（动物学专业论文）母体及子代连续两代饮食诱导建立apoe小鼠动脉粥样硬化模型.pdf

理学硕士学位论文fy”lllilllllltl8ulllf8lllllllllllll4lrllrl9llllll6ltllll母体及子代连续两代饮食诱导建立a p o e - - t j 、鼠动脉粥样硬化模型动物学专业硕士研究生章磊指导教师魏泓教授本研究受国家“8 6 3 ”项目科研基金( 2 0 0 溘1 0 2 3 5 6 ) 资助。西南大学生命科学学院二零一一年五月一苓一一，平丑月中国重庆d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e rd e g r e eo fs o u t h w e s tu n i v e r s i t ye s t a b l i s hm e n to fa na n i m a lm o d e lo fa t h e r o s c l e r o s i si na p o e 。| 。m i c e i n t e r g e n e r a t i o n a lh i g hf a t - h i g hc h o l e s t e r o ld i e td u r i n gp r e g n a n c ya n dm a l eo f f s p r i n g sa d u l t h o o dc a n d i d a t e ：z h a n gl e is u p e r v i s o r ：p r o f w e ih o n gd i s c i p l i n e ：z o o l o g yd i r e c t i o n ：a n i m a lm o l e c u l a rb i o l o g yt h i sw o r kw a ss u p p o r t e db yt h en a t i o n a l 8 6 3 r e s e a r c hf o u l l d a t i o no fc h i n a ( n o 2 0 0 7 a a l0 2 35 6 )s c h o o lo fl i f es c i e n c e ，s o u t h w e s tu n i v e r s i t yc h o n g q i n g c h i n am a y1 0 ，2 0 1 1k一1 3 主要仪器。1 01 4 孕鼠的获取与分组。1 01 5 取血与血脂的测定。l l1 6 子鼠的获取1 12 a p o e - - d , 鼠动脉粥样硬化模型的建立1 l2 1 成年鼠分组1 12 2 主要试剂。1 22 3 主要仪器设备。1 22 4 成年鼠饮食配方。1 22 5 取血与血脂的测定1 22 6 腹主动脉的获取与切片的制备1 22 7 病理切片的观察与图像处理1 32 8 动脉粥样硬化病变性评分1 32 9 统计学处理1 4第二章实验结果1 51 动脉粥样硬化模型评价1 41 1 动脉粥样硬化成模率1 41 2 成年鼠体重变化。1 41 3 成模后各组成年鼠血脂浓度比较1 51 4 腹主动脉切片i m a g ep r op l u s6 0 分析：- ：1 9k、西南大学硕士学位论文目录1 5 成年鼠动脉粥样硬化病变性评分1 91 6 成年鼠腹主动脉血管形态学与a s 斑块病理特征2 02 高脂高胆固醇饮食对孕鼠的影响。2 42 1 两组孕鼠体重变化。2 42 2 两组孕鼠产子数和新生子鼠体重2 52 3 高脂高胆固醇饮食对孕鼠血脂的影响一2 6第三章讨论2 9第四章结论3 2参考文献3 3致谢4 2研究生期间所发表的文章与参与的课题4 3西南大学硕士学位论文英文缩写表英文缩写a p o ea p o e ”| ”心a pd e s t i n y ( m e a n )a sc mc r p肿h p皿ll al d ll p o0 x l d lo f rp as p ft ct gv l d l英文缩写表英文全称中文全称a p o l i p o p r o t e i ne载脂蛋白ea p o l i p o p r o t e i ne k n o c k o u t载脂蛋白e 基因敲除a t h e r o s c l e r o t i cp l a q u e动脉硬化性斑块a t h e r o s c l e r o t i cp l a q u ed e s t i n y ( m e a n )斑块平均光密度a t h e r o s c l e r o s i s动脉粥样硬化c h y l o m i c y o n s c m乳糜微粒c r e a c t i v ep r o t e i nc 反应蛋白h i g hf a td i e t高脂饮食h e l i c o b a c t e rp y l o r i幽门螺旋杆菌h i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i n蒯韶泊l u m e nr r e a管腔面积l o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n低密度脂蛋白l i p i dp e r o x i d a t i o n脂质过氧化o x i d i z e dl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n氧化型低密度脂蛋白o x y g e nf r e er a d i c a l s氧自由基p a t c ha r e a斑块面积s p e c i a lp a t h o g e nf r e ea n i m a l无特殊病原体动物t o t a lc h o l e s t e r o l总胆固醇t r i g l y c e r i d e甘油三酯v e r yl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n极低密度脂蛋白西南大学硕士学位论文摘要母体及子代连续两代饮食诱导建立a p o e 十小鼠动脉粥样硬化模型动物学专业硕士研究生章磊指导教师魏泓教授摘要随着人们生活水平的改善，母体在孕期摄入过多脂肪和胆固醇，这对其胎儿发育存在重要的影响，甚至影响着子代成年期心血管疾病的发生，但目前对母体孕期高脂胆固醇饮食对其子代成年期心血管疾病发生影响的报道不多，实验研究尚处于起步阶段。动脉粥样硬化是世界上严重威胁人类健康心血管疾病之一，目前研究该病的动物模型的种类繁多，各种动物模型存在优缺点，因此建立一种能稳定、有效复制人类动脉粥样硬化的动物模型具有重要的意义。基于上述背景选择对高脂高胆固醇饮食具有高敏感性的a p o e 4 - 小鼠，在母体孕期及其子代成年期进行连续两代高脂高胆固醇饮食处理，以期创新建立一种稳定的、能有效提高成模率的造模方法，探讨母体孕期的高脂高胆固醇饮食对其子代成年期动脉粥样硬化发生的影响，为临床研究动脉粥样硬化提供基础性数据和依据。本研究中孕鼠分为高脂饮食组( g 组) 和正常饮食组( p 组) ，g 组雄性子代成年鼠分为高脂高胆固醇饮食组( g _ g ) 和正常饮食组( g _ p ) ，p 组子代雄性成年鼠也分为高脂高胆固醇饮食组( p g ) 和正常饮食组( p p ) ，每组子代成年鼠为6只，饮水不限，所有小鼠饲养于s p f 环境。g - g 组、g - p 组和p g 组为模型组，p p 组为对照组。为叙述方便子代雄性成年鼠简称成年鼠，g 代表高脂高胆固醇饮食，p 代表正常饮食。母鼠孕期高脂高胆固醇饲料配方：猪油2 1 ，胆固醇0 2 1 ，正常饲料7 8 7 9 。成年鼠高脂高胆固醇饲料配方：猪油1 5 ，胆固醇1 2 5 ，胆西南大学硕士学位论文摘要i,hial i l 皇曼曼酸0 5 ，正常饲料8 3 2 5 。本研究动脉粥样硬化评价指标：a s 形成率、体重变化、血脂浓度( t c 、t g 、h d l 和l d l ) 、动脉粥样硬化病变性评分、腹主动脉i m a g ep r op l u s6 0 分析、腹主动脉h e 染色形态学与病理学特征。两个月后腹主动脉h e 染色观察结果显示模型组g g 组、g - p 组和p g 组成模率分别为6 6 6 7 、3 3 3 3 和3 3 3 3 ，成功建立a p o e - - 小鼠动脉粥样硬化模型，动脉粥样硬化各项评价指标表明两代高脂高胆固醇饮食组( g - g 组) 的a s 病变最严重，造模方法最有效。结果表明母体孕期高脂高胆固醇饮食增加其子代成年期动脉粥样硬化发生的风险性。综上所述，连续两代高脂高胆固醇饮食造模法是一种创新方法，缩短了建模时间，成功建立a p o e - - 小鼠动脉粥样硬化模型，具有推广应用价值；母体孕期高脂高胆固醇饮食对其子代成年期动脉粥样硬化的发生具有重要的影响。关键词：母体：a p o e + 小鼠；连续两代；高脂高胆固醇；动脉粥样硬化；m西南大学硕士学位论文a b s t r a c te s t a b l i s h m e n to fa na n i m a lm o d e lo f a t h e r o s c l e r o s i si na p o e ”| | -m i c e ：i n t e r g e n e r a t i o n a lh i g hf a t h i g hc h o l e s t e r o ld i e td u r i n gp r e g n a n c ya n dm a l eo f f s p r i n g sa d u l t h o o d一一一一一a b s t r a c ta st h el i v i n gs t a n d a r d si m p r o v e d ，h i g hf a t 城g hc h o l e s t e r o ld i e td u r i n gm a t e r n a lp r e g n a n c yw h i c hh a sg r e a ti n f l u e n c e si nt h ef e t a ld e v e l o p m e n th a sb e c o m ec o m m o na n dc a nl e a dt oo f f s p r i n ga d u l t h o o dc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e s h o w e v e rt h er e p o r t so fs u c hi n f l u e n c e sa l ef e wa n dt h ee m p i r i c a ls t u d yi ss t i l li nt h es t a r t i n gs t a g e a t h e r o s c l e r o s i s ，w h i c hi so n eo fc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e s ，i sas e r i o u s t h r e a tt oh u m a nh e a l t hi nt h ew 矾d t h e r ea r ev a r i o u sa n i m a lm o d e l so fa t h e r o s e l e r o s i sw h i c he x i s tm e r i t sa n dd e m e r i t s ，s ot h es e a r c hf o rt h ep r o p e ra n i m a lm o d e lt ob ec a p a b l ea n de f f e c t i v eo fd e v e l o p i n ga t h e r o s c l e r o s i sw h i c hi ss i m i l a rt ot h o s ef o u n di nm a nh a sb e c o m eg r e a ts i g n i f i c a n c e a p o l i p o p r o t e i ne - d e f i c i e n t ( a p o e - - ) m i c ew e r es e l e c t e do na c c o u n to ft h ea b o v e - m e n t i o n e db a c k g r o u n d t h e s em i c e w e r ef e d 谢t hi n t e r g e n e r a t i o n a lh i g hf a t - h i g hc h o l e s t e r o ld i e t d u r i n gp r e g n a n c ya n dm a l eo f f s p r i n g sa d u l t h o o d t h ep u r p o s eo ft h i ss t u d yw a st oe s t a b l i s ha ni n n o v a t i v e , s t a b l ea n de f f i c i e n tm o d e l i n gm e t h o do fa t h e r o s e l e r o s i s ，i n v e s t i g a t et h ei n f l u e n c e so fi n t e r g e n e r a t i o n a lh i g hf a t i h i g hc h o l e s t e r o ld i e td u r i n gp r e g n a n c yt ot h ed e v e l o p m e n to fo f f s p r i n g sa d u l t h o o da t h e r o s e l e r o s i sa n dp r o v i d eb a s i cd a t aa n dr e f e r e n c ef o rt h ec l i n i c a lr e s e a r c h e so fa t h e r o s c l e r o s i s t h ep r e g n a n tm i c e w e r ea s s i g n e dr a n d o m l yt ot w og r o u p s ：h i e , hf a t 坷g l lc h o l e s t e r o ld i e t ( 21 f a t ，0 21 c h o l e s t c r o dg r o u p ( g g r o u p ) a n dc o n t r o lg r o u p ( pg r o u p ) t h em a l ea d u l to f f s p r i n g so fgg r o u pw e r ef e dah i g hf a t 坷g hc h o l e s t e r o ld i e t ( g - g西南大学硕士学位论文a b s t r a c tg r o u p ) ( 15 f a t ，1 2 5 c h o l e s t e r o l ，0 5 c h o l i ca c i d ) o rac o n t r o ld i e t ( g - pg r o u p ) ，1 1 1 cm a l ea d u l to f f s p r i n g so fpg r o u pw e r ea l s of e dah i 出f a t - h i g hc h o l e s t e r o ld i e t ( p gg r o u p ) o rac o n t r o ld i e t ( p pg r o u p ) s i xm i c e ，f i v ew e e k sa g e ，w e r ei n c l u d e di ne a c hg r o u p ，a l lt h ea n i m a l sw h i c hh a df r e ea c c e s st of e e da n dw a t e rr a i s e di nt h es p fe n v i r o n m e n t g - gg r o u p ，g - pg r o u pa n dp gg r o u pw e r ec o n f n - m e dt h em o d e lg r o u p s ，t h ee v a l u a t i o ni n d e x e so fa t h e r o s c l e r o s i s ：t h ef o r m a t i o nr a t eo fa t h e r o s c l e r o s i s ，b o d yw e i g h tc h a n g e s ，1 i p i dl e v e l ( t c ，t 1 3 ih d la n dl d l ) ，t h e o r eo fa t h e r o s c l e r o s i s ，ji m a g ep r op l u s6 0a n a l y s i so fa b d o m i n a la o r t a , h em o r p h o l o g ya n dp a t h o l o g yc h a r a c t e r i s t i c so fa b d o m i n a la o r t a t h em a l eo f f s p r i n g sw e r es a c r i f i c e dt w om o n t h sl a t e r , h es t a i n i n go fa b d o m i n a la o r t as h o w e dt h ef o r m a t i o nr a t eo fa t h e r o s c l e r o s i so ft h em o d e lg r o u p sw e r er e s p e c t i v e6 6 6 7 ( g - g ) ，3 3 3 3 ( g - p ) a n d3 3 3 3 口- g ) b ym i c r o s c o p i ce x a m i n a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h ea n i m a lm o d e lo fa t h e r o s c l e r o s i ss u c c e s s f u l l yf o u n d e d a l lt h ei n d e x e si n d i c a t e dt h em o s ts e r i o u sp a t h o l o g i c a lc h a n g e so fa t h e r o s c l e r o s i sh a p p e n e di ng - gg r o u p t h er e s u l t ss u g g e s tt h a ti n t e r g e n e r a t i o n a lh i g hf a t - h i g hc h o l e s t e r o ld i e td u r i n gp r e g n a n c yi n c r e a s e st h er i s ko fo f f s p r i n g sa d u l t h o o da t h e r o s c l e r o s i s t h es t d u d yp r o v e st h em e t h o d , i n t e r g e n e r a t i o n a lh i g hf a t h i g l lc h o l e s t e r o ld i e td u r i n gp r e g n a n c ya n dm a l eo f f s p r i n g sa d u l t h o o d , i si n n o v a t i v ew h i c hs h o r t e n e dt h em o d e l i n gt i m e t h ea n i m a lm o d e ls u c c e s s f u l l yh a sr e p l i c a t e da t h c r o s c l e r o s i sw h i c hi ss i m i l a rt om a na n dh a st h ev a l u eo fp o p u l a r i z e da n da p p l i c a t i o n t h i ss t u d yh a ss h o w nthath i g hf a t - h i g hc h o l e s t e r o ld i e td u r i n gp r e g n a n c yh a si m p o r t a n te f f e c t0 1 1o f f s r i n g sa d u l t h o o da t h e r o s c l e r o s i s k e yw o r d s ：m a t e r n a l ；a p o e 乒m i c e ；i n t e r g e n e r a t i o n a l ；h i g hf a t 坷g hc h o l e s t e r o l ；v两雨大学硕士学位论文文献综述文献综述动脉粥样硬化研究进展动脉粥样硬化( a t h c r o s c l c r o s i s ，a s ) 是指动脉内膜下有脂质沉积，并伴有纤维基质成分和平滑肌的细胞增殖，逐步发展形成动脉硬化性斑块( a t h c r o s c l c r o t i cp l a q u e ) ，斑块部位的动脉壁增厚、变硬，斑块内部组织坏死后与沉积的脂质结合，形成粥样物质的过程【。近年来，我国经济迅猛发展，人们生活条件改善，母亲在孕期摄入过多营养，孕期发生高脂血症和新生儿高出生体重的问题日益严重，母体孕期营养状况对胎儿的影响不仅仅限于胎儿期，甚至成年期心血管疾病的发生也与母体孕期有关，因此研究母体孕期的营养状况与子代成年期疾病的发生具有重要的意义，本文主要综述了母体孕期的营养状况与子代成年期疾病发生的联系及动脉粥样硬化模型研究进展，为本论文建立动脉粥样硬化模型提供理论依据。1 母体孕期营养状况与子代成年期疾病胎儿在母体内得以正常发育、成长依赖于母亲摄入营养的平衡，营养不良或营养过剩都会造成胎儿发育受到影响，还会影响其成年后的某些疾病的发生，母体孕期营养状况与其子代成年期疾病的研究尚处于起步阶段，对临床研究成年期具有重要的意义。1 1 母体孕期营养不良胎儿在母体内得以正常发育、成长依赖于母亲摄入营养的平衡，母体孕期摄入营养过少不仅会影响胎盘的发育，还会导致胎儿母源性营养减少。母源性营养减少导致胎儿营养缺乏引起胎儿生长发育迟缓，同时引起生理、生化和结构的变化，胎儿期营养缺乏影响到婴儿出生体重，胎盘重量及他们的比值，而婴儿出生体重、胎盘重量及他们的比值与成人心血管疾病的患病率及病死率关系密切，“b a k e r 假说认为母体孕期的营养状况影响着其子代成年后心血管疾病的发生，尤其孕期在低营养状况下胎儿成年后易患心血管疾病、心脏病【2 卅，研究证实孕期营养不良与其子代成年期心脏病、脑卒中、糖尿病的发生有判5 1 。母体孕期营养不良会使胎儿宫内发育受阻，导致新生儿体重减轻、免疫力下降、肝功能障碍、脂质代谢紊乱【6 】。胎儿期营养缺乏与低出生体重与成年期冠状动脉疾病、高血压、糖l西南大学硕士学位论文文献综述尿病、脑梗塞、高脂血症的发病关系密切，随着出生体重的减少，成人病的发病相应增加【7 1 。p e n n i n g t o n e 8 】等人研究表明大鼠母体孕期营养不良导致新生子鼠体重下降和脑的减轻。有人研究了二战时期经历饥饿的孕妇发现比未经历饥饿的孕妇所生后代在成年期患心血管疾病、代谢综合征、动脉粥样硬化等疾病的概率增n t 9 。也有学者提出相反观点，认为母体孕期营养不良与子代成年后的疾病没有联系。s t a n n e r 【1 0 】等研究了二战时期列宁格勒出生的儿童，得出宫内营养不良对成年期的葡萄糖耐受量、血压与血脂水平无影响的结论。1 2 母体孕期营养过剩随着生活条件的改善，母体孕期营养过剩是个不容忽视的问题，孕期营养过剩会造成胎儿发育受到影响。母体在孕期营养过剩易发生孕期高脂血症，孕期高脂血症激化胎儿肝脏对脂质的代谢【1 1 l ，母体孕期营养过剩导致新生儿体重的增加，母体孕期体重增加多少与新生儿体重呈正相关【眨l ，新生儿体重一个重要的生物学因素，它决定了生后生长水平和速度以及成年期健康状况。新生儿高出生体重与母体孕期营养摄入有关，母体孕期大量摄入的高脂高胆固醇，被胎儿通过胎盘吸收，过剩的营养储备在肝脏中，解剖学研究发现胎儿体重与肝脏重量之间有着密切的关系。一些研究 1 3 - 1 5 】已表明，高出生体重儿的成年期肥胖的发生率明显高于正常出生体重儿。c u r h a n 等【1 6 1 通过调查发现出生时体重偏高者成年期易患肥胖症。肥胖症患者往往有高血压、高脂血症和葡萄糖耐量异常，高脂血症和高血压是影响a s 的独立危险因素。有实验揭示母亲营养过剩时胎儿出现主动脉加速发展的脂纹【1 7 1 ，已有实验揭示【1 研母亲在孕期高营养饮食会导致子代成年后血脂升高和加重动脉粥样硬化发生的风险。目前对于母体孕期与成年后疾病的发生研究较少，母体孕期营养过剩是否是影响动脉粥样硬化发病因素之一，有待于进一步的研究。2 动脉粥样硬化动物模型研究现状2 1 动脉粥样硬化发病机制学说a s 的发病机制极其复杂，有关a s 的发病机制学说主要有脂质浸润学说、炎症反应学说和免疫反应学说，目前尚无完全阐明动脉粥样硬化发病机制，缺乏有2西南大学硕士学位论文文献综述效防止a s 的措施，因此对其机制的研究显得十分重要。2 1 1 脂质浸润学说脂质浸润学说由v i r c h o w 于1 8 6 3 年提出，认为a s 病变主要是因为血浆脂质水平升高所引起，脂质浸润学说是目前最为人们接受动脉粥样硬化的发病机制学说之一。动脉粥样硬化斑块是评价动脉粥样硬化重要指标，脂质是斑块的主要成分，现有研究证实a s 斑块中的脂质成分来源于血浆脂蛋白，主要是t c 、t g 、l d l等，上述脂质成分浓度与a s 发生密切相关【1 9 。2 1 1 。病例研究发现l d l 浓度与a s的发生呈正相关，是导致心脏病猝死的重要原因【2 2 1 ，是致a s 发生的最危险因素。l d l 导致a s 的机理可能是l d l 透过内皮细胞深入内皮细胞间隙，l d l 氧化修饰形成o x l d l ，o x l d l 与巨噬细胞的清道夫受体结合而被摄取，形成脂源性泡沫细胞。动脉中膜的血管平滑肌细胞( s m c ) 迁入内膜，吞噬脂质形成肌源性泡沫细胞，增生迁移形成纤维帽，o x - l d l 使上述两种泡沫细胞坏死崩解，形成糜粥样坏死物，粥样斑块形成。l d l 和o x l d l 是血管平滑肌细胞有效生长因子【2 3 1 ，前者还参与动脉粥样硬化各种生长因子和受体的调节。研究发现t g 参与动脉粥样硬化进程f 2 0 , 2 4 2 5 1 ，降低t g 浓度可以延缓a s 的发生，其机制可能是t g 作用在于引起a 型l d l 向b 型l d l 转化，a 型l d l 又称大颗粒l d l ，b 型l d l 又称小颗粒l d l ，小颗粒l d l 易氧化修饰成o x - l d l 参与动脉粥样硬化的病变【2 6 , 2 7 1 。t g是v l d l ( 极低密度脂蛋白) 的组成成分，v l d l 可转化为l d l 被巨噬细胞吞没形成泡沫细胞聚集于a s 斑块中心【2 引。2 1 2 炎症反应学说炎症反应是多种因素作用导致局部发生炎性细胞浸润引发的机体发生一系列反应，其中代表性的炎性细胞有单核细胞核淋巴细胞。g l 淞z t e n 等【2 9 】在动脉粥样硬化斑块中发现了大量的单核细胞和淋巴细胞，前者约占8 0 ，后者约占5 以上，揭示炎性细胞参与a s 的进程。引起炎症反应的因素很多，目前很多研究发现某些微生物的感染引发的炎症参与动脉粥样硬化【3 0 , 3 1 1 。m i r e 等【3 2 】提出引发炎症反应导致a s 的微生物主要是幽门螺旋杆菌( 肿) 、肠道病毒、肺炎衣原体( c p n ) 、巨细胞病毒( h c m v ) 等，其中c p n 和h c m v 引发a s 报道最多。c p n 是一种引发慢性感染并导致炎症反应的呼吸道病原体，o s s e w a a r d e 等【3 3 1 研究发现c p n 易感染冠3西南大学硕士学位论文文献综述状动脉等主要血管，c a m p b e l l 等【3 4 】用c p n 感染小鼠导致了动脉粥样硬化病变，l a i t i n e n 掣3 5 】用c p n 感染兔也得到了主动脉粥样硬化病变，上述研究揭示了c p n与动脉粥样硬化之间存在密切联系，但其机制尚未清楚。h c m v 是一种疱疹病毒，研究发现h c m v 感染内皮细胞和平滑肌细胞引发血管炎症反应，大量血清和组织学研究揭示了h c m v 与动脉粥样硬化存在一定相关性【3 6 , 3 7 ，h c m v 可能促动脉粥样硬化的机制。上述研究揭示了炎症反应与a s 之间的相关性，炎症反应学说为研究a s 的机制开辟了新的研究领域。2 1 3 免疫学说免疫学说认为特异性免疫参与a s 发生与发展【3 蜘，特异性免疫包括体液免疫和细胞免疫，o x l d l 是一种重要的自身抗原，由l d l 氧化修饰而来，最近研究显示o x l d l 介导一系列特异性免疫，在动脉粥样硬化斑块中含有大量的o x l d l 、巨噬细胞和t 淋巴细胞，而t 细胞主要介导细胞免疫。z h o u 等【3 9 】研究发现缺乏t淋巴细胞的小鼠a s 形成率减少4 0 以上，揭示t 细胞与a s 的发生具有密切的联系。t 淋巴细胞可分为c d 4 + 和c d 8 + 两种细胞，最近研究发现c d 4 + t 淋巴细胞能促进a s 的发生 4 0 , 4 1 1 ，c d 8 + t 淋巴细胞与a s 之间的联系尚未清楚，研究发现c d 8 + t 淋巴细胞引起a s 斑块中的细胞凋亡 4 2 , 4 3 。b 淋巴细胞主要介导体液免疫，研究发现b 淋巴细胞具有保护血管和导致a s 损伤面积缩小的作用，其机制可能是b 淋巴细胞通过高表达具有抗o x l d l 的抗体i g m 引起的m ，4 5 1 。上述研究表明免疫反应在动脉粥样硬化的起到越来越重要作用，但是免疫介导动脉粥样硬化机制仍相当复杂，免疫学说是否是个假说仍待于进一步的研究。2 2 动脉粥样硬化动物模型动脉粥样硬化造模动物主要涉及鸟类、小鼠、兔、小型猪、非人灵长类等实c验动物，所采用的方法包括饮食法、内膜损伤、转基因、免疫刺激等，饮食法造模是便捷、稳定、廉价的造模方法，在此主要综述了单代饮食法和连续两代饮食法造模方法的应用。2 2 1 单代饮食造模法单代饮食诱导是目前应用最广泛的建模方法，主要应用鸟类、鼠、兔、小型猪和猴等实验动物来建立动脉粥样硬化模型，通常在饲料中添加猪油或植物油、4西南大学硕士学位论文文献综述胆固醇等物质，造模时间在2 个月以上。2 2 1 1 鸟类动脉粥样硬化模型鹌鹑对外源性胆固醇敏感，易自发形成动脉粥样硬化斑块，其斑块性质与人类早期斑块病变相似，常通过喂养含胆固醇的饲料诱导建立动脉粥样硬化模型。在饲料中添加猪油、1 胆固醇，喂养鹌鹑1 2 周后就会形成a s 斑块m 】。h a m m a d 4 7 】等饲养雄性鹌鹑，喂养含0 5 胆固醇饲料，1 2 周后血清总胆固醇、总甘油三酯等血脂成分明显升高，主动脉出现动脉粥样硬化斑块，动脉粥样硬化模型建立。在白卡乳鸽饲料中添加1 的胆固醇和1 0 的猪油，3 0 r 天，连续喂养六个月，解剖发现胸主动脉发生动脉粥样硬化病变1 4 8 】。鸟类非哺乳类，其生理结构和血管解剖结构与人类不同，脂质代谢也与人类不同，其动脉粥样硬化病变只与人类早期病变相似，不能复制晚期动脉粥样硬化病变。2 2 1 2 鼠类动脉粥样硬化模型载脂蛋白e 基因敲除小鼠模型载脂蛋白e ( a p o l i p o p r o t e i ne ，a p o e ) 是s h o e 于1 9 7 3 年在极低密度脂蛋白( v 】l d l ) 中发现，它是l d l 的受体的配体，具有清除乳糜微粒能力，与脂蛋白代谢和动脉粥样硬化发生存在密切关系。a p o e 乒小鼠即a p o e 基因敲除小鼠。该小鼠在正常饮食条件下1 0 周或西方饮食( 2 1 脂肪和0 1 5 胆固醇) 8 周在内皮下发现了泡沫细胞堆积，而此时中膜还没有明显改变。西方饮食1 5 周以后，可出现早期纤维斑块，其斑块病理特征与人类a s 斑块病理特征极其相似，是研究a s 较为理想的模型。目前主要通过高脂高胆固醇饮食来诱导建立动脉粥样硬化模型 4 9 - s 2 1 。大鼠动脉粥样硬化模型解剖发现大鼠无胆囊，影响胆固醇的吸收，短期内不易引发高脂血脂症，高脂血脂与a s 发病有关，研究发现大鼠的a s 与人类早期相似【5 3 ，5 4 】。由于自身的生理特性和解剖特征，单纯高脂饮食下大鼠很难发生动脉粥样硬化，需在高脂饲里添加促胆固醇吸收药物( 胆酸钠) 、抗甲状腺药物( 丙基硫氧嘧啶) 、维生素等【5 5 蚓。l e e 等【5 7 】在普通饲料里添加5 猪油、0 6 1 丙基硫氧嘧啶、0 3 5 胆酸、1 胆固醇，饲喂大鼠建立动脉粥样硬化模型。有研究者 5 8 】将3 0 只s d 大鼠分成模型组和西南大学硕士学位论文文献综述对照组，模型组进行高脂饮食( 1 胆固醇、0 5 胆酸钠、0 1 甲巯咪唑、5 猪油，9 3 4 为普通饲料) ，2 个月后建立动脉粥样硬化模型。还有报赳5 9 1 称高脂饲料联合大剂量维生素d 3 可致w i s t a r 大鼠发生似人类中晚期动脉粥样硬化。上述研究表明大鼠必须在单一高脂高胆固醇饮食添加其他药物才能成功诱发a s ，且a s 病理特征与人类早期相似，不易发生似人类晚期动脉粥样硬化变化。2 2 1 3 兔动脉粥样硬化模型兔对外源性胆固醇和脂类吸收较好，血管易出现脂质沉淀等a s 病变特征，兔a s 模型在一定时间内比较稳定，高脂高胆固醇饮食可诱发兔冠状动脉、脑基底动脉等血管的动脉粥样硬化，但不易形成颈动脉粥样硬化。通常用含猪油或植物油、胆固醇的饲料饲喂家兔建立动脉粥样硬化模型，w a q a r 等【删用含3 或1 0 椰子油的饲料喂养日本雄性白兔2 2 星期，结果显示模型组血清游离脂肪酸水平较对照组升高，动脉粥样硬化模型建立。h u r a 等【6 1 相高脂高胆固醇饮食建立兔动脉粥样硬化模型，来研究高脂饮食对兔子血液胆固醇和血脂的影响。兔是草食性动物，其脂代谢与人类代谢有很大的差异性，且兔的a s 化病变位置与人类不同，这些特点决定了家兔在动脉粥样硬化中推广和研究的地位。2 2 1 4 小型猪动脉粥样硬化动物模型猪的心血管系统在解剖结构和功能上与人类十分相似，一头4 0 一- 5 0 k g 猪的心脏大小与人类相似，其脂蛋白结构与组成、脂质代谢机制也近似人类，随着年龄增长，猪可自发动脉粥样硬化，高胆固醇饮食可加速动脉粥样硬化的形成。选3 4 月龄喂含1 5 和3 的高脂饲料，分别在4 、6 、8 和1 2 个月对猪进行心血管检测，结果表明在4 8 发生动脉粥样硬化早期病变，1 2 个月后才能观察到晚期病变 6 2 】。猪属于大动物，体型较大，实验过程中会发生攻击人的现象，可控性较差，从操作上和安全性上具有一定的困难，长期饲喂高脂高胆固醇饲料会发生严重病变，并且病变消退缓慢。2 2 1 5 猴动脉粥样硬化模型猴的生理结构和功能与人类极其相似，目前国内以猴为模型动物来研究动脉粥样硬化的较少，国外研究的较多，以恒河猴、猕猴为主，常用高脂高胆固醇饮6西南大学硕士学位论文文献综述曼li iii i蔓曼量曼曼量曼皇曼舅曼曼食法造模，l i 铆a k 等【6 3 1 ，g e m y 等【6 4 1 通过高脂高胆固醇饮食法建立猴动脉粥样硬化模型来研究慢性多糖症、脂蛋白代谢的特点。但以其作为模型动物造价昂贵，不易普及应用。2 2 2 连续两代饮食诱导目前连续两代饮食诱导研究动脉粥样硬化报道较少，n o r m a n 等用猪作为模型动物，在孕期进行饮食处理，在实验组正常饲料中添加1 的胆固醇和1 5 的牛油，实验组子代饮食与其母体相同，子代1 2 1 4 天后进行饮食诱导，5 个月后建立动脉粥样硬化。肖婵云等【蛔在大鼠孕期饲喂高脂高糖饲料( 1 0 0 9 高脂高糖饲料含7 0 普通饲料，2 0 猪油，1 0 白糖，另加0 1 的胆盐) ，1 2 周后建立大鼠动脉粥样硬化模型。小结母体孕期高脂高胆固醇饮食对子代成年期动脉粥样硬化的发生尚无定论，因此具有重要的研究意义。各型实验动物在动脉粥样硬化研究中各有优缺点，从实验可操控性、安全性和是否能成功复制人类动脉粥样硬化上等方面来综合评价，a p o e c - d 、鼠是目前研究动脉粥样硬化较为理想的模型动物，目前单代饮食和两代饮食造模法时间较长，建立是一种廉价、时间短、能够提高动脉粥样硬化成模率的造模饮食方法显得尤其重要。7西南大学硕士学位论文引言母体及子代成年期连续两代饮食诱导建立a p o e 手小鼠动脉粥样硬化模型引言孕期是影响生命的发生和发展的重要阶段，母体孕期营养状况与胎儿的发育密切相关，母体孕期高脂高胆固醇饮食对其子代成年期心血管疾病的发生存在潜在影响，动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，a s ) 是世界上严重威胁人类健康的心血管疾病之一，是一种渐进的、复杂的、无痛感的过程，是心肌梗死和脑梗死等心血管疾病的重要病理基础。目前对影响动脉粥样硬化的发病因素尚未清楚，缺乏对动脉粥样硬化有效的防治措施，动脉粥样硬化实验动物模型种类繁多，造模方法多样和周期较长，因此建立一种脂质代谢和斑块与人类相似、简便易行和造模时间短的动脉粥样硬化整体动物模型具有重要意义。本论文选择母体孕期及子代成年期连续两代进行饮食干预，强化饮食对a p o e j , 、鼠动脉粥样硬化病变过程的刺激，以期缩短建模时间和提高成模率，探讨母体孕期高脂高胆固醇饮食对其子代成年期动脉粥样硬化发生的影响。8西南大学硕十学位论文技术路线技术路线币常饮禽申9西南大学硕士学位论文实验设计与过程第一章实验设计与过程1 a p o e - - 孕鼠的获取和饮食处理1 1 实验动物五对a p o e 小小鼠由南京大学实验动物中心提供，繁育获得4 0 只a p o e - - 雌鼠和4 0 只雄鼠，均为s p f 级动物，寄养于第三军医大学实验动物中心s p f 级动物房，恒温恒压和恒定光周期( 1 2 小时光照，1 2 小时黑暗) ，动物饲养笼具、饮水瓶定期消毒，所用垫料和饲料高压灭菌，自由饮食，饮水不限。1 2 主要试剂与孕鼠饮食配方主要试剂胆固醇猪油无水乙醇戊巴比妥钠c 2 2 i - 1 4 6 0n a h c 0 3 c a sc 2h 5o hc l l h l 7 0 3 n 2 n a成都市科龙化工试剂厂重庆新世纪超市重庆川东化工有限公司广州思乐生化试剂有限公司孕鼠高脂高胆固醇饮食配方猪油胆固醇正常饲料( 第三军医大学实验动物中心提供)1 3 主要仪器超低温冰箱( 8 0 )涡旋振荡器高速离心机立式压力灭菌锅电子分析天平全自动生化分析仪检测移液器光学显微照相系统1 4 孕鼠的获取与分组21 o 21 78 79 t h e r r n of o r m a ，美国国产h i t a c h i ，日本上海医用核子仪器厂p r e c i s a12 a ，瑞士o l y m p u sa u 2 7 0 0 ，日本t h c r m of o r m a ，美国o l y m p u s ，日本将发情的雌鼠与雄鼠合笼，小鼠在下午4 点和次日凌晨2 点活动频繁，易于受孕，本实验将雌雄小鼠于下午4 点左右能一次日上午8 点观察小鼠阴栓形成1 0西南大学硕士学位论文实验设计与过程1 1 1iii,i i 皇皇量曼曼曼曼皇皇皇曼曼皇鼍量皇皇曼皇曼量曼曼皇量量! 量曼曼笪曼量情况，阴栓是判断小鼠受孕的标准，有阴栓形成的即认定为孕鼠，并记录小鼠受孕情况并测量孕鼠体重。2 0 只孕鼠单独饲养，随机分成2 组，一组饲喂高脂高胆固醇饲料( 记为g 组) ，另一组饲喂正常饲料( 记为p 组) 。1 5 取血与血脂的测定自制小鼠取血固定器取一个5 0 m l 离心管，在底部钻数个孔利于小鼠呼吸防止小鼠窒息死亡，在管盖也钻个孔，孔径略大于小鼠靠脊柱尾巴的直径，这是为了让小鼠尾巴顺利通过。尾部静脉取血本实验采用断尾取血法，取小鼠尾部静脉血。首先腹腔注射麻药( 戊巴比妥钠，o 0 5 ) o 1 5 - 0 2 m l ，约5 分钟后小鼠麻醉昏厥，将小鼠置于底部有孔的5 0 m l离心管中让鼠尾穿过瓶盖小孔，用橡皮筋将取血器固定于铁架台上，将鼠尾置于4 5 温水中浸泡3 分钟，是局部血管扩张，用7 5 的酒精擦拭小鼠尾巴，将鼠尾擦干，减去尾尖i c m ，血自尾尖流出，让血液自然滴出或移液器吸取滴出的血液，血液用1 5 m l 离心管收集，取血过程会出现滴血很慢的情况，可用两指捏住小鼠尾巴自上而下捋几下直至有血滴出，尽量让血滴在离心管底，收集小鼠静脉血0 2 r n l 。取血结束先用酒精棉球压迫止血并立即用6 的液体火棉胶涂于尾巴伤口处，使伤口处结一层火棉胶薄膜来保护伤口防止小鼠出血死亡。将上述小鼠静脉尾部血静置或3 7 环境中以促其凝固，待血液凝固后，置于高速离心机上离心，3 0 0 0 r p m ，1 0 r n i n ，将上清液小心吸出置于新的1 5 m l 离心管中，并记录体积，用生理盐水稀释至总体积5 0 0 t l ，8 0 保存备用。血脂采用o l y m p u sa u 2 7 0 0 全自动生化分析仪检测( 第三军医大学西南医院检验科) ，检测指标包括总胆固醇( t c ) 、甘油三酯( t g ) 、高密度脂蛋白( h d l ) 和低密度脂蛋白( l d l )浓度。1 6 子鼠的获取新生鼠出生后辅助鸡蛋与瓜子饲喂母鼠，目的是增加母鼠的蛋白质和维生素，以