（果树学专业论文）草莓pgip基因的克隆及其序列分析.pdf

四川农业大学硕士学位论文 草莓p g i p 基因的克隆及其序列分析 摘要 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白( p o l y g a l a c t u r o n a s e i n h i b i t i n gp r o t e i n s ，p g i p s ) 是内切 多聚半乳糖醛酸酶( e n d o p g ) 的抑制剂，当病原真菌侵染植物时，它能与病原真菌 分泌的e n d o p g 专一性结合，一方面延缓病原真菌对植物细胞壁的降解，另一方面间 接地影响病原真菌的生长繁殖速度，在抵御真菌病害方面发挥重要作用，同时引发植 物的防卫反应。它还与大多数植物抗性基因一样，属于富亮氨酸重复( l e u c i n e r i c h r e p e a t ，l r r ) 蛋白超家族。p g i p 基因在植物抗病育种中已成为一重要的候选基因， 其分离鉴定是进行转p g i p 基因研究的基础。 根据蔷薇科植物p g i p 基因序列保守区域设计两对特异引物，以草莓( f r a g a r i a a n a n a s s ad u c h ) 叶片制备的总d n a 和总r n a 为模板，采用p c r 技术，克隆到了约 1 , 3 0 0 b p 和1 , 0 0 0b p 的d n a 和e d n a 片段。这两条片段与p m d1 8 - t 载体连接后转 化e c o l ij m l 0 9 ，对筛选到的阳性克隆进行序列测定与分析结果表明，获得的d n a 片段长1 , 3 8 9 b p ，含一个长度为1 6 8 b p 的内含子，e d n a 长1 , 0 5 3b p 。b l a s t 比对结 果表明，克隆到的片段是草莓的p g i p 基因，命名为f a p g i p ，g e n b a n k 登录号为 e u l l 7 2 1 5 和e u l l 7 2 1 3 。该片段含一个长度为9 9 9 b p 的完整开放阅读框，编码3 3 2 个氨基酸残基组成的蛋白质，具有5 个潜在的n 糖基化位点，中心l r r 结构域由1 0 个串联的l r r s 基序组成。预测该蛋白质分子量为3 7 1k d a ，等电点为7 6 7 ，n 端 2 4 个氨基酸残基构成的疏水区域为信号肽。序列同源比对结果显示，所克隆的f a p g i p 基因与蔷薇科其它植物飓勿基因核苷酸序列的同源性为7 5 2 8 6 5 ，推导氨基酸序 列的同源性为7 2 9 8 7 8 ；同源树表明其明显区别于其它昭基因；进一步的系统 进化树分析表明，所克隆的f a p g i p ( e u l l 7 2 1 3 ) 除与树莓的p g i p ( a j 6 2 0 3 3 6 ) 关系 较近外，与寿星桃( a y 9 0 3 2 1 9 ) 、美洲李( a y 8 8 3 4 1 7 ) 和梅( a y 9 0 3 2 2 3 ) 等的p g i p 基因都存在较远的进化关系。 关键词：草莓；多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白：基因克隆；序列分析 四川农业大学硕士学位论文 草莓腭驴基因的克隆及其序列分析 c l o n i n ga n dse q u e n c ea n a l y s i so f t h eg e n ee n c o d i n gt h e p o l y g a l a c t u r o n a s ei n h i b i t i n gp r o t e i n s ( p g i p s ) o fs t a w b e r r y a b s t r a c t p o l y g a l a c t u r o n a s ei n h i b i t i n gp r o t e i n s ( p g i p s ) a r ee x t r a c e l l u l a rg l y c o p r o t e i n sl o c a t e d i np l a n tc e l lw a l l i ti sb e l i e v e dt op l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ed e f e n s ea g a i n s tp l a n t p a t h o g e n i cf u n g i p g i p sc a ns p e c i a l l yb i n da n di n h i b i to rr e d u c et h eh y d r o l y t i ca c t i v i t yo f p o l y g a l a c t u r o n a s e s ( p g s ) s e c r e t e db yp l a n tp a t h o g e n i cf u n g i ，a n dl i m i tt h eg r o w t ho fp l a n t p a t h o g e n s ，a sw e l la se l i c i t i n gd e f e n s er e s p o n s e si np l a n t f u r t h e r m o r e ，p g i p sb e l o n gt o t h es u p e rf a m i l yo fl e u c i n e r i c hr e p e a t ( l r r ) p r o t e i n sw h i c ha l s oi n c l u d et h ep r o d u c t so f s e v e r a lp l a n tr e s i s t a n c eg e n e s t h e ya r ec o n s i d e r e dt ob ea l li m p o r t a n tc a n d i d a t eg e n ef o r g e n e t i ce n g i n e e r i n gt oo b t a i nt r a n s g e n i cp l a n t s 、) l ，i t hi n c r e a s e dt o l e r a n c et of t m g a li n f e c t i o n w h i c hd e c r e a s et h eu s eo fi n s e c t i c i d e t h e r e f o r e ，t h eb a s i cr e s e a r c ho ft r a n s g e n i c - e n g i n e e r i n gf o rt h a tp u r p o s ei st oi s o l a t ea n di d e n t i f yt h ep g i pg e n e s t h r o u g hp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) w i t ht w op a i r so fs p e c i f i cp r i m e r sb a s e do n t h ec o n s e r v e dr e g i o no ft h e p g i pg e n e so fg e n u sr o s a c e a e ，t w of r a g m e n t sa b o u t1 , 30 0 b pa n d 1 , 0 0 0b pw a so b t a i n e df r o mt h et o t a ld n aa n dr n ae x t r a c t e df r o mt h el e a v e so fm a t u r e s t r a w b e r r yl e a v e s a f t e rc l o n i n gi ti n t op m d 18 一tv e c t o r , t h el i n k e dd n aw a st r a n s f o r m e d i n t oe s c h e r i c h i ac o l ij m10 9 t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r ep i c k e do u ta n ds e q u e n c e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec l o n e dd n aw a s1 , 38 9 b p ，w h i c hs h o w sas i n g l e16 8 b pi n t r o nt h a t i se f f i c i e n t l ys p l i c e do u to ft h ef a p g i pp r e m r n at r a n s c r i p t t h ee d n aw a s1 , 0 5 3b pi n l e n g t ha n dar e a lp g i pg e n eo fs t a w b e r r yd e s i g n e da sf a p g i pi nt h i st h e s i sw i ma l l a c c e s s i o nn u m b e re u1 17 215a n de u1 17 213i ng e n b a n k t h ec l o n e dc d n ac o n t a i n sa n o p e nr e a d i n gf r a m eo f9 9 9 b p ，w h i c he n c o d e sf o rap o l y p e p t i d eo f 3 3 2a m i n oa c i dr e s i d u e s 、i t ham o l e c u l a rm a s so f 3 7 1k d aa n dap io f 7 6 7 ，a n dah y d r o p h o b i cr e g i o no f 2 4a m i n o a c i dr e s i d u e si nt h en t e r m i n a lw h i c hw a sc o n s i d e r e dt ob eas i g n a lp e p t i d e t h ed e d u c e d 2 四川农业大学硕士学位论文 草莓p g i p 基冈的克隆及其序列分析 a m i n oa c i ds e q u e n c e sc o n t a i n5p o t e n t i a ln - g l y c o s y l a t i o ns i t e s ，a n dt h ec e n t e rl r r s t r u c t u r a ld o m a i ni s c o m p o s e do f10t a n d e ml r rm o t i f s a l t h o u g ht h ec l o n e dc d n a e x h i b i t sah o m o l o g yo ft h en u c l e o t i d ea n dd e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e so f7 5 2 - 8 6 5 a n d7 2 9 8 7 8 r e s p e c t i v e l y , w h i c hw a s s i g n i f i c a n t l ys i m i l a rt oo t h e rp g i pg e n e sf r o mt h e g e n u sr o s a c e a e ，t h eh o m o l o g yt r e es h o w st h a ti to b v i o u s l yd i s t i n g u i s h e df r o mt h eo t h e r s a n dt h ep h y l o g e n e t i ct r e es h o w st h a ti ti n d e e df a rf r o mi t sn e a rs p e c i e s ，a n db e l o n g st oa d i f f e r e n tb r a n c hw i t ht h er u b u si d a e u s k e y w o r d s ：s t r a w b e r r y ；p o l y g a l a c t u r o n a s ei n h i b i t i n gp r o t e i n s ( p g i p s ) ：g e n ec l o n i n g ： s e q u e n c ea n a l y s i s 3 四川农业大学硕士学位论文 草莓p g i p 基因的克隆及其序列分析 缩写词 4 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成尽我所知，除了文中特别加以标注和致访十的地方外，学位论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其 它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 豫鸯 带占月弓t ，日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业 大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：渗焘 导师签名： 参9 谚年占月弓。白 乡艚晕占窍弓d 四川农业大学硕士学位论文 草莓昭勿基因的克隆及其序列分析 1 文献综述 1 1 引言 植物病害中有相当一部分是由病原真菌引起的，植物对病原体的抗性来茸于植物 细胞对病原体的感知并启动下游响应机制，以此来激活植物韵寸系列自身防卫反应， 以对抗病原物的入侵【卜3 1 。在病原真菌侵染植物的过程中所遇到的第一道防线便是植 物的细胞壁，植物细胞壁对植物抵抗病原真菌的侵染具有非常重要的作用j 当植物遭 受病原真菌侵染时，这些致病性真菌会分泌一系列韵酶来降解植物细胞壁咿。譬植物细 胞壁主要含纤维素、半纤维素和果胶类等物质，它们由葡萄糖、嗣拉伯糖o ：半乳糖糖 醛等聚合而成，其中果胶物质是胞间层的主要成分。果胶使相邻的细胞粘合在一起， 它主要是d 半乳糖醛酸经q 1 ，4 一键连接而成同源多聚半乳糖醛酸链【1 ，5 】。多聚半乳糖 醛酸酶( p o l y g a l a c t u r o n a s e s ，p c - s ) 是一类参与果胶降解的酶，它具有随机地在不同 部位水解切开非甲基化的果胶或其他多聚半乳糖醛酸的l 一一a 二半乳糖糖苷键而导 致细胞壁降解以及植物组织浸软的功能【6 7 】。在植物病原体榴互作用过程中，植物致 病性真菌遇到植物细胞壁后首先分泌的便是p g - s 8 1 叱几乎所有的植物致病真菌都会 产生p g s ，p g s 被认为是导致植物抵抗病原体能力下降的主要因素【2 , 1 0 】 植物在长期与病原物相互作用的过程中形成了一套自身的防御体系。多聚半乳糖 醛酸酶抑制蛋白( p o l y g a l a c t u r o n a s e - i n h i b i t i n gp r o t e i n s ，p g i p s ) 是一种富含亮氨酸重复 ( l e u c i n e r e a c hr e p e a t ，l r r ) 的细胞壁结合蛋白，它是一种特异性的热稳定的糖蛋 白【1 2 】，能够与病原真菌的p o s 专一地、可逆地结合，形成一种高亲和的复合物从而抑 制其活性，减缓多聚半乳糖醛酸的解聚，并能引起高浓度的寡聚半乳糖醛酸( o l i g o g a l a c t u r o n s a s ，o g s ) 在植物体内的积累，使具有生物活性的寡聚半乳糖醛酸的稳定期相 对延长，而o g s 的下游效应则是转录激活包括p o i p s 在内的一系列防卫相关基因，因 此能更有效地激活植物体内的防御系统，调控基因的表达，增强植物的抗病性，以抵 御病原真菌的侵入【l 3 ，1 0 ，1 3 。1 6 】。p g 口p g 相互作用已成为在分子水平上研究植物 l r r 介导的特异识别的一种模式系统【2 ，”】。p g i p s 在植物防卫反应等方面引起了广大 学者的关注，围绕p g i p s 所开展的研究也十分广泛 2 , 3 , 4 , 9 , 1 6 - 2 0 】。 四川农业大学硕士学位论文 草莓p g 妒基因的克隆及其序列分析 1 2 植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白( p g i p s ) 研究进展 1 2 1p g i p s 的发现及其在植物中存在的广泛性 p g i p s 最早是a l b e r s h e i m 和a n d e r s o n 于1 9 7 1 年在菜豆下胚轴、番茄茎和桐叶槭 悬浮培养细胞的蛋白提取物中发现，它能完全抑制由某些植物病原真菌分泌的p g s 的活性【2 1 1 。随后在巴梨口2 埘】，苹果 2 5 , 2 6 、甜橙【2 7 1 、豌豆【2 8 ，2 9 1 、青椒 3 0 l 、黄瓜【3 1 1 、苜 蓿( 3 2 】和小麦f 3 3 彤1 等植物上也发现了能够抑锖q p g s 活性的p g i p s 。p g i p s 只特异地抑制病 原真菌分泌的p g s ，而不能抑制植物和细菌产生的p g s 及其他微生物果胶酶【3 6 】。 在基因的分离研究方面，1 9 9 2 年t o u b a r t 等 3 7 j 首次从菜豆中克隆出两令脚基因， 它们编码3 2 4 个氨基酸残基，含2 9 个氨基酸残基的信号肽和3 1 3 个氨基酸残基的成熟 肽。据初步统计，国内外已先后从猕猴桃【3 8 】、拟南芥【3 9 1 、柑橘呻啦】、桉树h 3 1 、棉花1 4 4 、 苹果【4 5 ，4 6 1 、水稻【4 7 1 、菜豆【3 7 4 钔、豌豆【4 9 】、李【5 0 l 、桃侈1 , 5 2 1 、梅1 5 3 , 5 4 1 、梨瞪5 矧、树莓t 5 7 1 、 d , 麦t 4 7 j 等2 5 个属4 5 种植物中克隆到了脚基因。朋印基因从不同植物中分离成功表明 其在植物中的广泛存在。 1 2 2p g i p s 的生物学功能及作用机理 p g i p s 对p o s 的活性的抑制，引起高浓度o g s 的积累，使得活性o g s 的稳定期延长， 从而引发植物防卫反应f 川。此外，p g i p s 与病原真菌p g s 结合，减少了p g s 植物细胞壁 的降解，有助于维护植物细胞壁的完整性，使其不易被病原真菌分泌的其它水解酶所 渗透，以减慢细胞壁的降解，使得病原真菌得以利用的营养物质减少，进而减缓病原 真菌的生长繁殖速度( 5 引。 p g i p s 可能是与甲基化的果胶结合的。当病原真菌分泌出p g s 时便从果胶上释 放下来与p g s 结合( 1 6 1 。p g i p s 对p g s 的抑制可以是竞争性的，也可以是非竞争性。比 如：梨【2 2 1 和柑橘【2 6 】中的p g i p s 可以竞争性的抑制黑色蒂腐病菌( d i p l o d i an a t a l e n s i s ) 分泌的p g ：番茄p g i p 可以非竞争性的抑制黑曲霉( 4 s p e r g i t t u sn i g e r ) a n p g i i 【5 5 】；菜 豆p v p g i p 2 不但可以竞争性的抑制串珠镰刀菌( f u s a r i u mm o n i l i f o r m e ) f m p g t 5 9 1 ，而 且可以非竞争性的抑制m l p g i i 【6 0 1 ，对灰霉病菌( b o t r y t i sc i n e m a ) b c p g i 贝【 既有竞争 性抑制作用也有非竞争性抑制作用【6 l 】。几乎所有的植物致病真菌都产生p g s ，它们是 具有许多种形式的同工酶，有不同的一级结构、稳定性、特殊活性、最适p h 值、作 用方式、底物偏爱性以及释放不同类型的低聚糖，它们也许是为了适应不同的条件和 不同的寄主而进化来的【2 捌。 四川农业大学硕士学位论文 草莓p g i p 基因的克隆及其序列分析 1 2 3 踏勿基因的特点 对所有已克隆的全长昭勿基因及推定的氨基酸序列分析发现，p g i p 基因在结构 上具有下列特征：( 1 )具有富含亮氨酸重复l r r 结构域，其序列可归纳为： l x x l x x l x x l x l s x n x g x i p x x 6 2 1 ，重复数一般为1 0 。l r r 结构域是植物抗病基因( r g e n e ) 的特征结构，被认为是r 基因的功能区域。因此有学者认为，p g i p 基因的l r r 区域是与外源p g 酶催化结合部位，从而抑制后者的活性。( 2 ) 所有p g i p 基因的n 锻都含有一个疏水性的信号肽段，使他们靶向内膜系统，输出到胞外空间，而且信号 肽的剪切位点也是保守的，均在s e r 后剪切【4 6 1 。( 3 ) 存在不同程度的糖基化，根据 p g i p s 的c d n a 推导的氨基酸序列，发现水果p g i p s 有6 7 个潜在的n 糖基化位点。 ( 4 ) 所有双子叶植物p g i p s 的n 端和c 端分别存在4 个保守的半胱氨酸残基【6 3 】，且 位置不变。 船谚基因具有高度的保守性。苹果4 5 k 勿基因与梨的飓勿基因有9 6 的同源性； 马哈利樱桃瞰k 勿基因与杏的骝勿基因m i 斟a 序列、编码的氨基酸序列同源性分别达 到9 4 1 和9 6 7 ；梅【5 3 p g i p sc d n a 序列与桃、马哈利樱桃的p g i p s 序y l j l - 司源性分别 为9 6 和9 5 。 船勿基因是被多基因家族编码的。l e c k i e t 6 5 1 证明大豆飓勿基因是由多基因家族编 码的，且不同的p g i p 基因家族成员的表达产物g i j p g s 有不同的抑制效应。西红柿昭勿 基因的表达产物可以抑制炭疽病( g l o m e r e l l ac i n g u l a t a ) 的p g s 活性，但对灰霉病 ( b o t r y t i sc i m e r e a ) 的p g s 没有抑制效果【6 6 1 。v 毗i i l l a n a m a i l 等【5 7 】发现树莓的船印基因 家族有职勿j 和昭獬两个成员，p g i p i 从开花到果实成熟的整个发展过程以同等水平表 达，而骝i p 2 贝j j 是只有在抗果实软化的突变体的成熟果实中大量表达。 1 2 4 p g i p 基因的表达与调控 1 2 4 1 p g i p 基因的表达的特异性 p g i p 多基因家族各成员在非编码区序列上的差异，造威a p g i p 基因在同一植物在不 同发育时期、不同组织器官有不同种类和含量的理勿基因产物p 3 。5 ，6 7 1 。 p g i p 基因表达具有时间特异性。a b u g o u r t h 等【2 3 1 最早发现，随着果实的成熟， 梨对灰葡萄孢菌( b o t r y t i sc i n e r e a ) 、扩展青霉菌( p e n i c i l l i u me x p a n s u n ) 和柑橘小穴 壳菌( d o t h i o r e l l ag r e g a r i a ) 3 种病原真菌的抵抗力逐渐减弱，与此同时，梨体内的 p g i p s 含量也相应降低。后来，j o h n s t o n 等【6 8 】也发现类似现象，覆盆子随着果实的成 7 四川农业大学硕士学位论文 草莓p g i p 基因的克隆及其序列分析 熟，其体内的p g i p s 含量随之下降，并且受病原真菌一葡萄孢菌( b o t r y t i sc i n e m a ) 侵染的程度越大。阮期平等【6 7 】研究小麦p g i p s 时，观察到8 9 1 0 6 292 4 小麦品种在 幼苗初期不易受到小麦禾谷镰刀菌( f u s a r i u mg r a m i n e a r u m ) 感染，但幼苗后期却易 受到感染，而且日益严重。进一步对p g i p s 作免疫斑点实验( d o t i m m u n o b i n d i n ga s s a y ， d i b a ) 表明，在不同苗期p g i p s 的含量存在着差异，幼苗初期p g i p s 的含量明显 高于幼苗后期。这些研究说明p g i p s 可能更多的是在植物生长的幼苗期对病原真菌起 + r 。防御作用。 p g i p 基因表达具有组织特异性。h o f f m a n 等2 9 1 研究发现，豌豆托叶和叶中的 p g i p s 含量最高，种子中最低。t o u b a r t 掣3 7 1 研究发现梨果实中p g i p sm r n a 的含量 是花中的1 0 0 倍，而p g i p s 含量则是花中的2 0 0 倍，是叶中的1 4 0 0 倍。s a l v i 等【6 9 】 研究了蚕豆的根、茎、叶等各种器官，发现均有p g i p s 存在，但种子中含量最低，营 养芽和花中含量最高，并且随和植物的生长，茎中p g i p s 含量随之增加。 1 2 4 2 p g i p 基因的表达调控 p g i p 基因的表达主要受真菌感染调控。c e r v o n 等【3 6 】发现，在健康组织细胞壁中 p g i p s 是以低水平存在的，但当病原真菌侵染植物组织后，由于真菌分泌的内切多聚 半乳糖醛酸酶( e n d o p g s ) 大量进入植物组织中，使得内源p g i p s 含量超过原有水平。 由此认为，p g i p s 可以通过真菌感染诱导其水平增加。b e r g m a n n 等【7 0 】利用免疫组织 化学、n o r t h e r nb o l t 和w e s t e r nb l o t 技术从时间和空间上证实了当病原真菌侵染时， 踏p m r n a 和p g i p s 感染位点明显增多，表明p g i p s 的增加主要是依赖病原真菌的 攻击。 另外一些研究表明，p g i p 基因的表达还受创伤反应、水杨酸处理、胁迫等多种因 素调控，且同一家族的不同p g i p 基因成员所受调控因子可能不同。如油菜b n p g i p l 受 昆虫和机械创伤能诱导而高度表达，油菜b n p g i p 2 对真菌侵染和创伤很敏感，但昆虫 却不能诱导其表达；茉莉酸对两者的表达都有诱导作用，而水杨酸则不能诱导其表达 【7 1 1 。d im a t t e o 等发现菜豆菜_ 豆_ p v p g i p 3 受o g s 诱导而不受真菌葡聚糖、水杨酸以及 损伤诱导，j 雨p v p g i p l 受损伤诱导，而p v p g i p 2 则同时应答于真菌p g s 等多种应激因子。 1 2 5 职勿基因在植物抗病育种中的应用 p g i p s 对病原真菌的抗病作用使得其在植物抗病基因工程中有着十分重要的地 位。1 9 9 3 年，j o h n s t o n 等【6 8 】首次克隆出踏p 基因并转入到果树中进行果实耐贮藏育种， 8 四川农业大学硕士学位论文 草莓p g i p 基因的克隆及其序列分析 开启了昭勿基因用于植物抗病基因工程的先河。随后，b e r l e t t 等【7 2 】- 于1 9 9 6 年将梨昭勿 基因成功转入番茄并得到高效表达，使番茄对易感真菌灰霉病( b e t r y t i sc i n e m a ) 的 抗性大大增加。不久，d e s i d e r i o 等 7 3 】首次利用烟草花叶病毒强启动子和大豆踏勿基因 构建植物表达载体对番茄、烟草和大豆进行了遗传转化，结果表明从转基因番茄和烟 草中纯化的p g i p s 和大豆中纯化的p g i p s 对几种真菌p g s 的抑制特异性不同。2 0 0 0 年， p o w e l l 等【硎在番茄中转入梨职勿基因并使其过表达p g i p s ，发现由灰霉病引起的病症 减轻，这是p g i p s 首次在转基因植物体内表现出对病原物侵染的有限抑制。在转梨p g i p 基因的葡萄中也取得了相似的结果7 5 1 。将葡萄柚的p g i p 基因转入柑橘获得了对根象鼻 虫的抗性7 6 】；大豆职勿基因转入玉米，获得了对玉米穗腐病菌( s t e n o c a r p e l l am a y d i s ) 的抗性【7 7 】；表达菜_ 豆p g i p 的转基因烟草和番茄比野生型生长得更大更旺盛，转基因番 茄的果胶中含有更多的甲基化和乙酰化成分，事实证明高度甲基化的果胶不受p g s 影 响【7 8 】。 2 本研究的目的和意义 草莓( f r a g a r i a a n a n a s s ad u e h ) 属于蔷薇科( r o s a c e a e ) 草莓属( f r a g a r i a ) 多 年生草本植物，园艺分类属浆果类，总产量和总面积仅次与葡萄，居世界浆果生产第 二位。草莓具有较高的营养价值和经济价值，因其成熟浆果鲜红艳丽，柔软多汁，香 味浓郁，酸甜可口，营养丰富，深受国内外消费者的欢迎。然而草莓在生长过程中容 易受到各种病虫害的侵害，特别是某些细菌性和真菌性病害可以侵染植物的叶片、果 实等。目前草莓病害以灰霉病、果腐病、白粉病及炭疽病最为严重，已经严重影响到 果品的质量和产量。抗病育种一直是草莓现代育种的重要方向 ，分离、克隆草莓抗病 基因在草莓基因工程改良抗病性中具有重要意义。 “丰香 ( f r a g a r i aa n a n a s s ac v t o y o n a k a ) 是我国广泛栽培的优良草莓品种，具 有果质好，产量高等优良特性，对炭疽病、叶斑病抗性较强，本研究针对国内外果树 抗病基因工程改良方面的研究现状，以草莓品种“丰香 ( f r a g a r i a a n a n a s s a c v t o y o n a k a ) 为材料，克隆草莓的p g i p 基因，以期增加对其遗传背景的了解，有助于 育种工作的进行，并可为植物抗病育种提供有用的基因资源，同时为p g i p 基因的开发 和利用打下一定的基础。 9 四川农业大学硕士学位论文 草莓p g i p 基因的克隆及其序列分析 3 材料和方法 3 1 实验材料 3 1 1 植物材料 本试验选用培养室继代培养四周大小的草莓栽培品种丰香( f r a g a r i aa n a n a s s a c v t o y o n a k a ) 试管苗叶片为试材。试管苗由本实验室于2 0 0 3 年9 月通过茎尖培养建 立并保存。继代培养基是m s + 0 5 m g l b a + 0 1 m g l i b a ，其中蔗糖2 0 0 9 l ，琼脂 粉6 0 9 l 一，培养温度2 54 - 1 ，光照强度2 5 0 0i x ，光照时间1 6h d - 1 。 3 1 2 菌株 大肠杆菌e c o l ij m l 0 9 基因型为r e c a l ，e n d a l ，g y r a 9 6 ，t h i ，胁尿1 7 ( r k - m k + ) ， el4 。( m c r a 3 ，s u p e 4 4 ，r e l a1 ，a ( 1 a c - p r o a b ) f t r a d 36 ，p r o a b + ，l a ci q ，l a c z a m15 ，由四 川农业大学林学园艺学院园艺植物生物技术研究室保存。 3 1 3 载体 克隆载体p m d l 8 t 购自宝生物工程( 大连) 有限公司，是一种高效克隆p c r 产 物( t a 成果克隆) 的专用载体，由p u c l 8 载体改建而成，在p u c l8 载体的多克隆 位点区的x b ai 和s a li 识别位点之间插入了e c o rv 识别位点，其限制酶图谱及克隆 位点见图1 。 3 1 4 试剂与试剂盒 r n a 提取试剂盒p l a n tr n a o u t 购自绵阳高新区天泽基因工程有限公司； e a s y g o t mr tp r e m i x 购自北京赛百盛基因技术有限公司；琼脂糖凝胶d n a 回收试剂 盒购白天根生化科技( 北京) 有限公司。r n a s e 抑制剂s u p e r - r i 、购自成都博瑞克生 物技术有限公司，t a qd n ap o l y m e r a s e 、e xt a qd n ap o l y m e r a s e 、d n t p 、t 4d n a l i g a s e 均购自宝生物工程( 大连) 有限公司，胰蛋白胨、酵母粉购自英国o x o i d 公司， 限制性内切酶购自立陶宛f e r m e n t a s 公司，r n a 提取用试剂以及蛋白质电泳用试剂为 s i g m a 公司产品，其它常用试剂为进口分装或国产分析纯。 1 0 四川农业大学硕士学位论文 草莓只g 勿基因的克隆及其序列分析 酽_ _ - 哪 a 翻嘲两叫u 盯1 c c 0 瑚 ， 、，t j 、迥乏、， i _ 雕 l i l _ i t i 一i i _ 曩 i i i _ l 爿- _ 一- 刊撕- l 嗣i l - i i - i - - l l 一l l , l l - l l l l - i 3 1 5 培养基 图1 p m d1 8 一t 载体的物理图谱 f i g 1p h y s i c a lm a po fp m d18 一tv e c t o r ( 1 ) s o b 培养基 分别称量胰蛋白胨2 0g 、酵母粉5g 、5m n a c l2i i l l 、1mk c i2 51 1 1 1 和1 0 0 m 9 2 + 1 0m l 于2l 烧杯中，加入约8 0 0m ld d h 2 0 ，搅拌溶解后用1nn a o h 调p h 值至 6 8 7 0 ，加d d i - 1 2 0 定容至1l ，高温高压灭菌( 文中除特殊说明外，均指在1 2 1 ， 0 1m p a 下灭菌1 5 - 2 0m i n ) ，4 c 保存。 ( 2 ) s o c 培养基 上述s o b 培养基中加入葡萄糖至终浓度为2 0m m ( 即：9 8 2m ls o b 中加入1 8 m l2 0 的葡萄糖) 。 ( 3 ) l b 培养基 分别称取胰蛋白胨1 0g 、酵母粉5g 和n a c l1 0g 于2l 烧杯中，加入约8 0 0m l d d h 2 0 ，搅拌溶解后用5nn a o h 调p h 值至7 0 ，定容1l 后高温高压灭菌，4 。c 保 存。 ( 4 ) l b 固体培养基 在上述l b 培养基的基础上加入琼脂至终浓度为1 1 5 ( w v ) 。 ( 5 ) 氨苄青霉素( a m p ，10 0m g m 1 ) 四川农业大学硕士学位论文 草莓p g i p 基因的克隆及其序列分析 称取5g a m p 于5 0m l 离心管中，加入4 0 m l 无菌d d h 2 0 ，充分混合溶解，定容 至5 0m l ，小份分装后，2 0 c 保存。 ( 6 ) l b a m p 培养基 在上述灭过菌的l b 培养基中加入a m p 至终浓度为1 0 0i _ t g m l ，4 c 保存。 ( 7 ) l b a m p 固体培养基 在上述灭过菌的l b 固体培养基冷却至5 0 6 0 。c 时加入a m p 至终浓度为1 0 0 p g r n l ，并倒成平板，4 c 保存。 3 1 6 溶液和缓冲液 3 1 6 1 溶液 ( 1 ) 5nn a o h 称取2 0gn a o h 于2 0 0m l 烧杯中，加入约8 0m ld d h 2 0 ，溶解后定容至1 0 0m l ， 于塑料容器中室温( 文中除特殊说明外，均指2 0 - 2 5 。c ) 保存。 ( 2 ) c t a b 提取缓冲液 l o o m m 0 1 l d 嘶s h c l ( p h 8 0 ) ，2 0 m m 0 1 l 。1e d t a ( 乙二胺四乙酸二钠) ， 1 4 m o l l n a c i ，2 c t a b ( w v ) ，2 p v p ( 聚乙烯吡咯烷酮) ，1 p 一巯基乙醇( 每 次提取之前加入) 。 ( 3 ) 抽提试剂 将氯仿和异戊醇按体积比2 4 ：1 混合均匀后室温保存。 ( 4 ) 2mn a o a c ( p h 4 0 ) 称取2 7 2gn a o a c 3 h 2 0 于2 0 0m l 烧杯中，加入约4 0m ld d h 2 0 ，搅拌溶解后加 入冰醋酸调p h 值至4 0 ，定容至1 0 0m l ，高温高压灭菌后，室温保存。 ( 5 ) d e p c 处理水 1l m i l l i q 水q b d i ；i x 1m l 二乙基焦磷酰胺( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ，d e p c ) ，混匀 后3 7 过夜，高温高压灭菌后室温保存。 ( 6 ) 0 5me d t a ( p h 8 0 ) 称取1 8 6 1gn a 2 e d t a 2 h 2 0 ，置1l 烧杯中，加入约8 0 0m ld d h 2 0 ( 或d e p c 处理水) ，充分搅拌，用1 nn a o h 调p h 值至8 0 ，加d d h 2 0 ( 或d e p c 处理水) 定 容至1l ，适量分成小份后高温高压灭菌，室温保存。 ( 7 ) e t b r 染液( 1 0m g m 1 ) 1 2 四川农业大学硕士学位论文 草莓p g i p 基因的克隆及其序列分析 称取lg 溴乙锭( e t h i d i u mb r o m i d e ，e t b r ) 于2 0 0m l 烧杯中，力h x 1 0 0m ld d h 2 0 ， 充分搅拌溶解后转移至棕色瓶室温避光保存。工作浓度为0 5p g m l 。 ( 8 ) 8 0 甘油 取8 0m l 甘油与2 0 1 1 1 ld d h 2 0 混合，高温高压灭菌后，室温保存。 ( 9 ) 1 5mt r i s h c l ( p h8 8 ) 称量1 8 1 7g 玩s 置于1l 烧杯中，加入约8 0 0m ld d h 2 0 ，充分搅拌溶解，用浓 盐酸调节p h 值至8 8 ，加d d h 2 0 定容至1l ，高温高压灭菌后室温保存。( 注意：使 溶液冷却至室温后再调定p h 值。) ( 1 0 ) 1 0mt r i s - h c l ( p h6 8 、7 5 、8 o ) 称量1 2 1 1gt r i s 置于1l 烧杯中，加入约8 0 0m ld d h 2 0 ，充分搅拌溶解，用浓 盐酸调节至所需p h 值，加d d h 2 0 定容至1l ，高温高压灭菌后室温保存。( 注意：使 溶液冷却至室温后再调定p h 值。) ( 1 1 ) 1 0 s d s ( w v ) 称取1 0g 高纯度的十二烷基硫酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e ，s d s ) 于2 0 0m l 烧杯中，加入约8 0m ld d h 2 0 后6 8 。c 力n 热溶解，滴加数滴浓盐酸调节p h 值至7 2 ， 加d d h 2 0 定容至1 0 0m l 后室温保存。 ( 1 2 ) m g c l 2 ( 2 5m m ) 购d n ap o l y m e r a s e 时附送。 ( 1 3 ) 5m n a c i 称取2 9 2 2gn a c l 于2 0 0m l 烧杯中，加入约8 0m ld d h 2 0 后充分搅拌溶解，定 容至1 0 0m l ，高温高压灭菌后，4 。c 保存。 ( 1 4 ) 1m k c l 称取7 4 5gk c l 于2 0 0m l 烧杯中，加入约8 0m ld d h 2 0 后充分搅拌溶解，定容 至1 0 0m l ，高温高压灭菌后，室温保存。 ( 1 5 ) 1 0 0 xm g + 分别称取2 0 3 3gm g c l 2 6 i - 1 2 0 和2 4 6 5gm g s 0 4 7 h 2 0 于2 0 0r r d 烧杯中，加入约 8 0m ld d h 2 0 后充分搅拌溶解，定容至1 0 0m l ，高温高压灭菌后，2 0 c 保存。 ( 1 6 ) t f b 溶液 若配制2 0m l ，则分别吸取1m k c l2 0m l 、0 5m k m e s ( p h 6 3 ) 0 4m l 、0 4 5 m m n c l 22 0m l 、0 5mc a c l 20 4m l 和无菌d d h 2 01 5 2m l 于5 01 1 1 l 无菌溶液瓶或离 心管中，混匀后置冰上预冷后使用。 1 3 四川农业大学硕士学位论文 草莓p g i p 基冈的克隆及其序列分析 ( 1 7 ) 1nk o h 称取5 6 1gk o h 于2 0 0m l 烧杯中，加入约8 0m ld d h 2 0 后充