（安全技术及工程专业论文）除虫脲生物安全性评价.pdf

a b s t r a ( 汀 d i f l u b c n z u r o ni sak i n do fp e s t i c i d e sc a n ti n d u c em u t a t i o na n da b e r r a t i o nb e c a u s eo f i t sl o wt o x i c i t ya n dl o wr e s i d u e a tp r e s e n tt h ei n v e s t i g a t i o nm a i n l yc o n c e n t r a t eo n a p p r a s i n ga n ds e p a r a t i o ni t sp h o t o l y s i sp r o d u c t s i tw a sn o tr e p o r t e dg e n e t i ct o x i c i t ya b o u t d i f l u b e n z u r o nd e g r a d a t i o np r o d u c t i ti ss a i dr e s i d u a lp e r i o do fd i f l u b e n z u r o ni sl o n g e r , s o t h i s p a p e ra p p l ys i n g l e c e l l g e le l e c t r o p h o r e s i sa n dh i g l lp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y t os t u d yd i f l u b e n z u r o n t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) r e s i d u a ld e g r a d a t i o nd y n a m i c sa n dr e m o v i n gr a t eb yw a s h i n g ：t h er u l e st h a t d i f l u b e n z u r o nr e s i d u a ld e g r a d a t i o nw a ss i m i l a ro nc a b b a g ea n dc o l e d e g r a d a t i o nc u r v e e q u a t i o n so fd i f l u b e n z u r o no nc a b b a g ew a sy = 0 7 5 2 6 e - o m 6 2 x , t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sr 2 w a s0 9 5 1 3 ，h a l f - l i f ew a s 5 - - - 0 6 9 3 0 0 7 6 2 = 9 1 d a y s , d e g r a d a t i o nc u l v e e q u a t i o n so f d i f l u b e n z u r o no nc o l ew a s y - - 0 7 1 1 4 c m 0 6 9 3 。t l l cc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sr 2w a s o 9 5 5 , h a l f - l i f ew a st 0 s = 6 9 3 0 0 6 9 3 = 1 0 d a y so nc o l e t h er e m o v i n gr a t ew e r eb o t ha b o u t 6 0 b yw a s h i n gv e g e t a b l e s ( 2 ) d n ad a m a g ei n d u c e db yt h ep h o t o l y s i sp r o d u c t i o no fd i f l u b e n z u r o ni nm i c e l i v e r ：d i f l u b e n z u r o ni t s e l fi sak i n do fp e s t i c i d ew i t hn ob i o l o g yt o x i c i t y , b u ti t sp h o t o l y s i s p r o d u c t s , s u c ha s4 - c h l o r o b e n z e n ea n dc h l o r o p h e n y lu r e ao nv e g e t a b l e sm i g h th a v ea c e r t a i nt o x i c i t y i t p r e s e n t e dd o s e - e f f e c t i o n r e l a t i o nb e t w e e np h o t o l y s i sc o m p o u n d p r o d u c t sa n dd n ad a m a g e i nc e r t a i nr a n g e ( o 8 3 x 1 0 5g m l 2 x l o - ，g m 0 ( 3 ) d n ad a m a g ei n d u c e db yt h ep h o t o l y s i sp r o d u c to fd i f l u b e n z u r o ni n m i c e l i v e r ：t h er e s u l t si n v e s t i g a t e db ys i n g l ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i ss h o w e dt h a tt h es i g n i f i c a n t d i f f e r e n tw a sf o u n do fc o m e t si n d u c e db yt h er e s i d u a lm i x t u r eo fd i f l u b e n z u r o ni n v e g e t a b l e sc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p i ts h o w e dd i f l u b e n r u z o nr e s i d u a lp r o d u c t i o n s o nv e g e t a b l e sc a ni n d u c e dm u t a t i o na n da b e r r a t i o n i nc o n c l u s i o n sw es h o u l da s s c s st h es a f e t yo fd i f l u b e n z u r o nn o to n l yf o r mi t so n g l n a l p e s t i c i d e ，b u ta s l oi t sd e c o m p o s ea n dm e t a b o l i t e s k e yw o r d s ：d i f l u b e n z u r o n ，s i n g l ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d y n a m i co fr e s i d u e d e g r a d a t i o n ，p h o t o l y s i sp r o d u c t i o n ，r e s i d u a lp r o d u c t i o n ，d n ad a m a g e ，s a f e t ya s s e s s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取 得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼理王太堂 或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：磴缈渺签字日期：1 刀叼年 1 月加日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丞洼堡王太堂有关保留、使用学位论文 的规定。特授权云洼堡王太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编， 以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复本和电子 文件。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：岛知如 导师签 签字日期：纠 7 年1 月w 日 签字日期：加日 第章绪论 第一章绪论 1 农药的研究进展 1 1 农药发展的现状及其存在的问题 2 0 世纪4 0 年代至今世界农药获得了迅猛的发展，4 0 年代农药的研究开发与生产异常 活跃，开发了大量新结构的有机氯如：d d t 、六六六、氯丹等以及有机磷杀虫剂如：毒 死蜱，对硫磷，八甲磷等，进入5 0 年代以西维因为代表的氨基甲酸酯类农药进入市场， 由于西维因应用范围广至今仍大量的使用，在这个时期还出现了硫代氨基甲酸酯类除草 剂，扑草灭、毒草安、甲草胺，丁草胺，西玛律和赛克律等；6 0 年代出现了一批性能优 异的新化合物如呋喃丹、涕灭威等以及一系列引人注目的咪唑类杀菌剂。6 0 年代以前 的农药对环境安全的影响较大如：有机氯农药由于在环境中稳定持久、高残留、水溶性 低、脂溶性高，易通过食物链积累在生态系统中构成恶性循环，7 0 年代世界各国相继停 用：有机磷，氨基甲酸酯和拟除虫菊酯以昆虫的神经系统作为攻击靶标，对哺乳动物和人 类也会造成高毒性，并且专一性差，很容易造成抗性的产生，而使得农药过早失去作用， 7 0 年代以后，新的作用机制以昆虫所特有的生长发育系统作为攻击靶标的昆虫生长调节 剂问世后，使农药的概念发生了根本的变化，昆虫生长调节剂具有特异性，选择性高，安全 性好，二十世纪8 0 年代以后，新农药品种开发过程中，在强调高活性的同时，更加注重与环 境的相容性，以确保人类和非靶标生物的安全性，但仍不能满足时代的需要。由于环境的 要求和绿色化学的提出，现在的农药应该改造成安全性更高的无污染农药或无公害农 药，使之朝着更健康的方向发展。 1 2 新世纪农药的发展趋势 农药对环境的污染和人民身体健康的威胁对农药的发展提出了新的挑战，同时也为 农药的发展提供了新的机遇，新世纪农药的开发和研究主要集中在安全性更高的无污染 农药或无公害农药的方向发展【1 1 ，即少量即产生高效，对特定有害生物起作用且无毒或 者低毒在环境中能迅速降解的超高效、高选择性、无公害的绿色农药，使之朝着更健康 的方向发展。 1 2 1 杂环和稠杂环化学农药的研究 近年来一些新颖的杂环和稠杂环结构的农药由于其超高效、低毒、低残留性在创制 新农药中广泛应用，这些超高效的农药，不但使用成本低，而且对环境的影响降低到很 小的程度，对温血动物毒性很低，对鸟类，鱼类的毒性也很低，在杂环中，含有氮杂环 和氟杂环的化合物又特别的重要1 2 1 。 第一章绪论 ( 1 ) 含氮杂环化合物 从近几年的专利统计看，杂环和稠杂环化合物中含氮的占了9 5 ，这些含氮杂环化 和物农药中，不但有杀菌剂、除草剂、还有超高效的新型杀虫剂，主要有烟碱类化合物、 吡唑类化合物、噻( 嗯) 二唑啉类化合物、喀哗啉类化合物、吡嗪酮类化合物、哒嗪酮类 化合物、咪唑啉酮类、三唑类、三嗪类，嘧啶类、以及咪唑、噻唑化合物等等，对农药 工业的发展产生了重大的影响图卜图3 所示的某些具有代表性的新型含氮杂环化学农 药的新品种。 囤l ( 旷跫。 n 慰1 1i 、n p i i l 。瞍 c l i = ( ) 、办r n m l 圈3 恶= 臻类化台钧i 口d 喇曲 ( 2 ) 烟碱类杀虫剂 烟碱类杀虫剂是以天然烟碱为模型，结构改进而发现的性能优异的化学杀虫剂；具 有与天然烟碱相同的作用方式，即作用于烟碱乙酰胆碱的受体，具有触杀，胃杀和内吸 活性。吡虫啉是第一个品种，此药有强内吸性，持效期也很长，主要用于防治叶蝉、飞虱、 蚜虫等，对抗性害虫有高效，吡虫啉在玉米上进行种子处理1 5 0 9 h m 2 的用药量，即可保护 植物直到收获不受虫害。此外，此药毒性小可用于动物防虫。从化学结构来看，目前已开 发或正在开发的烟碱类杀虫剂可分为硝基胍类、硝基亚甲基类及吡啶甲胺类等三类。 2 第一章绪论 州 ：一早 n n 鸭 吡虫啉 ( 3 ) 三唑并嘧啶磺酰胺类除草剂 这类除草剂是在磺酞脉类除草剂的基础上对脲桥结构进行改进而发展起来的稠杂 环类化合物，作用方式是阻断植物体内支链氨基酸的合成，属a l s 抑制剂。其共同特 点是超高效、广谱、低毒，应用范围广，可防除多种一年生和多年生阔叶杂草，广泛用 于大豆、玉米、小麦、大麦等，活性很好，大多数品种的亩用量在1 3 克，甚至更低。 阔草清是第一个进入市场的该类除草剂。 1 2 2 含氟化合物 由于氟原子的半径小，又具有较大的电负性，c f 键键能比c h 键键能要大的多， 所以有机氟化合物的稳定性和生理活性较高，此外含氟有机化合物有较高的脂溶性和疏 水性，促进其在生物体内的吸收和传递速度，另外氟原子还具有模拟效应等，氟原子的 引用大大增强了其活性，含氟农药研究开发成为热点。含氟农药种类比较多，目前已经 开发应用的含氟杀虫杀螨剂、杀菌剂，除草剂和植物生长调节剂等。下面着重介绍一下 杀虫剂： 含氟的杀虫剂品种主要有两大类，分别是拟除虫菊酯类和苯甲酰脲类。拟除虫菊酯 类农药新品叠出，而且结构不断增加和多样化，其中芳环上含有氟原子结构的品种有五 氟苯菊酯、四氟菊酯、七氟菊酯、氟氯苯菊酯、氟硅苯菊酯等，还有芳环上含有o c f 3 、 一c h f 2 、- o c h f 2 等基团的拟除虫菊酯，如氟氰戊菊酯、氟溴醚菊酯等。苯甲酰脲类杀虫 剂属于几丁质合成抑制剂，通过抑制几丁质在昆虫体内的生物合成而使昆虫致死，其作 用机理与其他杀虫剂不同，具有杀虫活性高、杀虫谱广、残留量低、选择性强的特点 其主要产品有除虫脲、氟铃脲、伏虫隆、氟酰脲等1 3 1 。当前农药的发展趋势是研究开发 超高效，低毒，高选择性与环境兼容的环境友好农药，大力开发杂环化和物，使农药工 业走向新型的、无害的绿色农药的发展道路，除虫脲即符合上述要求，在绿色蔬菜种植中 有着广泛应用前景的绿色农药。 2 农药残留的研究 2 1 研究农药残留的意义 2 1 1 我国农药生产使用概况 我国有国土1 4 4 亿多亩，耕地1 5 亿多亩，由于幅员辽阔，地理环境和气候条件复 3 第一牵绪论 杂，农作物品种繁多，病虫革鼠害种类也很多，其中虫害7 0 0 多种，病害5 0 0 多种，草 害8 0 多种1 4 l 。每年发生病虫害0 4 7 1 8 7 亿h m 2 次，受害面积达3 0 多亿亩次，给农业， 产造成了严重威胁1 5 1 人们在与病虫草鼠害长期的斗争实践中，农药在防治农作物的病 虫草害和保证稳产、高产方面起着极为重要的作用。因此农药的发明和使用被认为是农 业生产上的革命【6 】。现在农药不仅是农业生产中不可缺少的生产资料，同时也是用于环 境和家庭除害防疫的主要药剂1 7 1 。我国是世界上最早使用农药防治农作物病虫害的国家 之一，至今已有2 0 0 0 多年的历史1 8 j 。目前我国已成为世界第二大农药生产国，现有农药 生产企业2 6 0 0 多家，能够生产6 0 0 多种农药原药，每年生产农药有效成分2 5 万吨左右， 可加工成制剂8 0 1 0 0 万吨，仅次于美国，约占世界农药总产量的1 1 0 t 9 h 埘。我国也是 一个农药使用大国，每年发生病虫害0 4 7 1 8 7 亿h m 2 ，次，施用农药防治面积为1 5 3 亿 h m 2 次左右，通过化学防治每年挽回粮食损失2 0 0 亿3 0 0 亿千克，挽回直接经济损失达 6 0 0 亿元1 1 1 l 。2 0 0 4 年，我国农药使用量2 5 9 万吨，与2 0 0 3 年同期相比，杀虫剂增幅为 8 9 3 ，杀螨剂增幅为7 8 1 。由于推广力度的加大及销售价格下降等原因，据我国3 0 个省级植保植检站预测分析，2 0 0 5 年全国农药需求量( 以有效成分计) 预计为2 8 2 5 万 吨左右( 不包括出1 3 及非农业用药) ( 中国农业网) 。随着我国农业的发展，经济作物种植 面积的扩大，特别是保护地蔬菜面积的逐年增加，杀菌剂的使用量有所上升，但是杀虫 剂的使用量也一直居高不下，加上常年的载种，土壤中的病虫害一直得不到改善，农药 的使用始终渗透在农业生产中1 1 2 1 。 2 1 2 研究农药残留的历史背景 随着农药的应用日益广泛，农药对环境的影响也越来越引起人们的关注，1 9 6 2 年美 国海洋生物学家莱切尔卡逊( r e c h e lc a r s o n ) 女士撰写了寂静的春天一书，反映了 大量使用农药给人类、生物和环境带来的严重危害，给人们敲响了警钟l 廿1 。人们逐渐发 现一些急性毒性不太高的农药如滴滴涕等，化学性质稳定，残留期限长，并可能在生物 体内引起累积性毒性农药的使用已经对空气、地下水、湖泊、土壤等的环境污染，同 时农药滥用还造成了一些生物濒i i 缶灭绝1 1 4 1 。一些研究结果表明，通过大气和饮水进入人 体的农药约占1 0 ，透过食物进入人体的占9 0 ，因此在日常饮食中可以检出多种农药。 目前人们食用的农产品中存在有7 1 种致癌杀虫剂，而且经政府有关部门检验认为至少 3 8 的食品有杀虫剂残留物【1 5 l 。在充分认识了农药功过的基础上，人们开始冷静地思考 如何战略性地利用农药的积极因素时，抑制其消极因素。并采取各种措施防止农药残留 的危害。 2 0 世纪6 0 年代初，农药残留问题就引起了国际社会的重视，由联合国粮农组织 ( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 联合组成的农药残留专家联席会议定期对国际食品法 典委员会( c a c ) 提出的制定最大允许残留量标准的农药进行评价，c a c 基于评价的数 据制定最大残留限量标准1 1 3 1 。 我国从二十世纪5 0 年代后期就开始了农药残留的研究工作。6 0 年代开始对一些高 残留农药的使用和污染情况进行了调查和研究。7 0 年代农业部丌始组织并开展了农药 4 第一章绪论 安全使用标准的实验研究工作。8 0 年代我国颁布并实施农药登记规定，要求申请 农药品种登记时，必须提供该农药产品在登记作物中的残留、代谢、降解和检测方法以 及中国两个代表性作物产区两年残留试验资料等。9 0 年代我国出台了农药管理条例， 农药管理开始走向法制轨道，农药残留试验研究和管理工作也随之得到进一步的提高和 发展。目前，我国已出台了1 1 5 种农药在1 8 种农作物上2 3 2 项农药安全使用标准、 农药合理使用标准国家标准【”l 。这对于加强农药管理、指导科学、合理、安全使用 农药，防止农药污染农产品和环境，保障人体健康，促进高产、优质、高效现代化农业 的发展具有重要意义。 2 2 农药残留的研究背景 2 2 1 农药残留研究的范围 农药残留一般指遗留在农产品和环境中的农药及其降解代谢产物、杂质还包括环境 中存有的污染物或持久性农药的残留物再次在商品中形成的农药残留。通常说的农药残 留量是指农药本身及其代谢的残留量的总和，以每千克样本中有多少毫克( 或微克、纳 克等1 表示1 1 刀。农药残留是农药使用后的必然现象，但超过了一定量就会对人畜产生不 良影响或通过食物链对生态系统造成危害，目前国际上常用的最大残留限量( m r i _ s ) 值 来表示。各国及有关国际组织所制定的m r l s 值也成为判定农产品质量安全的标准1 1 5 j 。 农药残留的研究主要是研究农药最大残留限量、消解动态、农药残留半衰期、安全 采收期和在农作物上的最终残留量等。农药残留试验是为了研究农药在生物体内和环境 中的消解规律、各种引子与最终农药残留水平的相关性，取得农药最大残留限量、消解 动态、农药残留半衰期、安全采收期和在作物上的最终残留量等而进行的试验。它包括 田间试验和残留量检测两部分。田间试验必须以推荐的施药方式进行。为了获得最大的 残留量，需要以最高剂量、最多使用次数，在收获前最短的间隔施药。残留量检测必须 建立残留分析方法，残留量检测是微量或超微量分析，必须采用高灵敏度的检测器才能 实现，检测方法具备简便、快速、灵敏度高的特点，具有科学性和可靠性1 1 9 j 农药在环境中的最终残留物通常除了微量的农药原体，还有部分有毒代谢物和降解 物： ( 1 ) 、农药原体 我国是农业大国，为确保农业的丰收，每年农药都加工成多种剂型，开发新品种施 于农作物，使用的农药类型主要如下：( 1 ) 有机氯农药：特点是非常稳定，挥发性小，不 易分解，耐高温，日照，酸性环境下均难降解，属于高残毒农药。在土壤中残留的时间 很长。有机氯农药脂溶性强不溶于水或者微溶于水。由于其残留时间长，毒性大，已经 被取代了。( 2 ) 有机磷农药：对害虫高效，广谱，作用方式多样，低残留且其化学结构变 化无穷，品种多适用范围广，除各别品种外一般对农作物安全，相比较其他类农药，害 虫对有机磷杀虫剂的抗药性发展缓慢，因此其在农业生产中得到了广泛的应用。有机磷 农药从结构上看绝大数属于磷酸酯类，硫代磷酸酯类以及二硫代磷酸酯类，还有少数属 第一章绪论 于磷酸胺酪和硫代磷酰胺酯类有机磷农药通过抑制害虫体内的胆碱酯酶，使乙酰胆碱在 肌体组织中累计起来，从而引起某些神经系统功能的紊乱，将其杀死。同样的机理引起 人体中毒，轻者呕吐，重者昏迷。( 3 ) 氨基甲酸酯农药：特点为作用迅速，选择性强，对 高等动物毒性低，在生物体内及环境中易降解，杀虫能力强。其毒性机理与有机磷类似， 能抑制胆碱酯酶，但有可逆性，能很快恢复正常，故比有机磷安全。在食品中残留情况 大致与有机磷相似。曾经考虑用氨基甲酸酯类农药代替有机磷农药，但西维因，多菌 灵在外界环境中可被亚硝化，形成亚硝化合物致癌，又会给生物体带来其他的危害。( 4 ) 拟除虫菊酯：高效低毒在人和温血动物体内在能迅速代谢，但是一旦同害虫接触就立即作 用于其中枢神经导致其死亡。其结构复杂阻止害虫抗性的产生，易在环境中被光和空气 降解，由于其光谱性在农业生产中得到广泛的应用，但是它在害虫体内十分容易被代谢 而迅速失去活性，见光不稳定。拟除虫菊酯按其化学结构的不同可将其分为不含口氰 基的i 型以氯氰菊酯为代表和含口一氰基的i i 型以氯氰菊酯和溴氰菊酯为代表。拟除虫 菊酯类农药在喷施时与果实、谷物直接接触，是造成污染的主要原因，它主要集中在果 皮上，此类农药毒性一般较大且有蓄积性，中毒表现为神经系统症状和皮肤刺激症状 ( 2 ) 、农药代谢和降解产物 农药的代谢与药剂有效成分的化学结构有关，基本化学结构相同的化合物其降解方 式相似。农药降解的方式和程度也与动植物的种类有关，动植物体内有关酶的含量及降 解过程中的催化物质的存在能影响农药的代谢。农药的原体进入生物体后，通过多种酶 对其产生化学作用，发生氧化、水解、还原、结合、衍生、异构化等反应，发生反应的 结果产生了多种代谢产物。代谢产物相对于农药原体可分为毒性增强的代谢产物和减弱 的代谢产物。( 1 ) 毒性增强的代谢产物：有机磷杀虫剂中的p = s 通过氧化脱硫转化成p = o ， 硫( 酮冰磷酸酯是胆碱酯酶的弱抑制剂，而相应代谢产物p = o 则是强抑制剂，此类杀虫 剂有对硫磷、马拉硫磷和地虫磷。甲拌磷具有硫醚结构，在植物体内迅速氧化成亚砜和 砜，其抗胆碱酯酶活性为硫醚 亚砜 = 1 3 条件下处理2 0 分钟。 电泳 彗星实验中的电场强度从0 5 v c m 到1 4 v c m 均可使用，主要根据实验的要求和目 的而定。电泳缓冲液的类型也有很多种，有t a e ( p h 8 5 ) 、t b e 以及碱性电泳缓冲液，电 泳缓冲液的成分随实验的要求不同而改变。 d n a 的迁移依赖于局部电压，为了消除因电压不同而引起的彗星图象不同，s i n g h 在1 9 9 4 年改进了电泳装置，在电泳的过程中用循环装置将电泳液进行循环并在其中加 入自由基清除剂比避免d n a 的额外损伤”“。 染色 单细胞凝胶电泳中荧光染料的选取，主要依据显微镜类型和荧光染料的特性。常用 溴化乙锭( e b ，2 0 m g l ) 、碘化丙啶( p i2 1 5 5 1 0m g l ) 等。 镜检与图像分析 可以直接在显微镜下测量彗星的相关参数，如彗星总长度，然后进行人工分析 f k o b a y a s h i - 1 , 1 9 9 5 1 也可以通过摄影将实验所得到的图像保存下来，存入计算机；实验条 件容许时，可以采用c c d 摄像机直接将图像传输到计算机，在用彗星分析软件分析。 ( 3 ) 单细胞凝胶电泳法的原理 该技术的原理为外界损伤因素造成细胞d n a 断裂时，d n a 的超螺旋结构被破坏，在 裂解液的作用下去除细胞膜和核膜，高盐提取核内的蛋白质和r n a ，使其扩散至裂解液 中，而核d n a 分子由于分子量太大而只能留在原位，形成类核。将类核置于电场中电 泳，受损的d n a 断链和片段向阳极迁移，经荧光染色后，在荧光显微镜下，可见形似 彗星的特征性图像。d n a 损伤越重，产生的彗星尾部长度、面积和荧光强度越大。通 过测量彗星尾部的长度、尾矩等指标，可以对d n a 的损伤进行估计。 ( 4 ) 单细胞凝胶电泳法的指标 目前s c g e 的主要计算指标为形状指标、距离指标、强度指标、“矩”类指标四类， 用于分析其实验结果。 a 形状指标 这是一类比较粗略的指标。根据细胞荧光图像是否像彗星一样头尾分明将其分为彗 星样细胞和非彗星样细胞，计数一定量细胞中彗星样细胞所占的比例，即彗星样细胞发 生率，估计d n a 的损伤程度盯町这种指标可通过镜下观察直接得到，方便实用。 1 9 第二章单细胞凝胶电泳法检测除虫脲残留物对小鼠d n a 分子损伤的研究 彗星样细胞发生率( ) = 彗星样细胞数( 迁移细胞数) x1 0 0 观察的细胞总数 一般每个染毒剂量随机观察大约1 0 0 个细胞，计算出彗星样细胞发生率。 b 距离指标 直接在显微镜下或在照片上测出彗星的一些长度数值，如总彗尾长，即沿电泳方向 “彗星”尾部最远端与头部中心间接的距离；总彗星长度即“彗星”电泳方向上的最大 长度；尾长和头部直径比值等嘲，以评价d n a 损伤程度。这些指标描述电泳中d n a 泳 动的距离，易于测量，无需复杂的仪器设备及图像处理软件。尾长与d n a 链的断裂频 率在一定程度上呈正相关。 i 、彗尾、彗星细胞的分级频数分布 彗尾长度= 总彗星长度一未染毒细胞的类核直径 根据彗尾长度将细胞分为5 级。i 级( 6 0 um ) ：细胞严重损伤，彗尾长，呈 扇型。每个染毒剂量中每一种类型( 分级) 的细胞百分率即为彗星细胞的频数。 i i 、d n a 损伤率 通过拍照放大后测量彗星样细胞的长度( 放大倍数为x4 0 0 或x2 0 0 ) ，计算d n a 损 伤率 实验组平均彗星长度一对照组平均彗星长度 d n a 损伤率= x 1 0 0 实验组平均彗星长度 依据慧星尾部占全部d n a 量的比例判断分为5 级。0 级：无损伤，细胞无拖尾，只 有一个圆形细胞核形成的荧光头，损伤率 c m 就可变化为“尾部惰 性”( t a i li n t e r i a , t i ) ，表示为艺s i d i ) ( i ) ( s h d h 十s t d t ) o 9 ) 其曲线方程如下：为实测值，x 为除虫脲的浓度) t d n a ： y - - 0 5 4 9 8 1 1 7 4 7 x + 2 5 5 5 2 4 x - 8 5 0 7 8 x ( r - - 0 9 9 5 ) 1 r i 二 y = 3 2 2 7 3 9 7 2 4 8 x + 3 1 2 4 7 2 搿一1 1 0 5 3 r ( = o 9 9 9 ) t i v i ： y = 0 0 1 4 5 - 2 1 8 8 9 x + 5 5 3 6 8 x z 一1 9 0 1 3 x 限- - - 0 9 7 4 ) o t m y - - - 0 0 5 8 6 - 2 8 0 1 4 x + 6 5 2 7 8 x - 2 2 2 1 1 x sr 】旷- - - - 0 9 9 9 ) 拟和曲线见5 - 4 、5 - 5 、5 6 图。 _ 一 图5 - 4 ：尾长拟和曲线图 第斤章单细胞凝胶电泳法检测除虫脲光降解产物对小鼠d n a 分子损伤的研究 5 2 2 讨论 h 图5 - 5 ：尾距拟和曲线图 图5 - 6 ：o n i 拟和曲线图 单细胞凝胶电泳是一种评价遗传毒理性损害非常敏感的、应用较为广泛的经典定量 方法，具有快速、简便、所需样品量少、花费少、无需同位素标记和检测限灵敏等特点。 它不仅可探讨已知或未知的化合物的遗传毒性，还用于研究体内相关途径给予化合物的 代谢动力学和剂量一反应关系等，在职业医学中得到广泛的应用如：评价职业有害因素 对d n a 的损伤等。i ) n a 损伤导致的癌变、畸变效应是一种潜在的长期毒性，它给人类带 来的危害远超过农药所致的临床毒性，因此检测农药是否能诱发d n a 损伤具有重要的意 3 1 第可章单细胞凝胶电泳法检测除虫脲光降解产物对小鼠d n a 分子损伤的研究 义。 研究中应用c a s p 彗星图像分析软件，采用尾部d n a 百分含量，彗星尾长、尾矩( 尾 长尾部d n a ) 、0 1i v e 尾矩4 个指标，结果显示除虫脲光降解混合物的主要成份2 ，6 - 二氟苯甲酰胺对小鼠的肝脏细胞d n a 没有明显的损伤作用，但其光降解的混和物对小鼠 的肝脏细胞d n a 损伤作用明显，这表明除虫脲光降解的混合物具有一定的遗传毒性。不 同浓度的除虫脲光降解混合物所导致的d n a 损伤各项指标与浓度的关系经软件 s p s s l 3 0 处理后呈现剂量一效应关系。d n a 的损伤可以导致各种类型的突变，产生致癌、 致畸效应或者其他严