（发酵工程专业论文）微生物油脂及其制备工艺的研究.pdf

关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目： 邀生塑油旦量区墓生! ! 圣王茎的婴窒 本学位论文作者完全了解大连工业大学有关保留、使用学位论文的规 定，大连工业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 是) ，保密期至力口年夕月2 日为止。 学生签名：盈：延堑导师签名：堑卫：篁垒 ) 州年仁月- 1 7 1 一 二二 卜 、， i i 摘要 摘要 微生物油脂又称单细胞油脂( s c o ) ，是微生物在发酵过程中以碳氢化合物和普通 油脂作为碳源，辅以无机盐生产的油脂，以脂肪粒形式储存在细胞内。微生物油脂除主 要含有甘油三酯外，还富含y 一亚麻酸、花生四烯酸等多种多不饱和脂肪酸。 本论文对发酵性丝孢酵母的细胞破碎方法及油脂提取方法进行了研究，比较了不同 微生物的油脂含量，并对细胞合成油脂的机理进行了探讨，实验研究了利用餐饮废水发 酵生产微生物油脂的可能性及影响因素。研究结果如下： 1 利用冻融破碎法、超声波破碎法、酸热法以及冻融和酸热结合法对发酵性丝孢酵 母细胞进行破碎，以乙醚一石油醚、氯仿一甲醇作为作溶剂萃取油脂。结果表明，酸热法、 超声波法破碎效果较好，采用酸热法破碎细胞后以乙醚一石油醚作为萃取溶剂油脂提取 效果较好，油脂含量高达2 9 8 。 2 通过摇瓶发酵研究了健强地霉、伯顿拟内孢霉和发酵性丝孢酵母的油脂合成能力 及生物合成微生物油脂与脂肪酶活性之间的关系。酸热法破碎细胞提取油脂，采用橄榄 油法测定胞外和胞内脂肪酶活力，并通过气相色谱法分析微生物油脂成分。研究结果显 示，发酵性丝孢酵母的油脂合成能力最强，而且胞内脂肪酶活力最高，胞内脂肪酶活力 达到2 9 7 u m l 高于胞外脂肪酶活力，表明微生物胞内脂肪酶活力高有助于细胞快速大 量积累油脂。 3 通过摇瓶发酵研究了发酵性丝孢酵母利用餐饮废水发酵产油脂的影响因素。在 3 0 培养7 2 h ，葡萄糖和硫酸铵适合菌体的生长和油脂的合成，在发酵液初始p h 6 0 、 1 ( v ) 大豆油为诱导剂、0 5 ( v v ) 吐温8 0 为乳化剂的条件下，菌体生物量为 4 7 2 9 l ，干细胞的油脂含量为2 6 8 。 关键词：发酵性丝孢酵母，发酵，细胞破碎，油脂，脂肪酶，餐饮废水 a b s t r a c t a b s t r a c t t h em i c r o b i a ll i p i di sa l s oc a l l e dt h es i n g l ec e l lo i l ( s c o ) w h i c he x i s t si nt h ec e l l ， s y n t h e s i z e db yu s i n gt h eh y d r o c a r b o n ，t h eo r d i n a r yl i p i da st h ec a r b o ns o u r c ea n di n o r g a n i c s a l t i nm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o np r o c e s s t h em i c r o b i a ll i p i dm a i n l yi n c l u d e sm a n yk i n d so f u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，s u c ha st r i g l y e r i d e ，- l i n o l e n i ca c i d ，a r a c h i d o n i ca c i d ，e t c t h i sp a p e ra i m st os t u d yt r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n sc e l ld i s r u p t i o nm e t h o d sa n dt h el i p i d e x t r a c t i o nm e t h o d sa n dt h eb i o s y s t h e t i cm e c h a n i s mo fl i p i d ，a n dc o m p a r et h ea b i l i t yo f p r o d u c i n gl i p i d t h er e s e a r c hf o c u s e so nt h ep o s s i b i l i t ya n da d j u s t m e n tf a c t o r so fm i c r o b i a l l i p i df e r m e n t a t i o nb yt h er e s t a u r a n tw a s t e w a t e r t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n sw e r ed i s r u p t e db yf r e e z e - m e l tm e t h o d ，u l t r a s o n i cw a v e m e t h o d ，a c i d h e a t i n gm e t h o da n df r e e z e m e l t & a c i d - h e a t i n gm e t h o d ，r e s p e c t i v e l y t h el i p i d e x t r a c t i o nr a t e so ft r i c h o s p o r o n f e r m e n t sb yt h ee t h e r - b e n z i n ea n dc h l o r o f o r m - m e t h a n o lw e r e c o m p a r e d t h er e s u l t si m p l i e dt h a tt h ec e l l sw e r ed i s r u p t e db ya c i d h e a t i n ga n dt h e ne x t r a c t e d b yt h ee t h e r - b e n z i n e ，t h el i p i de x t r a c t i o nr a t ec o u l dr e a c hh i g h e rl e v e la sh i 曲a s2 9 8 2 t h ea c t i v i t yo fl i p a s ea n dt h ea c c u m u l a t i o no fl i p i do fg e o t r i c h u mr o b u s t u m ， e n d o m y c o p s i sb u r t o n i i ，t r i c h o s p o r o n f e r m e n t a n sw e r es t u d i e db ys h a k e nf l a s kf e r m e n t a t i o n t h el i p i dw e r ee x t r a c t e da f t e rc e l ld i s r u p t i o nb ya c i d h e a t i n g ，t e s t e dt h ee x t r a c e l l u l a ra n d i n t r a c e l l u l a r l i p a s ea c t i v i t y , a n da n a l y z e d m i c r o b i a l l i p i dc o m p o n e n t st h r o u g hg a s c h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a t t h ea b i l i t yo fa c c u m u l a t i o no fl i p i db y t r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n sw a st h es t r o n g e s ta n dt h ei n t r a c e l l u l a rl i p a s ea c t i v i t yw a su pt o 2 9 7 u m l t h i sd i s p l a y e dt h a th i g ha c t i v i t yo fi n t r a c e l l u l a rl i p a s ec o n t r i b u t e dt ot h es i g n i f i c a n t a c c u m u l a t i o no fl i p i d 3 t r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n sw a sc u l t i v a t e dt op r o d u c el i p i dw i t hg l u c o s ea st h ec a r b o n s o u r c ea n da m m o n i u ms u l p h a t ea sn i t r o g e ns o u r c e ，1 ( v ) s o y ab e a no i la st h ei n d u c e r , 0 5 ( v v ) t w e e n 8 0a se m u l s i f i e r , a ti n i t i a lp h6 0a n d3 0 cf o r7 2 h u n d e rw h i c hc e l l b i o m a s s ，l i p i dc o n t e n tr e a c h e d4 7 2 9 l ，2 6 8 ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d ：t r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n s , f e r m e n t a t io r c ei idis r u p tio n ，iipid s ， l ip a s e r e s t a u r a n tw a s t e w a t e r 目录 目录 第一章绪论1 1 1 微生物油脂1 1 1 1 微生物油脂1 1 1 2 微生物油脂的特点1 1 1 3 微生物油脂的生理功能1 1 1 4 微生物油脂的研究意义及应用2 1 2 产油脂微生物5 1 2 1 主要的产油脂微生物5 1 2 2 微生物油脂的合成机理6 1 2 3 微生物油脂的发酵生产工艺7 1 3 影响微生物油脂合成的因素7 1 3 1 培养基碳氮比7 1 3 2 培养条件8 1 4 微生物细胞破碎方法及油脂提取、纯化、分析1 0 1 4 1 微生物细胞的破碎方法1 0 1 4 2 微生物油脂的提取1 0 1 4 3 微生物油脂的纯化1 l 1 4 4 微生物油脂的分析方法1 l 1 5 展望1 2 1 6 本论文的研究内容1 2 第二章材料与方法13 2 1 实验材料1 3 2 1 1 菌种1 3 2 1 2 化学试剂1 3 2 2 主要仪器1 4 2 3 实验方法1 5 2 3 1 培养基制备1 5 一 目录 2 3 2 培养条件1 5 2 3 3 发酵特征参数的测定1 6 2 3 4 细胞破碎方法1 8 2 3 4 1 超声波破碎法1 8 2 3 4 2 酸热法1 8 2 3 4 3 自溶破碎法1 8 2 3 5 油脂提取方法1 8 2 3 6 碳源对发酵产油脂的影响2 0 2 3 7 氮源对发酵产油脂的影响2 0 2 3 8 发酵条件对发酵产油脂的影响2 0 第三章结果与讨论2 2 3 1 影响发酵性丝孢酵母油脂提取的因素2 2 3 1 - 1 干、湿菌体油脂提取效果的比较2 2 3 1 2 细胞破碎方法对油脂提取的影响2 2 3 1 3 细胞破碎方法对微生物油脂提取率的影响2 7 3 1 4 油脂提取方法对微生物油脂提取率的影响2 7 3 2 不同产脂微生物的油脂合成能力比较2 8 3 2 1 不同产脂微生物的形态观察2 8 3 2 2 发酵液中脂肪酶活力比较2 9 3 2 3 微生物细胞内脂肪酶活力比较3 0 3 2 4 脂肪酶活力与细胞油脂含量的关系分析3 1 3 3 发酵性丝孢酵母利用餐饮废水合成微生物油脂3 6 3 3 1 诱导剂对发酵产油脂的影响3 7 3 3 2 碳源种类对发酵产油脂的影响3 8 3 3 3 氮源种类对发酵产油脂的影响4 2 3 3 4 初始p h 值对发酵产油脂的影响4 5 3 3 6 乳化剂种类及含量对发酵产油脂的影响4 9 3 3 7 利用餐饮废水合成微生物油脂5 1 第四章结论5 3 参考文献5 4 致谢5 8 第一章绪论 1 1 微生物油脂 1 1 1 微生物油脂 第一章绪论 微生物油脂又称单细胞油脂( s c o ) ，是微生物在发酵过程中以碳氢化合物和普通 油脂作为碳源，辅以无机盐生产的油脂，并形成脂肪粒储存在细胞内【1 1 。微生物油脂 除含有甘油三酯外，还富含亚油酸、丫一亚麻酸、花生四烯酸等多种多不饱和脂肪酸【3 1 。 1 1 2 微生物油脂的特点 ( 1 ) 微生物适应性强，生长繁殖迅速，生长周期短，代谢活力强，易于培养和品种 改良。 ( 2 ) 微生物产油脂所需劳动力低，占地面小，且不受场地、气候和季节变化等的限 制，能连续大规模生产。 ( 3 ) 微生物生长所需原材料来源丰富且便宜，可利用农副产品、食品加工及造纸业 的废弃物( 如乳清、糖蜜、木材糖化液等) 为培养基原料，十分有利于废物再利用和坏 境保护。 ( 4 ) 微生物油脂的生物安全性好，具有良好的风味和消化吸收性高。 ( 5 ) 不同的菌株和培养基的产品由于构成变化较大的特点，适合开发一些功能性油 脂，如富含油酸、7 一亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、角鲨烯等的油脂以及代可可 脂。 ( 6 ) 微生物油脂资源是可再生的资源，石油的开采量还能供人类约6 0 年的使用， 因此石油化工产品逐渐向油脂化学产品转移也是必然的【4 ，5 1 。 1 1 3 微生物油脂的生理功能 微生物油脂在组成成分上类似植物油，主要有中性油脂、游离脂肪酸、类脂物及不 皂化物6 1 。微生物发酵过程所产生的油脂，是含有两个或两个以上非共轭顺式双键的 第一章绪论 c 1 8 - 2 2 的多不饱和脂肪酸，包括n 一3 和n 一6 两大类，n 一3 脂肪酸有：a 一亚麻酸、d h a 和 e p a ；n - 6 脂肪酸有：亚油酸、y 一亚麻酸和花生四烯酸【7 ，羽，这些脂肪酸的功能各不相同， 具有潜在的工业价值【引。 a 花生四烯酸( a r a ) 花生四烯酸是人体中重要的一种多不饱和脂肪酸，也是“必需脂肪酸”之一，一般存 在于陆地动物油脂和一些植物油中，但含量极低。a r a 是合成前列腺素e 2 、前列环素、 血栓烷素a 2 、白三烯b 4 和c 4 等物质的直接前体，其代谢产物p g 、t x 、l t 具有调节 脉管阻塞、血栓、伤口愈合、炎症及过敏等生理功制9 1 。 b 二十碳五烯酸( e p a ) 、二十二碳六烯酸( d h a ) 天然e p a 、d h a 主要富集在深海鱼油中，具有重要的生理功能，可以预防和治疗动 脉粥状硬化、血栓及高血压，并且能防治乳腺癌和结肠癌，还可以治疗气喘、关节炎等 疾病。海生真菌中d h a 含量高达3 4 ，许多海尘藻油脂中e p a 和d h a 含量都非常高， 如金藻纲、黄藻纲、畦藻纲、红藻纲、绿藻纲、绿枝藻纲、隐藻纲中的一些藻【3 】o c r 亚麻酸( g l a ) g l a 是人体必需的脂肪酸之一，对生物体正常的代谢起着十分重要的作用。传统 上g l a 主要从月见草油中提取，但受天气、产地等影响，其产量少且不稳定，不能满 足市场需要。g l a 与人体健康很有关系，具有明显的降血脂和降低血清胆固醇的作用； 是人体中合成前列腺素等具有强烈生理活性的自身调节物质的前体，如前列腺素e ，具 有阻止血液中胆固醇积累，防止血小板凝集，保护急性心肌缺血，抑制动脉硬化斑块形 成等多种重要的生理功能，已被广泛应用于医药、保健食品、高级化妆品中。而g l a 的缺乏会抑制前列腺素的合成，从而引起血压升高、动脉硬化、血栓形成、糖尿病、风 湿病、肥胖症和皮肤老化等疾病f 4 ，5 1 。 d 亚油酸 亚油酸是人体的一种必需脂肪酸，人体不能自身合成，须从食物中摄取。亚油酸能 促进幼儿生长发育，防止和减轻老年人的动脉粥样硬化0 1 。 1 1 4 微生物油脂的研究意义及应用 1 1 4 1 微生物油脂的研究意义 微生物油脂不仅是构成和维持生命活动的基本物质，也是重要的工业原料。尤其是 不饱和脂肪酸( g l a 、a r a 、e p a 、d h a ) 具有多种生理功能，如降血酯、降糖、健脑、 2 第一章绪论 益智等的重要作用，逐渐引起国内外的广泛重视，因此，微生物油脂的研究将成为新世 纪油脂工业的一个发展方向【1 1 ，1 2 】。 随着经济的迅速发展，全球性的能源短缺及环境污染问题r 趋严重【1 2 】。我国人均化 石资源贮量十分有限，但能源需求量却与日俱增。微生物可将碳水化合物转化为油脂， 是生物柴油的潜在油源，生物柴油是一种清洁的可再生能源，一般是采用可再生的油脂 资源( 如动物、植物或微生物油脂) 经过酯化或转酯化工艺制得的、性质与普通柴油非常 相似的液体燃油【1 2 l3 1 ，作为一种极具潜力的化石能源替代品。因而就需要- 丌发微生物油 脂为生物柴油的生产提供原料油脂。目前，我国将微生物油脂作为特种油料资源，记入 了2 0 2 0 年中长期发展规划，说明我国政府对微生物油脂研究的重视，也反映出微生物 油脂研究具有广阔的前景。 1 1 4 2 微生物油脂的应用 1 微生物油脂在食品中的应用 由于微生物油脂中富含大量多不饱和脂肪酸，是人体必需的营养物质，可作为营养 强化剂用于各种食品如婴幼儿奶粉、鲜奶、饮料和饼干中，为智力发育提供必需脂肪酸。 在婴幼儿配方食品中添加多不饱和脂肪酸是食品发展的趋势。 2 0 0 0 年7 月美国惠氏公司在中国推出添加a r a 的新型婴幼儿配方奶粉，成为中国 市场上第一种添加a r a 的婴幼儿奶粉，这一产品的推出为中国国产婴幼儿奶粉企业指 明了发展方向。亨氏公司、贝因美、飞鹤乳业、银桥乳业等知名乳品企业已添加了武汉 福星生物药业有限公司生产的富含a r a 的微生物油脂【1 4 】。另外，以富含不饱和脂肪酸 的功能性油脂为油相，用乳糖酶对脱脂乳中的乳糖进行水解，以此溶液为水相，添加适 量乳化剂，制成水包油型乳化饮料代替牛乳，既可避免乳糖不适症，又可预防动脉硬化 4 ，1 5 j 。因此，大力开发和利用富含多不饱和脂肪酸的微生物油脂这一营养强化剂，对调 整和改善人们的膳食结构，提高健康水平将具有重要作用【1 6 】。 2 微生物油脂在化工方面的应用 在化妆品中，多不饱和脂肪酸可作为美容护肤、促进毛发生长、改善发质的功能因 子，添加在美容护肤用品及美发用品中，一些使用天然植物油脂开发的洗涤化妆品就是 利用其中的a l i a 和g l a 对皮肤的营养保护作用。这类产品在国外较为常见，如d c a r e 的d a n d r u f 晤波、l a b e l l e 的维生素e 护肤霜等。 微生物油脂的研究正方兴未艾，从食用到粉末涂料、可塑剂、润滑油、香料和农药 3 一 e p a 、d h a 等富含多不饱和脂肪酸的真菌、海生细菌【1 2 堪，1 9 】。 进入2 1 世纪以后，特种油脂的发展愈来愈受到重视；而且相继从丝状真菌、细菌、 酵母和微藻类中，寻找到能生产许多特种油脂的菌种，并取得突破，为进一步形成生产 力提供技术依据【2 0 1 。目前，已上市的微生物油脂产品有：英国的s e l l b yf a c t o r yo f s t u r g e b i o c h e m i c a l s 、日本出光化学公司的g l a 产品，主要用于医药、功能性饮料和高级化妆 品；m s r t e kb i o s c i e n c e sc o r p o r a t i o n 生产的海藻d h a ；武汉嘉吉烯王生物工程有限公司用 高山被孢霉发酵生产的花生四烯酸产品：a r a 粉剂和a r a 油剂；润科生物工程有限公司 的d h a 微藻粉、d h a 微藻油；随州生物中科生物工程有限公司的神农牌农康胶囊( 含 5 的丫一亚麻酸，1 0 的亚油酸) 。这些产品的上市激励着微生物油脂研究的进行【2 1 2 2 】。 在我国，从事微生物油脂研究的有华中科技大学生命科学院、中国热带农业科学院 热作生物技术国家重点实验室等，在6 0 年代就有过用霉菌和酵母生产油脂的报导，但 研究较多的是在9 0 年代，其研究重点集中在开发微生物功能性油脂方面1 2 0 1 。 张峻1 2 4 j 等人筛选到深黄被孢霉的突变株m 6 ，菌体得率2 5 ，油脂含量3 2 8 ，g l a 含量为8 8 4 。南开大学生物系用深黄被孢霉a s 3 4 10 为出发菌株，经紫外诱变得变异 株，发酵产生g l a 时，菌体得率为2 9 3 ，油脂含量达4 4 7 ，其中g l a 含量达9 4 4 。 1 9 9 8 年黄建中等【2 5 】以深黄被孢霉a s 3 4 1 0 为出发菌株，经紫外、硫酸二乙酯、亚硝基胍 复合诱变处理后，进行6 0 m 3 大罐三级发酵，菌体油脂含量7 9 2 。同年，上海工业微 生物研究所报道了丫_ 亚麻酸油脂的发酵生产，其y 一亚麻酸占油脂总量的8 。1 9 9 9 年朱 法科等【2 6 j 以被孢霉为出发菌株，经紫外诱变获得a r a 高产菌，a r a 得率达o 8 3 9 l 。 同时还发现，不同培养时间的菌丝体( 3 5 天) ，总油脂含量由1 8 - 3 0 上升至3 6 - - 4 1 ，a r a 含量由】1 2 6 上升至2 6 3 7 。 4 养基进 盐分含 油脂进行转移和转化，将油脂作为微生物所需的碳源和能源，并在酶的催化作用下将其 水解成甘油、脂肪酸，最后降解为i - i z o 、c 0 2 等代谢终产物，不仅解决了环境治理和食 品安全的难题，还实现了资源循环的再利用【2 9 1 。2 0 0 2 年李塑宝等【3 0 j 人利用毛霉对油脂 废水降解并合成了丫一亚麻酸。 1 2 产油脂微生物 1 2 1 主要的产油脂微生物 能够生产油脂的微生物有酵母、霉菌、细菌和藻类等，其中真核的酵母、霉菌和藻 类能合成与植物油组成相似的甘油三酯，而原核的细菌则合成特殊的脂类。目前研究得 较多的是酵母、藻类和霉斟1 0 】。 可再生的天然资源，每年以2 的速度递增，随着生命科学的、能源产业的进展， 微生物、原生动物、藻类等生命体用作新油脂原料j 下在成为现实，如丝状菌中的卵菌类 ( c o m g c e t e s ) 接合菌类( z y g o m y c e t e s ) 藻类中隐藻纲藻类( c h r y s o p h c e a e ) 、涡鞭毛藻 类( d i n o p h y c e a e ) 、黄菌色藻类( c h r y s o p h y c e a e ) 等是生产d h a 的菌体【2 0 】。 常见的产油脂酵母有：浅白色隐球酵母( c r y p t o c o c c u sa l b i d u s ) 、弯隐球酵母 ( c r y p t o c o c c u sa l b i d u s ) 、弯假丝酵母( c a n d i d ac u r v a t a ) 、斯达氏油脂酵母( l i p o m y c e s s t a r k e y i ) 、茁芽丝孢酵母：( t r i c h o s p o r o ns t a r k e y 0 、产油油脂酵母( l i p o m y c e sl i p o f e 厂) 、胶粘 红酵母( r h o d o t o r u l ag l u t i n i s ) 、类酵母红冬孢( r h o d o s p o r i d i u mt o r u l o i d e s ) 等。 常见的产油霉菌有：土曲霉( a s p e r g i l l u st e r r e u s ) 、高山被孢霉( m o r t i e r e l l aa l p i n a ) 、 深黄被孢霉( m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ) 、拉曼被孢霉( m o r t i e r e l l ar a m m a n i a n a ) 、紫癜麦角菌 5 第一章绪论 ( c l a v i c e p sp u r p u r e a ) 等。 常见的产油微藻有：普通小球藻( c h l o r e l l av u l g a r i s ) 、丛粒藻( b o t r y o c o c c u sb r a u n i i ) 、 盐生杜氏藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) 、粉核小球藻( c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a ) 等。 许多海生藻油脂中e p a 和d h a 含量都非常高，如金藻纲、黄藻纲、哇藻纲、红藻 纲、褐藻纲、绿藻纲、绿枝藻纲、隐藻纲中的一些藻【3 1 1 。菌物系统报道，以拉曼被孢霉 ( m o r t i e r e l l a r a m a n n i a n a ) s m 5 4 1 为原始菌株，经过紫外线复合氯化锂诱变处理，得到突 变株s m 5 4 1 9 ，其生物量由1 2 6 9 l 提高到2 8 8 9 l ，油脂含量由5 8 9 l 提高到1 5 7 9 l ， a r a 含量由3 2 1 m g l 增加到6 2 3 m g l ，实验表明，s m 5 4 1 9 具有良好的遗传稳定性【3 2 1 。 1 2 2 微生物油脂的合成机理 产脂微生物是在培养基中氮素耗尽并且有过量碳素用于脂类合成时，才能在细胞内 累计较多的脂类。微生物产生油脂过程，本质上与动植物产生油脂过程相似，都是从利 用乙酰c o a 羧化酶的羧化催化反应开始，经过多次链的延长，或再经去饱和酶的一系 列去饱和作用等，完成整个生化过程。参与脂肪酸的合成过程主要有两个酶系【3 3 1 。 1 丙二酰c o a 为中心的酶系 此酶系的主要特征使醋酸盐或乙酰c o a 生成软脂酸，再合成脂肪酸。合成脂肪酸过 程常停止在c 1 6 及c 1 8 酸阶段。过程如下：乙酰c o a 与酰基载体蛋白( a c p ) 在乙酰转 移酶的作用下结合，同时，乙酰c o a 在乙酰羧化酶的催化作用下生成丙二酰一c o a ，丙 二酰一c o a 再经丙二酰单酰基转酰酶活化生成丙二酰一a c p 后，合成饱和脂肪酸；不饱 和脂肪酸的合成与生物膜的结合有关，微生物本身存在去饱和酶系，是微生物通过氧化 去饱和途径生成不饱和脂肪酸的关键酶，此过程发生在内质网中。此外，三硫基甘油也 随之生成，由于解糖作用生成甘油醛一3 一磷酸经还原作用而生成甘油，再经一系列反应 便生成三硫基甘油。 2 线粒体酶系 其中去饱和酶是微生物通过氧化去饱和途径、生成不饱和脂肪酸的关键酶，该过程 称之为脂肪酸氧化循环【3 3 1 。线粒体系为脂肪酸氧化分解过程，此分解途径称之为脂肪酸 氧化循环，即脂肪酸受巯基激酶作用与c o a 结合成活化型，尔后经脱氢、加水、再脱 氢的过程，每次减少2 个碳元素而分解( 3 - 氧化) ，生成的乙酰c o a 再进入循环，完 全分解成c 0 2 和h 2 0 。生物合成脂肪酸时是b 一氧化的逆循环，不过b 一氧化系统酶不能 合成长链脂肪酸，而需有新的酶( 已经肯定的为叭3 - 烯脂酰c o a 还原酶) 及其它辅助 6 第一章绪论 因子( 如磷酸吡哆醛或磷酸吡哆胺) 的参与，才可能进行延长脂肪酸链的合成。因而线 粒体酶系的合成途径不是新的长链脂肪酸的合成，而是脂肪酸碳链延长的合成【7 ，1 2 ，3 4 】。 粘红酵母油脂合成的机理可分为4 个环节：两个前体乙酰c o a 和3 一磷酸甘油的形 成；甲羟戊酸的合成，乙酰c o a 形成脂酰c o a 和鞘脂；以甲羟戊酸为前体合成甾醇、 类胡萝b 素和碳水化合物；以乙酰c o a 和3 一磷酸甘油为前体合成磷脂酸、甘油二脂、 甘油三脂和磷脂。由此可见，在酵母细胞内油脂的合成多少，乙酰c o a 起了主导作用， 而乙酰c o a 的形成又受氮源多少、a m p 和异柠檬酸脱氢酶活力等诸因素的影响。禹慧 明等l j 5 j 对产生g l a 机理进行探讨，认为微粒体膜的苹果酸酶活性与菌体油脂g l a 含量 存在显著相关关系，这是因为苹果酸酶原位产生的n a d p h 是微粒体膜磷脂上脂酰基完 成去饱和作用的关键所在，而胞基质上的在脂肪酸延长和去饱和中不能发挥作用。 1 2 3 微生物油脂的发酵生产工艺 在微生物油脂生产技术中，目前能够进行工业化生产的产油脂微生物首先是丝状真 菌，其次是微藻。微生物油脂的发酵生产技术主要是产油脂丝状真菌的发酵生产技术。 1 发酵原理 微生物在生命活动过程中，营养物质进入细胞，在一系列酶的作用下，物质进行分 解与合成，同时进行能量的释放和利用。这一系列物质和能量的转化反应，都与微生物 呼吸发酵有密切关系【3 6 1 。 2 生产菌种的工艺流程 根据现代生产的要求，首先建立菌种库，菌种库包括一级的原始菌种库、二级的保 存菌种库和三级的生产菌种库。 菌种库一活化生产菌种库的菌种_ 扩大菌种培养，形成分生孢子一一级液体种子_ 发酵生产【3 7 】 1 3 影响微生物油脂合成的因素 1 3 1 培养基碳氮比 油脂含量是评价产油微生物经济性的重要指标，油脂含量越高，表明菌体对底物的 利用效率越高。不同产脂微生物其产油脂量是不相同的，即使同种微生物菌株，在不同 7 第一章绪论 脂肪酸种类也不相刚3 8 , 3 9 。 分缺乏是高产油脂的一个关键因素。用于培养产油微生物的 、淀粉糖化液、废糖蜜、乳糖、餐饮废水、纸浆工业废水及 胞生长和油脂合成的碳源是葡萄糖。p a p a n i k o l a o u 等【4 0 1 利用 深黄被孢霉在以葡萄糖为碳源的培养基中生产单细胞油脂，油脂含量和生物量得率分别 为1 7 和3 4 ，油脂质量分数为5 0 。李永红等【4 i 】系统优化了圆红冬孢酵母 r h o d o s p o r i d i u mt o r u l o i d e sy 4 利用葡萄糖发酵过程，油脂含量和菌体油脂质量分数分别 达到了2 2 和7 6 。曲威等【4 2 】对l s t a r k e y im 3 6 禾1 用葡萄糖发酵产油进行了比较系统的优 化，使油脂含量和菌体油脂质量分数分别达到1 9 和6 0 。 用于培养产油微生物的氮源主要有玉米浆、氨基酸、硝酸盐、氨盐及尿素。黄建忠 等人【4 3 】进行的不同氮源影响细胞油脂合成的实验表明，n h 4 n 0 3 、尿素等适合于细胞生 长但不适合油脂的合成；蛋白胨、牛肉膏不适于细胞生长但利于油脂合成；酵母膏不仅 适宜细胞生长，而且是油脂合成的最佳氮源。微生物生产油脂可分为两个阶段，即菌体 增殖期和油脂积累期。两阶段碳氮比要求不同。氮源的作用是促进细胞生长，因此培养 前期要求低碳氮比，可以获取大量菌丝体，产油阶段要求高碳氮比，以积累更多脂肪【2 2 】。 1 3 2 培养条件 1 3 2 1 温度的影响 温度对微生物合成油脂的影响较大，适宜的温度可以促进产油微生物对油脂的合 成，而过高或过低的温度将会阻碍细胞油脂的合成，油脂生成的最适宜温度大多在2 5 ( 2 左右。温度可影响油脂的组成、含量，一般情况下，不饱和脂肪酸的熔点比饱和脂肪酸 低，细胞膜中不饱和脂肪酸及短链脂肪酸含量增加，主要是棕榈油酸、油酸等含量增加， 当温度升高时，平均链长就增加，温度低时不饱和脂肪酸含量将会增加【4 3 1 。 不同的微生物产生油脂的最适宜p h 值不同，酵母为3 5 - - - 6 0 ，而霉菌为中性至偏碱 性。构巢曲霉( a s p e r g i l l u s n i d u l a n s ) 在p h - 值2 8 - - 7 4 培养时，随着p h 值的上升，油酸含量 增加。而培养油脂酵母的培养基最初p h 值越接近中性，稳定期细胞油脂含量越高【4 4 】， 藻类一般适宜中性或微碱性培养。 8 细胞变形、自溶，油脂难以收集，同样影响油脂产量。 1 3 3 其他因素 适当增加无机盐和微量元素的使用量，可提高真菌产油速度和产油量。国外有人 对构巢曲霉的研究表明，在培养基中适当调整n r 、k + 、m 9 2 + 、s 0 4 2 一、p 0 4 3 一等离子的含 量比，可使菌体油脂含量由2 5 , - - , 2 6 提高到5 l 。有人利用油脂酵母( l i p o m y c e s s t a r k e y i l 生产油脂的实验证明，在培养基中增加铁离子浓度，可加快油脂合成速度；增加锌离子 浓度，可提高油脂累积量【4 5 1 。但需注意，任何无机盐及微量元素的增加剂量都是有限的， 不宜过多。 一般来说，产油微生物合成油脂都需要氧气参与，因此需供应充足的氧气，菌体生 长期孢子数量过多，单细胞油脂产量反而下降。细胞内积存的油脂过多，又会使菌体失 去增殖能力。因此，应使产油菌达到最佳孢子数量，以保持菌体的增殖能力和产油生理 状态。 添加某些中间物，如乙醇、乙酸盐、乙醛等可增加油脂含量 4 6 , 4 7 】。如添加脂肪酸合 成的中间物或能形成中间物的c 2 化合物可以增加油脂含量，有些菌株添加维生素b 族， 还有的添加e d t a 来防止糖与盐类生产复合物，减少糖的损失，使油脂含量增加【4 8 , 4 9 1 。 忻耀年【5 0 】的研究指出在微生物合成油脂过程中，脂肪酶( l i p a s e ，e c 3 1 1 3 ) 的可逆作 用即脂质合成对生长、繁殖、积累养分起了重要作用。因此，添加油脂诱导剂和乳化剂 对脂肪酶有一定作用。 关雯洁等【5 1 j 采用5 l 发酵罐研究非离子乳化剂和植物油对被孢霉发酵生产亚麻酸的 影响，研究发现培养基中添加2 的橄榄油和0 5 m l l 的吐温2 0 可使菌体量及亚麻酸产 率提高2 0 ，最终发酵的菌体量为5 1 5 9 l ，油脂含量为质量分数2 5 1 ，y 一亚麻酸产量 为2 0 8 l 。 9 第一章绪论 1 4 微生物细胞破碎方法及油脂提取、纯化、分析 1 4 1 微生物细胞的破碎方法 微生物油脂大多存在于由较峰韧的细胞壁所包裹的菌体细胞内，部分与蛋白质或 糖类结合以脂蛋白、脂多糖的形式存在，较难分离出来，因此在提取油脂前必须对菌体 进行细胞破碎。主要有掺砂共磨法( 将菌体与砂子一起进行研磨) 、与盐酸共煮法( 共煮 使细胞分解有利于获得油脂) 、菌种自析法和蛋白质溶剂变性法( 用乙醇或丙醇使结合蛋 白变性) 、反复冻融、超声波破碎等方法【5 2 】。 1 4 1 1 酸热法 酸热法破碎细胞油脂含量较高，酸热法处理菌体主要是利用盐酸对细胞中的糖及蛋 白质等成分的作用，疏松细胞的结构，再经过沸水、冷冻处理，使细胞达到破碎的效果， 油脂含量相对较耐5 3 1 。 1 4 1 2 反复冻融法 反复冻融破碎，是通过温度的突然变化，细胞在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的 同时，发生溶胀破碎，以达到使细胞破碎的目的。在反复冻融过程中，由于耗时较长， 部分酵母细胞产生了自溶使油脂含量减少【3 】o 1 4 1 3 超声波法 超声波法破碎细胞是利用超声波产生独特的机械振动作用，使细胞结构发生变化， 促使细胞破碎。但油脂含量略低于酸热法。可能在超声波作用时间较长时产生热量，使 部分油脂进行了分解反应，不利于油脂的提取【5 4 1 。 1 4 2 微生物油脂的提取 微生物油脂的提取是微生物发酵工业化生产中的关键技术。微生物油脂在原料中的 浓度一般不太高，且在提取过程中，易受氧、光、热等影响而发生氧化、聚合、降解等 反应。此外，作为医药和保健食品原料，还要求在提取的过程中不能含有色素、臭味以 及残留的有机溶剂等物质 5 5 , 5 6 】，因此，用于油脂浸提的溶剂应该使全部油脂物质都能溶 解而且要求有足够的极性使其与细胞膜、脂蛋白等连接键破坏而得以提取。目前，研究 1 0 第一章绪论 者常采用油脂提取方法有：酸热法、索氏提取法、超临界c 0 2 萃取法( s c f c 0 2 法) 、有 机溶剂法【5 7 ，5 8 1 ，常用于微生物油脂浸提的有机溶剂主要有乙醚、石油醚、异丙醚、氯仿、 乙醚一石油醚、乙烷等【5 引。 1 4 2 1 索氏提取 精确称取一定量粉碎后的干菌体，全部移入滤纸包内，将滤纸包放入索氏提取器的 抽提管内，连接已恒重的接受瓶，加入石油醚，于5 5 水浴加热回流6 h ，然后回收溶剂， 称恒重，计算油脂含量【6 0 6 1 1 。 1 4 2 2 有机溶剂法 精确称取一定量粉碎后的干菌体，每克干菌体添加4 m o l l 的盐酸4 0 m l ，室温下静 置2 0 m i n ，沸水浴加热l o m i n ，加入适量氯仿一甲醇( 2 ：l ，v ：v ) ，振荡3 0 m i n ，然后 于5 0 0 0 x g 下离心1 5 m i n ，分液，取氯仿层，真空干燥除去氯仿即得油脂，计算油脂含 量由于氯仿一甲醇一水混合溶剂是一种有效的提取剂，它不仅能提取非极性脂类( 提取剂 本身有一定的极性，与极性脂类的亲和性增大) ，也能将极性脂类有效地提取出来。 由于乙醇或丙酮作为有机溶剂使结合蛋白质变性，常用的溶剂有乙醚、异丙基醚、 正己烷等【6 2 1 。 1 4 3 微生物油脂的纯化 微生物油脂中的多不饱和脂肪酸往往需进行分离和纯化。用于多不饱和脂肪酸纯化 的方法有很多种，但目前仅有少量几种方法适合于大规模的工业化生产，主要包括低温 结晶法、超临界流体精馏法、吸附分离法、分子蒸馏法以及酶分离法等【6 3 ，硎。 1 4 4 微生物油脂的分析方法 目前所用的油脂定性分析主要是苏丹黑染色法定性分析菌体油脂，而定量油脂含量 通常用的是苏丹黑染色，测吸光度绘制标准曲线法定量分析菌体油脂含量【6 5 , 6 6 1 。油脂成 份分析一般利用气质联用仪在线检测，即待测样品加入5 k o h 甲醇溶液封管水解_ 加 1 4 b f 3 1 甲醇溶液封管甲酯化_ 加饱和n a c l 溶液分层，以石油醚( b p 3 0 6 0 ) 提取一无水硫 酸钠干燥_ 挥发溶剂_ 进样测定【6 7 , 6 8 1 。 一 一 第一章绪论 1 5 展望 微生物油脂的研究和开发，不仅丰富了传统的油脂工业技术，而且是工业化生产 油脂的一个重要途径，尤其是在人口增长迅速的今天，同益增加的油脂需求量与自然资 源严重短缺的矛盾愈发尖锐，开辟微生物油脂这一新的油脂资源更具有非常重要的现实 意义，含多不饱和脂肪酸的微生物油脂在未来营养品市场上将大有潜力。由此可见，微 生物油脂的研究将成为新世纪工业的一个发展方向，它将使油脂行业的加工范围更加广 阔，在促进人类保健、能源方面也将起着越来越重要的作用【6 9 , 7 0 。 1 6 本论文的研究内容 本研究主旨在利用微生物发酵产油脂，优化油脂取工艺，提高油脂的产率；将废弃