由此制成 d n a 探针电极检测了囊性纤维变性基因a f 5 0 8 的序列。他们还以玻碳电极为基 体【2 6 ，2 8 1 ，用e d c 和n h s 活化电极，使其与脱氧鸟嘌呤核营酸基结合，从而使 d n a 连接到电极表面。u u 等人1 2 9 埘】用乙基一( 3 一二甲基丙基) 碳二皿胺盐酸盐和 羟基丁二酰亚胺活化已被氧化的光谱纯石墨电极，将含有7 5 个碱基的d n a 共价 固定到电极表面。c h r i s e y 等人【3 2 】用n 羟基硫代琥珀酰亚胺酯( 4 l 碘乙酰氨基苯 甲酸酯) s l a b 处理氨基化的电极使末端氨基转化为碘乙酰氨基团，含有碘乙酰 青岛科技大学研究生学位论文 氨基团的电极对5 - s h - d n a 的固定化是一个好的载体，在p h8 o 8 5 时，同巯 基修饰的d n a 偶联反应非常快，在电极及d n a 之间形成稳定的巯醚键，可以保 证较高的固定化密度。 ( 3 ) 化学免疫法 化学免疫法是首先在电极表面键合抗生蛋白，然后利用抗生蛋白与生物素之 间的亲和作用，使其与末端标记有生物素的d n a 结合，从而达到将d n a 固定在 电极表面的目的。 g a j o v i c e i c h e l m a n 等【3 3 】先将天然化合物7 羟基一6 一甲氧基香豆素( s c o p o l e t i n ) 电聚合在电极表面，然后在其上修饰一层链霉抗生素蛋l l ( s t r e p t a v i d i n ) ，于是生 物素标记的d n a 便可通过抗生蛋白与生物素之问的亲和作用固定到电极上。y a n 等【3 4 ：i 利用抗生蛋白和生物素间的基本反应通过多层分子组装将双链d n a 固定化 用来测定小分子量有机物质和氯代联苯等。m a r r a z z a 等【3 5 】先将碳棒电极在+ 1 6 v 处( v s a g a g c l ) 处理1m i n 后浸入含抗生物素蛋白( a v i d i n ) 的溶液中将其吸 附至电极表面；取出后用磷酸缓冲液冲洗；接着将电极放入含有生物素( b i o t i n ) 活化的d n a 溶液中搅拌即可将目标d n a 固定。用共价偶联方法将a v i d i n 固定比 直接将a v i d i n 吸附到电极表面有更好的稳定性及重现性。在铂电极上，一种衍生 了吡咯功能团的b i o 血可以电聚合到电极上形成聚( p y r r o l e - b i o t i n ) 膜，再通过a v i d i n 及b i o t i n s s d n a 的亲和作用固定目标d n a l 3 6 1 。 这种基于亲和素一生物素反应系统固定生物分子方法在生物传感器领域越 来越受到人们的重视，这种方法简便温和，且高效，应用越来越广泛。 ( 4 ) 自组装法 自组装法一般以金电极为基底电极，并在d n a 探针分子上接上硫醇基团， 利用s h 基团可自组装至电极表面，其组装过程如图1 2 所示。h a s h i m o t o 等【3 7 】 将预处理过的金电极浸入与v - m y c 致癌基因互补的含有2 0 个碱基且连有巯基己 基的d n a 探针溶液中，在4 c 时连续1 2h ，制成的d n a 电极对目标d n a 的检 测限达1 0 m o l l 。t a r l o v 等人【3 0 1 发现当自组装后的d n a 修饰电极置于烷基硫 醇6 - m e r c a p t o 1 一h e x a n o l ( m c h ) 后，非特异性吸附的h s s s d n a 将被m c h 从电极 表面所取代离去。这样有利于减少探针的非特异性吸附，对杂交反应有益。d n a d n a 探针n 固体电极i ：的固定以及对转基阁植物产品的检测 探针也可以通过修饰的巯基与银膜发生白组装过程 4 1 - 4 2 l ，从而将探针固定丁传感 器的银膜电极表面，可构成结合牢固、排列有序、分布均匀的单层d n a 分子膜。 以白组装膜法得到的s s d n a 修饰电极表而岛度有序，稳定性也好，在适当的 吲定密度下，对互补d n a 有很高的杂交效率；但它对巯基修饰的d n a 化合物纯 度要求较高，分离提纯操作繁琐，山于大的亲水性核酸基团，也较难产生一个紧 密的堆积表而，并且有一定的非特异性吸附。 磁塑婴魁塑嫩渺辫霪娜心州镌墼嫩魍塑竖静羹蜮剖咆。 参哟辘删攀魄嗡 图卜2d n a 探钎在佥电板上的自组装过程示意图 f i g 1 - 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h es e l f - a s s e m b l i n go f d n a o ng o l de l e c t r o d e ( 5 ) 电聚合法 电聚合法是利用导电化合物在电极表面的电聚合作用将d n a 固定在电极表 而。j i a n g 等f 4 3 j 在碳纤维电极表面( c f e ) 聚合一层过氧化吡咯膜，再通过电化学 方法把小牛胸腺d n a 固定在电极上。这种纳米级厚度的d n a 吡咯膜对一些具有 中性氨基基团的d n a 序列屁示出很好的选择性和灵敏度。p e n g 等【4 4 j 把聚吡咯丁j 酸电聚合在电极表面形成一层功能导电聚合物膜，此种聚合物膜在液相介质中具 有很强的电活性，再通过此聚合物膜对氨基替代的寡聚核苷酸片段( o d n ) 进行 固定。徐春等例首先在具有羧基功能团的碳纳米管修饰的电极表面电聚合一层聚 吡咯膜，然后根据d n a 杂交前后的阻抗变化来检测d n a 探针的杂交状况。朱宁 宁等0 4 州于z r o c l 2 k c l 电介质中，在1 1v + o 7 v 电位范围内，在金电极表面电 聚合层z r 0 2 膜，并用此膜实现对d n a 的固定。 一 晦洲 h 媾 + d磊签_缮泓 青岛科技大学研究生学位论义 1 3 3d n a 探针杂交的电信号转换 在一定的条件( 适当的温度、p h 值、离子强度) 下，将s s d n a 修饰电极浸入 被测溶液，使其与溶液中互补的s s d n a 杂交反应，在电极表面形成双链 d n a ( d s d n a ) ，然后根据d n a 杂交反应前后电化学信号的变化来对日标d n a 进 行识别或定量。由于d n a 本身的电化学活性较弱，为了方便地检测杂交前后电 极表向结构的差异，通常需要借助些具有电化学活性的杂交指示剂，它能选择 性地与d s d n a 结合且仍然保持电活性，根据杂交前后指示剂的电化学信号的变 化来确定足否存在目标d n a 。通常，杂交后杂交指示剂的电化学响应信号与目标 d n a 的含量存。定范围内成线性关系，由此可达到定量检测特定d n a 序列的目 的。可见，d n a 电化学生物传感器的灵敏度直接依赖于杂交指示剂对d s d n a 的 选择性。因此，如何将杂交信息转化为可测定的电化学信号( 即：杂交的指示) 是 该类传感器的关键问题之一。根据杂交指示剂与d n a 的作用方式的不同刚5 将其 分为两类：即内部指示剂和外部指示剂。 1 3 3 1 内部指示剂 所谓内部指示剂，是指利用d n a 分子中的碱基或者d n a 链上引入的其它修 饰基团的电活性直接进行检测。 ( 1 ) 非标记法直接检测d n a 杂交( 1 a b e lo ri n d i c a t o rf r e e ) 电化学d n a 传感器也可以不用指示剂来检测d n a 的杂交，因为电活性剂的 加入使得电化学信号的本底加大，使得检测的分辨率降低。虽然d n a 链中脱氧 核糖和磷酸骨架均呈非电活性，但d n a 中的碱基具有电化学活性，因此可直接 用电化学方法进行检测。最常利用的碱基是鸟嘌呤( g ) ，它很容易发生氧化反应。 由于d s d n a 双螺旋外侧的脱氧核糖阻碍内侧碱基的电化学反应，因此杂交后g 的电化学氧化信号下降，利用此电信号的变化可直接检测d n a 杂交。该法无须 外加指示剂，也无须复杂的标记过程，很大程度上简化了检测过程及操作步骤， 但g 的氧化是不可逆的，杂交前g 发生氧化反应会对杂交及检测产生影响，这种 传感器的灵敏度也不高。w a n g 4 7 1 等提出了一种肌苷( 即次黄嘌呤) 基因传感器，固 定在碳糊电极表面的探针中的g 都用次黄嘌呤替代，次黄嘌呤可与靶序列中的胞 1 1 d n a 椿针在同体电极h 的胡定嘎搜对转幕植物产品的柃测 嘧啶( c ) 形成碱基埘，次黄嘌呤对g 的氧化峰不产生十扰，ml l 杂交后，g 的氧 化峰是从尤到有，榆测限得到了改善。p a i e c e k 等利用腺嘌呤f a l 的阴极信号直 接检测d n a 杂交。固定在固体电极表面的d n a 探针与靶序列杂交后，将其置于 强酸溶液中溶解变性，使d s d n a 链中的碱攮脱落在溶液中，然后以悬汞电极为 工作电檄，用灵敏度高的阴极溶出伏安法检测溶液中腺嘌呤( a ) 的电化学信号，灵 敏度大大提高。 ( 2 ) 电活性d n a 标识剂 就是将具有电化学活性的物质直接或问接引入d n a 分子。通常利用化学键 合的作用将具有电活性的物质( 如聚吡咯、一茂铁、葸醌、聚噻吩等) 连接在人上 合成的寡聚核许酸片段的术端，制备成 乜活性物质修饰的s s d n a 探针，当该 s s d n a 探针与幽定在电极表面的目标s s d n a 杂交形成d s d n a 时，电活性物质就 被带至电极表面，这样不外加电压下电极的电流强度就会发生改变，通过测定其 信号变化可以识别和测定d n a 。g a m i e r 等将具有1 3 个碱基的寡聚核苷酸连接 到聚吡咯上，这样不仅可【三【增加电导，还使其在水溶液中具有更高的电活性。当 杂交反应发生时，由十聚合物骨架形态的改变，电流强度会降低。日前，该方法 灵敏度为1 0 _ 1 3m o l l 。t a k e n k a s o l 等将羧基二茂铁标记在寡聚核苷酸的末端，成功 地用于目标d n a 的电化学检测，方法的线性榆测范围为2 0 1 0 0f m o l 。方禹之 等( 5 t - 5 2 | 在d n a 探针的末端衍生二戌铁基团，通过检测二茂铁电化学信号的有无 来表征杂交事件的发生与甭。l u m l e y w o o d y e a r 等【5 ：1 1 则在待测d n a 链末端衍牛 辣根过氧化酶，一旦标记了酶的s s d n a 与电极表面互补的s s d n a 发生杂交反应， 即相当于在电极表向修饰了一层酶，该修饰电极便能大大催化过氧化氢的电化学 还原，通过检测过氧化氢的还原电流，实现对特定d n a 序列及单碱基错配序列 的识别和测定。 纳米金在分子生物学领域的研究和应用己成为目前科学家研究的热点【5 4 - 5 8 。 近年来有文献一“1 报道将胶体纳米金颗粒连接住寡聚核苷酸片段的末端，作为标 记物。杂交后，在强酸溶液中使胶体会纳米粒子溶解释放出大量a u ( n 1 ) 离子，然 后用灵敏度极高的阳极溶出伏安法或电位溶出法测定a u ( i i i ) 的电化学信号，通 过该电化学信号间接测定d n a ，方禹之等p 1 将金纳米颗粒标记在寡聚核苷酸片 1 2 青岛科技人学研究生学位论文 段上，利用“金标银染”技术来检测d n a 杂交。另外，纳米银、铜金纳米合金溶 胶 6 2 】也被作为标记物来指示d n a 杂交，胶体溶解后分别释放出大量的a g ( i 、 和c u ( i i ) 离子，利用阳极溶出伏安法测定它们的电化学信号，该法有较高的灵敏 度。将纳米技术、核酸杂交技术及电化学分析技术卡h 结合用于d n a 分析，是当 前d n a 研究中最具有活力的前沿课题之一。 内部指示剂用来指示d n a 杂交，通常检测的灵敏度高，选择性好，不受非 互补序列的干扰。但标记探针的合成步骤较繁琐，因而目前在电化学d n a 传感 器领域中外部指示剂仍有一定的主导地位。 1 3 3 2 外音b 指示齐0 外部指示剂是一类氧化还原电位处于d n a 的电化学窗口之间，且能与 s s d n a 和d s d n a 以不同非共价方式相互作用的电化学活性化合物，基于其与 s s d n a 和d s d n a 选择性结合能力的差异达到指示d n a 的杂交是否发生和发生程 度的目的【3 7 】。当它与d n a 结合后，发生可逆的氧化还原反应时，可与d n a 发生 电子交换，而d n a 通过远程电子传递而使指示剂与电极发生电子交换完成电化 学反应过程。另一方面，外部指示剂还具有如下优点：( 1 ) 根据s s d n a 和d s d n a 结构上的差异进行选择性识别，作用原理简单；( 2 ) 在设计和开发中可根据需要 进行可控修饰和衍生，从而提高其构效性能：( 3 ) 避免了进行d n a 标记、分离 等复杂操作，只需将杂交反应后的电极浸入含有指示剂的溶液中富集反应一段时 间，或将指示剂直接加入杂交反应液中，让杂交反应和嵌插作用同时进行，然后 进行电化学检测。 根据指示剂的分子组成及结构特征可将其分为三类：( 1 ) 有机染料或荧光 素；( 2 ) 药物小分子；( 3 ) 金属配合物。 f 1 1 有机染料或荧光素有机染料和具有强荧光性质的一类有机化合物是使 用范围很广的一类电化学杂交指示剂，这类化合物一般都具有较大的蒽醌式刚性 平面结构，带有一o h 、= 0 、一n h 2 、- - - n 等电化学活性基团，另外此类化合物市场 价格便宜、种类丰富。常见的有h o e c h s t3 3 2 5 8 2 0 ，3 7 ，6 3 i ，耐尔蓝( n b ) 【叫，亚甲 基兰( m b ) 6 5 - 7 3 l ，m e l d o l a sb l u e ( m d b ) 7 4 - 7 5 1 ，吖啶及其衍生物【7 6 l ；2 ，6 - 二磺 d n a 探针相陶体电极卜的同定以及对转基凶植物产品的榆测 酸基蒽醌( a q d s ) r - 7 8 、溴化乙啶( e b ) 3 1j ，等等。我们选择其中典型的几种 做一介绍。 h o e c h s t3 3 2 5 8 是种二苯并酰亚胺类染料，具有抗癌活性，且与其他d n a 靶 向分子相比具有更高的电流密度。p e n g 等【7 9 _ 8 0 l 曾采用电化学方法研究 h o e c h s t 3 3 2 5 8 与d n a 的相互作用，并获得了二者的结合常数和结合位点，与d n a 的扭曲 小沟区结合，而这种小沟区只存在于双链d n a 中，从而达到对单双链d n a 的识别 而应用于d n a 的杂交指示。h a s h i m o t o 等 2 0