（遗传学专业论文）原核表达小鼠嗅觉受体mor28及其多克隆抗体的制备.pdf

摘要 哺乳动物每个嗅觉感受神经( o s n ，0 1 f a c t o r ys e n s en e u r o n e s ) 从超过数百个甚 至上千个嗅觉受体( 0 r ，o l f a c t o r yr e c e p t o r ) 基因中，只选择一个进行表达，这种表 达调控方式是产生嗅觉的遗传学基础。经过相关研究实验推测，o r 的这种表达方式的调 控机制包括o r 的负调控作用：当每个0 s n 成功表达一个有功能的o r 后，此0 r 将抑制 其它o r 的表达，使o s n 只表达这个o r 。但在此过程中，0 r 具体是如何反馈抑制其他o r 的表达，现在仍不清楚。 0 r 蛋白进行反馈调控的具体途径有以下几种可能性：1 o r 结合到其它转录因子或 上游激活因子上，使其失活或活性大大降低，以进行反馈调控；2 0 r 直接或与其它转录 因子共同作用，结合到相关的顺式调控元件上，使此顺式调控元件的活性受到抑制，以 进行负调控。 本实验旨在原核表达小鼠嗅觉受体2 8 ( m o r 2 8 ) ，并制备其多克隆抗体。此抗体将用 于对上述o r 蛋白反馈调控具体途径的推理进行研究。 以小鼠基因组d n a 为模板扩增出小鼠嗅觉受体2 8 基因的部分序列s m o r 2 8 ( s h o r t m i c e0 1 f a c t o r yr e c e p t o r ) ，将其连接到p e t 2 8 a ( + ) 骨架载体上，构建原核表达载体 p m o r 2 8 。p m o r 2 8 表达载体诱导表达，s d s p a g e 检测目的蛋白的表达情况。利用n i n t a 琼脂糖提纯表达的目的蛋白s m o r 2 8 ，s m o r 2 8 经透析除盐，冻干浓缩后，免疫兔子制备 其抗兔多克隆抗体。经w e s t e nb l o t t i n g 检测，s m o r 2 8 的抗兔多克隆抗体特异性及滴度 较好。 关键词：嗅觉受体蛋白；多基因家族；抗原性；多克隆抗体：表达载体 a b s t r a c t e a c ho l f a c t o r ys e l l s en e u r o n ( 0 s n ) c h o o s ej u s to n eo l f a c t o r yr e c e p t o r ( o r ) f r o mt h e m o r et 王l a n1 0 0 0p o s s i b i l i t i e se n c o d e di l lt h eg e n o m ea n d 缸a n s 硎b e si t 丘d mj u s to n ea 1 1 e l e 1 h i sp r o c e s sg e n e r a t e sg r e a tn e u r o n a ld i v e f s i t ya n df o n n st h eb a s i sf o r 铂ed c v e l o p m e ma n d 1 0 9 i co f 也eo l f a c t o r yc i r c 疵b 曲e e nm en o s ea dh 血 t h em e c h a i l i s mb e dt l l i sm o n o a l l e l i cr e g u l a t i o nh a sb e e nm es u b j e c to fi n t e n s e s p e c m a t i o n r e c e n tg e n e t i ce x p e r i m e m sh a v eb r o u g h tt l l eo u t l i n eo ft h ep r o c e s si n t os h a r p e r r e l i e ei d e n t i 聊n gaf e e d b a c km e c h a n i 锄i nw h i c ht l l ef i r s to l f 砬t o r yr e c e p t o re x p r e s s e d ， g 雠e r a t e sas i g i l a l 也a ts 协m 1 i z e si t sc h o i c e ，m u sm a j m a i l 血gs 协g u l a rs d e c t i o n t h e r ea r et v p o s s i b l ef b e d b a c kw a y s ：( 1 ) a c 血培a saf e e d b a c kf a c t o r ，o rb i n d st oo m e r 缸锄s 翻p t i o l l a lf 犯o r ( 2 ) a c t i n ga saf e e d b a c k 缸t o r ，o rb i n d st or e g u l a t i o nr e 舀o no fo t h e r o rg e n e s t bs t u d yt h et 、o p o s s i b l ef e e d b a c kw a y sj u s tm e n t i o n e d ，w ee x p r e s sa n dp u r i 母p a n 锄i n oa c i do f m i c e0 1 t o r yr e c 印t o r 2 8 ( s m o r 2 8 ) i ne ，c o i ia n dp r e p a r er a b b i t 趾t i s m o r 2 8 a 1 1 曲o d y t h e 趾t 沁m m ub eu s e dt o s t u d y o rf e e d b a c km e c b 砌s m b y i i 抑i i n u n o p r e c i p i t a t i o na n do 也e rm e t h o d s p a r ts e q u e n c eo fm i c e0 1 f a c t o r yr c c 印t o r 2 8g e n e ( s m o r 2 8 ) h a sb e e n 砌p l i f i e df m mt h e r n i c eg e n o m eb yu m i z i n gp c r n ep r o d u c t sh a v eb e e nl ig a _ t e di m om ep e t 2 8 a ( + ) v e c t o r p i a s m i d w bo b t a i ns m o r 2 8e x p r e s s i o nv e c t o r sp m o r 2 8s u c c e s s f i l l l y e x p r e s s i o nv e c t o r s p m o r 2 8w e r ei n d u c e d ，s d s p a g ea s s a yd e t e c te x p r e s s e dp r o d u c t s w ep u r i 匆s m o r 2 8b y u l i l i z i l l gn i - n 1 aa g a r o s e p 岫f i e dp m t e i n 、a sd i a l y s e da 1 1 d 雠e z e d d r yt 0 叫e c tr a b b i t p r e p a r i gr a b b i t 雒t i s m o r 2 8 趾t i b od y w e s t e mb l o 札i n ga s s a ys h o w st h a t 恤ep o t e n c yo f t h i s r a b b i ta n t i - s m o r 2 8a n t i b o d yi s9 0 0 d k e yw o r d s ：o l f a c t o r yr e c e p t o r ；m u l t i g e n ef a m i l y ；a n t i g e n i c h y ；p o l y c l o n a la n t i b o d y ； e x p r e s s i o nv e c t o r i t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王数丑日期：趔：兰：丛 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复 印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：王塑i 血指导教师 日 期：醴：“日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： l 引言 化学信号深刻的影响着动物的行为，并对动物的生存有着重要的意义。哺乳动物用 两套嗅觉系统对化学信号进行探测，主嗅觉系统和犁鼻器。前者能够对环境中的大多数 挥发性化学物质进行识别，并与不同的行为表现相联系：如寻找食物，反捕和标记领域 等；后者主要处理社会和繁殖信息，识别同种动物释放的信息素。我们通常所说的嗅觉 是针对主嗅觉系统而言的。 1 1 哺乳动物的嗅觉及嗅觉受体 主嗅觉系统能探测到小的，挥发性的气味分子，这些气味分子大部分是疏水性的化 合物。哺乳动物的嗅觉系统识别气味的能力十分惊人，即使气味分子的浓度很低，也能 探测到。人类能识别数千种不同的气味，而某些动物的嗅觉更为发达【i ”。 嗅觉检测的原初过程发生在位于鼻腔中的特异性的嗅觉神经元。嗅上皮有三类细 胞：感觉神经元，支持细胞，基底细胞。嗅觉神经元是双极细胞，其树突伸展到粘膜表 面，树突末梢膨大形成一定数目的纤毛，扩大了与气味分子相互作用的表面。嗅觉神经 元的轴突投射到脑的嗅球，这是嗅觉系统的初级信号转换站；在此可以识别不同的气味。 1 1 1 嗅觉受体的分布 气味识别的起始是通过嗅觉神经元纤毛上特异性的受体与气味相结合。小的挥发性 的有机分子随呼吸气流到达鼻腔的嗅上皮。嗅上皮处有百万个嗅觉感受神经元( o s n ， o l f a c t o n rs e n s en e u r o n e s ) ，0 s n s 的树突延伸到鼻腔中，其末梢形成5 一l o 个纤毛，这是 真正的化学感受结构，他们包埋在保护鼻腔的黏液中，纤毛的膜上有特异性的嗅觉受体 ( o r ，0 1 f a c t o r yr e c e p t o r ) 。 1 1 2 嗅觉受体蛋白及氨基酸序列特点 嗅觉受体蛋白属于g 蛋白偶联受体( g p c rg p r o t e i i l - c o u p l er e c e p t o r s ) ，结构上具 有7 个螺旋状跨膜结构，是7 次跨膜蛋白。各种气味受体蛋白的长短不一，但都具有7 个长度为1 9 2 6 个氨基酸的疏水区( 跨膜区) 。氨基酸链的n 端在细胞膜内，c 端在膜 外，这样在细胞膜的两侧各形成3 个环。通过比较分析哺乳动物不同的o r s 的氨基酸序 列发现有几处序列基元( 恒定区) ，其中最明显的是第3 跨膜区t m 3 ( n 锄s m e m b r a n e d o m a i n ) 的尾端和膜内第2 环i c 2 ( i n 竹a n c e l u l a r1 0 0 p ) 头端之间氨基酸残基 m a y d r y 、，a i c ，另外还有i c l 的l h t p m y ，t m 5 尾端的s y ，t m 6 头端的f s t c s s h 和1 m 7 的p m l n p f 等。相反，在第3 ，4 ，5 跨膜区的氨基酸序列则表现出显著的多变 性，可能与形成气味分子的结合部位有关，这一特点可以解释嗅觉受体能和数量众多的 气味分子相结合的现象【l “。更重要的是，利用o r 蛋白存在一致的氨基酸序列的特点设 计各种寡核苷酸引物，利用p c r 克隆出o r 的核苷酸序列，用于0 r 基因的研究。 1 1 3 嗅觉受体基因 嗅觉受体蛋白是由一个巨大的多基因家族编码的，它们组成了哺乳动物最大的一个 基因家族【1 ，2 0 1 。1 9 9 1 年b u c k 和a x e l 发现了一个被认为是嗅觉受体的跨膜蛋白家族，克 隆并测序了其中的1 8 个编码这些蛋白的基因，全都仅限于在嗅上皮上表达。这一发现 被认为是对产生嗅觉的机制研究的重大突破，并且因此两人获得了2 0 0 4 年的诺贝尔生 理学和医学奖。现在已经知道人类约有9 0 0 个嗅觉受体基因，占基因组总数的2 ，其 中约5 6 0 个是假基因1 3 3 2 1 ；小鼠约有1 3 0 0 个嗅觉受体基因，其中包括几百个假基因33 1 。 分析这些基因发现：o r 基因编码区无内含子，但在编码区和5 端非翻译区之间有一长 的内含子，o r 基因以1 0 个或更多成员组织成基因簇形式，基因簇平均长约3 5 0 k b ，基 因间隔平均1 5 k b ，这些基因簇几乎遍布所有的染色体上【2 】。 1 20 s n 表达0 r 可能的调控机制 每个o s n 从超过1 0 0 0 个o r 基因中，只选择一个进行表达，并且反转录它的一个等 位基因【2 鼬，2 4 1 。这个过程产生大量的分化的0 s n ，为鼻和脑之间形成嗅觉通路奠定基础。 o r 的单个等位基因表达的调控机制备受人们的关注，而近期的研究工作使我们对这个过 程有了进一步的认识。 鼻子在环境中识别化学信息，并将它们转变成神经信号，使脑能分辩成千的气味分 子，并给予动物嗅觉。在小鼠中，o r 基因超过一千个，o r 的数量如此巨大，暗示了每 个气味分子可能产生唯一的信号，这个信号是通过气味分子与数量相对有限的o r 相互 作用而产生的。这些相互作用形成足够多的：1 0 4 一1 0 5 种动物能感知的气味信号。大脑 确定呈现的是什么气味，就必须确定哪个o r 被激活了，而嗅觉系统的两个特性使这项 任务变得更为简单。首先每个o s n 只表达一个0 r ，第二表达相同0 r 的0 s n 的轴突汇集 到嗅球中同一个嗅小球中1 1 4 0 3 2 们，因此大脑能通过识别那个嗅小球被激活而确定那些o r 结合了气味分子。这将在嗅球中产生一个感觉的局部解剖图，因此气味性质由嗅球中不 同的空间部位的活化来确定2 8 3 l ，锄。这种在0 r 与嗅小球中一对一的关系对于它们之间的 嗅觉信号通路是十分重要的，而这一对一的关系也依赖于o r 基因家族表达的正确调控： 一个o s n 只表达一个o r 。 1 2 10 r 基因表达调控的几个假说 在对其他多基因家族的基因研究的基础上，推测0 r 基因表达调控可能的机制有3 个i9 j ：d n a 重组，基因转换( g e n ec o n v e r s i o n ) ，基因座控制区( l c r ，1 0 c u sc o n t r o lr e g i o n ) 的调控。( i ) d n a 重组使启动子和增强子区域靠近基因编码区；( i i ) 基因转变：使一个 复制的o r 基因转座到一个表达框中；( i i i ) l c r 的调控：l c r 只与一个位点处的启动子 相互作用2 1 。支持不可逆的d n a 变化( 包括d n a 重组，基因转变) 这些假说的实验数 据很少。 通过荧光原位杂交( f i s h ) 的方法对小鼠o s n 中o r 基因m o r 2 8 进行分析，对其d n a 及r n a 做f i s h 以检测其基因序列在染色体上的位点及转录活化位点 8 】。d n a f i s h 检测 到两个基因位点：一个来自母本，一个来自父本。r n a f i s h 检测结果：m o r 2 8 从2 个 基因位点中的1 个转录。这些试验证明o r 基因是单等位基因表达的，并且排除了基因 转变的可能性。如果发生基因转变，应该有第三个d n a f i s h 位点，这个位点应该是转 录活跃，但实际上，没有检测到额外的基因位点。 1 2 20 r 基因选择的2 个模型 0 r 基因选择有2 个模型【2 7 】( 1 ) 决定模型( d e t e r m i n i s t i cm o d e l ) ：由唯一的反 式作用因子与单个o r 基因的顺式作用元件相结合，而使1 个o r 被选择。在这个基因活 化的模型中，将包括一个额外的调控水平，可能类似于x 异染色体失活的过程，因为激 活因子的结合将同时激活0 r 基因的2 个等位基因；( 2 ) 随机模型( s t o c h a s t i cm o d e l ) ：o r 选择是随机的，选择机器或选择过程是唯一的，同时只能与o r 的一个等位基因相互作 用，这个机制可能包含一个对所有o r 基因都通用的顺式作用元件，可以启动o r 基因的 随机选择，一系列在小鼠中的转基因实验都支持这个模型【7 埘舯，2 2 3 0 1 。利用酵母人工染色 体y a c 转基因小鼠研究m o r 2 8 基因簇表达调控，发现基因上游区域截短后，y a c 上的任 何o r 基因都不表达了。对小鼠及人基因组进行比较后，发现在m o r 2 8 基因簇上游远端 有2 k b 的同源区，此区称为“h 区”【1 7 】，将h 区连接到截短的y a co r 基因簇上游，则 能恢复y a c 上o r 基因的表达。将h 区连接在靠近基因簇的位置时，近端o r 基因表达的 几率大大升高了，而下游的o r 基因则很少被选择【2 4 ，2 郇。 1 2 3o r 基因表达的负调控 在o s n 中一旦一个o r 基因被选择表达了，o s n 如何保持识别它，并阻止其他0 r 基 因的表达? 当o s n 与嗅小球形成突触以后，o s n 必须保持0 r 选择的稳定性，因为使每个 0 s n 保持其表达的o r 不变，对于将此o r 所识别的气味解码成嗅觉信号是很重要的。在 轴突投射的过程中，保持o r 表达的稳定也是十分重要的，这将决定轴突投射的嗅小球 的位型5 ，3 ”。使o s n 中o r 的选择稳定似乎也包括第一个表达的o r 对于o r 选择过程的 反馈抑制1 1 2 】。通过转基因小鼠研究这个问题：所转的0 r 基因开放阅读框缺失或产生截 短的蛋白质，并通过与l a c z 或g f p 共表达而被标记【2 5 j 。选择表达突变o r 的o s n 以很高 的几率表达另一个o r 并将轴突分散的投射到嗅球上 4 12 ”# 。在对照实验中，表达完整 0 r 转基因的0 s n 不再表达另一个0 r ，并将它们的轴突投射到一个嗅小球中去。f e i n s t e i n e t a l 用同源重组的方法将0 r 的编码区用g f p 基因代替，发现带有绿色荧光的0 s n 与表 达完整o r 转基因的对照细胞相比，表现出比较混杂的气味敏感性。综合这些实验数据， 说明一个有功能的0 r 能调节o s n 对o r 选择的稳定性，使0 s n 保持只表达此o r 。一个无 功能的o r 不能产生这样的反馈信号，而细胞在成功的表达一个有功能的0 r 之前，则继 续选择不同的0 r 基因，当表达了一个有功能的0 r 之后，缺陷的0 r 等位基因被关闭。 新表达的有功能的o r 稳定o s n ，使其进入一个只表达此0 r 的阶段。有趣的是，实验观 察到转基因m o r 2 8 被选择后，它的不稳定性和变化几率约是1 0 。因此，选择突变或野 生型0 r 的o s n 可能变化，尽管几率不同，而且转变表达另一个o r 的几率与初始选择一 个o r 的几率相似。这说明o r 选择的变化代表重新进入选择过程，并不是0 r 起始选择 机制的不同。o r 选择变化发生在o s n 发育的早期：在以o r 指导轴突投射到嗅小球之前。 3 因此形成这样一个模型：0 s n 以单一的选择机制或有限的动力学过程( 包括l c r ) 随机的 选择一个0 r ，初始表达的0 r 不稳定，但一个有功能的o r 可能反馈调控0 s n ，使其稳定 的只表达此0 r f l 6 】。 1 3m o r 2 8 基因 小鼠0 r 2 8 基因簇位于1 4 号染色体，包括6 个基因：m o r 2 8 ，1 0 ，8 3 ，2 9 a ，2 9 b 和3 0 。 序列分析显示m o r 2 8 ，1 0 ，8 3 氨基酸序列相似度为7 5 一9 5 。人的与这个基因簇同源的 基因簇位于人1 4 号染色体上，包括5 个基因：h o r 2 8 1 0 ，8 3 ，2 9 a ，2 9 b 和3 0 6 1 1 ，1 7 ，1 8 1 。 1 4 立题依据及研究意义 哺乳动物每个嗅觉感受神经( 0 s n ) 从超过数百个甚至上千个嗅觉受体( o r ) 基因 中，只选择一个进行表达，并且只表达这个o r 基因的一个等位基因。这种表达调控方 式是产生嗅觉的遗传学基础。经过相关研究实验推测，这种o r 表达方式的调控机制包 括o r 的负调控作用：当每个o s n 成功的表达一个有功能的o r 后，此0 r 将抑制其它0 r 的表达，使o s n 只表达这个o r 。但在此过程中，o r 具体是如何反馈抑制其他o r 的表达 的，现在仍不清楚。 研究0 r 表达调控机制的有关实验工作，很多都是用小鼠m o r 2 8 为材料进行的( 包 括基因编码区及上游调控区序列分析，同源性比较；d n a f i s h ，r n a f i s h ：m o r 2 8 转 基因小鼠等) 。用m o r 2 8 的转基因小鼠研究0 r 的负调控作用时，为了标记m o r 2 8 ，以便 于观察试验结果，有关研究组将m o r 2 8 基因与g f p 基因或l a c z 基因共同连到一个y a c 上，转入小鼠体内，这样表达m o r 2 8 的o s n 将同时表达g f p 或l a c z 。我们可以通过检测 g f p 或l a c z 以确定哪个0 s n 表达m o r 2 8 了。但这种方法不能检测m o r 2 8 具体是如何进行 反馈调控的。 o r 蛋白进行反馈调控的具体途径有以下几种可能性：1 o r 结合到其它转录因子上 或激活因子上，使其失活或活性大大降低，以进行反馈调控；2 m o r 2 8 直接或与其它转 录因子共同作用，结合到相关的顺式调控元件上，使此顺式调控元件的活性受到抑制， 以进行负调控。 为了对上述o r 反馈调控途径的推理进行研究，我们用原核表达系统这种快速方便 的表达系统，表达m o r 2 8 ，以其为抗原，制备兔源多克隆抗体。此抗体将用于免疫共沉 淀等方法，分离其它可能与m o r 2 8 相作用共同进行负调控的转录因子或激活因子，以及 检测m r 2 8 是否与相关嗾式作用元件相互作用。 4 2 1 实验材料 大肠杆菌( ec o f ) d h 5d 大肠杆菌( ec d f f ) b l 2 1 ( d e 3 ) p m d 1 8t - v e c t o r p e t 2 8 a ( + ) 小鼠( m u sm u s c u 山s ) 2 2 试剂与药品 p c r p r e m i x p h 伍i1 8t _ v e c t o r t 4d n a l i g a s e p 血n e r r e s 锄c t i o ne n d o e m m e n i n t a a g a r o s e r n a s e d n a 片段快速纯化回收试剂盒 a m p i c i l l i n y j a s te x 订a c t a g a r o s e a g a r k a i l 锄v c i ns u l f 乱e a c r v l a m i d e b i s a c r v l a n l i d e a m m o n i u m p e r s u l f a t e t e m e d g l y c i n e e d t a s d s t r i s t r y p t o n e i p t g a e c t w e e n 一2 0 辣根酶标记山羊抗兔i g g ( h + l ) 2 材料和方法 5 北京鼎国 北京鼎国 i 擞水a 公司 p r o m e g e 吉林大学动物实验中心 1 百k a r a 聊：a r a i 般a r a t a k a r a t a k a r a q n g e n 瑚( a i h 北京鼎国 g e n v i e w o x o i d o x o i d ，s p a l l i s h 北京鼎国 j 印a n b b i b b i b b i b b i b b i b b i b b i b b i b b i b b i 上海生工 宝泰克 北京鼎国 2 3 实验仪器 p c r 仪 台式高速离心机 凝胶成像系统 暗箱式紫外检测仪 核酸水平式电泳槽( b 3 3 0 型) 双垂直电泳槽 恒温振荡培养箱 恒温培养箱 恒温循环式水浴锅 水平摇床 电热恒温水浴锅 电子天平 微量移液器 一2 0 冰箱 4 冰箱 真空冻干机 美国应用生物公司g e n e a m 口9 6 0 0 上海安亭科学仪器公司 p h a n n a c i a 公司 北京鼎国 北京六一厂 北京六一厂 江苏金坛医疗仪器厂 上海精宏实验设备有限公司 北京博医康仪器有限公司 北京鼎国生物公司 天津市泰斯特仪器设备有限公司 o h a u sc o r p u s a 日本三洋 h a i e r h a i e r 湖南湘仪科学仪器设备有限公司 2 4 常用试剂配制 ( 1 ) l b ( l u s i a b e r t a n i ) 液体培养基( 表2 1 ) 表2 1 细菌l b 培养基( 1 l ) 试帮名称用量 细菌培养用的酵母提取物( y e a s te ( t r a c t ) 细菌培养用的胰蛋白胨( b a c t op e p t o n e ) n 丑c l d h 2 0 g 1 0 9 1 0 9 1 0 0 0 m l 用5 m o l 几n a o h ( 约1 ，2 m l ) 调节p h 值至7 4 ，加入去d h 2 0 至总体积为1 l ，1 0 3 4 1 0 p a 高温蒸汽灭菌2 0 m i n 。室温冷却至5 0 ，加入抗生素( 根据实验需要) 。 ( 2 ) l b 固体培养基 方法参照l b 液体培养基的配置，高温灭菌前加入琼脂1 2 9 l 。 ( 3 ) t e 缓冲液 t e 缓冲液含有1 0 m m o l lt r i s c 1 和1 m m 0 1 l e d l a ，溶液的p h 为8 0 。 ( 4 ) t a e 缓冲液( 表2 2 ) 表2 2t a e 缓冲液的配制( 1 0 ) 试剂名称用量 t r i s 冰醋酸 o 5 m o 儿e d l - a ( p h8 0 ) 棚2 0 4 8 4 9 1 1 4 2 m l 2 0 m l 至1 0 0 0 m l ( 5 ) 胰r n a 酶( r n a s e ) 用l o m m o 忱的t d s c l ( p h 7 5 ) 和1 5 m m o 扎的n a c l 配制成溶剂，溶解胰r n a s e 至最终浓度为1 0 m g m l 。 ( 6 ) 氨苄青霉素 1 9 氨苄青霉素( a m p ) 溶于1 0 0 m l 无菌水中，过滤除菌后分装，最终浓度为 1 0 0 m 咖l ，2 0 保存备用。 ( 7 ) 卡那霉素 l g 卡那霉素( k 眦) 溶于1 0 0 m l 无菌水中，过滤除菌后分装，最终浓度为1 0 0 m g m l ， - 2 0 保存备用。 2 5 实验方法 本论文实验设计的流程参见图2 1 。 图2 一l 本论文实验设计流程 2 5 1 质粒的构建 1 小鼠基因组d n a 的提取 从鼠尾中或其他小样本中制备基因组d n a ，需如下试剂： ( 1 ) 乙醇 ( 2 ) 异丙醇 ( 3 ) 酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1v v ) ( 4 )s n e t 的配制：2 0 m m o l lt r i s c l0 h 8 o ) ，4 0 0 m m 0 1 ln a c l ，1 ( w ) s d s 需要 r 经过o 4 5 的硝酸纤维素滤器滤菌，无菌溶液每份5 0 r n l 保存于室温 ( 5 ) 蛋白酶k ( 2 0 m g m l ) ，一2 0 保存 具体操作步骤如下： ( 1 ) 准备适量的裂解缓冲液( s n e t 加入蛋白酶k ，终浓度4 0 0 m m l ) 向鼠尾或 其他组织中加入裂解缓冲液( 表2 3 ) ； 表2 3 加入s n e t 裂解缓冲液的体积 ( 2 ) 管子垂直放置于振荡平台或振荡恒温箱中5 5 放置过夜； 消化过程中样品的充分混匀是非常重要的，过夜消化后，应当看不到组织或鼠尾， 缓冲液呈灰色乳状液； ( 3 ) 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，密闭管口，室温下置于振荡平台3 0 m i n ( 如 需要大分子质量的d n a ，注意尽量减少剪切力) ； ( 4 )离心分离有机相和水相，转移上层水相至一新的微量离心管中； ( 5 ) 加入等体积的异丙醇沉淀d n a ，4 ，1 3 2 5 0 9 离心1 5 m 缸收集沉淀的d n a ； ( 6 ) 小心除去异丙醇，将d n a 沉淀，侵于1 m l 7 0 乙醇中。如果沉淀较松散， 再离心5 m i i l ，除去7 0 的乙醇，室温下空气中干燥沉淀约1 5 2 0 m i n ； ( 7 ) 加入0 5 m i ，t e ，4 下轻柔振荡过夜使核酸沉淀溶解； ( 8 ) 将溶液转移到微量离心管中，一2 0 保存。 2 引物设计 根据n c b in u c l e o d d e 序列库中m o r 2 8 基因序列，利用p r i m e rp r e m i e r5 o 设计引物： s e n s e l： 5c a a a g g c t g t c c t c a t c a a c3 s e n s e 2 ：5a t 酊c c t g a c a c t g g t t g g3 a n t i s e n s e l ：5t t t c c c c t c t t t t c t c c t 9 3 引物s e n s e l 是从m o r 2 8 基因序列第5 个碱基处开始设计的。由于引物 s e n s e l a n t i s e n s e l p c r 扩增产物在m o r 2 8 基因序列第8 8 9 4 位7 个连续t 处不能正确 合成，总是少个t ，合成的是6 个连续的t ，因此引物s e n s e l 舍弃不用。 引物s e n s e 2 是从m o r 2 8 基因序列第1 1 2 个碱基除开始设计的，引物 s e n s e 2 a n t i s e n s e l 组合，参数较好。( 表2 4 ，2 5 ) 表2 4 引物s e n s e 2 ，a n 恤口s e l 的参数( 1 ) 表2 5 引物s e n s e 2 ，a n 也e n s e l 的参数( 2 ) 3 p c r 扩增目的基因片段s m o r 2 8 以小鼠基因组d n a 为模板，利用引物s e n s e 2 a n t i s e n s e lp c r 扩增的目的基因片段 命名为s m o r 2 8 ( s h o r tm o r 2 8 ) 。 ( 1 ) 一次p c r 反应体系( 表2 6 ) ： 表2 6 一次p c r 反应体系( 5 0 l 体系) 反应组分用量 s e t l s e 2 ( 2 州) a n t i s e n s e l ( 2 u m ) 模板d n a p r e m i x d h 2 0 5 l l l 5 u l 2 皿( 约0 2 一o 3 岭) 2 5 u l 补足至5 0 u l ( 2 ) 一次p c r 反应条件 9 4 8 m i n 9 4 1 m i n 、 l 5 5 4 0 s e c 卜3 0 c y c l e s 7 2 l m i n 7 2 1 0 m i n 4 2 h ( 3 ) 二次p c r 反应体系( 表2 7 ) ： 表2 7 二次p c r 反应体系( 5 0 肛l 体系) 反应组分 用量 s e n s e 2 ( 2 咂) a n t i s e n s e l ( 2 m ) 一次p c r 产物稀释1 0 倍 p r e m k d h 2 0 1 0 皿皿此驰黏驯叫娜跬 ( 4 ) 二次p c r 反应条件： 9 4 3 m i n 9 4 1 m i n 、 5 5 4 0 s e c 卜3 0 c y c l e s 7 2 l m i n 一 7 2 1 0 m i n 4 2 h p c r 反应结束后，用1 5 琼脂糖凝胶电泳分离目的条带，然后利用d n a 纯化回 收试剂盒纯化回收p c r 产物。具体操作步骤如下： ( 1 ) 切取含目的片段的琼脂糖，捣碎按重量比1 ：3 加入溶液a ； ( 2 ) 5 0 水浴1 0 m i n ，期间可振荡助溶，待溶化后置室温加入1 5 此溶液b ，充分 混匀； ( 3 ) 将溶液置于离心柱中，静置2 m i n ，8 0 0 0 r p m 离心2 0 3 0 s e c ： ( 4 ) 倒掉液体，加5 0 0 止，溶液c 于离心柱中8 0 0 0 r p m 离心2 0 3 0 s e c ，弃液体； ( 5 ) 重复步骤( 4 ) ； ( 6 ) 1 2 0 0 0 r d m 再次离心1 r n i n ，甩干剩余液体以除去残余酒精： ( 7 ) 将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖风干5 1 0 m i i l ，使乙醇挥发殆 尽： ( 8 ) 加入2 0 3 0 u l 溶液d ( 5 0 水浴) ，静置2 m i n ： ( 9 ) 1 5 0 0 0 r p m 离心1 m i n ，管底溶液即为所需d n a ； ( 1 0 ) 琼脂糖凝胶电泳粗算回收d n a 浓度； ( 1 1 ) 贮存于一2 0 保存备用。 4 连接与转化 缠毡鳇b 亡麴皇里! ! q 数整撞( 塞2 ：墨2 i 表2 8 连接反应体系 反应组分用量 l g 鲥o ns o l m i o ni t - v e c t o r d n a 片段 d h 2 0 5 u l l 儿 1 u l 补足至1 0 吐 1 6 连接过夜。d n a 片段为纯化回收的s m o r 2 8 基因片段。s m o r 2 8 基因片段与t v e c t o r 连接构成质粒t s m o r 2 8 。 剑釜太墅拄萱盛墅查堡庭； ( 1 ) 大肠杆菌d h 5o 、b l 2 1 ( d e 3 ) 的甘油菌按1 ：1 0 0 接于3 m l 的l b 液体培 养基的试管中，3 7 摇床培养过夜； ( 2 ) 取1 m l 菌液转接到l o l 的l b 液体培养基的锥形瓶中，3 7 震荡培养1 2 h ( 菌液o d 6 0 0 值o 4 0 6 ) ； ( 3 ) 将菌体转移到5 0 m l 的已灭菌的冰预冷的离心管中，冰上放置1 0 i n i n ； ( 4 ) 4 0 0 0 r p m ，4 离心l o m i n ，收集菌体细胞； ( 5 ) 倒掉培养液，将离心管倒置l 面n ，以便培养液彻底流尽； ( 6 ) 用冰预冷的o 1 m o l 几c a c l 2 溶液1 0 m l 悬浮沉淀细胞，冰浴3 0 m i n ； ( 7 ) 4 0 0 0 r p m 低温离心1 0 m i n ，收集菌体细胞； ( 8 ) 用冰预冷的o 1 m o l lc a c l 2 溶液2 m l 悬浮沉淀细胞，置于冰上； ( 9 ) 分装细胞，每1 0 0 此装于个微量离心管中： ( 1 0 ) 每个1 0 0 此细胞的微量离心管中加入等量4 0 甘油溶液，混匀，7 0 保存。 重组王整焦盍避j 王菌； ( 1 ) 取2 0 0 此甘油保存的感受态细胞，低温融化后，加入5 此重组质粒，混匀， 冰上放置3 0 m i i l ；同时做两个对照，即2 0 0 此感受态细胞，不加任何质粒d n a 和2 0 0 吐 感受态细胞，加入不带外源d n a 的空载体； ( 2 ) 将转化的混合物立即放入4 2 循环水浴中9 0 s e c ( 注意不要晃动) ： ( 3 ) 冰浴2 m i n ； ( 4 ) 在转化子中加入6 0 0 皿不含抗生素的l b 液体培养基，3 7 摇床培养1 h ： ( 5 ) 5 0 0 0 r p m 离心5 m i l l ，沉淀细菌细胞； ( 6 ) 吸弃约5 0 0 “l 上清液，将沉淀与剩余的上清混匀，分为1 0 0 止和2 0 0 此分别 涂在制备好的含加n p 的琼脂平板上。阴性对照的转化混合物，一部分涂于含a m p 的琼 脂平板，一部分涂于不含a m p 琼脂平板上，检测感受态细胞是否污染； ( 7 ) 待菌液完全被吸收后，3 7 倒置培养1 2 1 6 h 。 重缰王盥箍选! 采用兰白斑筛选方法，原理如下：蓝白斑筛选是根据组织化学的原理来筛选重组体。 主要是在载体( 载体) 的非必要区插入一个带有大肠杆菌b 半乳糖苷酶的基因片断， 携带有i a c 基因片断的载体( 载体) 转入l a c 。的宿主菌后，在含有x g a l 的平板上形成 浅蓝色的菌落( 噬菌斑) 。当外源基因插入l a c 后，重组的载体会失去分解x g a l 的能力， 转入l a c 的宿主，在含x g a l 的平板上形成白色菌落。非重组载体则形成蓝色的菌落。 5 重组子的p c r 鉴定及测序 厦揎的握塑； 在p h l 2 0 1 2 6 碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体d n a 变性，而共价闭环 ( c c ) 质粒d n a 仍为自然状态。将p h 调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 d n a 问交联形成不溶性网状结构。大部分d n a 和蛋白质在去污剂s d s 的作用下形成 沉淀，而c c 质粒d n a 仍然为可溶状态。通过离心，可去除大部分细胞碎片染色体d n a 、 r n a 及蛋白质，质粒d n a 尚在上清中，再用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒d n a 。 质粒提取需要如下试剂： ( 1 ) s t e 的配制：o 1 m 0 1 几n a c l ，1 0 r 衄o l l t 订s c l ( 口h 8 0 ) ，1 m m 0 1 ，l e d t a 。 1 ， ( 2 ) 溶液i 的配制：5 0 m m o l ，l 葡萄糖，2 5 m m o l l t r i s c l ( d h 8 0 ) ，1 0 n u n o l l e d t a 该溶液可配置成1 0 0 m l ，6 7 6 1 0 4 p a 高温灭菌1 5 m i i l ，4 贮存。 ( 3 ) 溶液的配制：0 4 i n o l l n a o h ，1 s d s ；该试剂需要新鲜配制，配制后将 n a c l 和s d s 按1 ：1 的比例混合。 ( 4 ) 溶液i i i 的配制( 表2 9 ) 表2 9 溶液i 的配制( 1 0 0 m l ) 药品名称用量 5 m o l lk a c 冰醋酸 h ，o 配置好的溶液i i i 含3 m o l ，l k a c 、5 m o l l 冰醋酸( p h 4 8 ) 。 过程： ( 1 ) 挑菌：琼脂培养板上的“白斑”单菌落，移至3 m l l b 液体培养基中( 含a m d 或m a ) ，或将大肠杆菌的甘油菌按l ：1 0 0 的比例接到l b 液体培养基中，3 7 剧烈摇 荡培养过夜； ( 2 ) 取出1 5 2 m l 菌液移至e p p e n d o r f 管中，1 2 0 0 0 r p m ，4 离心3 0 s e c ，弃上清， 用1 i n ls t e 悬浮菌体沉淀，洗涤菌体，再离心回收菌体； ( 3 ) 再重复用s t e 漂洗菌体，离心后，去尽上清液； ( 4 ) 将细菌沉淀悬浮于1 0 0 此冰预冷的溶液i 中，强烈振荡混匀； ( 5 ) 加入2 0 0 u l 新配制的溶液i i ，轻轻颠倒离心管5 次以混合内容物，不要强烈 振荡，放置冰上3 m i n 左右( 根据不同菌株，可适当缩短) ； ( 6 ) 加入1 5 0 血冰预冷的溶液i i i ，轻轻颠倒5 次，混匀，置于冰上3 5 m i n ； ( 7 ) 1 5 0 0 蛐蛐，4 离心5 m i n ，将上清转移到另一个离心管中； ( 8 ) 向上清中加入等体积的酚：氯仿( 1 ：1 ) ，混匀，1 5 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，将上 清转移到另一个离心管中； ( 9 ) 加入二倍体积冰预冷的无水乙醇，室温放置2 i n i n ，沉淀双链d n a ； ( 1 0 ) 1 5 0 0 0 r p m ，4 离心5 m i n ； ( 1 1 ) 倒掉