（遗传学专业论文）工业酿酒酵母菌株met10基因敲除及其用于工业生产可行性的研究.pdf

原刨性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明本声明的法律责任由本人 承担 论文作者签名。塑堕日期；竺! ：墨加 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：兰! 堕导师签名：垒盎堑 日期：丝妒 山东大学硕士学位论文 摘要 啤酒的维生素群以及矿物质含量丰富，并被列为营养食品。如果适量饮用， 啤酒绝对是对健康有益的低度酒精饮料啤酒中所含各种成分既有较高的营养价 值又具有良好的药疗效果。对于一些疾病有一定的预防及治疗作用 然而啤酒的老化是啤酒行业面临的严重问题，它直接关系到啤酒的销售及企 业的效益，如何解决啤酒的氧化问题已成为国内外研究的重点目前预防啤酒老 化有多种措施，其中最理想的措施之一就是构建具有能增加啤酒中亚硫酸盐含量 的酿酒酵母菌株 亚硫酸盐是食品及啤酒行业普遍采用的抗氧化剂。在啤酒酿造过程中能与醛 类物质发生加成反应而起稳定风味的作用然而在啤酒酿造过程中形成的亚硫酸 盐被亚硫酸盐还原酶还原而不能在啤酒中积累，故其在发酵液中含量一般较低， 不能起到稳定啤酒风味的作用。酿酒酵母m e t l o 基因编码亚硫酸盐还原酶的a 亚 基，该基因部分或全部缺失会使亚硫酸盐还原酶失活，发酵液中亚硫酸盐不被还 原而得以积累。这样既能增强啤酒的抗氧化能力，又能增加啤酒风味的稳定性， 同时也可以解决传统发酵终了外加亚硫酸盐而导致啤酒产生h 2 s 的问题 本研究采用l f h p c r 法从质粒p f a 6 a - k a n m x 4 及酿酒酵母染色体上构建了 两端带有酿酒酵母m e t l o 基因同源序列的具有g 4 1 8 抗性的外源基因片段利用 完整细胞转化法将构建的外源基因片段导入工业酿酒酵母细胞内，外源基因片段 通过同源重组而整合于酿酒酵母染色体，破坏酿酒酵母m e t l o 基因从而得到 m e t l o 基因敲除菌株 通过1 吨发酵罐发酵试验，比较了m e t l o 基因敲除菌株和原始酿酒酵母工业 菌株的生长性状、发酵性能及啤酒中乙醛、酯、高级醇及亚硫酸赫等成份的含量， 发现m e t l o 基因敲除菌株较原始菌株生长快、发酵度高、发酵周期短；啤酒中游 离亚硫酸盐含量并未明显提高但啤酒中乙醛等醛类物质含量有较大程度的降低， 从而提高了啤酒风味的稳定性；m e t l o 基因敲除菌株对于发酵液中的双乙酰还原 能力较原始菌株差通过1 0 0 吨啤酒发酵罐发酵啤酒及贮存试验表明m e t l o 基 因敲除菌株酿造的啤酒比外加亚硫酸盐的啤酒口感更好。贮存时问也较长 关键词：酿酒酵母，抗氧化，亚硫酸盐还原酶，基因敲除，啤酒 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t b e e ri sa b u n d a n ti nv i t a m i n sa n dm i n e r a ls u b s t a n c e , b e n e f i c i a lt oh e a l t hi n a p p r o p r i a t ed e m a n d , s oi t i sc a l l e da sn u t r i t i o u sf o o d i n g r e d i e n t so fb e e ra 他v e r y n u t r i t i o u sa n dh a v eg o o de f f e c t so np r e c a u t i o na n dc u r ef o rs o m ed i s e a s e s b e e ra g i n gi ss t i l las e r i o u sp r o b l e mt ot h eb e e rb r e w i n gb e c a u s ei tc o u l ds h o r t e n t h es h e l fl i f ea n dc h a n g et h eg o o df l a v o ro fb e c r s om a n yr e s e a r c h e r sw e 他v e r y i n t e r e s t e di nt h i sp r o b l e m , a n dl o t so fm e a s u r e sh a db e e nt a k e nt op r e v e n tb e e ra g i n g u s i n gag o o ds 扛a i no fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei nb e e rb r e w i n gm a yb eo u eo ft h e b e s tw a y st os o l v et h i sp r o b l e m s u l f i t ei sw i d e l yu s e da sa na n t i o x i d a n ti nf o o da n db e e ri n d u s t r y i nb e e rb r e w i n g , s u l f i t eh a st h ea d d i t i o n a lr o l eo fs t a b i l i z i n gt h ef l a v o rb yf o r m i n ga d d u c t sw i t h a l d e h y d e s d u r i n gt h eb e e rb r e w i n g , t h ec o n c e n t r a t i o no fs u l f i t ei nb e e ri sr a t h e rl o w b e c a u s es u l f i t ec a nb ed e o x i d i z e db ys u l f i t er e d u c a 豫i ns c e r e v i s a e ，m e t l og e n e e n c o d e sas u b u n i to f s u l f i t er e d u c a 辩p a r t i a lo rf u l ld e l e t i o no f m e t l og e n er e s u l t e di n i n a c t i v i t yo fs u l f i t er e d u c a s e ，s os u l f i t ec o u l d a tb ed e o x i d i z e da n dw o u l db e a c c u m u l a t e di nb e e r b e e rb r e w e du s i n gm e t l og e n em u t a n t $ c e r e v i s a es w d l nm a y p r e v e n tb e e ro x i d a t i o na n d s t a b i l i z et h eb e e rf l a v o r af o r e i g ng e n et a r g e t i n gc a l s s c t t ew a sc o n s t r u c t e df r o mp l a s m i dp y e s 2a n d s c e r e v i s a eb yl f h p c r i tc o n s i s t e do fag 4 1 8 r e s i s t a n c eg e n ew i t hl o n gf l a n k i n g h o m o l o g yr e g i o n so fm e t l og e n e i tw a st r a n s f e n e di n t ot h ei n d u s t r i a ls t r a i nt h r o u g h t h ep r o c e d u r eo fi n t a c tc e l lt r a n s f o r m a t i o n i ti n t e g r a t e di n t os c e r e v i s a eg e n o m ed u e t oh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n t h u sm e t l og e u ew 笛d i s r u p t e da n da ni n d u s t r i a l5 f f a i n 、i l l lm e t l o g e n ek n o c k o u t e dw a so b t a i n e d 1 1 碡o n g m a ls t 阻i i ia n dt h em e t1 0g e n e k n o c k o u t e ds t r a i nd i f f e r e di ng r o w t hr a t e a n df e r m e n t a t i o np r o p e r t yi ni , 0 0 0 lf e r m e n t a t i o nt a n k s 1 1 圮l a t t e rg r e wa n d f e r m e n t e df a s t e rt h a nt h ef o r m e r , a tt h e 鬏蛐et i m et h ec o n c e n t r a t i o no fa c e t a l d e h y d e i nt h eb e e rp r o d u c t i o no ft h el a t t e rw a sl o w e rt h a nt h a to ft h ef o r m e r , t h o u g h d i s s o c i a t i v es u l f i t ec o n c e n t r a t i o ni nb o t hb e e rp r o d u c t i o nw a sa l m o s ta tt h es a m el e v e l 一坐至查茎曼主兰竺丝苎 o nt h ec o n t r a r y , t h ef o r m e r “a b i l i t yt or e d u c ed i a c e t y lw a s b e t t e rt h a nt h el a t t e r s t h e b e e rp r o d u c t i o nw i t ht h eg e n e k n o c k n u t e ds t r a i nt a s t e db e t t e rt h a nt h a to f t h eo r i g i n a l s t r a i ni nt h e1 0 0 ，0 0 0 lf e r m e n t a t i o nt a n k , a n dc o u l db es t o r e df o ra l o n gt i m e k e yw o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 。a n t i - o x i d a t i o n , 期垴t er e d u c a s e , g e n ek n o c k o u t , b e e r 3 山东大学硒士学位论文 第一章绪论 1 1 啤酒及啤酒的功能性 啤酒是以大麦和其它谷物为原料并添加少量酒花，采用制麦芽，糖化、发 酵等特定工艺酿制而成的它是一种含有少量酒精和充足二氧化碳具有酒花香 和爽口的口味、营养丰富、风味独特的低度酿造酒f 随着人们生活水平的不断提高，对啤酒的需求量越来越大比起其它的酿造 酒来，啤酒的维生素群以及矿物质含量都更丰富，如果适量饮用，啤酒绝对是对 健康有益的低度酒精饮料 1 9 7 2 年7 月1 日在墨西哥召开的第九次世界营养食品会议上，把啤酒正式 列为营养食品主要基于以下原因：一是啤酒含有大量和多种氨基酸：二是啤酒 含有较高的热量；三是营养成分易被人体消化和吸收啤酒中营养成分有：糖类、 糊精、蛋白质、维生素、无机盐类等啤酒中这些营养成分来源于原料和发酵期 问所生成，而且都以溶解状态溶于啤酒中啤酒中的各种营养成分都是以低分子 的形式存在，有利于人体的吸收，几乎不需要消化系统的辅助，吸收率可高达 9 5 以上，啤酒中碳水化合物和蛋白质的比例约在1 5 ：l ，最符合人类的营养平 衡 从某种意义上来说，啤酒可成为蔬菜水果的代用品啤酒含有1 8 种氨基 酸及7 种人体不能合成的和平衡人类营养的肽 2 1 3 1 近年来大量报导了酒花内含物质在药理学方面的优良特性：除抗菌作用和预 防骨质疏松或者动脉硬化外可能还具有抗癌作用 绿茶有抗肿瘤作用这种作用是来自于绿茶中的多酚类物质多酚类物质对 t r p p 2 变异原具有抑制作用，t r p p 2 是烹调食品时所产生的焦状物成分杂环胺的 代表，此成分会引起基因变异从而引发肿瘤现已发现，啤酒也有抑制t r p p 2 变异原的作用啤酒的这种作用可能与多酚类以外的成分也有关系州 在一篇关于流行病的论文中指出，啤酒饮用者( 同样包括葡萄酒饮用者) 比不 饮酒者较少感染螺旋幽门杆菌这种微生物是引起单纯性胃溃疡的根源日本科 学家已经证明，酒花一特别是蛇麻酮，具有很高的抗螺旋幽门杆菌的能力唧啤 酒花中的苦味物质以及单宁等各成分具有各种各样的药理作用主要有镇静作 4 山东大学硕士掌位论文 用，催眠作用、抗菌作用、抗生素作用、健胃作用和性激素作用等 3 1 1 6 1 2 啤酒风味老化及预防措施 啤酒的风味稳定性是指啤酒罐装后，酒的风味长期不变的可能性实际上， 啤酒罐装后，在保存过程中风味是不断变化着的开始时出现黑栗子味，随即 消失，而后出现甜味，面包味、焦糖味，奶酪味。严重时则出现纸板味和金属腥 味等【。l 同时口感也变得租、涩、后苦这一切风味上的变化习惯上称之为氧 化味、老化昧或败坏味啤酒的老化是啤酒行业面临的严重问题，它直接关系到 啤酒的销售及企业的效益因此如何解决啤酒的氧化问题已成为国内外研究的重 点 对引起啤酒风味老化的化合物的定性与定量工作和导致形成啤酒风味老化 的化学机理，以及相互之间反应的特征是分析与理解啤酒风味老化的前捌7 1 当 前国际上对啤酒风味不稳定性的来源、变化机制和防止方法正在不断的探索和 研究中随着检测手段与方法的日益完善，大量导致啤酒风味老化的物质逐渐被 检测出来嘲尽管已经采取了广泛的研究，但对于啤酒风味老化物质是怎样、什 么时候、在哪形成，啤酒研究人员甚至表达矛盾的观点其原因在于在酿造与贮 藏过程中，在分析与评价一些极其微量的成分以及它们在前驱物方面存在固有的 难度与差异b u r g e r 率先引入。纸板味”来描述啤酒老化风味特征。同时指出它 与羰基化合物的出现相关联1 9 ，大量的研究表明：挥发性长链不饱和醛类是导致 啤酒风味老化的原因而这些挥发性长链不饱和醛类中最重要的一种是反2 壬 烯醛【i o l ，其风味阈值是o 1 嵋，l ，它是啤酒风味老化的最仞来源这些羰基化合 物主要是一些挥发性的长链不饱和醛类这些醛类主要来自以下几个方面【硼： ( 1 ) 美拉德反应及斯特雷克尔降解 ( 2 ) 类糊精或多酚物质引起的高级醇氧化 ( 3 ) 异- 一酸的氧化降解 ( 4 ) 发酵过程中产生，没能被充分还原 ( 5 ) 不饱和脂肪酸的自氧化作用 提高啤酒的抗氧化性及风味稳定性，除了要对生产过程的各个环节加以控制 外，目前国内外啤酒厂家采用的提高啤酒风味稳定性的方法大致有以下几种l ； ， 山东大学硕士学位论文 l 啤酒生产菌株的改造； 2 添加酵母的方法【1 2 】： 3 使用抗氧化剂：亚硫酸盐、抗坏血酸、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠、葡 萄糖氧化酶等 1 3 啤酒中亚硫酸盐保持啤酒稳定的作用机制及其来源 亚硫酸盐是啤酒中一个含量较低而又重要的组分，其作为抗氧化剂以及降低 各种羰基化合物对啤酒风味的影响【哪1 而担当风味稳定剂的作用作为抗氧 化剂主要是由于亚硫酸盐能够结合氧而产生无毒害影响的硫酸根离子作为风味 稳定荆主要是由于亚硫酸盐能够与含醛类化合物结合产生不挥发性的亚硫酸盐 加成物【1 3 1 减少了啤酒中游离醛类物质的含量；d u f o u r 等采取核磁共振光谱分 析法测定分析啤酒中亚硫酸盐与不饱和醛类物质的反应特征模型z s ：k 出z c d a 等 阐明了亚硫酸盐能抑制自由基的反应1 1 4 1 ：t o s h i h i k o 采用液相色谱荧光检测器分 析了发酵与啤酒贮藏期间亚硫酸盐的变化趋判 1 啤酒中亚硫酸盐有多种来源，然而两个主要来源是发酵过程中酵母代谢产生 的和在啤酒瓶装或罐装前外加进的为了提高啤酒的口味稳定性生产中常常在 制麦汁和滤酒时添加亚硫酸氢钠、亚硫酸，液态s o z 等，添加量不超过2 0 p p m ， 最好在8 - - l o p p m ，可提高成品啤酒亚硫酸盐含量l 一2 p p m 亚硫酸盐含量小于 1 0 p p m ，不会引起不愉快的气味。过量则会产生硫的口味8 1 不确定的因素也可 以影响二氧化硫的含量，包括：麦汁成分，发酵工艺条件、酵母菌株与生理状况 【l | l i 9 1 大量啤酒研究人员认为：包装啤酒中亚硫酸盐含量在s - g p p m 对啤酒风味 稳定性是最合适的 由于亚硫酸盐对健康影响的缘故，其含量受到严格检查欧洲对食品添加剂 中二氧化硫含量限度是：瓶装啤酒中总二氧化硫含量q o p p m ，桶装啤酒中总二 氧化硫含量9 0 p p m 口“而美国市场整个二氧化硫的法定最高含量为1 0 p p m 1 4 酿酒酵母的亚硫酸盐代谢途径 硫酸盐迸人酵母细胞后，在a t p 硫酸化酶的催化下首先被三磷酸腺苷活 化经过一系列酶促反应后变为亚硫酸盐亚硫酸盐是中问产物，其进一二步被 山东大学硕士学位论文 亚硫酸盐还原酶还原后。形成硫化氢嗍亚硫酸盐能与啤酒中主要的老化物质羰 基化合物通过复杂的反应，生成对风味稳定性无影响的较稳定的复合物，能够延 长啤酒的保鲜期 酿酒酵母的m e t i o 基因编码了一个1 1 5 k d 的亚硫酸盐还原酶必需的多肽，它 可能是亚硫酸盐还原酶的亚单位，缺失r n e t l o 基因的酿酒酵母在发酵过程中亚硫 酸盐的含量可能会大幅度提高c 硼阴亚硫酸盐作为一种抗氧化剂，在啤酒中含 量增加对啤酒的稳定性有利。用此种酵母生产的啤酒的风味稳定性比用常规酵母 高得多可以避免在发酵完毕时，添加抗氧化剂亚硫酸盐而引起生成较多的 h 2 s 翻螨移爵 蠹翻融翊溆 s 铲7 a t p 苇一积尹芍啪sp p l i r v 胛 图1 i 酿酒酵母中硫酸盐代谢途径 1 5 酿酒酵母的选育及改良 在影响啤酒质量的诸多因素中，酵母菌种的好坏起着至关重要的作用，可以 说酵母是啤酒的灵魂高质量的啤酒当然需要性能优良的酵母菌种 1 5 1 酿酒酵母的研究动态 酿酒酵母是最早人类认识和利用微生物之一几个世纪以来酿酒酵母被用 于食品和酒精饮料生产。如今它也被应用于制药，表达异源蛋白等不同行业中 7 山东大学硕士学位论文 酿酒酵母因其不袁达内毒素而不具致病性，使得其被分类为g r a s ( g e n e r a l l y r e g a r d e d a ss a f e ) 生物。其在工业上大规模的被用于生产面包、酒精和啤酒 国内基因工程技术在酵母方面的研究始于1 9 7 8 年。1 9 7 9 年得到第一个2 1 a n 的啤酒酵母的质粒近几年此项技术发展较快，由于基因重组技术的开展。根据 生产需要，可以改变酵母的某些特性国外在这一领域的研究更深更广已将啤 酒酵母的1 6 条染色体通过电泳分离出来，并将其碱基序列全部定位嗍 1 9 9 6 年4 月，在国际互联网的公共数据库中公布了酿酒酵母的完整基因组 顺序它被称为遗传学上的里程碑首先。这是人们第一次获得真核生物基因组 的完整核苷酸序列；其次，这是人们第一次获得一种易于操作的实验生物系统的 完整基因组酵母是一种较好的模式生物，通过对其基因组的深入研究将有助于 人们了解高等真核生物基因组的结构和功能瞄i 1 5 2 酿酒酵母的选育 啤酒酵母应用于酿造工业已有很悠久历史。但一直没有进行系统的育种，只 是根据酵母的发酵情况和啤酒的风味筛选较理想的酿造菌株。亦即依靠“自然育 种”这个过程不仅漫长而且很难获得遗传特性变化较大的菌株然而现代啤 酒酿造技术主要着眼于提高质量、降低成本，因此必须从工艺控制、酵母管理及 菌株改良3 个方面着手鲫 在选育菌种时，不论是为了改进工艺或是提高某一方面的质量，都应保证原 啤酒酵母的优良酿造特性不变为了达到这一目的采用基因工程是最有效的 也是最理想的方法幽1 在过去的几年里，用基因工程改进酵母的特性己取得了显 著的效益【捌另外，使用酿酒酵母在生物技术领域应用的另一重要途径是它对重 组途径d n a 技术基因修饰的易感性 对于啤酒酵母的研究大致可分为四个阶段：一、从自然界或生产过程中分离 菌种，这是一个自然筛选阶段二、用物理、化学因子诱变菌种，即酵母的遗传 与变异，通过诱变可以获得改变了遗传特性的变异菌株三、杂交，原生质体 融合，这是在细胞水平上构建新菌株杂交育种是依靠酵母的生活史。利用具有 不同遗传特性和交配型的细胞能产生新的双倍体杂交后的新菌株应具有稳定的 遗传特性。否则就没有实用价值通过杂交获取满足生产需要的某些特有性能； i 山东大学硕士学位论文 原生质体融合包括种内和种问融合以上方法均存在以下缺点：随机性大、间接、 费时，耗人m 2 s l p o ! 四、分子遗传与育种的研究，这是在分子，基因水平上构 建工程菌即所谓的基因工程基于重组d n a 技术的基因工程育种可以弥补上 述缺点，可以定向、直接地将有用的遗传信息输入微生物细胞，从而实现定向育 种微生物的基因工程育种一般采用两种方式：i ) 引入新的基因，使菌株获得新 的性状：2 ) 定向诱变( s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ) ，即在体外使基因的特定区域有效 地突变，置换受体菌该基因的野生形拷贝，改良菌种的某一性状 目前通过基因重组技术来改变酵母菌种的遗传特性。使它具有生产所需要的 某些优良性状，正在进行的研究试验有以下几个方面：1 ) 高发酵度的酵母菌株： 从许旺氏酵母属将编码糖化酶的基因转化到啤酒酵母中主要是提高酵母分解麦 芽三糖的能力，提高啤酒的发酵度，此类菌株主要用来做干啤和高浓稀释酒( 淡 爽型啤酒) 2 ) 具有争葡聚糖酶的酵母菌种：将木霉或枯草芽孢杆菌编码争葡聚 糖酶的基因转移到啤酒酵母中，使啤酒中的高分子争葡聚糖得以分解，降低啤酒 牯度。加快啤酒过滤速度3 ) 改善酵母凝聚性的菌种：将控制凝聚性的基因主要 是加j 基因转移到非凝聚性酵母中，改善其凝聚性，发酵后便于收集酵母，使啤 酒过滤快4 ) 产生胞外蛋白酶的菌种：将野生酵母中编码胞外蛋白酶的基因克隆 到啤酒酵母中，发酵时蛋白酶分泌到细胞外，将高分子蛋白质分解，有利于提高 啤酒的非生物稳定性5 ) 具有弘乙酰乳酸脱羧酶的酵母菌株：啤酒酵母本身不含 a 乙酰乳酸脱羧酶，将枯草芽孢杆菌编码小乙酰乳酸脱羧酶的基因克隆或整合到 啤酒酵母中，可大大减少双乙酰的形成6 ) 能消除自由基的酵母菌株：将桑蚕的 这一基因克隆到啤酒酵母中能有效消除啤酒中的自由基，提高啤酒的风味稳定 性7 ) 增加亚硫酸盐含量的菌株此外将要开发的菌种还有：h 2 s 含量低的菌株 类胆固醇含量高的菌株，耐高酒精度、高渗透压的菌株耐高温的菌株，抗污染 的菌株，抗老化的菌株，增加醋酸乙酯含量的菌株，能利用淀粉的菌株，改善泡 沫的菌株及无醇啤酒的菌株等等通过这些工作的进一步展开，使我们能够科学 地控制啤酒酵母的遗传特性，使其变得符合要求，使啤酒酿造技术更为合理，便 于控制f 3 i 0 0 1 9 山东大学硕士学位论文 1 6 标记基因的应用及剔除 1 6 1 标记基因的利用 目前转基因技术中的d n a 递送过程都是在细胞或组织水平上进行。转化后 的细胞中只有一小部分细胞的基因组整合了外源d n a ，所以同时还存在着大量 未转化的细胞，这就需要用标记基因将转化细胞从未转化的细胞中筛选出来常 用的标记基因大多是一些抗生素抗性基因当它与目的基因共转化细胞时，就可 以为细胞提供在含有相应抗生素培养基上生长的能力，而未转化细胞不能在这样 的培养基上生长。因此存活下来的细胞就只有转化细胞一般是在构建载体时， 标记基因连接在目的基因一旁两者各有自己的基因调控序列( 如启动子、终止 子等) 口2 1 1 6 2 标记基因对受体细胞影响及安全问题 转基因技术的发展能够将具有优良性状的目的基因导入动、植物和微生物细 胞中并得到表达。从而使得受体细胞的遗传性状得到改良但目前基因转移在技 术上还存在着一些不足，其中之一就是转化过程中只有少数受体细胞能够吸收外 源基因并整合迸基因组中，而大多数细胞仍是未转化的因此。目的基因的引入 常常需要筛选标记基因，从而赋予受体以特定的选择性标记。以便于识别和鉴定 转基因细胞遗憾的是这些标记基因在识别和鉴定后仍保留在受体细胞内具有 很多潜在的危害，这种多余的基因会带来一些负效应i 北3 ，i 首先，在转化细胞 的筛选过程中大量生长受到抑制的未转化的细胞会阻碍转化细胞对营养物质的 吸收，并且还可能分泌一些有毒的物质抑制转化细胞的生长 3 4 1 其次，用重转化 方法进行基因堆积( g e 鹏s t a c k i n g ) 时，每一次转基因的插入都需要进行转化筛选： 但实际上方便可用于生物转基因筛选的标记基因并不多，不能满足重转化对多个 标记基因的要求，因此只能在一、两次转化后从生物基因组中剔除标记基因，以 便下一次转化时使用同一个标记基因然而标记基因最令人关注的方面还在于 其潜在的“流动”一基因的水平转移与基因逃逸可能产生的生物安全性问题：作为 标记基因的抗生素抗性基因一旦流动到危害人类健康的微生物中就会为其提供 抗药性，使抗生素失去效力而除草剂抗性基因如果通过传粉流动到危害粮食作 物生长的杂草中就会使其获得除草剂抗性而成为“超级杂草* 会造成某些杂草 山东大学硕士学位论文 难以人为控制p 卯带有标记基因的转基因生物体及产品作为食品进入市场，对人 体可能产生某些毒理作用和过敏反应转入的生长激素类基因有可能对人体生长 发育产生重大影响；转基因生物中使用的抗生素标记基因，如进入人体可能使其 对很多抗生素产生抗性更为严重的是，由于人体内生物化学变化的复杂性，转 基因食品对人体健康的影响在短期内难以监测出来 因此，抗生素抗性基因和除草剂抗性基因虽然有利于受体细胞的筛选，但它 们对受体细胞的生长并非必要如果能剔除筛选标记基因，将是提高动植物和食 品安全性的最好方法p q 标记基因的剔除( s d t a b l em a r k e r - f i - e e s m f ) 已成为了 转基因研究中的新课题 1 6 3 标记基因的剔除 目前已发展不少有效地剔除标记基因的方法，主要有以下几种： 1 ) 转座系统 目前已经报告的用于转基因植物标记基因剔除的转座系统是来源于玉米的 a c d s 系统 a ce x c i s i o n r b i r a i t l b 图1 2 基于转座的标记基因剔除系统 嵋i 一 山东大学磺士学位论文 2 ) 共转化 利用共转化也能获得没有标记基因的转化子( 图i 3 ) ，此时转化所需的选择 标记在一种可自主复制的质粒上，而目的基因在另一载体上当这些分子共转化 进入细胞，根据选择标记筛选到一定数目的转化子，其中有一定比例是把目的基 因整合到染色体上的共转化予整合可通过单交换，在同源位点添加一段外源 d n a ，也可通过双交换，即转化的d n a 将一段靶位点序列取代 鼻d 岫nc n 嘲 i 嘲 臣z 翻匿密盈叠囝勿 o o u m l f o r m 帅n 一c 嘶ht m m ) m r m l n m 据刚 g 憎x 甜曲i yh 啊讲嚏i a m w o m ( m o m e n o 由_ 口_ 硼印啊n 一 n h 岫咖 图i 3 用共转化的方法选择无标记基因受体细胞的示意图 1 2 山东大学硕士学位论文 3 ) 位点特异性重组系统 位点特异性重组( s i t c - s p e c i f i cr e c o m b i n a t i o n ) 是利用重组酶催化两个短的特定 的d n a 序列间的重组，来剔除选择标记基因以获得无标记基因的基因转化系统 ( 图1 4 ) 其原理是双链d n a 片段之间可以发生相互遗传交换，链的交换是通过 对d n a 特定序列进行准确切割和连接，从而在基因或染色体水平上对生物进行 遗传改造利用特异性重组可以去除特定的外源基因，为培育无选择标记的转基 因生物提供了新的思路到目前为止已经使用的重组系统包括：噬菌体p j 的 c r e l o x p 系统口7 3 q 、酵母的i p ，f l l t 位点特异重组系统、z y g o s a c c h a r o m y c 髂嗣f o u x i i 的r r s 系统以及噬菌体m u 的g i n 重组酶系统f 辨 ，i loxp,loxp, f r tf f 盯i o r r so r 尺s r b i r a i t s i t em a r k e rs i t el b c r e ，f l p o rr s m l c r o b l a lr e c o m b l n a s e e r b m a i tl b 1 皿皿皿制 图1 4 位点特异性重组系统 噬菌体p ic r e 坍o x p 重组系统，酿酒酵母f l p f r t 重组系统， 结合酵母r r s 重组系统 4 ) 筛选标记基因的失活 为了减少抗性标记基因产物带来的不安全性。还有些研究者采用反义r n a 基因、核酸裂解酶( r i b o z 3 m l e s ) 基因或采用抗体基因等策略筛选标记基因或基因 产物失活但这些方法的缺点是没有去除筛选标记基因，仍存在基因传播的可能 性 5 ) 共整合载体 山东大学硕士学位论文 运用以下的整合转化方案可以去除整合于受体基因组中的标记基因序列如 图l 所示，即设计某一整合型载体通过体内重组的方式整合入染色体上，通过再 次同源重组剔除标记基因载体携带( 3 4 1 8 抗性标记和l a c z 标记转化子在生色 底物x - g a l 平扳上产生蓝斑利用( 3 4 1 8 抗性和蓝色获得初始转化子再通过筛 选( 3 4 1 8 敏感性和白斑获得因同源重组而丢失标记基因的重组克隆 憎一 二叫艺勃纪牙卫蚴一亿乙乙z 盈口= = = ：= 睁s_ectlon e l 恤喇 x州k z s a h 嘲州 亿弦乙霞叠盈罾z z 卜t = 卜电z z z z 卜一 州一i u 4 m l “m ls c m m o 啊删 1 o 啊呻日_ hl g 匹l 帅i h i t x 臣z 犹翟窭露北乙勿一一 g o n e x 蛐l 晰w e d i n t oa a 帆蚴 n o 由啊a 嘿_ f e l th m - i 如 图i 5 从酵母染色体上剔除标记基因的示意图 6 ) 同源重组( h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ) 该方法是将标记基因置于重复序列之间通过重复序列同源重组作用将标记 基因切除【撕i i 山东大学硕士学位论文 1 7 酿酒酵母的遗传转化系统 1 7 1 酿酒酵母的筛选标记 自从1 9 7 8 年建立了酵母转化方法m ，重组d n a 技术不仅用于实验室酵母 也用于工业酵母酵母转化最常用的是基于内源2 1 z m 质粒复制起点的高拷贝自 主复制质粒 4 8 i 、染色体上高频率的同源重组技术 4 9 1 、基因融合技术 s o l 、构建 舍中心粒功能和质粒舭峪( 自主复制) 序列的环状微染色体1 5 1 1 和构建含端粒d n a 序列的人工染色体等技术也被用于酵母转化这些技术大大地促进了基因表达和 染色体功能的研究，也为传统菌株改良和外源蛋白生产的研究提供了技术支持 尽管酵母的转化频率很高但在每次转化试验的全部细胞中仍然只有一小部 分细胞会发生转化。因此必须有一个合适的选择标记用来筛选那些真正发生了转 化的细胞筛选标记的选择主要是依转化的宿主菌株的遗传特性而定，经常采用 的选择标记是利用某种特定的营养缺陷型如l e u 2 、h i s 4 、卸1 显性抗药基因 也可被用作筛选标记使用于酵母转化试验中。如g 4 1 8 抗性基因、潮霉素抗性基 因等 1 7 2 酿酒酵母转化方法 基因转移( g e n et r a n s f e r ) 是将外源基因导入细胞内，其转移方法较多。常用的 要有下列几类： 1 ) 完整细胞壁的酵母细胞的直接转化1 5 2 1 3 1 1 h 1 ： 最常用的转化方法是乙酸锂转化法操作快捷转化效率高( 可达1 0 5 1 0 6 转化体i t g d n a ) ，分为一般法和快速法两种快速法省时实用，转化频率却较低 在乙酸锂转化法中“+ 的最适浓度为1 0 0 m m o l l ，受体酵母浓度为5 x 1 07 细f 超m l ， p h 为7 0 ，为维持高转化频率。体系中需加聚乙二醇( p e g 4 0 0 0 或p e g 3 3 5 0 ) ，乙 酸锂可用硫氰化锂代替 2 ) 酵母原生质体转化i 艟 i ： 首先将酵母用酶法去细胞壁成原生质体后再进行外源d n a 导入，然后再使 细胞壁再生，操作过程中需将原生质体保持在一定合适渗透压的培养基中操作 步骤多而费时，原生质体非常脆弱。不能直接筛选( 药物) 且原生质体可能融合 产生多倍体细胞，对依其表型筛选造成困难，而直接法就不存在这些问题 山东大学硕士学位论文 3 ) 电脉冲穿孔法转化嗍 在酵母转化过程中，特别是使用乙酸锂方案转化时，添加变性的单链相对高 分子量单体d n a 对提高转化效率十分重要，一般是将从鲑鱼睾丸制取的双链 d n a u i 钠盐用t e 溶液溶解，并经超声波处理成2 1 5 k b ( 最好平均为7 k b ) 的片 段，在转化时同质粒d n a 同时加入转化体系 1 8 基因敲除 1 8 1 基因打靶 基因打靶( g e n et a r g e t i n g ) 是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一项重要的分子生物 学技术，是利用基因转移方法按预期方式精细改造生物遗传信息的实验手段外 源d n a 序列导入靶细胞后，通过外源d n a 序列与靶细胞内染色体上同源d n a 序列间的重组，将外源d n a 定点整合入靶细胞基因组上某一个确定的位点，或 对某一预先确定的靶位点进行定点突变，从而改变细胞遗传特性的方法【研作为 一项新兴的技术，基因打靶有着无可比拟的优点：基因打靶所适应的细胞既可以 是原核细胞，也可以是真核细胞；基因打靶能把外源基因引入染色体d n a 的特 定片段上；在设计合理的情况下，基因打靶可对宿主细胞染色体基因进行精细的 改造；基因打靶后被击中的基因或新引入的基因随染色体d n a 的复制而稳定复 制目前基因打靶技术已应用在改造生物、培育新的生物品种，研究基因结构与 功能、表达与调控，研究细胞生活周期调控机制。遗传病的基因治疗等多方面 尽管还存在一些技术问题，但随着研究的深入，基因打靶技术正在不断发展与完 善【硼 1 8 2 基因敲除 基因打靶最常用的一种策略是：通过同源重组使特定靶基因失活，以研究该 基因的功能，称基因敲除( g e n el 【l l o c i u d ；也可通过同源重组用一种基因替换另 一种基因，以便在体内测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入基因组 中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的，该技术叫基因敲入( g e n ek n o c k - h a ) 基因敲除( g a a ek n o c k o u t ) 是通过外源d n a 与染色体d n a 之间的同源重组， 精细地定点修饰和改造基因d n a 片段的技术它是在胚胎干细胞技术和同源重 山东大学硕士学位论文 组技术基础上发展起来的，具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体 d n a 共同稳定遗传的特点，目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验 方法 基因敲除技术早在2 0 世纪7 0 年代就在酿酒酵母( s c e r e v i s i a e ) 中得以应用 1 5 9 1 0 8 0 年代初，胚胎干细胞( e s 细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的 技术基础1 9 8 5 年。首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲 除的理论基础到1 9 8 7 年，t h o m p s s o n 首次建立了完整的e s 细胞基因敲除的小 鼠模型此后的几年中基因敲除技术得到了进一步的发展和完善【删1 6 l i 细胞基因敲除途径建立转基因小鼠技术的成熟，首次使体外精细的基因操作 与小鼠的整个生长发育和生命过程得到了直接的结合，为探讨高等动物基因组结 构和功能提供了有效的方法由基因敲除技术产生出的特殊小鼠已经对哺乳类生 物学的各领域。包括发育生物学、癌生物学、免疫学、神经生物学和人类遗传学 产生了极大影响理论上，基因敲除可适用于任何能产生e s 细胞的物种，将来 可在小鼠基因敲除技术成熟的基础上开展其它实验动物的基因敲除工作在人类 基因组序列分析的结构基因组学的研究完成后，基因敲除将成为在功能基因组学 研究中最直接和最有效的方法之一舭1 1 9 本论文研究的目的及意义 啤酒老化是啤酒行业面临的严重问题，虽然已有多种方法来预防啤酒老化、 延长啤酒的保鲜期，但利用良好的酿酒酵母菌株来解决该问题可能是最理想的 措施 酿酒酵母m e t l o 基因编码亚硫酸盐还原酶的口亚基，利用基因敲除技术将 m e t l o 基因部分或完全消除，使亚硫酸盐还原酶失活，亚硫酸盐不能进一步还原， 而在发酵液中得以累积，作为抗氧化剂及风味稳定剂，从而延长啤酒的保鲜期 酿酒酵母的m e t l o 基因敲除可能会使得酵母的生理活性发生一定的变化，其 发酵性能可能比原始菌株更具有优越性，其酿造的啤酒更有利于保鲜期的延长 1 7 山东大学硕士学位论文 第二章酿酒酵母高效转化体系的建立 酿酒酵母是人类了解、研究最彻底的真核生物之一，其具有很多原核生物活 性，容易吸收外源基因因此酿酒酵母是最广泛应用的真核生物工程菌之一，普 遍被用于产生和表达外源蛋白 目前已有很多高效率酿酒酵母转化方法，主要是电转化法、原生质体转化法、 p e g 几蛐d n a 法及氯化锂法其中氯化锂转化法的转化效率较低；原生质体 转化法步骤多、操作过程复杂；电转化法具有较高的效率但需要特殊的仪器电 转化仪；p e g ，l i a 幽d 1 q a 法不需要特殊的仪器，且具有很高的转化效率，在没 有电转化仪的情况下，其将是最有效的方法本研究中采用p e c 扎i a c 旭d n a 法 将外源基因转入酿酒酵母细胞内 2 1 材料与方法 2 1 1 实验中所使用质粒及菌株 质粒p f a 6 a k a n m x 4 及p y e s 2 e c o l id h s a 、x c e r e v i s i a e 刖船、为本室保 存 图2 1 实验中所用质粒示意图 2 1 2 试剂与设备 g e n e r u l e r t mz o o b p d n a l a d d e r p l u s 和t a q p l u s d n a 聚合酶均为m b i 公司产 品：e z n a c - e l e x t r a c t i o n k i t 购自o m e g a 公司；k d n a ( h i n d m ) d n a m 缸k 盯 i i 山东大学硕士学位论文 购自t a k a r a 公司；生物素( b i o t i n ) 购自上海生物工程公司；蛋白胨和酵母粉为英 国o x o i d 公司产品；葡萄糖及其他试剂均为中国医药( 集团) 上海化学试剂公司分 析纯试剂； u v p 凝胶成像仪，s g 超纯水仪，t h z - c 恒温振荡器( 江苏太仓) h v 3 0 0 0 多用电泳仪( 北京东方特力科贸中心j 2 1 3 溶液配置 ( 以下溶液配置完后，除个别说明外，均4 0 储存备用) 2 1 3 1 氨苄青霉素( a m p ) 母液浓度为1 0 0m g m 1 2 1 3 2 碱法提取质粒试剂： 溶液i ：5 0 m m 葡萄糖；2 5 m m t r i s h c i ：1 0 m m e d l r a ： 溶液i i ：2 0 0 m m n a