（化学专业论文）二氢叶酸还原酶胸苷合酶的提取及抑制剂筛选研究.pdf

首都师范大学硕士学位论文 摘要 二氢叶酸还原酶和胸苷合酶是d n a 生物合成中的关键酶。因此，这两种酶被广泛用 作包括抗癌、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗疟药在内的许多药物筛选的靶标分子，对其作进 一步研究具有重要的现实意义。本文介绍了二氢叶酸还原酶和胸苷合酶的提取，以及高效 毛细管电泳法在二氢叶酸还原酶反应动力学研究中的应用，包括酶反应动力学参数的测定 及抑制动力学研究。 利用建立的二氢叶酸还原酶抑制剂的高效毛细管电泳法筛选模型，研究了人参皂苷 r 9 3 、三七总皂苷、黄芩苷、木樨草素、表儿茶素、紫杉醇等6 种从植物中提取得到标准 品对二氢叶酸还原酶的抑制作用。研究结果表明，表儿茶素、木樨草素、紫杉醇对二氢叶 酸还原酶有明显的抑制作用。 利用亲和层析法从鸡肝中提取得到了二氢叶酸还原酶，并利用紫外分光光度法测定了 氨甲喋呤和表没食子儿茶素没食子酸酯对提取得到的鸡肝二氢叶酸还原酶的抑制作用。 建立了高效毛细管电泳法对鸡肝二氢叶酸还原酶活力的测定方法及其抑制剂的筛选 模型。通过对产物n a d p 峰面积的定量测定，计算出鸡肝二氢叶酸还原酶的米氏常数。将 己知的氨甲喋呤抑制剂作用于本文所建立的鸡肝二氢叶酸还原酶体系，发现测得抑制剂的 半数抑制浓度与文献值相符，证明该体系可用于二氢叶酸还原酶抑制剂的筛选。 胸苷合酶是胸苷酸生物合成中的关键酶，在快速增殖的细胞中抑制胸苷合酶的活性， 可使d n a 合成受阻，导致d n a 链碎裂，引起细胞死亡，因此被广泛用作抗癌和抗感染病 药物筛选的靶标分子，对其作进一步研究具有重要的现实意义。由于没有商品胸苷合酶出 售，为了进行胸苷合酶的详细研究，我们通过细胞培养的方法，逐步提高培养基中氨甲喋 呤的浓度，驯化出能耐高浓度氨甲喋呤的鼠李糖干酪乳杆菌菌株。发现在耐药菌体细胞中， 胸苷合酶的含量得到了明显增加。 关键词：二氢叶酸还原酶；胸苷合酶；提取；抑制剂；毛细管电泳；动力学；活性 首都师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t d i h y d r o f o l a t er e d u c t a s e ( d h f r ) a n dt h y m i d y l a t es y n t h a s e ( t s ) ，e s s e n t i a le n z y m e sf o rt h e b i o s y n t h e s i so f d n a w e r e c r i t i c a lt a r g e t so f a n t i c a n c e r 、a n t i m i e r o b i a l 、a n t i f u n g a l 、a n t i v i r a la n d a n t i m a l a r i a ld r u g s i nt h i sp a p e r , t h es e p a r a t i o n so f d h f ra n dt sa n dt h ea p p l i c a t i o no f h i l g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ) m e t h o di nt h er e s e a r c ho f k i n e t i c so f e n z y m e r e a c t i o n so f d h f rw o r ei n t r o d u c e d ，i n c l u d i n gt h em e a s u r e m e n to f k i n e t i cp a r a m e t e r so f e n z y m e r e a c t i o n sa n dt h er e s e a r c ho f k i n e t i c so f i n h i b i t o r ya c t i v i t i e s t h r o u g ht h ee s t a b l i s h e da n a l y s i sm o d e lf o rs c r e e n i n go f d i h y d r o f o l a t er e d u c t a s ei n h i b i t o r s ( d h f r i s ) b yh p c e ，t h ei n h i b i t i o n so f d h f ra c t i v i t yb yc a t e c h i n s 、l u t e o l i n 、p a c l i t a x e l 、 b a i e a l i n 、g i n s e n o s i d er 9 3a n dt o t a ls a p o n i n so f p a n a xn o t o g i n s e s e n gw e r es t u d i e d i tw a s f o u n dc a t e c h i n s 、l u t c o l i na n dp a c l i t a x e lc o u l dm a r k e d l yi n h i b i td h f r d h f rw a ss e p a r a t e df r o mc h i c k e nl i v e rb ya f f i n i t yc l l r o m a t o g r a p h y t h ei n h i b i t i o n so f d h f r a c t i v i t yb ym e t h o t r e x a t ea n d ( 一) e p i g a l l o c a t e c h i ng a l l a t ew e r es t u d i e db yu l t r a v i o l e t s p e c t r o p h o t o m a t r y an e w a s s a yo f c h i c k e nl i v e rd h f ru s i n gh p c eh a sb e e ne s t a b l i s h e d t h er e a c t a n t sa n d r e s u l t a n t sw e r es e p a r a t e di na b o v ec o n d i t i o n s am e t h o d w a sd e v e l o p e dt od e t e r m i n ek i n e t i c s p a r a m e t e r so f c h i c k e nl i v e rd h f rb ym o n i t o r i n gi t sp r o d u c t ，n a d p b yd e t e r m i n i n gt h ea c t i v i t y o f d h f r i s ，i tw a sf o u n dt h a tt h e1 c 5 0o f m e t h o t r e x a t em a t c h e dt h ev a l u e sh a db e e np u b l i s h e d ， a n dt h i sm e t h o dc o u l db eu s e df o rt h es c r e e n i n go fa n t i c a n c e rd r u g s b yg r a d u a l l yi n c r e a s i n gt h ec o n c e n t r a t i o no f m e t h o t r e x a t ei nt h ec u l t u r em e d i u m ， m e t h o t r e x a t e - r e s i s t a n ts t r a i n so f l a c t o b a c i l l u sc a s e iv a t , r h a m n o s u sw a so b t a i n e d e x t r a c t so f m e t h o t r e x a t e - r e s i s t a n t 三c a s e ip r o v i d ear i c hs o u r c 君o f t s ，s h o w i n gh i g h e l a e t i v i t yt h a nw h i c h f o u n di ne x t r a c t so f t h es e n s i t i v es t r a i n k e yw o r d s ：d i h y d r o f o l a t er e d u e t a s e ；t h y m i d y l a t es y a t h a ；s e p a r a t i o n ；l n h i b i t o r s ；c a p i l t a r y e l e c t r o p h o r e s i s ；k i n e t i c s a c t i v i t y 英文缩略语对照说明 缩略语英文全称中文全称 p o l y o x y e t h y l e n e - 2 , 3 一l a u r y l e t h e r 聚氧乙烯月桂醚 n 5 ，n 1 0 - m e t h y l e n e t e t r a h y d r o f o l a t e n 5 ，n l o 亚甲基四氢叶酸 d i h y d r o f o l a t er e d u c t a s e二氢叶酸还原酶 d i h y d r o f o l a t er e d u c t a s ei n h i b i t o r二氢叶酸还原酶抑制剂 2 - d e o x y t h y m i d i n e - 5 - m o n o p h o s p h a t e 2 - 脱氧胸苷一5 _ 一磷酸 2 - d e o x y u r i d i n e - 5 一m o n o p h o s p h a t e 2 - 脱氧尿苷- 5 - 一磷酸 ( - ) - e p i g a l l o c a t e c h i ng a l l a t e 表没食子几茶素没食子酸酯 f o l i c a c i d 叶酸 d i h y d r o f o l i ca c i d二氢叶酸 t e t r a h y d r o f o l i ca c i d四氢叶酸 f l u o r o u r a c i l 氟尿嘧啶 l l i g hp e r f o r m a n c ec a p m a r ye l e c t m p h o r e s i s高效毛细管电泳 i n h i b i t o rc o n c e n t r a t i o n5 0半数抑制浓度 l a c t o b a c i l l u sc a s e iv a lr h a m n o s u s鼠李糖干酪乳杆菌 m e t h o t r e x a t e 氨甲喋岭 n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d ep h o s p h a t e 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸 n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d ep h o s p h a t e ，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 r e a u c e mf o r m磷酸还原型 p h o t o d i o d ea r r a y二极管阵列 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十六烷基硫酸钠 t r i m e t h o p r i m甲氧苄胺嘧啶 t h y m l d y l a t es y n t h a s e胸苷合酶 邺一一一一一一队眦肌砌一脚一一 一 嗽泌咖12 首都师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰 写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 凛姻旱 1 日期：) 哪7 年6 月哆日 首都9 币范大学学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。 学位论文作者签名：焉；蜘 日期：加7 年占月侈日 首都师范大学硕士学位论文 第一章二氢叶酸还原酶胸苷合酶体系研究概述 二氢叶酸还原酶( 5 ，5 ，7 ，8 四氢叶酸：n a d p + 氧化还原酶，d i h y d r o f o l a t er e d u c t a s e ， d h f r ，e c1 5 1 3 ) 和胸苷合酶( 5 ，l o 亚甲基四氢叶酸：尿嘧啶脱氧核苷酸c 甲基转移酶， t h y m i d y l a t es y n t h a s e ，t s ，e c 2 1 1 4 5 ) 是胸苷酸生物合成中的关键酶，而胸苷酸生物合 成是d n a 合成所必需的。抑制这两种酶可以破坏胸苷酸循环，导致d n a 链碎裂，细胞死 亡。因此，这两种酶广泛用作癌症药物筛选的靶标分子。近年来，又发现d h f r 和t s 是 有价值的抗感染病的靶标分子，可以作为包括抗菌、抗真菌、抗病毒、抗疟药在内的许多 药物的靶标，对其作进一步研究具有重要的现实意义。 1 1 基本性质及催化机理 d h f r 是一个不含二硫键的单体酶，分子质量较小，不同来源的酶分子质量约为2 2k d 左右。d h f r 是叶酸代谢中的一个关键酶，因而对于胸苷酸合成也非常重要【l 。它在胸 苷酸生物合成中的作用是以n a d p h 为辅因子，将二氢叶酸( d i h y d r o f o l a t e ，f h 2 ) 还原为 四氢叶酸( t e t r a h y d r o f o l a t e ，f i - h ) 。f 1 4 亚甲基化形成n 5 ，n 1 0 亚甲基四氢叶酸 ( n 5 ，n 1 0 - m e t h y l e n e t e t r a h y d r o f o l a t e ，c h 2 t h f ) ，作为一碳单位供体参与到t s 催化的反应中 去 3 1 。t s 是种叶酸依赖性酶，由两个相同的亚基构成，每个亚基的分子量为3 6 k d a l 4 1 。 其催化的反应主要为在细胞内以c h 2 t h f 作为辅因子，催化生物体内的2 - 脱氧尿苷一5 ，- 一磷酸( 2 - d e o x y u r i d i n e - 5 - m o n o 曲o s p h a t e ，d u m p ) 还原甲基化形成2 - 脱氧胸苷一5 一一 磷酸( 2 d e o x y t h y m i d i n e - 5 - m o n o p h o s p h a t e ，d t m p ) 1 5 1 。d t m p 进一步在细胞内代谢为脱 氧胸苷三磷酸( d t t p ) ，d t t p 为d n a 合成所必需的前体物质。在快速增殖的细胞中抑制 d h f r 和t s 的活性，可使d n a 合成受阻，引起细胞死亡【6 】。因此，多年来d h f r 和t s 一直是肿瘤化学治疗的重要靶标。 首都师范大学硕士学位论文 宫 霄 臆y 1 2 来源及提纯 弋j 9 0 2 h r 一 掰r 礴矿刚 r ，洲f r 图1 d h f r 和t s 的催化机理 f i g u r e 1 t h er e a c t i o n sc a r r i e do u tb yd h f ra n dt s 对d h f r 和t s 的性质等进行详细研究需要大量的酶。d h f r 和t s 的来源有很多，可 以从鸡肝【7 引、老鼠皮肤【外、噬菌体t 4 10 1 、干酪乳杆菌哺，叭、l 1 2 1 0 细胞【8 川1 2 1 、埃希氏 大肠杆菌【1 3 】、h a m s t e r ( 东欧或亚洲产的大颊的鼠类) 细胞1 4 】、小牛肝脏等不同的来源 处提纯得到d h f r ；从埃希氏大肠杆菌1 1 6 】，小牛胸腺旧，粪链球菌【t 8 】，慢性骨髓白血病白 细胞【1 9 1 ，小鸡胚胎【2 0 1 ，t - 偶数噬菌体，e h r l i c h 腹水癌细胞【2 2 捌中可以纯化得到的t s 。 但是，细胞和组织中的t s 含量极低，很难得到纯酶蛋白，只有在表达体系中才能得到大 量的t s 。c r u s b e r g 等坡现在耐二氯氨甲喋呤的鼠李糖干酪乳杆菌细胞中，t s 的量增加 了1 0 0 倍。d u n l a p 等【2 5 】仅以氨甲喋呤代替二氯氨甲喋呤，以相同的方法从干酪乳杆菌细胞 中得到t s 的量增加了近2 0 0 倍，同时还得到了大量d h f r 。近年来，人们又利用基因表 达技术分别从埃希氏大肠杆菌抓2 7 2 鲥、枯草芽胞杆斟2 8 埤表达载体中得到了大量的t s 。 4 孓箕 首都师范大学硕士学位论文 由于d h f r 和t s 在细胞和组织中含量很少，用传统的蛋白纯化方法往往费时费力， 而且只能提纯得到的极少量的酶蛋白。而亲和层析对目标蛋白有较强的特异性吸附，亲和 介质的配基可以是该酶的抑制剂、辅酶或底物。 在d h f r 纯化中应用最广泛的亲和配基是氨甲喋呤( m e t h o t r e x a t e ，m t x ) 。m t x 是 d h f r 的一种抑制剂，与不溶性的支持物，如a g a r o s e 、s c p h a r o s e 共价结合，可有效地特 异吸附酶蛋白。k a u f m a n t l 5 1 等利用m t x - a t - a g a r o s e 亲和层析从鸡肝和小牛肝脏中提纯 d h f r ，回收率可达5 0 左右。蝶酰赖氨酸( p t e r o y l l y s i n e ) 也可以用作纯化d h f r 的亲和 层析介质的配基，蝶酰赖氨酸是一种叶酸结构类似物，它是底物而非抑制剂，对d h f r 有 适度的亲和作用，可以在非常温和的条件下将酶洗脱下来，酶活力回收率较高，而且亲和 介质的配基损失也少，不会对接下来的酶的研究产生影响【2 9 j 。 在t s 纯化中广泛应用的是n 1 0 - f o n n y l 5 ，8 d i d e a z a f o l a t es e p h a r o s ec l - 6 b 亲和层析。 r o d e 等 3 0 l 将老鼠白血病l 1 2 1 0 细胞超声破碎及硫酸铵沉淀后，以上述亲和层析介质纯化 两次，每次亲和层析后都以d e a e 一纤维素层析浓缩样品，从而提纯得到t s ，回收率为2 5 。 c i e s l a 等用同样的纯化程序从绦虫及其寄生的鼠肝中得到纯化的t s ，回收率分别为9 4 和7 5 。 1 3 酶活力检测方法 在生物体外，最简单、最广泛应用的酶活力测定方法是分光光度法。 d h f r 活力可按m a t h e w s 等的方法进行测定。测活体系中包含：d h f r 、p h 7 5 的 磷酸盐缓冲溶液、2 一巯基乙醇、f h 2 以及n a d p h 。在2 5 c 下用分光光度计监测测活体系 在3 4 0 h m 处吸光度值( 也4 0 ) 的降低。一个单位的酶活力定义为在该测定条件下，l m i n 还 原l 州f h 2 所需的酶量。综合考虑n a d p h 的氧化和f h 2 的还原，摩尔消光系数为 1 2 3 0 0 m - l c l n l 【3 3 1 。 t s 活力可按w a h b a 等【3 4 】的方法进行测定，测活体系中包含：t s 、p h 6 8 的磷酸盐缓 冲溶液、c h 2 t h f 、d u m p 。保持3 0 c 恒温，监测测活体系中不加d u m p 时a 3 柏的变化； 然后加入d u m p ，记录a 3 柏的变化。经过修正，减去不加d u m p 时的4 3 4 0 的变化后，通过 爿3 4 0 变化的净值与3 4 0 n t o 处的摩尔消光系数6 4 x1 0 3 m 1 c n l l 来计算酶的速率。一个单位的 酶活力定义为在本条件下，l m i n 合成l u m 胸苷酸所需的酶量。 首都师范大学硕士学位论文 一种更灵敏、但不太便利的测定t s 活力的方法是监测生成d t m p 时5 3 h d u m p 释放 到溶剂中的氚。通常，核苷被吸附在一个固体介质上。如活性炭，测定水中的放射性。这 种方法极灵敏，检测限可达1 0 4 u m gt s 活力。一个更方便准确的，但灵敏度降低了的测 定氚释放的方法是监测溶剂蒸发后2 - b c ，3 h d u m p 的3 h h c 比值。因为t s 也催化d u m p 的5 一h 与溶剂的缓慢交换，证实氚的损失是由于d t m p 的形成非常重要。这通过h p l c 分 离【2 - 1 4 c , 3 h d u m p 和【2 1 4 c d t m p 和定量同位素可以很轻松地完成f 碉。 1 4 抑制剂及其筛选 l 4 1 d h f r 抑制剂 d h f r 抑制剂通常是与其底物f h 2 具有类似结构的化合物，因此可以竞争性结合酶蛋 白，抑制f h 2 参加酶反应。此类抑制剂被称为叶酸拮抗剂。主要有氨甲喋呤、三甲氧喋呤、 乙胺嘧啶及环氯胍等，结构式见图2 。 氨甲喋呤与d h f r 的亲和力比f h 2 强1 0 0 0 倍，在细胞内跟f i t 2 竞争性地与d h f r 结 合( 3 6 1 。m t x 在体内经聚谷氨酰化后不易逸出细胞外，不易和d h f r 离解，能增加抗肿瘤 作用。m t x 不仅抑制d h f r ，也抑制t s ，对所有细胞的核酸代谢产生致命作用【3 7 1 ，主要 作用于d h f r ，效用较好，已用于i 临床。适用于各类型急性白血病、绒毛上皮癌和恶性葡 萄胎，对头颈部肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、消化道癌和恶性淋巴癌也有一定效用。然而，现 发现肿瘤细胞对m t x 耐药。产生的耐药性的原因可能是多方面的：m t x 主动运转机制受 损；m t x 同d h f r 的亲合力下降；m 聚谷氨酰化下降；d h f r 产出增多。 三甲氧喋呤( t r i m c t r e x a t e ，t m t x ) 为亲脂的m t x 衍生物，是一种非典型的叶酸拮 抗剂，其作用机理与m t x 相似。因无谷氨酸，在细胞内不会聚谷氨酰化，不依赖叶酸正 常的载体转运，可通过被动扩散进入细胞内，克服了因透过性降低导致的抗药性。 二氨嘧啶类药物三甲氧苄氨嘧啶( t f i m e m o p r i m ，t m p ) 、二甲氧苄氨嘧啶( d i a v e r i d i n e ， d v d ) 和二甲氧甲基苄胺嘧啶( o r m e t o p r i m ，o m p ) 是合成的广谱抗菌药，可以抑制d h f r ， 有抗菌作用，乙胺嘧啶( p y r i m e t h a m i n e ，p y i ) 是目前用于病因性预防的首选抗疟药。磺 胺类为二氢叶酸合成酶抑制剂，二氨嘧啶类药物与其合用，就同时阻断了细菌叶酸形成的 两个环节，能够增强磺胺类药物和抗生素的抗菌效果，称抗菌增效剂。溴奠普林 ( b r o d i m o p r i m ) t m p 的衍生物，具有抑制d h f r 及广谱抗菌作用，1 9 9 3 年已在国外上市， 6 首都师范大学硕+ 学位论文 该药抗菌机制与t m p 相似，但抗菌谱比t m p 广，且毒性比t m p 低，受到医药界的重视。 环氯胍( c y d o g u a n i l ) 通过选择性地抑制疟原虫的d h f r 而产生抗疟作用。然而d h f r 基因点突变使恶性疟原虫对环氯胍产生耐药性。 嘲鼢科心。 m e t h o t l e x a t e o m e o m e 0 m b yn h q o m e 。w 诞。v ： t l 缸e 打e x a t e b ，l 恤e m a m 虹et r l m e t h o p s h n c y d o 删m i l 图2 d h f r 抑制剂 f i g u r e 2 n b j b j t o r so f d h f r 另外，近年来人们从许多天然植物中提取得到了对d h f r 有抑制作用的物质。从印度 药用植物a l a n g i 啪l 锄a r c l 【i 冲提取得到的植物碱d e o x y t i l b u l o s i n e ( d t b ) ，可以有效地抑制 赖氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sl e i c h m a n n i i ) 细胞的生长及细胞i 为d h f r 的活力( i e 5 0 分别为4 0 a n d3 0m m ) 【3 引。绿茶多酚的予结构和m t x 结构相近，对d h f r 也有抑制作用，抑制作用 i ：i ：m t x 弱，但对健康细胞副作用也比较小。 1 4 2t s 抑制剂 结构上与d u m p 或c h 2 t h f 类似的化合物都有可能被发展成为t s 的抑制剂，按照化 学结构可分为两大类：一类是5 一氟尿嘧啶及其衍生物；另类是以r a l f i t r e x e d 为代表的叶 酸结构类似物。这些结构上与底物或辅因子类似的化合物被称为经典抗代谢物【3 9 】。它们可 以阻止底物或辅因子与t s 活性位点结合，从而干扰d t m p 的合成。但是经典抗代谢物的 结构与天然代谢物的结构非常类似，通常选择性较差，而且容易产生耐药性，其应用受到 很大限制【柏l 。因此，近年来研究的兴趣正逐渐转向非叶酸类似物抑制剂。 7 首都师范大学硕士学位论文 1 4 2 1 5 - 氟尿嘧啶及其衍生物 氟尿嘧啶( f l u o r o u r a c i l ，f u ) 化学名为5 氟2 ，4 ( 1 h ，3 h ) 一嘧啶二酮( 5 f l u o r o 2 ， 4 ( 1 h ，3 h ) - p y r i m i d i n e d i o n e ) ，又名5 氟尿嘧啶( 5 f u ) 。是目前唯一应用于常规临床治 疗的以t s 为靶标的抗癌试剂。它在体内经过代谢转化为f d u m p ，与t s 和c h 2 t h f 形成 一个稳定的三元络合物，使反应不再迸一步进行。抗肿瘤谱比较广，对绒毛膜上皮癌及恶 性葡萄胎有显著疗效，对治疗结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、头颈部癌等有效，是治疗 实体肿瘤的首选药物。不幸的是，许多癌症对5 f u 不敏感，或者逐渐产生了抗药性；另 外，该化合物毒性较高，可引起严重的消化道反应和骨髓抑制等副作用。人们在继续寻找 特异性更强且毒性更低的核苷类似物，最近的进展集中在c 5 、0 2 、0 4 的取代物上。为降 低毒性，提高疗效，研制了大量的5 f u 的衍生物。主要包括替加氟( t e g a f u r ) 、双呋氟尿 嘧啶( d i f u r a d i n ) 、去氧氟尿苷( d o x i f l u r i d i n e ) 、卡莫氟( c a n n o f u r e ) 。 1 4 2 2 叶酸结构类似物 许多抑制剂设计集中在c h 2 t h f 的类似物上。它们包含一个与天然叶酸相同的苯甲酰 l 谷氨酸侧链，能被叶酸聚y 谷氨酸酯合成酶( f p g s ) 聚谷氨酰化，这增加了他们的在 细胞内浓度以及与酶的亲和性【n , 4 2 1 。尽管一些经典叶酸拮抗剂的聚谷氨酰化对于细胞毒性 是必需的，但同时这意昧着可能对宿主细胞也有毒性，而且f p g s 水平降低会引起耐药性。 另外一个与经典叶酸拮抗剂有关的问题是它们依赖一个还原性的叶酸载体系统进入细胞。 载体系统受到损伤也会引起耐药性【4 3 1 。 第一个广泛研究的此类抑制剂是c b 3 7 1 7 ( p d d f ) ，它对t s 显示了n m 级的抑制，但 由于水溶性差，因而对肾脏有相当的毒性】。z d l 6 9 4 ( t o m u d e x ，r m r a l t i t r e x e d ) 是c b 3 7 1 7 的一个结构类似物，对喹唑啉和p 氨基苯酸部分进行了修饰，它的水溶性较好，在有机体 内更容易聚谷氨酰化，从而增加了停留的时间，在保持了化合物较强的的抑制活性的同时 改善了其药理学性质【4 5 舯，4 刀，在治疗结直肠癌的临床治疗中很有效。z d 9 3 3 1 由于y 位置 的四唑基团而不发生聚谷氨酰化【4 8 1 。l y 2 3 1 1 4 5 ( a l i m t a ，t m p e m e 仃e x e d ) 是一种多靶向抗叶 酸药，可抑制多种叶酸依赖性酶而发挥抗肿瘤作用。抗肿瘤谱广，对多种实体瘤疗效确切， 但毒性较大，在补充叶酸后毒性显著减少。与顺铂( c i s p l a t i n ) 联用可以治疗恶性胸膜间皮 瘤，与其他化疗药物联合仍在研究中。b w l 8 4 3 u 8 9 在n m 以下的浓度即可对t s 产生抑制， 而且毒性比其他叶酸拮抗剂都低f4 2 】。 首都师范大学硕士学位论文 。猢* j k t 0 a 柳 n 1 - a m e t h y l e u t e t r a h y d r o f o l a t eb w l 8 4 3 u 8 9 哪奄扩。p 舯鼍c n 2 州焱广的轴毫 蜊触”f _ 蓉岍如哟期吾c o o 。 图3 经典叶酸拈抗剂 f i g u r e 3 c l a s s i c a la n t i f o l a t e s 1 4 2 3 非叶酸类似物抑制剂 非叶酸类似物抑制剂( n o n a n t i f o l a t e a n a l o g u ei n h i b i t o r s ，n a a i s ) 化合物的结构与叶 酸无关，却有着与叶酸拮抗剂同样的抑制活性，而且克服了叶酸拮抗剂通常具有的耐药性， 已经越来越引起人们的重视。许多有非经典叶酸结构的抑制剂被研制出来。a g 3 3 7 ( t h y m i t a q ) 是第一个达到临床试验阶段的非经典t s 抑制剂【4 9 1 ，是脂溶性的化合物，不 发生聚谷氨酰化。临床研究已证实其对肝癌、头颈癌、子宫直肠癌及非小细胞肺癌等多种 实体瘤有较好临床疗效。a g 3 3 1 也已经进入临床试验阶段1 5 0 l 。 a g 3 3 i a g 3 3 7 图4 a g 3 3 1 和a g 3 3 7 f i g u r e4 a g 3 3 1a n da g 3 3 7 9 首都师范大学硕士学位论文 c o s t i 等【5 1 】对一系列酚酞和萘的衍生物以及丹磺酰衍生物进行了研究，发现这些化合物 与c h 2 t h f 竞争性地结合t s 而产生抑制作用。这些化合物对干酪乳杆菌t s ( 厶 t s ) 、埃 希氏大肠杆菌t s ( e c t s ) 以及人t s ( h t s ) 的抑制活性彼此相差很大，尤其是化合物3 ，3 双( 3 氯- 4 - 羟苯基) - l h ，3 h 一萘酚【l ，8 - c ，d 1 吡喃1 酮对l c t s 比对h t s 的抑制强6 0 倍之多。 随后他们又研究了一系列邻位卤素取代的萘衍生物，其中除了碘取代物的活性较弱外，其 他化合物对t s 的表观抑制常数( 面) 为o 7 7 0 1 x m ，但所有的化合物对人t s 的抑制都非 常弱【4 9 】。这为研制能有效抗菌而不会伤害人体的新型抗菌药提供了思路。 另外，人们还合成了一系列喹喔啉类化合物吲以及2 - 氨基4 氧5 ( 取代苯基) 硫基 吡 咯【2 ，3 - 棚嘧啶类化合物【5 3 1 ，从中筛选出t s 的抑制剂，其中的一些化合物对d h f r 也具有 抑制活性。 1 4 3 抑制剂筛选方法 用作药物的抑制剂筛选模型可以是个体水平、组织水平、细胞水平和分子水平。 个体水平的筛选可以从整体水平直观地反应出药物的治疗作用、不良反应以及毒性作 用。但筛选过程主要依赖于手工操作，而且只能对有限的样品进行筛选，特别是人类目前 在实验动物身上复制出的病理模型还十分有限，使用整体动物模型筛选新药具有显著的局 限性、低效率和高成本等不足之处。 组织水平的筛选是通过观察药物对特定组织或器官的作用，可以分析药物作用原理和 可能具有的药理作用。但规模小，效率低，反应药物作用有限，对样品的需求量仍然较大， 不易实现一药多筛。此外，人工操作技术要求高等也是影响其在药物筛选中应用的主要原 因之一。 细胞水平的筛选是基于化合物与细胞的作用来进行药物筛选的方法，需要专门的技术 和技能，且只能够反映出药物对细胞生长等过程的综合作用，不能反映药物作用的具体途 径和靶点。k o t h a p a l l i 3 8 1 使用配有红滤镜的k l e t ts u m m e r s o n 色度计测定细胞培养液的浊度 以确定细胞的生长情况，用该方法测定了植物碱d e o x y t u b u l o s i n e ( d t b ) 对赖氏乳杆菌细胞 生长的抑制作用，i c 5 0 为4 0m m 。a r v i n d 【蚓通过以下测定胞内a t p 的含量和 3 h 】胸苷含量 的上升这两个生化参数，测定了依匹普林( e p i r o p r i m ) 单独使用以及和氨苯砜( d a p s o n e ) 、 溴莫普林( b r o d i m o p r i m ) 联用时对够阳d 知c f e r f “埘l e p r a e 细胞的抑制作用。 l o 首都师范大学硕士学位论文 分子水平的抑制剂筛选模型是高通量药物筛选使用较多的模型，采用与某种疾病有关 且功能已知的生物靶分子( 酶、调节蛋白、生物活性分子等) ，筛选与靶分子有相互作用 的化合物或天然植物的提取物，是一种针对机理的药物筛选方法。其优点是直接、快速和 较为简便、易于发展为高通量药物筛选平台，是高通量药物筛选生物芯片的开发基础。许 多药物筛选模型以酶作为靶标，通过检测药物对酶活性的抑制来观察二者之间的相互作 用。酶反应的底物、产物都可以用作检测指标，并可由此来确定酶反应速度。目前药物筛 选模型采用的检测方法有重复扩增法、w e s tb l o t t i n g 、荧光标记酶联免疫以及紫外吸收法 等方法。 目前d h f r 和t s 的抑制剂筛选多采用紫外分光光度法，操作简便但灵敏度较低。近 年来，随着现代仪器的快速发展，出现了许多新的抑制剂筛选方法，如荧光法、毛细管电 泳法、高效液帽法等。 安会梅5 如建立了用荧光光度法测定d h f r 活力的体系，并应用于了抑制剂的筛选。 n a v a r r o 等划通过荧光猝灭( f 1 u o r 船c e n c eq u e t l d 勘g ) 和停留荧光计( s t o p p e d - n o wf l u o r i m e t r y ) ， 基于荧光滴定、过渡态及稳态动力学研究的实验数据证实表没食子儿茶素没食子酸酯 【( - ) e p i g a l l o c a t e c h i ng a l l a t e ( e g c g ) 】及表儿茶素没食子酸酯【( - ) 一e p i c a t e c h i ng a l l a t e ( e c g ) 】与 二氢叶酸竞争性与牛肝脏d h f r 结合，抑制常数蜀分别为1 2 0 和8 2 r i m 。 贾蕊【5 7 1 等建立了一种毛细管电泳法测定d h f r 反应动力学参数的新方法。以含o 0 0 2 b 哟一3 5 的p h 9 1 85 0 m m 的硼砂缓冲溶液作为电泳介质，检测波长2 8 0 n m ，1 8 分钟内实 现了酶、底物及反应产物的基线分离。通过研究在酶反应过程中反应物和反应产物的浓度 变化，来计算有关反应动力学参数。将已知的m t x 、t m p 和叶酸三种抑制剂作用于所建 立的二氢叶酸还原酶体系，测得抑制剂的半数抑制浓度与文献值相符，证明该体系可用于 d h f r 抑制剂的筛选。 k e n j ia i s o 5 8 1 通过配备了电化学检测器的高效液相色谱检测反应生成的f f h 的浓度测 定d h f r 活力，可检测反应体系中低于l n m 的f h 4 ，比常用的分光光度法低了近1 0 0 倍。 t s 3 5 】和d h f r t 5 9 】抑制剂的筛选还可以采用同位素示踪法，灵敏度较高但操作繁琐。 1 5 小结与展望 综上所述，对d h f r 和t s 作进一步研究将有助于深入了解现有药物的耐药性机制 l l 首都师范大学硕士学位论文 为新型抑制剂的研究提供新的思路，为获得新型药物打下基础。同时，采用现代分析和分 离手段，建立更加简便、快速、有效的药物筛选模型，并将其用于化学合成药物和天然植 物提取物中有效成分的筛选中，对以d h f r 和t s 为靶标酶的药物的研制具有重要的现实 意义。 1 6 本研究主要内容 本文对d h f r 和t s 的提取进行了研究。由于商品d h f r 活力较低且价格昂贵，本文 参照k a u f i n a n “。等的方法，对提取步骤进行了适当改进，利用m t x - a t - a g a r o s e 亲和层析 从鸡肝中提取得到了d h f r 。由于没有商品t s 出售，为了进行t s 的详细研究，我们通过 细胞培养的方法，逐步提高培养基中m t x 的浓度，驯化出能耐高浓度m t x 的鼠李糖干酪 乳杆菌菌株。发现在耐药菌体细胞中，t s 的含量得到了明显增加。 本文还对d h f r 反应动力学性质进行了详细研究。利用已建立的d h f r 抑制剂的高效 毛细管电泳法筛选模型【5 7 1 ，研究了黄芩苷、木樨草素、紫杉醇、表儿茶素、人参皂苷r 9 3 、 三七总皂苷等6 种从植物中提取得到标准品对d h f r 的抑制作用。研究结果表明，表儿茶 素、木樨草素、紫杉醇对d h f r 有明显的抑制作用。木樨草素和紫杉醇对d h f r 的抑制作 用未见报道。 利用紫外分光光度法测定了m t x 和e g c g 对亲和层析提取得到的鸡肝d h f r 的抑制 作用。建立了高效毛细管电泳法对鸡肝d h f r 活力的测定方法及其抑制剂的筛选模型，通 过对产物n a d p 峰面积的定量测定，计算出鸡肝d h f r 的米氏常数。将已知的m t x 抑制 剂作用于本文所建立的鸡肝二氢叶酸还原酶体系，发现测得抑制剂的半数抑制浓度与文献 值相符，证明该体系可用于二氢叶酸还原酶抑制剂的筛选。 1 2 首都师范大学硕士学位论文 参考文献 【1 】b l a n e y jm ，h a n s c hc ，s i l i p oc ，v i t t o r i a a c h e m r e v , 1 9 8 4 ，8 4 ：3 3 3 - - 4 0 7 【2 】s e l a s s i e c d ，k l e i n t e c o m p a r a t i v e q s a t a y l o r & f r a n c i s ，l o n d o n , 1 9 9 7 【3 g i l b e r tih b i o e h i m i c ae tb i o p h y s i e aa c t a ，2 0 0 2 ，1 5 8 7 ：2 4 9 2 5 7 【4 卓丽娟福建医科大学学报，2 0 0 2 ，3 “2 ) ：2 3 0 - 2 3 8 【5 c a r r e r a scw e ta 1 a a h t lr e vb i o c h e m , 1 9 9 5 ，6 4 ：7 2 1 【6 】阎松，牛荣丽，c h ue d w a r d ，林秀坤细胞生物学杂志，2 0 0 5 ，2 7 ：1 0 5 1 0 8 7 k a u f m a n bt p i e r c e j vb i o c h e m b i o p h y s r c s c o m m u n ，1 9 7 1 ，4 4 ：6 0 8 8 w h i t e l e yjm ，j a c k s o nrc ，m e l lgp e ta 1 a r c h b i o c h e m b i o p h y s ，1 9 7 2 ，1 5 0 ：1 5 【9 1 n e w b o l dpch ，h a r d i n gn g lj b i o c h e m ，1 9 7 1 ，1 2 4 ：l 【1 0 e r i c k s o njs ，m a t h c w sci cb i o e h e m b i o p h y s r e s c o m m u n ，1 9 7 1 ，