miseq实验流程.doc

2.1 MiSeq测序实验流程2.1.1 基因组DNA抽提默认用E.Z.N.A. Soil DNA Kit（D5625-01）进行样品提取。完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA，用NanoDrop2000进行浓度的检测。（具体参考多样性样品质检报告）一、 项目基本信息 项目名称多样性项目跟进销售项目联系人合同编号收样员收样日期质检员质检日期报告撰写人报告审核员报告终审员报告日期二、 样品检测方法l DNA纯度检测方法： NanoDrop2000l DNA完整性、总量检测方法： 琼脂糖凝胶电泳三、 样品检测结果N0.美吉编号样品名称浓度（ng/l）OD260/280OD260/230胶图(取2l样品跑胶)：2.1.2 PCR扩增按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件，1) 尽可能使用低循环数扩增；2) 保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；PCR仪：ABI GeneAmp 9700型；全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱； 2%琼脂糖电泳检测。（具体参照PCR实验报告）PCR扩增报告 1. 项目基本信息 项目名称项目跟进销售项目联系人合同编号收样员收样日期PCR操作员PCR报告日期报告撰写人报告审核员2.PCR预实验2.1引物设计测序区域引物名称引物序列2.2 PCR扩增条件为了保证后续数据分析的准确性及可靠性，需要两个条件，首先是尽可能使用低循环数扩增；其次保证每个样品扩增的循环数统一。为了达到以上目的，我方首先随机选取10个样品进行预实验，以确保在最低的循环数中绝大多数的样品能够扩增出浓度合适的产物，为所有样品的正式试验做充分准备。在预实验完成后，PCR 正式试验采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20l反应体系：5FastPfu Buffer .4 l2.5 mM dNTPs.2 lForward Primer(5 M). 0.8lReverse Primer(5 M) . 0.8lFastPfu Polymerase.0.4 lTemplate DNA .10ng_补ddH2O至.20 lPCR仪：ABI GeneAmp 9700型PCR反应参数：a. 1 (3 minutes at 95C)b. 27 (30 seconds at 95C；30 seconds at 55 C；45 seconds at 72C)c. 10 minutes at 72C，10C until halted by user2.3PCR扩增结果鉴定胶图2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，3l上样检测电泳图：2.4PCR扩增结果我方已将贵方样品进行PCR扩增条件摸索，截止目前的PCR扩增结果统计如下：胶图编号样品名称实验名称测序引物Tm（）cycles结果2.5结果说明结果代码预实验结果说明APCR产物目的条带大小正确，浓度合适，可进行后续实验；BPCR产物目的条带大小正确，浓度偏低，可尝试进行后续实验；CPCR产物目的条带太弱或未检测到，无法进行后续实验，需要重新提供样品；2.1.3 荧光定量参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor -ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。2.1.4 Miseq文库构建1) 连接“Y”字形接头；2) 使用磁珠筛选去除接头自连片段；3) 利用PCR扩增进行文库模板的富集；4) 氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。2.1.5 Miseq测序 1) DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；2) 另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥 (bridge)”；3) PCR扩增，产生DNA簇；4) DNA扩增子线性化成为单链。5) 加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；6) 用激光扫描反应板表