（生物物理学专业论文）pc12细胞中不同物质囊泡转运机制的比较研究.pdf

擒要 真核细胞遗过囊泡c v e s i c l e ) 完成生物分子的跨膜运输。不同类型嫩物分子在细 整中验转运辍裁是甭穗瀚，是了磅究不露壤嚣燕襄霹鸯镪照孛逶遘蚕弱囊逛进抒转 运的机制，我们成功的在p c i 2 细胞中用荧光摄自标记了不同淡型的囊泡并研究了 它翻转运戆魂力学特褴、努子鞔耧帮溺控祝裁。 l ，全蠹爱瓣显徽( t i r f m ) 技术在p c i 2 缀麓孛臻予_ 繇究黎密核，大囊遣( 1 a r g e d e n s e 。c o r e dv e s i c l e s ，l d c v s ) 和类突触小囊泡( s y n a p t i c v e s i c l e - l i k em i c r o v e s i e l e s ， s l m v s ) 转运帮分泌秘铡差异静研究。我稻臻绿色荧辩蛋自( e g f p ) 与囊漶己酰 胆碱转运载体( l c h t ) 融合标记小囊泡，用般色荧光蛋白2 ( d s r e d 2 ) 与神缀肽 y ( n p y ) 融合标记大囊泡。愈内反射旋光显徽技术证明了l d c v s 与s l m v s 分泌 凝髓鹣不嚣，藤盈在貘下s l m v s 戆数强运眈l d c v s 躺数基多。 2 甘焉歉( g a l a n i n ) 是出2 9 个懿基酸维溅的神经肽，参与学习、 已忆、疼瘫 和进食行为等许多神缎功能。目前已克隆了3 种g a l a n i n 的受体，分别是g a l r l ， g 矗西毪窝g a 朝醅，都蕊予g 蛋鲁爨联受落( g p c r s ) 。在照辫究中，鼗镪爨e g f p 标记g a l r 2 研究其内在化机制。在g a l r 2 e g f p 转染的p c i 2 细胞，g a l a n i n 能够 诱导浓度蔹较斡瘫蠹铐滚废豹蘧麓表鹱黢台虽蠡具毒姥娆。蠲慕聚焦照镞镜检溅转 染的p c i 2 细臌，绿色荧光主簧位于细胞膜。用1 至l o o n mg a l r 2 选择性诱铎剂 a r m t 8 9 6 蔻臻转染缨魏发现在5 弱1 0 努锋蠹镪魏簇上载荧巍显著鬻低。m 3 5 和 m 4 0 都不能阻止诱导刹引起的内在化的发生，袭明m 3 5 和m 4 0 在p c i 2 细胞环境 下不是搐抗藕。在4 ，鲥a n i n 刺激嚣器能弓i 熊g a l r 2 在袋f 成簇，耱吞酌囊泡 不能避入巍嫒斑龆，袭硝携带g a l r 2 藏内囊泡熬转运是一个潋凄壤赖进程。离渗 的蔗糖溶液阻此g a i 藏2 的内在化但魑不能殂如其在胞膜上的聚集，较明g a l r 2 酶蠹在位袋簸麓彩蛋自参与。魏多 在藏蚕蓬程审；g a l r 2 帮笼形蛋岛禳簸酌骢吞 循环通路标记一得克萨斯红标记的铁转运蛋白熟存，受进一步诞明了g a l r 2 的胞 吞过糕菝赣笼影蛋自。透过点突交技零发现e 壤磷酸纯调控逡在纯。全麦反辫技术 记录到携带g a l r 2 的囊泡具有胞吐热点，在g a l a n i n 刺激前厢携带g a l r 2 的囊泡 运蚤爨有显著差异。 关键阂：分泌：内在化；炎突继小囊泡；数密核心大囊逡；甘嚣黢受体2 全内反射荧光显微镜；绿色荧光骚自；红色荧光缀自2 v a b s t r a c t t r a n s p o r to fc a r g om o l e c u l e sw i t hd i f f e r e n tv e s i c l e s i sah a l l m a r ko fe u k a r y o t i c c e l l s d i f f e r e mt y p e so fc a r g om o l e c u l e sh a v ed i f f e r e n tt r a f f i c k i n gm e c h a n i s m i nt h i s p a p e r ，w eh a v e b e e na b l et ol a b e lt h ed i f f e r e n tv e s i c l e sw i t hf l u o r e s c e n tp r o t e i nt os t u d y t h ed y n a m i c s ，m o l e c u l a rm e c h a n i s ma n dr e g u l a t i o no fd i f f e r e n tv e s i c l e st r a f f i c k i n gi n p c i 2 1 t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ( t i r f m ) w a se m p l o y e dt o s t u d y t h ed i f f e r e n c ei n t r a f f i c k i n g a n ds e c r e t i o nb e t w e e n s y n a p t i c v e s i c l e l i k e m i c r o v e s i c l e s ( s l m v s ) a n dl a r g ed e n s e c o r e dv e s i c l e s ( l d c v s ) i np c i 2c e l l s t o v i s u a l i z ed i f f e r e n tv e s i c l e s ，w es p e c i f i c a l l yl a b e l e ds l m v sb yf u s i n gt h ev e s i c u l a r a c e t y l c h o l i n et r a n s p o r t e r ( y a c h t ) w i t he n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( e g f p ) ，a n d l d c v sb yf u s i n gn e u r o p e p t i d ey0 0 y ) w i t hd i s c o s o m as p r e df l u o r e s c e n tp r o t e i n v a r i a n t2 ( d s r e x l 2 ) e v a n e s c e n tf i e l dm i c r o s c o p yc o n f i r m e dt h a te g f p v a c h tl a b e l e d v e s i c l e sa r ed i f f e r e n tf r o ml d c v sa n du n d e r g on o r m a ls e c r e t i o n m o r es l m v sw e r e v i s i b l eu n d e re v a n e s c e n tf i e l di l l u m i n a t i o nt h a nl d c v s ，s u g g e s t i n gn l o r es l m v sa r e l o c a t e dw i t h i nt h es u b p l a s m a l e m m a la r e a 2 g a l a n i n ( g a l ) ，a2 9a m i n oa c i dn e u r o p e p t i d e ，h a sb e e ns u g g e s t e dt ob e i n v o l v e d i nn u m e r o u sn e u r o n a lf u n c t i o n ss u c ha s l e a r n i n g a n dm e m o r y ，p a i na n d f e e d i n g b e h a v i o r s s of a r ，t h r e er e c e p t o rs u b t y p e s ，t e r m e dg a l r l ，g a l r 2a n dg a l r 3 ，h a v e b e e ni d e n t i f i e d t h e ya l lb e l o n gt ot h eg - p r o t e i n c o u p l e d - r e c e p t o rs u p e r f a r n i l y i nt h e p r e s e n te x p e r i m e n t ，w es t u d i e dt h et r a f f i c k i n go fg a l a n i nr e c e p t o r sb yi n v e s t i g a t i n gt h e g a l r 2 r e c e p t o rf u s e dw i t he g f p ( e g f p g a l r 2 ) a p p l i c a t i o no fg a l a n i ni n d u c e da c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n ti n c r e a s ei n c a 2 + 】il e v e l si ne g f p g a l r 2t r a m f 氍t e dp c i 2 c e l l s ，s u g g e s t i n g t h a tt h eg a l r 2 - e g f pc o n j u g m ei s f u n c t i o n a l u s i n g c o n f o c a l v i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ，t h ee x p r e s s i o no f t h ec o n s 扛u c tw a sd e m o n s t r a t e di nt r a n s f e c t e d p c i 2c e l l s t h ee x p r e s s e dp r o t e i nh a dap r e d o m i n a n t l yp l a s m am e m b r a n el o c a l i z a t i o n i n t e r n a l i z a t i o nw a sd e t e c t e da f t e rt r e a t m e n tw i 搬1t o1 0 0n i v lg a l a n i no ra r m t 8 9 6 。a s e l e c t i v eg a l r 2 a g o n i s t ，w i t had r a m a t i cr e d u c t i o ni np l a s m am e m b r a n el o c a l i z a t i o n w i t h i n5 - 1 0m i n n e i t h e rm 3 5n o rm 4 0 p r e v e n t e d g a l r 2 a g o n i s t i n d u c e d i n t e r n a l i z a t i o no fe g f p g a l r 2 ，s u g g e s t i n gt h a tt h e ya l en o ta n t a g o n i s t sa tt h eg a l r 2 u n d e rt h e s ec i r c u m s t a n c e s g a l a n i ns t i m u l a t i o na tl o w t e m p e r a t u r ec a u s e de g f p g a l r 2 a g g r e g a t i o na n dc l u s t e r i n go nt h es u r f a c eb u tn o tt r a n s l o c a t i o nt oc y t o p l a s mi n d i c a t i n g t h a ti n t r a c e l l u l a rv e s i c u l a rt r a f f i c k i n go fe g f p g a l r 2i s a t e m p e r a t u r e d e p e n d e n t p r o c e s s 。h y p e r o s r n o t i cs u c r o s ei n h i b i t e di n t e r n a l i z a t i o no fg a l r 2 - e g f p ，s u g g e s t i n g t h a tt h eg a l r 2r e c e p t o ri n t e r n a l i z a t i o ni n v o l v e sa e l a t h r i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m m o r e o v e r , g a l r 2 - e g f p w a sc o l o c a l i z e dw i t hi n t e r n a l i z e dt r a n s f e r r i n ，am a r k e ro ft h e c l a t h r i ne n d o c y t i cp a t h w a y , a f t e rc o - i n c u b a t i o nw i t hg a l a n i na n dt e x a sr e d t r a n s f e r r i n ， f u r t h e r s u p p o r t i n g t h a te g f p - g a l r 2 t r a f f i c k i n g u t i l i z e st h e c l a t h r i n d e p e n d e n t e n d o c y t i cr e c y c l i n gp a t h w a y 。u s i n gs i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，w ef o u n dt h a tg a l r 2 c _ l i n k e d p h o s p h o r y l a t i o nr e g u l a t e sr e c e p t o ri n t e r n a l i z a t i o na n d o r s i g n a l i n g u s i n g t i r f m ，w eo b s e r v e d h o ts p o t s o fg a l r 2i n s e r t i o na n dt h em o t i o no fv e s i c l e s c o n t a i n i n gg a l r 2 一e g f p w e r em o r ea c t i v ea f t e rs t i m u l a t i o nw i t h g a l a n i n k e yw o r d s ：s e c r e t i o n ，i n t e r n a l i z a t i o n ，s l m v s ，l d c v s ，g a l r 2 ，t i r f m ，g f p ，d s r e d 2 v i l a b c h a t c m v c p o n d s r e d d s r e d 2 e g f p f i t c g a i 晨2 g f p ( 诤c r g r k l d c v s n g f n p y r r x s s v s s l m v s a n t i b o d v 抗体 主要符号和缩略词表 c h o l i n ea c e t y l t r a n s f e r a s e 胆碱乙酰转移酶 h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s 人细胞肥大病毒 c f ia n k d i gp e p t ) eo fn p y 前神经肽y 原c 端肽 d i s c o s o m a s p r e df l u o r e s c e n tp r o t e i n 红色荧光蛋白 d i s c o s o m a s p r e df l u o r e s c e n tp r o t e i n v a r i a n t2 红色荧光蛋白突变体2 e n h a n c e d g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 增强型绿色荧光蛋白 f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e 荧光素异硫氰酸盐 g a l m i n r e c e p t o r2 甘丙肽受体2 g r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n 绿色荧光蛋白 g p r o t e i nc o u p l e dr e c e p t o r g 蛋白偶联受体 g p c rk i n a s e s g 蛋白偶联受体激酶 l a r g ed e n s e c o r e dv e s i c l e s 致密核心大囊泡 n e r v eg r o w t hf a c t o r 神经生长因子 n e u r o p e p t i d ey 神经肽y r h o d a m i n er e d - x 罗丹明红一x s m a l ls y n a p t i cv e s i c l e s 突触小囊泡 s y n a p t i cv e s i c l e - l i k em i c m v e s i c l e 类突触小囊泡 v i i i t i r f m v a c h t v m a t 2 c a 2 + 】l c a m p d e p c d g d m s o f l u 0 4 g 4 1 8 t m c s n e o o r i p l c p o l y a r r p s v 4 0 e f f w h m m s d n s f s n a p 2 5 s n a r e v s n a r e s t s n a r e s v a m p t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y 全内反射荧光显微镜 v e s i c u l a r a c e t y l c h o l i n et r a n s p o r t e r 囊泡乙酰胆碱转运载体 v e s i c l em o n o a m i n e t r a n s p o r t e r 囊泡单胺类转运载体 胞内游离钙浓度 环腺酐酸 焦碳酸二乙酯 二酰基甘油 二甲基亚砜 钙离子荧光染料 g e n e t i e i n 1 , 4 ，5 三磷酸肌醇 多克隆位点 新霉素抗性基因 复制原点 磷脂酶c 多聚a 即刻可释放囊泡 猴病毒4 0 e v a n e s c e n t f i e l d f u l lw i d t ha th a l f m a x i m u m m e a n s q u a r ed i s p l a c e m e n t n - e t h y l m a l e i m i d e - s e n s i t i v ef u s i o np r o t e i n s y n a p t o s o m a l a s s o c i a t e dp r o t e i no f 2 5k d a s n a p r e c e p t o r v e s i c l e ss n a r e t a r g e tm e m b r a n e ss n a i 也 v e s i c l e - - a s s o e i a t e dm e m b r a n ep r o t e i n 1 绪富 1 1 生物分子在细胞中的囊泡转运 真核细胞通过不同类型囊泡( v e s i c l e s ) 完成生物分子与颗粒性物质的跨膜运 输，如蛋是痿、多核蛰酸、多凝等。谯转运避程中，黛物分予蔻裹在鏊双层貘凌缝 的囊泡中或位于囊泡膜上，因此又称囊泡运输。不同装型的物质在细胞中合成、转 运极糕是不霜戆，如章孛经递囊瓣合戒、转运与分澄，受体窃离子逶遒在缨戆簇或缨 胞器膜上的定位等。细胞是如何识别、分拣和转运这熄不同物质是目前细胞生物学 研究静热点之一。在鞠缒中煮多种途径形成囊泡，分潮由c l a t h r i n 、c a v e o l a e 、c o p i 和c o p i i 介导。c o p i 和c o p i i 介导内质网和高尔基体之间转运囊泡的形成，c o p i 主要怒介导高尔基体别内质网，以及高尔基体不同层之间转运囊泡的形成，c o p i i 介 导内膜网到建尔基体之闯转运囊泡的蟛成。簸形蛋白分导扶纲腿膜到晕裳内濑钵， 高尔撩体到细胞膜阻及高尔基体到内涵体之间转运囊泡的形成。( 图1 1 ) “3 。 图1 1 囊核细胞中形成囊泡的儿种途径 1 1 1 细胞的分泌 分泌作用是指真核细胞中含有待分泌物的囊泡与质膜融合，从而将内含物排出 胞外的过程。在组成型分泌活动中，分泌作用是自发进行的，但是在调节型的分泌 活动中，分泌作用必需有信号的触发。分泌步骤包括分泌囊泡向细胞膜的募集 ( r e c r u i t m e n t ) 、锚定、囊泡的成熟( p r i m i n g ) 、最后囊泡膜与细胞膜融合及其内含 物通过融合孔释放至细胞外液的过程。分泌作用的结果一方面将分泌物释放到细胞 外，另一方面小泡的膜融入质膜，使质膜得以补充。 神经朱梢突触前释放神经递质是神经元信号输出的第一步。因此阐明其分子机 制对于理解突触神经传递是非常重要的。神经递质释放的条件非常简单，大多数只 要求神经末梢中自由钙离子浓度的上升和m g a t p 的存在，当动作电位到达使得膜去 极化时钙离子通过电压门控钙离子通道进入细胞聚集在突触前膜。钙离子内流能迅 速促使停泊在释放位点的囊泡与突触前膜发生融合继而延伸融合孔。 在体外，可用瞬时电场对细胞膜进行穿孔( p e r f o r a t i o n ) 处理来研究细胞的 外排作用。当胞外自由钙离子浓度大于1 0 1 m 时，经过穿孔处理的细胞才会释放儿 茶酚胺，胞外培养基的变化及不同的蛋白质、肽类抗体的导入都很有可能改变穿孔 细胞的内环境。通过这些模型发现，在囊泡外排的过程中至少有两步是非常重要的： 依赖m g a t p 的初始化及随后不依赖m g a t p ，由钙离子触发的融合步骤。在穿孔处理 的细胞中，当不存在m g a t p 时，钙离子所触发的儿茶酚胺的释放非常迅速，这说明 这些囊泡已经过了内源m r a t p 的初始化作用。当m g a t p 存在时，钙离子所触发的儿 茶酚胺的释放速率要慢得多，并且会以一持续的速度维持一段时间，其分泌的囊泡 还包括了由外源m g a t p 所初始化的囊泡。同样，实验证明在类突触小囊泡( s y n a p t i c v e s i c l e l i k em i e r o v e s i c l e s ，s l m v s ) 分泌乙酰胆碱的过程中，同样存在依赖m g a t p 的初始化和不依赖m g a t p 的钙离子触发的融合过程。通过儿茶酚胺和乙酰胆碱的释 放发现这两种囊泡的分泌机制具有共性。研究中还发现，佛波醇酯会激活蛋白激酶 c ，对细胞的分泌起着一定的作用。由此，进一步实验证明，蛋白激酶c 调节着类 突触小囊泡的分泌。 在高尔基体顺面中发现了与囊泡融合有关的n s f ( n - e t h y l m a l e i m i d e s e n s i t i v e f u s i o np r o t e i n ) 和可溶性n s f 连接蛋白( s o l u b l en s f a t t a c h m e n tp r o t e i n sm e m b r a n e f u s i o n ，s n a p s ) ，这两种蛋白在基础性分泌及内分泌的膜融合过程中都发挥了作用。 在脑细胞膜中发现了s n a p 受体( s n a pr e c e p t o r ，s n a r e s ) ，这是一种与囊泡连接的膜蛋 白，v s n a r e ( v e s i c l e ss n a r e ) 由v a m p ( v e s i c l e - - a s s o c i a t e dm e m b r a n ep r o t e i n ) 和突触 小囊泡蛋白( s y n a p t o b r e v i n ) 组成，t s n a r e ( t a r g e tm e m b r a n e ss n a r e ) 由突触融合 蛋白( s y n t a x i n1 ) 和s n a p 一2 5 ( s y n a p t o s o m a l a s s o c i a t e dp r o t e i no f2 5k d a ) 所 形成。s n a r e 假说提出，某些突触小泡膜蛋白会特异的与突触膜活性区的蛋白形成复 合体，它与突触原生质内的蛋白，a t p 及钙离子相互作用使突触小泡与突触前膜进行 融合。在膜运输的过程中n s f 、s n a p s 和s n a r e s 都发挥了一定的作用。它们在进化的 过程中非常保守，在很多细胞和组织中都是同源的。并且只有s n a r e 蛋白，v a m p ，突 触融合蛋白及s n a p 一2 5 是梭菌毒素一破伤风毒素和肉毒杆菌毒素的靶蛋白，这些毒素 在体外都会阻断神经递质的释放。通常认为s n a r e 和它们的结合蛋白在膜运输的特异 性中发挥了一定的作用。s n a r e 假说虽强调了基础性分泌和调节性分泌的相似点，但 不足以解释细胞分泌过程的高度的特异性和精细的调控能力。可调节性分泌尤其是 神经递质的释放在很多方面都与基础性分泌不同，比如反应时间及释放可能性。 图1 2 中给出了可调节性分泌过程中的关键蛋白。突触囊泡到达神经末梢后从 储存库移至释放位点，停泊在突触前膜的活性区，在突触内钙离子内流的作用下与 突触前膜发生融合将突触囊泡内含物释放。释放过程完成后突触囊泡通过胞吞作用 被细胞摄取，再次装入神经递质分子。突触囊泡与细胞骨架的相互作用使突触囊泡 能从储存库移至释放位点，在囊泡定位与随后的膜融合过程中，蛋白与蛋白，蛋白 与脂质的相互作用起到了重要的作用。突触囊泡的停泊与融合至少经历了以下四个 步骤：突触囊泡与质膜受体的相互作用，突触囊泡的初始化，钙离子内流触发释放， 及突触囊泡与质膜的融合。 图1 2s n a r e 介导突触囊泡的分泌过程 锚定( d o c k i n g ) 、成熟( p r i m i n g ) 、融合( f u s i o n ) 神经递质释放和内分泌激素的分泌是两个典型的需要膜包裹( 囊泡) 的转运和 分泌过程的例子。近年来发现免疫防卫反应、受精过程、细胞的生长、细胞内外物 质的交换、细胞膜上受体蛋白的嵌入和再循环等细胞生理功能的实现都需要膜转运 过程的参与，且所涉及的一些蛋白质和分子机制是类似的。因而，目前国际上形成 了一个研究胞内蛋白质与膜转运、囊泡与细胞质膜的融合及细胞的分泌和胞吞过程 中分子机制与调节途径的热点，这对于揭示神经信号传递、学习与记忆、内分泌激 素分泌、免疫细胞脱颗粒、细胞的生长、膜上功能蛋白的嵌入等重要生命过程有着 极其重要的理论意义。 4 1 1 2 细胞的胞吞 胞吞是一个质膜囊泡萌发的过程，是细胞外物质进入细胞的过程。胞吞作用是 通过细胞质膜内陷形成囊泡，称胞吞泡( e n d o c y t i cv e s i c l e ) 。胞吞的功能包括 营养物质的摄取、受体信号的调控等。根据形成的胞吞泡的大小和胞吞物质，胞吞 作用又可分为两种类型：胞吞物若为溶液，形成的囊泡较小，则称为胞饮作用 ( p i n o c y t o s i s ) 。若胞吞物为大的颗粒性物质( 如微生物和细胞碎片) ，形成的 囊泡较大，则称为吞噬作用( p h a g o c y t o s i s ) 。胞饮作用形成的胞吞泡又称胞饮泡， 吞噬作用形成的胞吞泡称吞噬泡。 受体介导的胞吞作用 根据胞吞的物质是否有专一性，可将胞吞作用分为受体介导的胞吞作用 ( r e c e p t o rm e d i a t e de n d o c y t o s i s ) 和非特异性的胞吞作用。受体介导的胞吞作 用是大多数动物细胞通过笼形蛋白包被小泡从胞外液摄取特定大分子的有效途径。 g p c r 介导的胞吞由多种机制介导( 图1 3 ) ，d y n a m i n 参与的胞吞有c l a t h r i n 和 c a v e o l a e 介导的两种形式，被转运的大分子物质( 配体) 首先与细胞表面互补性的 受体相结合，形成受体一大分子复合物并起动内化作用( i n t e r n a l i z a t i o n ) 。膜相 关因子启动c l a t h r i n 和c a v e o l a e 介导的胞吞，胞吞泡的形成需要c l a t h r i n 或 c a v e o l a e 参与。c l a t h r i n 是由相对分子量为1 8 0 x1 0 3 的重链和3 5 1 0 3 4 0 1 0 3 的轻链组成的二聚体，三个二聚体形成组成包被的结构单位三脚蛋白复合物 ( t h r e e l e g g e dp r o t e i nc o m p l e x ) ( 图1 4 ) 。当配体与膜上受体结合后，c l a t h r i n 蛋白聚集在膜内侧，逐渐形成直径5 0 1 0 0n m 的质膜凹陷，称笼形蛋白包被小窝 ( c l a t h r i nc o a t e dp i t ) ，一种小分子6 t p 结合蛋白( d y n a m i n ) 在深陷包被小 窝的颈部组装成环，d y n a m i n 蛋白水解与其结合的g t p 引起颈部缢缩，最终脱离质 膜形成笼形蛋白包被小泡( c l a t h r i nc o a t e dv e s i c l e ) ，几秒钟后，笼形蛋白 便脱离包被小泡返回质膜附近重复使用，去被的囊泡与早胞内体( e a r l ye n d o s o m e ) 融合”。 a 盹m a c h r 0 2 r e 钿棚 舶啊h a f tm o r c 叠v 酬a e b k 2 r u 瞅r 蝴n 封d i 1 m 1 m 啪m c 扣r 图1 3a ，g p c r s 多种胞番形式，配体结合以后活化g p c r s ，受体被g r k s 或 其它蛋白激酶磷酸化。磷酸化做为一个信号使得接合素蛋白( a d a p t o r ) 与受 体相互作用，或者其它不依赖磷酸化机制使得接合素蛋白与受体作用，然后 g p c r s 避过不同形式胞吞：d y n a m i n 依赖的胞吞由( b ) 通过 c l a t h r i n b a r r e s t i n s 依赖途径胞吞”“和通过c a v e o l a e 介导的胞吞”1 。 有些d y n a m i n 依赖的胞香由一些未知接合素蛋白介导”1 。c ，有些g p c r s 通过 非d y n a m i n 依赖的途径内在化”。 在大分子跨膜转运中，笼形蛋白本身并不起捕获特异转运分子的作用，有特异 性选择作用的是包被中另一类接合素蛋白，它既能结合笼形蛋白，又能识别跨膜受 体胞质面的尾部肽信号( p e p t i d es i g n a l ) ，从而通过笼形蛋白包被小泡介导跨膜受 体及其结合配体的选择性运输( 图1 4 ) 。 6 图1 4 笼形蛋白包被小泡形成过程示意图 a p l 8 0 结合素( 橙色) 蛋白与质膜相互作用，a p 2 结合素( 绿色) 同时结合 脂质和与内在化相关膜蛋白a p l 8 0 和a p 2 和囊泡包被蛋白一笼形蛋白( 蓝 色) 结合，笼形蛋白脚手架原件然后在膜表面组装脚手架的自然弯曲力 使脚手架原件自然收缩形成一个包被凹陷。通过运动因子如e n d o p h i l i n a m p h i p h y s i n 和d y n a m i n 的作用，凹陷进一步变形形成一个通过一个瓶颈与 细胞膜连接在一起的囊泡。d y n a m i n 和a m p h i p h y s i n 形成瓶颈( 红色) ，g t p 依赖的变形产生的剪切使得囊泡从质膜上分离下来。笼形蛋白结构在 s y n a p t o j a n i n 和a u x i l i n 作用下解离下来，然后囊泡在细胞中转运到目的细 胞器。 另一理论提出，在结合素蛋白蛋白介导的内在化过程中，部分g p c r s 与配体结合 以后，活化的g p c r s 被g r k s 或其它蛋白激酶磷酸化脱敏，然后a r r e s t i n s 与磷酸化g p c r 结合，引发受体的内在化阻断信号进一步传递，在这个过程中，a r r e s t i n s 作为接头 和脚手架。( 图1 5 ) 7 图i 5b a r r e s t i n 依赖的g p c r 的内在化。“配体与g p c r 结合后g p c r 激酶( g p c rk i n a s e s ，g r k ) 将g p c r 胞内第三个l o o p 环和c 端的尾巴磷 酸化导致b a r r e s t i n s 与g p c r 相互作用，然后b - a r r e s t i n s 和 c l a t h r t n a p 一2 作用，导致笼形蛋白介导的胞吞。 在细胞胞吞过程中，内涵体被认为是膜泡运输的主要分选站之一，其中的 酸性环境在分选过程中起关键作用。已知有2 5 种以上的不同受体，具有不同 的分选信号，参与不同类型分子的受体介导的胞吞作用。在受体介导的胞吞作 用过程中，不同类型的受体具有不同的内涵体分选途径：大部分受体返回它 们原来的质膜结构域，如l d l 受体又循环到质膜再利用；有些受体不能再 循环而是最后进入溶酶体，在那里被消化，如与表皮生长因子结合的细胞表面 受体，大部分在溶酶体被降解，从而导致细胞表面e g f 受体浓度降低，称为 受体下行调节( f e c c p t o rd o w n r e g u l a t i o n ) ；有些受体被运至质膜不同的结构 域，该过程称作跨细胞的转运( t r a n s c y t o s i s ) 。在具有极性的上皮细胞，这是 一种将胞吞作用与分泌作用相结合的物质跨膜转运方式，即转运的物质通过胞 吞作用从上皮细胞的一侧被摄入细胞，再通过分泌作用从细胞的另一侧输出。 如母鼠的抗体从血液通过上皮细胞进入母乳中，乳鼠肠上皮细胞将抗体摄入体 内，都是通过跨细胞的转运完成的。 1 2 本研究应用到的主要技术 1 2 1 荧光蛋白技术 绿色荧光蛋白f g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 最初是从多管水母属 a e q u o r e a v i c t o r i a 中分离得到的。纯化的g f p 是一个含有2 3 8 个氨基酸残基的蛋白质， 其分子较小，分子量约为2 7k d ，能够吸收蓝光( 3 9 5n m 处有最大光吸收) ，当受至t j c a 2 + 或紫外线激活时，发射绿色( 或黄绿色) 荧光，最大发射峰为5 0 9n r n 。c h a l f i e 等首次报 道g f p 基因在e c o l i 中表达成功后“，陆续证明g f p 在哺乳动物、鱼、昆虫、植物、 酵母和多种多样的细菌中都能够表达，发出强烈的绿色荧光，被广泛用做原核细胞 和真核细胞的报告基因。作为一个报道基因，尤其是活体组织中的报道基因。g f p 具 有很多优良特性：女n g f p 的表达与种属无关，不管细胞的种类和位置如何，只要受到 合适的基因表达调控序列的调控都能够在细胞内表达；其荧光机制是自身含有的，绿 色荧光的发射仅需分子氧的存在，而无需其它外源的辅因子：g f p 对细胞、组织是无 毒的，不会扰乱细胞的正常生长和功能。g f p 的荧光可以耐受福尔马林的固定，因而 可以制成长期保存的标本；另外对细胞内g f p 的检测非常简单，用显微镜、荧光计、 荧光激活细胞分选仪等就可以实现等等。与0 一半乳糖苷酶基因，荧光素酶基因等报 告基因相比，g f p 具有明显的优势，也决定了它的功能的多样性。因为细胞g f p 的 检测仅仅需要附近的紫外线和或蓝光的照射，不受底物能否得到的限制，因此它是 在活体细胞中基因表达和蛋白质定位的极其有用的工具；相对较小的蛋白质。使得它 在有广大分支的细胞( 如神经元和神经胶质) 中的扩散较为容易。 原理上，引起突变体与野生型的g f p 的荧光强度差异的原因有以下几种：( 1 ) 蛋 白质表达的增加：( 2 ) 蛋白质有效折叠增加：( 3 ) 生色团的形成加快：( 4 ) 荧光波 长红移。具有不同光谱特性的g f p 突变体使在同一细胞中同时分析两种不同蛋白质 或启动子成为可能。 增强型绿色荧光蛋白( e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，e g f p ) 是一个 9 红移突变体“”、“3 ，在哺乳动物细胞中有高的表达量，能激发出更强的荧光( 4 8 8 n m 有最大光吸收、最大发射峰为5 0 7n m ) 。e g f p 有2 个氨基酸替代f 6 4 l 和$ 6 5 t “， 还根据人的密码子偏好性突变了1 9 0 多个碱基。 红色荧光蛋白( d i s c o s o m as p r e df l u o r e s c e n tp r o t e i n ，d s r e d ) 是从 d i s c o s o m a s p 分离得到的一种2 8 k d 的荧光蛋白“”，和以前荧光蛋白相比，对极端 p h 值和光漂白作用都有极好的抗性，但也存在一些缺点，如强的四聚体作用和成熟 慢。而快速成熟，可溶的蛋白质可以降低对宿主细胞的毒性。d s r e d 2 ( d i s c o s o m as p r e df l u o r e s c e n tp r o t e i nv a r i a n t2 ) 作为其一种具有快成熟和低的非特异性聚 合等特性，有一系列根据人密码子偏好性的无声突变“，有6 个氨基酸替代，其中 a 1 0 5 v ，1 1 6 1 t 和$ 1 9 7 a 是为了在转染细胞系中快速表达，r 2 a ，k 5 e 及k 9 t 是防止 蛋白质聚合体的形成“。 由于g f p ( 及其衍生基因) 和d s r e d 等作报告基因可直接将基因表达的时间和空 间联系起来，对研究基因表达的定位是最有效的手段。将g f p 基因与目的基因构建成 嵌合基因，其表达产物重组蛋白是带有荧光标记。用这种方法可以很方便地研究目的 基因的表达、定位和运转过程。近年来，人们用不同的g f p 标记了质膜上的受体o ”和 离子通道”、囊泡。2 3 和s n a r e 相关蛋白 2 3 3 、细胞骨架。4 3 等，用于研究膜融合、受体胞 吞与循环或降解、蛋白质运输、蛋白质空间分布、蛋白质相互作用。”等。本研究中 所用到的p e g f p n i c i 和p d s r e d 2 - - n 1 是c l o n t e c h 公司专门为将g f p 和d s r e d 基因与目 的基因构建成嵌合基因，用于研究目的基因的表达、定位和转运的真核表达载体。 1 0 p e g f p n 1 黜“”帮搿詈拶i i 黼滞篙筘帮“”“ * i“ # 、e #g # lf n e 自，m 一砧i r i - - 图1 6p e g f p n l 质粒图谱：s v 4 0o r i 为哺乳动物复制原点，p u co r i 为大肠杆菌复 制原点，f 1 为单链噬菌体复制原点；p 真核生物启动于c 吖和增强子，p 原核生物 启动子；s v 4 0p o l ya 和h s vt k 为哺乳动物终止子，k a n 。n e o 为抗性基因；e g f p 为 增强型绿色荧光蛋白基因；m c s 为多克隆位点。 在这个表达质粒中携带一个受到真核生物c m v 启动子和增强子调控的e g f p 报 告基因，在基因上游有用于插入目的基因的多克隆位点，用于不同基因与e g f p 融 合时有可选择的位点。这个质粒属于一种穿梭质粒，在质粒上有大肠杆菌的复制原 点p u co r i ，同时携带有哺乳动物复制原点s v 4 0o r i ，抗性基因k a n 同时受到原核 和真核生物启动子的调控，使这个质粒既可以在大肠杆菌又可以在哺乳动物细胞中 复制，所以可以在大肠杆菌中完成融合基因的构建过程，当转染哺乳动物细胞p c i 2 以后在g 4 1 8 筛选压力下又可以在细胞中稳定复制。这个表达质粒插