（材料加工工程专业论文）骨组织工程磷酸钙生物陶瓷多孔支架的制备及性能.pdf

东南大学颂士学位论文 中文摘要 摘要 本研究利用直接沉淀法和两步中和法合成磷酸钙粉体，并以其为原料， a 1 2 0 3 m g o h 3 p 0 4 为粘结剂配制浆料，采用有机泡沫浸渍法制备了骨组织工程磷酸钙生 物陶瓷多孔支架。对支架的性能与结构进行了测试与表征，并通过体外细胞培养实验 ( i n v i t r o ) 研究了支架的细胞活性和生物相容性。 应用x 射线衍射对磷酸钙粉体的相组成进行了分析，以c a ( o h ) 2 和h 3 p 0 4 为原料， 用直接沉淀法制备的粉体为纯磷酸钙( 1 3 - t c p ) ；以c a o 、c a ( o h ) 2 和h 3 p 0 4 为原料，利用 两步中和法制备的粉体为复合磷酸钙。在对两种方法制备的沉淀物煅烧过程进行热重( t g ) 和差示扫描量热法( d s c ) 分析的基础上，确定了粉体制各工艺。 以p - t c p 和复合磷酸钙为原料，用有机泡沫浸渍法制备了骨组织工程多孔支架。以 孔隙率和抗压强度为评价指标，研究了相组成、烧结温度、保温时间和粘结剂含量对多 孔支架性能的影响。研究结果表明，以复合磷酸钙制备的多孔支架，孔隙特征和力学性 能更好。在孑l 隙率高的情况下，其抗压强度仍高于由p - t c p 制备的支架。对磷酸钙生物 陶瓷多孔支架的制备工艺进行了优化，以两步中和法制各的复合磷酸钙为原料，粘结剂 含量2 7w t ，非线性升温，烧结温度9 5 0 。c 制备多孔支架，其抗压强度为1 4 5 5m p a ，平 均孔隙率为7 8 7 3 ，且具有网状开i l 结构，能满足骨组织工程对支架结构和强度的要求。 用m t t 法对多孔支架细胞活性的研究表明，支架材料对细胞没有毒性；支架和成骨 细胞进行体外复合培养( i n v i t r o ) 的结果显示，支架材料具有良好的生物相容性。 关键词：骨组织工程，多孔支架，磷酸钙，有机泡沫浸渍法，生物相容性 查堕查兰堡二! 兰笪堡兰 茎苎垫蔓 a b s t r a c t t h ec a l c i u mp h o s p h a t e p o w d e r sw e r ep r e p a r e db yd i r e c tp r e c i p i t a t i o na n dt w o s t e p s n e u t r a l i z a t i o n t h e nt h ep o w d e r sw e r em i x e dw i t ha 1 2 0 3 一m g o h 3 p 0 4b i n d e rt op r e p a r es l u r r y ， a n dt h ep o r o u sc a l c i u m p h o s p h a t e b i o c e r a m i cs c a f f o l df o rb o n et i s s u ee n g i n e e r i n gw a sf a b r i c a t e d b yo r g a n i cf o a mi m p r e g n a t i o n t h em o r p h o l o g ya n dp e r f o r m a n c eo fs c a f f o l d sw a st e s t e da n d c h a r a c t e r i z e d t h eb i o c o m p a t i b i l i t ya n d c y t o t o x i c i t yo f s c a f f o l d sw a ss t u d i e di nv i t r o t h ec o m p o s i t i o no fc a l c i u mp h o s p h a t ep o w d e r sw a s a n a l y z e db yx r d t h ep u r ec a l c i u m p h o s p h a t ew a s o b t a i n e d u s i n gd i r e c tp r e c i p i t a t i o nf r o mc a ( o h ) 2 a n dh 3 p 0 4 t h e p o w d e r s ，w h i c h w e r ep r e p a r e db yt w os t e p sn e u t r a l i z a t i o na n du s i n gc a o ，c a ( o h ) 2a n dh 3 p 0 4a sp r e c u r s o r s ， w e r ec o m p o s i t ec a l c i u m p h o s p h a t e b a s e do n t h er e s u l t so ft h e r m a lg r a v i t y ( t g ) a n dd i f f e r e n t i a l s c a n n i n gc a l o r i m e t r y ( d s c ) o ft h et w op r e c i p i t a t e s ，t h ep r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yo fc a l c i u m p h o s p h a t ep o w d e r w a sc o n f i r m e d ， t h ep o r o u ss c a f f o l d sf o rb o n et i s s u ee n g i n e e r i n gw e r ep r o d u c e du s i n gf o a mi m p r e g n a t i o n p r o c e s sw i t h 3 - t c pa n dc o m p o s i t ec a l c i u mp h o s p h a t ea sm a i nm a t e r i a l s i nt h i s p r o c e s s ，t h e i n f l u e n c e so f c o m p o s i t i o n o ft h e p o w d e r s ，s i n t e r i n gt e m p e r a t u r e ，h o l d i n g t i m ea t h i g h t e m p e r a t u r ea n dp e r c e n to fb i n d e ro ni n t e n s i t ya n dp o r o s i t yw a ss t u d i e d e x p e r i m e n t a lr e s u l t s s h o w e dt h a tt h ep o r o u ss c a f f o l d s ，w h i c hw e r ep r e p a r e db yc o m p o s i t ec a l c i u mp h o s p h a t e ，p o s s e s s b e t t e r p r o p e r t i e s i n t h ec a s eo fh i g h e rp o r o s i t y , t h e i n t e n s i t y v a l u eo fc o m p o s i t ec a l c i u m p h o s p h a t es c a f f o l dw a s s t i l lg r e a t e rt h a nt h a to f1 3 - t c ps c a f f o l d t h ef a b r i c a t i n gp r e s so fp o r o u sc a l c i u mp h o s p h a t eb i o c e r a m i cs c a f f o l dw a s o p t i m i z e d t h e s c a f f o l dw a sp r e p a r e db ys i n t e r i n ga t9 5 0 。cf o r2ha n dn o n l i n e rh e a t i n g ，u s i n gt h ec o m p o s i t e c a l c i u m p h o s p h a t ep o w d e r a sm a i nm a t e r i a la n db i n d e rc o n t e n to f2 7w t i th a st h r e e d i m e n s i o n a lo p e np o r es t r u c t u r ea n dt h ec o m p r e s s i v ei n t e n s i t yw a s145 5m p a ，a v e r a g ep o r o s i t y 7 87 3 ，t h e s ew i l lb es a t i s f a c t o r yp r o p e r t i e sf o rb o n et i s s u ee n g i n e e r i n g t h ec e l la c t i v i t yo fs c a f f o l dw a sm e a s u r e db ym t tm e t h o da n dn 0c e l lc y t o t o x i c i t yw a s o b s e r v e d ，w i t ht h ec o - c u l t u r eo fs c a f f o l da n dc e l l ，t h eg o o db i o c o m p a t i b i l i t yo ft h es c a f f o l dw a s d e f i n e d k e y w o r d s ：b o n e t i s s u e e n g i n e e r i n g ，p o r o u ss c a f f o l d ，c a l c i u mp h o s p h a t e ，o r g a n i c f o a m i m p r e g n a t i o n ，b i o c o m p a t i b i l i t y i i 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 研究生签名：日期： 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复 印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和 纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布 ( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办 理。 研究生签名：导师签名墼! 竺 日期： 东南大学顺士学位论文 绪论 1 1 骨组织工程的研究背景 第一章绪论 1 1 1 组织工程的提出与发展 2 0 世纪，人类在生命科学领域的研究取得了丰硕的成果，对生命本质的认识达到了一 个前所未有的高度，自体组织器官移植、同种异体组织器官移植和异种组织器官移植等革 命性技术的诞生提高了人们的健康水平和生活质量，挽救了大量的生命。但是自体组织 移植是一种以刨伤来修复创伤的治疗模式，给病人造成供区的缺损，增加新的痛苦，而且 自体组织的来源也极其有限；同种异体组织移植也由于移植或捐赠的器官供给缺少，许多 患者在等待器官移植中失去治疗机会：将部分动物细胞或整个器官植入人体中进行异种移 植时，存在强烈的免疫排斥反应问题。因而，人们在尽可能完善现有治疗方法的同时，积 极努力探索，试图从根本上解决组织器官修复和重建的难题。组织工程学正是在这样的背 景下建立和发展起来的。 组织工程是一个崭新领域，是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上 又一新的里程碑，标志着医学将走出器官移植的范畴，步入制造组织和器官的新时代。 组织工程最初是由美国的r o b e r t l a n g e r 和j o s e p h r v a c a n t i 在2 0 世纪8 0 年代中期提出的 一个概念，即在一种可生物降解的支架上种植人体活细胞，使之在生长因子的作用下， 长成为组织。华人学者冯元祯1 9 8 4 年提出组织工程的概念之后，1 9 8 8 年，美国科学基金 会在加利福尼亚l a k et o h o e 举行的专家讨论会上正式提出“组织工程”的定义【2 j ，它是 应用生物学和工程学的原理和方法，去认识正常和病态生物组织的结构功能关系， 设计、构造、改良和培育生物活组织，以修复或重建器官结构、维持或改善组织器官功 能的门新兴交叉边缘学科。 组织工程学的提出、建立和发展是对外科领域组织、器官缺损和功能障碍传统治疗 方法和模式的一次革命，孕育着巨大的科学价值和广阔的研究应用前景，是2 1 世纪生命 科学研究领域的热点之一。此外，组织工程学是一门多学科交叉的边缘学科，是2 1 世纪 具有巨大潜力的高技术产业，具有巨大的社会和经济效益，一经提出，就受到了世界范 围的关注。 经过十几年的研究发展，组织工程领域的研究己取得令人瞩目的成果( 3 j 。1 9 9 5 年， 美国筹建组织工程学会，并出版了正式刊物“组织工程学”。1 9 9 8 年5 月美国批准了一种 名为a p l i g r a f 的组织工程皮肤产品用于临床。它用新生儿包皮作为成纤维细胞和角化细 胞的来源，在由牛腱中提取的胶原网格上培养细胞，形成具有与人类皮肤一样的真皮和 表皮双层结构的人工皮肤，用于i 瞄床静脉溃疡的治疗，取得良好疗效。组织工程培育的 骨骼、软骨、血管、皮肤以及神经组织正在进行体内实验，再造的肝脏、胰脏、心脏、 东南人学硕士学位论文 绪论 手指、角膜等正在实验室里生长成形。个别器官再造研究领域已经取得了明显进展，软 骨组织工程产品己进入临床实验，临时的助肝装置正在进行临床实验，预计组织工程化 骨产品不久也将面世。 我国自2 0 世纪9 0 年代初开始了有关组织工程的研究，1 9 9 7 年中国修复重建外科 杂志开辟了“组织工程研究”的专栏。2 0 0 0 年，成都华西医院杨志明教授编著出版了 名为组织工程基础与临床的我国第一部组织工程专著。国内组织工程研究与国外相 比起步虽然稍晚，但中国组织工程研究跳跃了组织工程发展的前两个阶段，即初步探索 与尝试和裸鼠体内组织构建，直接重点丌展了高等哺乳动物体内的组织构建及修复组织 缺损的研究，如杨志明教授领导的组织工程实验室于1 9 9 7 年7 月至2 0 0 2 年6 月间，运 用组织工程已成功地修复重建骨缺损5 2 例，肌腱、韧带2 1 例，治疗肌病1 1 例，获得了 不同程度的满意效果 4 。上海第二医科大学附属第九人民医院整形外科专家、“9 7 3 ”组织 工程项目首席科学家曹谊林教授领衔的上海组织工程研究中心，将构建的组织工程化骨 用于临床修复骨缺损患者获得巨大成功，达到了国际领先水平 5 j o 1 1 2 骨组织工程的研究进展 骨骼在人体内起着重要的支撑作用，它执行着多种不可替代的生理功能。骨有很高 的力学强度，支撑着人体的组织：骨骼是人体内钙的储存库，可调节人体血液内c a 2 + 的 浓度；而骨腔中的骨髓还具有造血功能。然而由于创伤、肿瘤切除、感染以及发育异常 等原因所造成的骨缺损，破坏了人体正常的外观与机能，甚至影响人的正常生活。在这 种情况下，修复骨缺损是优选的治疗方案，骨组织工程学技术为骨缺损的修复提供了新 的思路和方法。 骨组织工程学是在组织工程研究领域中专门从事研究组织工程化新生骨组织的一个 研究分支，并被认为是最具有前途和可行性的一个分支。骨组织和其他内脏组织不同， 具有相对单一的细胞成分，相对单一的框架，客观上降低了体外复制的难度，骨特有的 组织器官特异性及生物学特性为组织工程化组织提供了良好的研究模型 6 】，因此，骨组织 工程研究受到广泛重视。1 9 9 5 年c r a n e 7 系统提出了骨组织工程的概念、研究方法、研究 现状及发展前景，引起了广大学者的关注。骨组织工程学的基本方法【8 1 是将分离的自体高 浓度成骨细胞、骨髓基质细胞或软骨细胞，经体外培养扩增后，种植于一种天然的或人 工合成的，具有良好生物相容性并可被人体逐步降解吸收的细胞支架( s c a f f o l d ) ，或称细 胞外基质( e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ，e c m ) 上。这种细胞支架材料为细胞提供生存的三维空间， 有利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，排除废料，使细胞按预制形态的三维 支架生长，然后将这种细胞支架材料复合体( h y b r i dm a t e r i a l ) 植入骨缺损部位，在生物材 料逐步降解的同时，种植的骨细胞不断增殖，从而达到修复骨组织缺损的目的。应用组 织工程学原理修复骨组织缺损的基本方法如图1 1 所示 9 】，其中( a ) 和f d ) 分别是关节处的骨 缺损和长干骨的骨缺损，将分离的骨髓基质细胞( b o n em a r r o ws t r o m a lc e l l ，b m s c ) 在体 2 东南大学硕士学位论文 绪论 外培养，扩增到一定数量，种植于多孔支架材料上( 如图1 - 1 ( b ) 、( e ) ) ，然后将这种支架 细胞复合体植入骨缺损部位，如图1 - 1 ( c ) 和( f ) 所示。植入后，细胞沿支架迁移、铺展、生 长和分化，最终形成组织工程化骨，修复骨缺损。 图1 1骨组织工程不意图 近年来骨组织工程研究领域取得了令人瞩目的进展，1 9 8 8 年，v a c a n t i 等【lo j 将小牛骨 膜细胞种植于多层编织的聚羟基乙酸( p o l y g l y c o l i ca c i d ，p g a ) 支架中，然后移植于裸 鼠体内，结果证实骨细胞可以增殖成为骨骼：1 9 9 7 年，b r e i t b a r t 等 1 l j 采用体外培养的骨 膜细胞种植于p g a 无纺网支架，植入体内，修复颅骨缺损，证明了组织工程化骨可用于 修复骨缺损。f r a n c e s c o ” 将高度多孔h a 制成管状复合人骨髓基质细胞，植入裸鼠背部 带血管蒂背阔肌皮瓣，8 周后组织学分析证实，材料中可见新生骨组织，材料表面及内部 高度血管化，偶尔可见骨髓腔结构，从而形成带蒂的骨肌皮瓣，在i 临床应用中展示出可 喜的前景。2 0 0 2 年，暨南大学生物医学工程系的汤顺清等【13 】从青山羊两侧髂骨处破皮后， 在严格无菌条件下用1 6 号骨穿针穿刺抽取红骨髓，混入d m e m 完全培养基进行培养， 将传2 3 代的骨髓基质细胞和d 一磷酸三钙聚乳酸支架复合培养，形成组织工程化骨。将 其植入山羊体内，1 2 周后发现，大致修复了2c m 的山羊胫骨缺损，这表明组织工程化骨 在一定意义上是一种活的骨组织移植，其中大量的种子细胞在修复骨缺损的过程中表现 出旺盛的成骨能力。骨组织工程研究取得的新成果必将促进其它组织和器官组织工程研 究的发展，推动组织工程的研究向成熟阶段迈进。 1 2 骨组织工程的主要研究内容 骨组织工程的研究方法主要分为两种 1 4 】：一种是将载体材料与成骨细胞在体外复合， 然后植入体内，成骨细胞生长分化，进而形成新骨；另一种是将细胞在体外培养，获得 足够数量的成骨细胞，并与载体材料在体外组装后植入骨缺损部位。所以，种子细胞、 骨组织工程支架材料以及细胞与支架材料的相互作用是骨组织工程研究的主要内容。 在骨组织工程中，种子细胞依赖于细胞外基质即组织工程支架材料发挥功能。单纯的 t 查堕查鲎! 些主兰些堡塞 鳖鲨 成骨细胞植入体内成骨能力较低，主要原因是由于缺乏细胞载体，细胞易流失，不能在植 入部位形成有效的细胞浓度。细胞本身的功能表达不仅取决于细胞内在的基因序列，而且 在很大程度上也受外界环境因紊的影响，因此组织工程支架材料具有不可替代的作用，它 不仅为成骨细胞提供结构支撑，起到模板作用，引导骨组织再生和控制骨组织结构，更重 要的是支架材料作为细胞外基质成分之一，起着介导细胞间信号传导和相互作用的媒介作 用，并且影响成骨细胞生存、迁移、增殖和功能代谢。支架材料性能的优劣不仅影响种子 细胞的生物学特性和培养效率，而且决定移植后能否与受体很好地适应并结合在一起，从 而发挥其修复骨缺损的作用。支架材料直接影响骨组织工程的成败，成为制约骨组织工程 研究进一步发展的主要因素之一。 1 3 骨组织工程支架材料 1 3 1 骨组织工程支架材料的性能要求 支架在骨组织工程中不仅对细胞、组织起物理连接和支持作用，而且还调节细胞的各 种功能，因此理想的骨组织工程支架材料应符合以下条件 【5 】： ( 1 ) 良好的生物相容性。除满足生物材料的一般要求，如无毒、不致畸等之外，还要 利于种子细胞粘附、增殖，且降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应，甚至利于细 胞生长和分化。 ( 2 ) 良好的生物降解性。材料在完成支架作用后应能降解，而且降解和吸收的速度应 与细胞组织生长的速度相匹配；降解时间应能根据组织生长特性做人为调控。 ( 3 ) 可塑性和一定的力学强度。支架材料应具有良好的可塑性，能够根据模型加工成 各种形状结构，同时也要根据不同修复组织的要求而具备相应的力学强度，使之在植入部 位能承担相应的外力而不致变形，为新生组织提供支撑，并保持一定时间直至新生组织具 有自身生物力学特性。 f 4 ) 具有三维立体多孔结构。可加工成三维立体结构，孔隙率最好在9 0 以上，具有 较高的比表面积。这种结构可提供宽大的表面积和空间，利于细胞粘附生长、细胞外基质 沉积、营养和氧气进入及代谢产物排出，也有利于血管和神经长入。 ( 5 ) 良好的材料一细胞界面。材料具有良好的材料一细胞作用界面，有利于细胞粘附、 生长，更重要的是能激活细胞特异基因表达，维持正常细胞表型表达。 f 6 ) 易于消毒。由于支架要植入人体，为了防止感染，必须进行消毒，支架材料应在 使用现行常规的高压、熏蒸、浸泡等简单的消毒方法时，结构及性能不发生改变。 f 7 ) 易于保存。可于常温、常湿等自然条件下保存，并且在长期保存的情况下，性能 不发生变化。 f 8 ) 材料的表面修饰。材料的处理应该有利于细胞的贴附，为细胞的生长繁殖、分泌 基质提供良好的环境。就目前来说，通过调整基质表面化学及微观结构的修饰、整合上一 4 东南大学硕士学位论文 些特异的细胞表面受体识别物质，提高细胞的粘附，促进细胞的分裂及发生形态的分化。 或者通过提高材料表面的亲水性来提高细胞的贴附和分化。 1 3 2 骨组织工程支架材料 目前，骨组织工程中应用的支架材料主要包括天然高分子材料、合成高分子材料和无 机材料州。 ( 1 ) 天然高分子材料 主要包括胶原、明胶、甲壳素、血清纤维蛋白、聚氨基酸等，其中胶原和血清纤维蛋 白应用较多。该类支架材料可降解，易于吸收，不产生炎症反应，但其力学强度与分子量 有关，和降解速度是反对应关系，即分子量大时，力学强度高，降解速度慢，难于满足组 织构建速度。因此，该类材料难以制备出强度高、降解性能好的三维多孔支架。 ( 2 ) 合成高分子材料 主要包括聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等。这类支架材料的降解速度和力学强度可以 调节，容易塑型。但这类材料的降解产物易产生炎症反应，降解单体集中释放，使培养环 境酸度过高，而且该类材料与细胞的亲和力较弱，需要物理方法或加入某些因子促进细胞 与材料的黏附。 ( 3 ) 无机材料 主要包括生物玻璃和生物陶瓷。其中羟基磷灰石c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 ( 简称h a ) 和磷酸三 钙( t c p ) 生物陶瓷应用较多。 羟基磷灰石的钙磷比为1 6 7 ，细长针状结构，晶体结构完整，属六方晶系。其钙磷比 和晶体结构与人体骨骼中的无机物相同，无毒、无害、无致癌作用，具有良好的生物活性 和生物相容性，能够诱导新骨生长和形成，广泛应用于生物硬组织的修复和重建。纯h a 陶瓷的力学性能优于其他生物活性陶瓷，如纯h a 陶瓷的断裂强度优于含有杂相 ( 1 3 t c p 、8 7 h a ) 的h a 陶瓷。因此，2 0 世纪7 0 年代国际上很多研究者开始对h a 的 制备、结构和性能及其在医学上的应用进行了系统的研究，并取得一些重要的成果。但羟 基磷灰石的降解速度极其缓慢，植入体内后不能被新生骨组织完全代替，所形成的组织也 不完全符合骨的生物学特性。 磷酸三钙( b t c p ) 的钙磷比为1 5 ，与正常骨组织接近，是一种生物降解和生物吸收 型活性陶瓷，具有良好的生物相容性和骨诱导能力。研究已经证实【6 】，b t c p 能被机体所 吸收，无炎症或排斥反应，不产生局部或全身性毒性反应。 3 - t c p 在水溶液中的溶解度大 于h a ，植入骨组织后，缓慢地被体液降解，为形成新骨提供丰富的c a 、p ，通过新陈代 谢途径促进新骨组织的生成。 3 - t c p 降解下来的c a 、p 在其界面形成一种钙磷固一液平 衡 1 7 】，维持这种平衡的离子来自周围的骨组织和植入材料。这些钙磷离子“媒介”最终 以生物性磷狄石的形式形成钙磷固体沉积在界面，形成f 3 - t c p 与骨的直接结合或骨性结 合。r i e u l l 8 认为两者的结合是一种化学性磷灰石和生物性磷灰石的合并。另外，有些材料 5 查匝盔兰堡土堂焦鲨三薹 整堡 学者指出“，p - t c p 生物陶瓷在热力学上是不稳定的，其吸收体液后会部分发生相变，并 形成羟基磷灰石，其相关的化学反应方程式为： 4 c a 3 ( p 0 4 ) 2 + h2 0 c a l 。( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 + 2 c a 2 + + 2 h p 0 4 2 一。( 1 1 ) 这种相变会使材料体积增加，在材料内部产生隐裂纹，体液进入裂纹内的材料表面，破坏 了材料颗粒间的相互结合，在应力腐蚀作用下裂纹进一步扩展，使材料表面积逐渐增加， 促进溶解。但是，由于h a 在体液中的极小溶解度，孔隙中产生的h a 会在一定程度上阻 碍d t c p 的降解，这也会对p t c p 多孔支架材料的降解速度起调节作用。多孔b t c p 作 为骨生长的支架时，支架表面和孔隙内部同时发生溶解、降解吸收，参与宿主生命过程， 并逐步为新生骨组织所置换。骨组织工程b t c p 多孔支架的优良性能促使其成为当今生 物陶瓷发展的活跃领域。 目前，国内外许多学者对骨组织工程b t c p 生物陶瓷多孔支架进行了相关方面的研 究。日本名古屋工业技术试验所的鸟山等j 以b t c p 为原料制备多孔支架，最高强度达 到1 9 7m p a ，符合人致密骨强度的要求；k l e i n 2 1 1 对b t c p 多孔支架的降解吸收与孔隙率 和孔径大小的关系阻及降解机理进行了研究，结果发现，含6 0 微孔( 孔径d 5g m ) 的 p t c p 植入3 6 个月有明显吸收，而孔径大小为2 0 0 5 0 0 “m 的样品吸收不明显，反应 滞后至少2 个月。微孔陶瓷周围骨髓腔中出现大量的巨噬细胞及多核破骨细胞，它们的吞 噬作用导致陶瓷吸收。k l e i n 认为，烧结陶瓷颗粒间的相互连接部分是陶瓷溶解的薄弱环 节，其决定了陶瓷粒子的分散能力，该效应称为瓶颈效应，它与陶瓷制备工艺有关。中国 科学院光电技术研究所的黄占杰1 2 2 j 则认为，在体内复杂的生理环境下，有两种过程可能 在起作用：一是陶瓷被分散为微粒或碎片，随后被细胞吞噬、转移；二是陶瓷溶解，析出 离子，转移到组织液中，沉积成为新晶相。 1 4 骨组织工程磷酸钙生物陶瓷支架材料的制备方法 1 4 1 磷酸钙生物陶瓷粉体的制备方法 磷酸钙生物陶瓷支架的制备是以粉体为原料，经过成型和烧结，形成具有一定力学强 度的多孔支架。原料粉体的性能对支架的成型、烧结和显微结构有很大的影响，进而对支 架的性能产生决定性的作用，所以粉体的制备也很关键。 制备b t c p 陶瓷粉体的方法，可分为固相反应法( 干法) 和溶液反应法( 湿法) 。固相 反应法是在高温下，让钙盐和磷酸盐在空气中或水蒸气气氛中发生反应，生成磷酸钙陶瓷 粉体。固相反应法生成的产物粒径较大，原料粉需要长时间混磨，其过程易玷污；而湿法 装置简单，易得到组成均匀、粒度较细的陶瓷粉体。因此制备b t c p 粉体，通常采用湿 法，其中三种典型的方法是 2 3 - 2 5 ： 1 、化学沉淀法 原料为c a ( n 0 3 ) 2 溶液和( n h 4 ) 2 h p 0 4 溶液，用氨水调节p h 值，将( n h 4 ) 2 h p 0 4 溶液以 6 壅! 亘盔学颁士学位论文绪论 一定速度滴加到强烈搅拌的c a ( n 0 3 ) 2 溶液中，在室温下反应一定时间，该生成反应为： 3 c a ( n 0 3 ) 2 + 2 ( n h 4 ) 2 1 4 1 7 0 4 + 2 n h 4 0 h + c a 3 ( p 0 4 ) 2 + 6 n h 4 n 0 3 + 2 h 2 0( 1 2 ) 反应结束后，静置、陈化、过滤、洗涤，在8 06 c - b - 烘于，9 0 0 。c 焙烧，然后球磨粉碎， 即可得到 3 - t c p 粉体。 2 、直接沉淀法 室温下将c a ( o h ) 2 和h 3 p 0 4 直接反应生成沉淀， 3 c a ( o h ) 2 + 2 h 3 p 0 4 _ c a 3 ( v 0 4 ) 2 + 6 h 2 0( 1 3 ) 生成的沉淀8 0 下烘干后，在9 0 0 。c 下焙烧2h ，炉冷至室温，然后球磨粉碎即可得 到1 3 - t c p 粉体。 该方法采用c a ( o h ) 2 悬浮液滴加到h 3 p 0 4 溶液中直接生成沉淀，反应过程简单，容易 控制，反应唯- n 产物是水，无需洗涤，可制得高纯1 3 - t c p 粉体 2 3 】。 3 、两步中和法 室温下将c a o 悬浮液加入h 3 p 0 4 中反应，生成c a ( h 2 p 0 4 h ，然后与c a ( o x ) 2 中和， 反应方程式为： c a o + 2 h 3 p 0 4 c a ( h 2 p 0 4 ) 2 + h 2 0 ( 1 - 4 ) c a ( h 2 p 0 4 ) 2 + c a ( o h ) 2 。c a 3 ( v 0 4 ) 2 + h 2 0 ( 1 - 5 ) 生成的沉淀8 0 。c 下烘干后，在9 0 0 。c 下焙烧2h ，炉冷至室温，然后球磨粉碎即可得 到1 3 - t c p 粉体。 1 4 2 骨组织工程磷酸钙生物陶瓷多孔支架的制备方法 骨组织工程生物陶瓷多孔支架中孔的相互连通程度以及连通孔的大小，对其骨传导性 能有较大的影响。研究显示，虽然人的成骨细胞可以通过直径2 0i z m 的孔，但互通孔径 大于5 0u m 才有利于骨单元在孔内形成1 2 6 1 ，随着互通孔径的增大，磷酸钙生物陶瓷的骨 传导性能增强。力学强度测试表明【2 7 圆】，孔径和孔隙率的增加都会降低生物陶瓷的力学强 度，而生物陶瓷多孔支架的力学强度、孔径及孔隙率受制备方法的影响很大。 按照成孔原理，骨组织工程生物陶瓷多孔支架的制备方法可以归结为以下几类，即加 造孔剂法、化学发泡法、颗粒烧结形成多孔结构、溶胶凝胶法、有机泡沫浸渍法。 ( 1 ) 加造c l o g 法 该方法是将磷灰石粉体和水混合后，与一定形状、体积比例的可燃性填料混合，经烘 干固化成型，再在高温下烧结，可燃性填料燃烧后，在陶瓷中留下孔洞。利用这种方法可 以制得形状复杂、孔隙结构各异的多孔制品，但制品孔隙率不高( 一般低于5 0 ) ，且孔 隙分布均匀性差，其工艺与普通陶瓷工艺相似，关键在于造孔剂种类和用量的选择。目前 使用的造孔剂有双氧水和一定粒径、形状的聚合物，如硬脂酸、聚乙烯醇缩丁醛、甲基纤 维素。 武汉理工大学生物材料中心曾以高纯超微t c p 粉为原料，加入高温粘结剂，采用加 7 东南大学硕士学位论义绪论 造孔剂法制备多孔p - t c p 生物降解陶瓷1 2 。它是一种白色多孔海绵状材料，材料表面与 内部均匀分布着大孔与微孔，呈现一种大孔与微孔相互贯通的网络结构。大孔径一般为 1 0 0 5 0 0 岫，颗粒问颈部连接，孔隙率为4 9 ，9 ，抗压强度为1 5m p a ，密度为1 2g c m 3 。 材料的主晶相是b c a a ( p 0 4 ) 2 ，还存在少量其他磷酸钙晶相与非晶相。 ( 2 ) 化学发泡法 该方法是将在较高温度能够分解产生气体或发生化学反应产生气体的化学物质与磷 灰石粉体浆料混合成型，在一定温度下加热处理发泡，然后烧结制得大孔陶瓷。该方法要 求成孔剂和发泡剂的残留物不影响陶瓷的性能和组成，或残留物经简单的水洗可以除去。 气体发泡法 3 0 】制备的支架孔隙率高达9 3 ，孔径可达1 0 0 a m ，但该技术形成的支架中的 孔与孔之间大多数是非连通的。常用的发泡剂是过氧化氢 3 0 - 3 1 1 ，聚乙烯醇缩丁醛或甲基纤 维素。 d r i s s e n 3 2 1 将平均粒径为1 “m 的 3 - t c p 粉末和粘结剂按( 8 5 8 0 ) ：( 1 5 2 0 ) 的比例加蒸 馏水球磨4h 后倒出，蒸去一部分水形成浆料。然后将松香放入饱和的n a o h 溶液中煮沸 1h ，冷却后得到发泡剂。将发泡剂与浆料混合均匀，倒入石膏模成型，脱模，干燥，烧 结。制得的多孔支架孔径在5 1 0 0l a m 之间，抗压强度大约为7m p a 。 发泡法的优点是不需滤除过程，可以容易地制得一定形状、组成和密度的多孔陶瓷。 但发泡工艺制备的支架孔隙率较低、孔径分布狭窄，孔与孔之间大多数是非连通的，这种 孔结构使得细胞在支架中的种植和移动变得困难。 ( 3 ) 颗粒烧结形成多孔结构 该方法是凭借骨料颗粒按一定堆积方式形成的颗粒间空隙，在烧结过程中，由于粘结 剂如m g o c a o p 2 0 5 系玻璃粘结剂在高温下产生液相，使陶瓷颗粒相互接触的部分被烧结 在一一起，颗粒间的空隙形成相互贯通的微孔。这种多孔支架的孔隙率一般较低，在2 0 3 0 左右。为了提高孔隙率，也可在原料中加入成孔剂，这样制得的多孔支架孔隙率可达 6 5 左右，孔径在0 1 6 0 0m 之间【j “。 1 9 9 8 年t a n c r e d 等【3 4 】报道了用此方法合成的骨组织工程支架材料，用颗粒大小为2 ，1 6 p a n 的羟基磷灰石粉末和颗粒大小为o 9 7p m 的1 3 - t c p 粉末，按3 ：1 混合，加入3 的氰乙 烯短纤维作为成孔剂，将混合物装入试管，在混合机上慢速旋转5 天，使原料混合均匀。 然后在高温炉中1 2 0 0 烧结3h ，升温和降温速率都控制在4 m i n 。通过上述方法得到 了与人体骨形态相似的多孔支架，孔径为1 0 2 0 0g m ，孔隙率达到6 0 以上。 ( 4 ) 溶胶凝胶法 溶胶一凝胶法( s 0 1 g e l ) 3 5 1 一般以金属醇盐及其化合物为原料，在一定介质和催化剂存在 的条件下，进行水解一缩聚反应，使溶液由溶胶变成凝胶，再经干燥、热处理，制得多孔 陶瓷或多孔陶瓷膜。溶胶一凝胶法是一种典型的原位成型工艺，是一种把传统陶瓷成型工 艺与高分子化学相结合的一种崭新的陶瓷成型工艺。其特点在于通过凝胶的独特三维网状 东南人学硕上学位论文 绪论 结构来制各孔径为2 1 0 0r i m 的多孔陶瓷，特别是多孔陶瓷膜。用溶胶凝胶工艺制得的 陶瓷膜孔径分布范围极为狭窄，孔径大小可通过调节溶液组成和热处理过程来控制。 ( 5 ) 有机泡沫浸渍法 有机泡沫浸渍工艺是s c h w a r t a w a l d e r 在1 9 6 3 年发明的口，其独特之处在于它凭借了 有机泡沫体所具有的开孔三维网状骨架的特殊结构。该方法采用具有网状丌孔结构的软质 泡沫塑料( 如聚氨酯) 为载体，加工成所需形状、尺寸，浸渍陶瓷浆料后，去除多余浆料， 留下涂覆在泡沫纤维上的陶瓷浆料，以缓慢的速度升温至8 0 并保温一定时间烘干后， 在高温下烧结，使聚合物完全烧尽，余下一个具有三维网状连通开孔骨架的孔隙结构( 即 泡沫结构) 。 t a m p i e r i 3 7 】等用上述方法制备了具有多孔结构的骨组织工程支架。以h a p 粉末为原 料，加入1 6 的分散剂分别制成浆料，然后进行超声波振动处理，使浆料混合均匀。 将有机泡沫在浆料中浸渍，当泡沫充分吸附浆料后经7 2h 烘干，然后在1 2 5 0 下烧结， 恒温时间1h ，充分去除有机泡沫，制得多孔支架，最小孔径小于5 0 儿m ，最大为2 0 0 5 0 0u m ，孔隙率大于6 6 ，抗压强度为3 6 4 5m p a 。有机泡沫浸渍工艺是制备高孔隙率 ( 7 0 9 0 ) 多孔陶瓷的一种有效工艺，并且此类多孔陶瓷具有三维网状开孔骨架结构。 在以上制备方法中，加造孔剂法和发泡法等方法都存在一定的缺陷，制备的样品孔隙 率不高，孔隙分布均匀性差，孔径分布狭窄，孔与孔之间的连通性差。而有机泡沫浸渍工 艺是一种发展较早，应用较成熟的多孔陶瓷制备工艺。由于开孔有机泡沫塑料的形态和孔 尺寸决定了多孔支架的形态和孔尺寸，可以通过改变泡沫孔隙形态来调节支架的孔隙，有 机泡沫浸渍法的操作控制简单，而且容易得到网状开孔结构。因此，该方法制备的多孔支 架从结构上能满足骨组织工程的要求，具有较好的实用性和广阔的应用前景。 1 5 研究内容 目前，制备的骨组织工程磷酸钙生物陶瓷多孔支架主要存在着以下不足： 1 支架降解速度难以控制，不能与新生骨生成速度匹配。这主要是由于多孔支架的 降解受其组成和结构，尤其是孔隙大小、连通程度矛n g r l 隙率等方面的影响较大。而目前的 支架制各技术还不够完善，支架结构还不能完全根据需要进行调控； 2 陶瓷材料的脆性大，力学性能达不到人体的生物力学要求，限制了它在负重及高 应力部位应用。 本研究主要结合骨组织工程支架的研究现状，对磷酸钙生物陶瓷多孔支架的制各工艺 进行改进，研制符合骨组织工程要求的支架。 有机泡沫浸渍法制备磷酸钙生物陶瓷多孔支架时，要求浆料具有较好的性能，高性能 的浆料不仅有利于成型，而且可以保证骨组织工程多孔支架的力学强度和孔隙率等性能。 本文以磷酸钙生物陶瓷粉体为主要原料，a 1 2 0 3 一m g o h 3 p 0 4 为粘结剂配制浆料，有机泡沫 浸渍法成型，然后高温烧结制各多孔支架，并对影响生物陶瓷多孔支架的孔隙率和强度等 9 查直盔堂堡主兰焦堡至 笪堡 性能的参数( 如相组成、粘结剂含量、烧结温度、保温时间) 进行了研究，主要内容包括粉 体的制备、浆料的制备、多孔支架的制备工艺及优化。具体如下： ( 1 )研究制备方法对磷酸钙粉体组成的影响，以其获得符合要求的粉体。 ( 2 )探索提高磷酸钙生物陶瓷多孔支架的强度和孔隙率、改善孔隙微观特征的制各技术 及工艺，通过对粘结剂含量，烧结温度和保温时间等方面进行调整，优化制备工艺， 以提高支架强度、孔隙率及孔隙的均匀性，实现强度和孔隙率的较好匹配。 ( 3 )利用体外细胞培养( i n v i t r o ) 研究磷酸钙生物陶瓷多孔支架的细胞毒性和生物相容 眭。 1 0 东南大学硕上学位论文 实验设备及方法 第二章实验设备及方法 本章主要介绍了磷酸钙生物陶瓷多孔支架制备过程中所用的原料、实验设备以及性 能测试方法。 2 1 原料和设备 ( 1 ) 原料 本研究选用氢氧化钙( c a ( o h ) 2 ) ，氧化钙( c a o ) 和磷酸( h 3 p 0 4 ) 作为磷酸钙粉体制备的 原料；选用氧化铝( a 1 2 0 3 ) 、氧化镁( m g o ) 和磷酸( h 3 p 0 4 ) 制备粘结剂。所有原料都是分析 纯。 ( 2 ) 设备 t g 3 2 8 a 光电分析天平( 上海精密科学仪器有限公司) ：称量范围0 - 2 0 0 克，精确度为 0 1 毫克： 7 8 1 磁力加热搅拌器( 浙江乐清乐成电器厂) ； n c l 0 1 1 a 电熟鼓风干燥箱( 南京市长江电器仪器厂) ：工作室体积( m m 3 ) 3 5 0 x 4 5 0 x 4 5 0 ，额定功率3k w ，温度范围为室温3 0 0 ，恒温灵敏度i l 。c ； s x 一5 1 2 电阻炉( 南京光英炉业有限公司) ； 2 2 性能测试方法及原理 “) 物相组成分析 本研究采用s h i n a d z u x d 3 a 型x 射线衍射仪对磷酸钙粉体和磷酸钙生物陶瓷多孔支 架进行物相分析，实验条件为：c u - k 。辐射，波长为0 1 5 4 1 8n m ，电压4 0 k v ，电流3 0m a ， 测量角度误差小于o 0 1 。 ( 2 ) 热分析 利用n e t z s c hs t a 4 4 9 c 热分析仪，对粉体的煅烧和生物陶瓷多孔支架的烧结过程 进行热重( t g ) 和差示扫描量热法( d s c ) 分析。实验条件为：实验起始温度为环境温度， 实验终止温度为1 2 0 0 。c ，升温速率l o 。c m i n ，气氛为氮气。 ( 3 ) 多孔支架的结构分析 本研究分别采用h i t a c h i 和j s m 6 3 0 0 扫描电子显微镜，对多孔支架样品的孔隙形貌 和微观特征进行分析。 ( 4 ) 多孔支架的孔隙率测试 基于阿基米德法进行测试【3 8 。9 1 ，采用比重瓶，在恒温3 0 条件下测定，具体操作如 下：选用一个比重