（物理电子学专业论文）小型spr生物传感器的研制.pdf

摘要 摘要 表面等离子体谐振( s p r ) 传感技术是一项新兴的生物化学检测技术，相比 传统的生化分析方法具有免标记检测、实时检测生化反应的动力学过程、无损伤 检测等诸多优点，而小型化则是其发展趋势之一。本课题的主要任务是设计一台 小型便携式s p r 生化分析仪，用这台仪器进行灵敏度分析以及一些典型的生化实 验，使它的灵敏度能够达到较高水平。 本论文首先介绍了表面等离子体谐振传感技术的背景、原理以及其发展趋 势，并得出了使s p r 曲线最尖锐所需要的光源以及光路的条件，随后分光路，机 械，电路，软件等部分介绍了所设计的小型便携式s p r 生化分析仪，然后给出了 用这台仪器进行的灵敏度以及生化实验的结果，最后讨论了这台仪器需要改进的 地方。 在课题中，我对现今世界上几款小型s p r 生物传感器进行了调研，分析了它 们的特点。根据我们实验室的情况，设计了独特的光路，机械结构，电路以及， 软件程序，成功研制出小型便携式s p r 生化分析仪一台，经过灵敏度实验检测， 这台样机的灵敏度已经达到约5 4 x l o 。5 折射率单位，具有较好的性能，完全可以 胜任一些基本的生化分析实验。并且经过一些改进，它的灵敏度还可以进一步提 高一个数量级，就可以达到t i 生产的的小型s p r 传感器s p r e e t a 的灵敏度水平， 达到世界先进水平。 本仪器具有高灵敏度水平和相比世界上其他同类产品的较低价格，相信会取 得较好的应用前景。 关键词：s p r ，k r e t s c h m a n n 结构，s p r 传感器的小型化 d e s i g no fm i n is u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) b i o c h e m i c a l s e n s o r c h e ny u e ( p h y s i c a le l e c t r o n i c s ) d i r e c t e db yp r o f c u io a f u a b s t r a c t s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) i san e wb i o c h e m i c a la n a l y s i sm e t h o d c o m p a m d w i t ht r a d i t i o n a lb i o c h e m i c a la n a l y s i sm e t h o d s ，i th a st h ea d v a n t a g eo fl a b e l f r e e d e t e c t i o n ，r e a l t i m em o n i t o r i n g ，a n dn o n - i n v a s i v ea n a l y s i s o n eo f i t st r e n d si s m i n i a t u r i z a t i o n t h em a i nm i s s i o no ft h i sp r o j e c t i st o d e s i g n ah a n d ys p r b i o c h e m i c a ls e n s o r , c a r r yo u ts o m eb i o c h e m i c a le x p e r i m e n t sw i t ht h i ss e n s o r , m a k e s u r et h i ss e n s o rh a sh i g hs e n s i t i v i t y t h ed i s s e r t a t i o nf i r s td e s c r i b e st h eb a c k g r o u n da n dp r i n c i p l eo fs p rt e c h n o l o g ya n d i t sd e v e l o p i n gt r e n d ，g i v e st h e c o n d i t i o n sw h e nt h es p rc u r v ew o u l d b et h eb e s t ，t h e n i n t r o d u c e st h i si n s t r u m e n tf r o mi t so p t i c a l ，m e c h a n i c a l ，c i r c u i t ，a n dd a t ap r o c e s s i n g s y s t e m s ，t h e ng i v e ss o m ee x p e r i m e n tr e s u l t s a tl a s t d i s c u s s e ss o m ea s p e c t sw h i c h n e e d e dt oi m p r o v eo n w eh a v es u c c e s s f u l l ym a n u f a c t u r e d o n eh a n d ys p rb i o c h e m i c a ls e n s o ，t h e e x p e r i m e n t r e s u l t ss h o w e dt h ei n s t r u m e n th a dg o o dp e r f o r m a n c e i t ss e n s i t i v i t y r e a c h e da p p r o x i m a t e l y5 4xl o r u a n di t ss e n s i t i v i t yw o u l db eb e t t e ra f t e rs o m e i m p r o v e m e n t s k e yw o r d s ：s p r ，k r e t s c h m a n ns t r u c t u r e ，t h em i n i a t u r i z a t i o n o fs p rs e n s o r 2 研究成果声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是我本人在指导教师的指导 下进行的研究工作获得的研究成果。尽我所知，文中除特别标注和致 谢的地方外，学位论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得中国科学院电子学研究所或其它教育机构的学位 或证书所使用过的材料。与我一同工作的合作者对此研究工作所做的 任何贡献均己在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。 特此申明。 签名：弥1 忆日期：2 。9 多年6 舟i s - g 关于学位论文使用权的说明 本人完全了解中国科学院电子学研究所有关保留、使用学位论 文的规定，其中包括：电子所有权保管、并向有关部门送交学位论 文的原件与复印件；电子所可以采用影印、缩印或其他复制手段复 制并保存学位论文；电子所可允许学位论文被查阅或借阅；电子 所可以学术交流为目的，复制赠送和交换学位论文；电子所可以公 布学位论文的全部或部分内容( 保密学位论文在解密后遵守此规定) 。 签 名：际i 铆签名：微付 日期：知。多用压厨 日期：加乡。占。6 第一章引言 1 1s p r 技术应用背景 第一章引言 表面等离子体谐振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 传感技术是一项新兴 的生物化学检测技术。自从n y l a n d e r 和l i e d b e r g 于1 9 8 2 年首次将s p r 传感技 术用于气体检测和生物传感器中”“2 “，2 0 年来，s p r 传感技术在实现方式、仪 器开发和应用领域扩展上都获得了飞速的发展。与传统的生化分析方法相比，s p r 传感技术具有以下几个显著的优点： ( 1 ) 免标记检测。s p r 传感技术对被测物质的折射率非常敏感，它与荧光 分析或e l i s a 检测方法不同，省去了样品纯化和材料标记等样品准备 步骤，大大节省了额外的时间，并消除了标记物对反应造成干扰的可 能性：另外，它可以观察每个实验步骤对反应的影响，而不像其他实 验方法只能得到实验的最终结果。 ( 2 ) 实时检测。采用s p r 传感技术，反应的进展情况可以直接地显示在计 算机屏幕上，这种对实验步骤地实时反馈，加快了实验开发和分析的 速度。最为吸引人的是，s p r 传感技术可以对反应进行动力学参数分 析，这是其他分析方法所无法比拟的。 ( 3 ) 无损伤检测。s p r 传感技术是一种光学检测方法，光线在传感芯片表 面被反射回来，并不与被测物接触；由于光线并不是穿透样品，甚至 是混浊或不透明的样品，也同样可以进行检测。 传统的分析方法局限于体外实验或使用离体器官进行，例如x 射线光电子能 谱( x p s ) 、俄歇电子能谱( a e 8 ) 以及次级离子质谱( s i m s ) 等，不仅费用比较 昂贵，设备庞大，灵敏度有限，而且都不能研究有关动力学过程。与传统技术相 比，s p r 技术的优点极为明显。s p r 分析技术的出现，大大加快和优化了免疫测 定过程，更为d n a 和蛋白质之问的研究带来了重大突破。几十年来，d n a 和蛋白 质之间相互作用，特别是其反应动力学的测定一直没有简便快捷的方法，而s p r 第一章引言 技术解决了这一难题。 由于s p r 传感技术与其他传统分析方法相比，有着无可比拟的独特优点，它 在药物筛选、环境监测、生物科技、毒品及食品检测等许多重要领域有着巨大的 市场潜力，并且保持着快速的发展。然而值得注意的是，即使是在s p r 市场上占 有绝对主导地位的b i a c o r e 公司，他们的产品主要面向对象仍然是科研院所和实 验室：也就是说，s p r 传感技术与目前市场上广泛使用的免疫检测方法相比，在 价格、易用性、灵敏度和稳定性等方面必须要有进一步的发展。这些市场的强烈 需求将驱动s p r 传感技术朝着微型化“1 和阵列化、多通道检测”“63 和更加灵敏的 方向发展。 本室也己研制成几种型号的s i ) r 生化分析仪并实用化，其中s p r 一2 0 0 4 型还 在s a r s 病毒检测等生化分析领域取得了应用”町“1 。 1 2s p r 传感技术发展历程 1 9 0 2 年，w o o d “”首次描述了入射光波在衍射光栅上引起的反常衍射现象。 1 9 4 1 年，f a n o “根据金属和空气界面上表面电磁波的激发解释了这一现象。随 后，有人提出了体积等离子体的概念，认为这是金属中体积电子密度的一种纵向 波动；r i t c h i e “2 1 注意到，当高能电子通过金属薄片时，不仅在体积等离子体频 率处有能量损失峰，在更低频率处也有能量损失峰，认为这与金属薄膜的界面有 关。1 9 5 9 年，p o w e l 和s w a n “”通过实验证实了r i t c h i e 的理论。1 9 6 0 年，s t e r n 和f a r r e l l “”研究了此种模式产生谐振的条件并首次提出了表面等离子体 ( s u r f a c ep l a s m o n ，s p ) 的概念。r a e t h e r “对s p r 在不同类型的表面上的特性 进行了详细的描述。 6 0 年代末，k r e t s c h m a n n 和o t t o 使用衰减全反射( a t t e n u a t e dt o t a l r e f l e c t i o n ，a t r ) 的方法演示了光激发表面等离子体共振的现象。7 0 年代末以 来，s p r 在检测金属薄膜特性和实时监测金属表面反应的潜能越来越受到重视。 第一章引言 在1 9 8 2 年，n y l a n d e r 和l i e d b e r g 将s p r 原理应用于气体检测和生物传感器领 域中。从那以后，s p r 传感技术取得了持续的发展。各种应用于物理、化学和生 物领域的新的s p r 传感结构被提出来。s p r 传感技术在实时监测生物分子相互作 用等领域显示出了巨大的潜能。 1 3s p r 传感技术的小型化发展趋势 s p r 传感技术的小型化是s p r 传感技术的重要发展方向之一。其带来的好处 是价格将大大降低，另外由于使用方便，使它的应用范围得到很大的扩展。此外， 微型化后的s p r 传感器在稳定性和可靠性上也会有很大提高。 近年来，为适应多种领域在现场中检测的需要，小型化、便携式s p r 生物传 感器在国外开始出现，并逐步走向商业化，而在国内，研制小型s p r 传感器尚属 起步阶段。因此研制小型s p r 生物传感器在国内具有很好的市场前景。 目前，国外的小型s p r 生物传感器的灵敏度可以达到1 旷5 到1 0 “数量级的折 射率单位( r i u ) ，本文研制的小型s p r 生物传感器也希望能够达到或接近国外的 先进水平。 1 4 课题主要任务 设计一台小型便携式s p r 生化分析仪，用这台仪器进行灵敏度分析以及一些 典型的生化实验，使它的灵敏度能够达到较高水平。分为以下几个部分来实现。 1 ) 光路结构： 采用经典k r e t s c h m a n n 棱镜结构。所不同的是棱镜采用了三棱镜，由激光 光源发出的会聚光折射进入棱镜后，在棱镜表面会聚成一条直线( 会聚的直线在 下面的图中为垂直纸面方向，而线型单通道流通槽也是这个方向，正好覆盖了这 条直线) ，全反射后光线照射到线阵c c d 上，在c c d 上不同像素所对应的全反射 第一章引言 角度不同，就可以用c c d 采集到的光强代表角度光强，得出s p r 曲线。实际应用 时是在棱镜表面用香柏油贴上一片附有金箔的薄玻璃片，成为k r e t s c h m a n n 棱 镜结构。 在构思中采用激光光源的原因是认为它的稳定性好，但在实际应用中发现了 激光光源的一些缺点，将在下文论述。 2 ) 机械结构： 机械结构的设计思路为避光以及防止机械配合误差。所以采用的是六块面板 拼合而成的避光结构，在接合处做成台阶。防止配合误差的方法是将光路结构全 部置于上面板上，并且上面板的厚度足够不会造成变形。 3 ) 电路结构： 电路结构的作用是将c c d 采集到的光强信号转化为数字信号并且传送到电 脑中进行处理。为了提高精确度采用了1 4 位a d 。并且应用到了单片机以及c p l d 。 4 ) 数据处理： 在电脑中用l a b v i e w 编写了数据处理程序，进行频域和时域的滤波，并且多 次测量求平均值，以提高灵敏度。 4 第二章国外开发的几种小型化s p r 产品 第二章国外开发的几种小型化s p r 产品 2 1 德州仪器( t e x a si n s t r u m e n t s ) 生产的s p r e e t a2 0 0 0 “” 图1s p r e e t a2 0 0 0 的外观 s p r e e t a 是德州仪器( t i ) 研制的小型s p r 生物传感器，它的最大特点是体 积非常小。它的尺寸仅为1 5 c m * o 7 c m * 3 c m ，和一枚硬币差不多大小。图l 就是 它的外观，和一枚硬币的比较。 图2s p r e e t a2 0 0 0 结构示意图 s p r e e t a 主要由印刷电路板( p c b ) ，遮光罩，$ p r 敏感元件( s p rc h i p ) 和 一块反射镜( m i r r o rc h i p ) 组成，如图2 。 印刷版上主要包括一个发光二极管( l e d ) ，一面二极管图像接收阵列 第二帝国外开发的几种小型化s p r 产品 ( p h o t o d i o d ea r r a y ) ，以及存储数据的内存( m e m o r y ) 。 遮光罩的主体是聚碳酸酯材料的用作主要光路的棱镜( p r i s m ) ，发光二极管上方 的起偏镜( p o l a r i z e r ) ，以及棱镜周围阻挡光路的l i g h ts h i e l d i n g 。 l e d 发出的光经过起偏镜起偏后，在棱镜中以大于临界角度射到s p r 敏感 元件上。s p r 敏感元件是在玻片上镀上一层很薄( 小于5 0 纳米) 的金。由于s p r 效应，在一定的角度，有一部分偏振光沿着金与样品之间传播，这样全反射回来 的光在一定的角度会明显变弱。这一角度与样品的折射率( r e f r a c t i v ei n d e x ，r i ) 有关。反射光经过平面镜再次反射，被图像接收阵列接收，数据储存到内存中。 经过一些后续信号处理，就可以求出样品的折射率。 下面是它的制造步骤： ( a )将l e d ，图像接收阵列，内存安装到电路板。 ( b )检测l e d ，图像接收阵列，内存的功能。 ( c )注模透明聚碳酸酯棱镜。 ( d )在棱镜周围注入黑色聚碳酸酯形成光线遮挡。 ( e )用环氧树脂将起偏镜连接到棱镜上。 ( f )将棱镜与电路板连接，利用遮光罩上的引脚和环氧树脂。 ( g )增加黑色的环氧树脂完成光线的遮挡。 ( h )用环氧树脂安装反射镜。 ( i )用环氧树脂安装s p r 敏感元件。 ( j ) 检测l e d ，图像接收阵列，内存的功能。 ( k )在空气和水中测量传感器光谱。 它的随机误差包括三方面：检测随机误差( 接受阵列的固有随机误差) ，发 射随机误差( 在一个检测周期中光线强度的统计误差) ，发光二极管的波动误差。 减小随机误差可以采用多次测量光谱求平均值以及一次光谱像素求和的方 法。”1 图3 是用带有s p r e e t a 的o c t a v ei n s t r u m e n t 测量蒸馏水。il e d = 2 0 m a ，t 第二章国外开发的几种小型化s p r 产品 i n t = 5 m s 。反复测量2 - 4 分钟。 t i m et oa c q u i r em e a s u r e m e n t ，( m s ) 5m a h i e 口旧曲n ；m 图3 用带有s p r e e t a 的o c t a v ei n s t r u m e n t 测量蒸馏水，测量时间与误差图 其中，数字是测量次数，是用原始数据测量，+ 是采用像素求和法测量。 另一个重要特性是准确度。因为s p r 传感器是利用测量光谱来测定折射率， 需要进行标度，所以可以把测量结果的光滑度( s m o o t h n e s s ) 作为准确度。一种 简单且灵敏的测量光滑度的方法“”是利用r i 梯度，它可以用下面的装置产生。 m i x i n g c h a m b e r 图4 测量传感器光滑度的装置 一对注射器中分别盛有水和4 0 的甘油，连接到一个有两个入口的注射阀。 阀的出口是一个混合箱( 体积小于1 4 m 1 ) 。因为混合箱完全被液体充满并且只 含有以上两种液体，所以混合箱出1 2 1 处的甘油浓度符合下面的微分方程： b co茹m一口dl仍口cg一叱 第二章国外开发的几种小型化s p r 产品 dcou_坐t：生。一【_。)dlv i “ u 其中吖p 是注射泵的流量。在上面的情况下，混合箱中开始是纯水，然后注 射阀转动到注入甘油。这样出口处的r i 变化应该符合一条指数曲线，从n = 1 3 3 到n = 1 3 7 。图5 是分别用三个s p r e e t a2 0 0 0 测得的结果。 兰 q 芷 包 ( a )t i m e s 图5 川三个传感器测量的r i 结果 为了检验光滑度，用四阶多项式进行逼近，得到的残差如下 - 0 2 i b ) 1 0 02 0 0 t i m e s 图6 将图1 5 进行四屑多项式逼近得到的残差 曲线上下偏移幅度在0 2 左右。 以上方法也可以用于量化传感器的刻度。 t i 在2 0 0 3 年推出了改进型的s p r e e t a2 0 0 3 ，拥有更好的灵敏度以及稳定性。 以下就是对s p r e e t a2 0 0 3 的灵敏度测试。 叫 。 叫 i b 3 d i s 9 j 面x i q 碰正 第二章国外开发的几种小型化s p r 产品 图7s p r e e t a2 0 0 3 的s p r 吸收峰 对光电二极管检测出的光强阵列进行最小值检测，由于具有不同折射率的样 品具有不同的s p r 吸收峰，因此它们也就具有不同的最小像素值，经过线性拟合 后这些检测出的最小值如图8 所示。 图8s p r e e t a2 0 0 3 的像素点一r i u 图 将其转换成为角度一r i u 图，如图9 。 图9s p r e e t a2 0 0 3 的角度一r i u 图 一3一一_co一口_ko；-口cou 第二章国外开发的几种小型化s p r 产品 图1 0s p r e e t a2 0 0 3 的蚩自质分子亲和反应数据图 一般来说，灵敏度由单位角度对应的r i u 值与检测噪声两方面共同决定。而 检测噪声与测量的频率有直接关系。噪声数量级别与检测次数n 的平方根有直接 关系。在标准取点频率( 3 0 0 h z ) 下，通过计算s p r e e t a 的灵敏度在0 6 h z 采样 频率下为1 x 1 0 r i o 。图1 0 就是使用s p r e e t a2 0 0 3 进行的蛋白质分子亲和反应 数据图。 1 0 3叱mcoq芷!一旦m叱 第二章国外开发的几种小型化s p r 产品 2 2e t 本n t t a t 开发的h a n d ys p rp s - 0 1 0 9 “9 h a n d ys p rp s 一0 1 0 9 是日本n 兀 a t 开发的一款小型s p r 生物传感器，采用 的是棱镜耦合k r e c h m a n n 结构。图1 1 为它的外观。 图11h a n d y s p r0 1 0 9 外观图 日本n t t a t 开发的这台h a n d y s p r0 1 0 9 和上面的s p r e e t a 相比体积较大， 其主要参数和产生的s p r 曲线见表l 和图1 2 。其各项参数和本论文设计的仪器 比较相似，但价格比较高( 2 5 0 万日元) 。 表1h a n d y s p r0 1 0 9 的主要参数 原理 s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e 结构 k r e c h m a n n 结构 测量范围 6 5 7 5 度 芯片尺寸1 8 4 1 8 m m 光源点光源型l e d ，7 7 0 n m ( f w h m 5 0 n m ) 棱镜材料b k 7 光学敏感器件线阵c c d ( 2 0 4 8 像素) 外形尺寸1 7 0 + 1 0 0 4 5 0 m m 重量 2 k g 价格 2 5 0 万日元 第二章国外开发的几种小型化s p r 产品 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 0 s p rc u r v e 弋、。 _ | r 歹 = = ：爷 - j f 1 | l | j o j 。 7 0 09 0 011 0 0 p i x e ln u m b e r 图1 2t | a n d y s p r0 1 0 9 测量曲线 1 2 1lsc1u一石钟li匹 第三章s p r 传感技术的理论基础 第三章s p r 传感技术的理论基础 3 1s p r 传感技术概述 s p r 传感技术基于一种名为表面等离子体谐振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e s p r ) 的物理光学现象。当光线由光密媒质( 折射率) 照射到光疏媒质( 折射率 n ，并且n ，n ，) 时，在入射角大于某个特定角度时，会发生全反射( t o t a l i n t e r n a lr e f l e c t e d ，t i r ) 现象。如果在两种媒质的界面之间，存在一层合适厚 度( 约为几十纳米) 的金属膜，在发生全反射的条件下，入射光线的消逝波 ( e v a n e s c e n tw a v e ) 伽1 的p 偏振分量将穿透导电金属层，并与金属层中的自由 电子相互作用，激发出沿金属导体表面传播的表面等离子体波( s u r f a c ep l a s m o n w a v e ，s p w ) ，适当的改变入射光角度或者波长，当入射光波矢在媒质界面方向上 的投影t 与s p w 的固有传播波矢k ，。满足： 七，= 七叩 ( 1 ) 消逝波与s p w 发生谐振，入射光的大部分能量被s p w 吸收，使得反射光能量急剧 下降，从而出现谐振吸收峰，由于发生了入射光的能量吸收，这种全反射形式也 被称为衰减全反射( a t t e n u a t e dt o t a lr e f l e c t i o n ，a t r ) 。s p w 的k 与金属折 射率及光疏媒质折射率有关： 女”2 詈( 羔) q ， 上式中，m 是入射光在真空中的角频率，c 是入射光在真空中的速度。理论计算 表明“，当光疏媒质折射率发生极细微的变化时，将会相应的改变谐振吸收峰的 位置。s p r 传感技术就是利用上述原理对金属表面的被分析物进行检测的。 利用s p r 传感技术检测生化反应时，首先将一种反应物( 如配体) 固定在传 感芯片表面金属膜上，然后将分析物的样品( 受体) 以恒定的速度通过传感芯片， 与传感芯片上分子间的相互作用，引起表面膜的折射率变化，从而使s p r 光学信 号的改变，实时地记录整个反应过程的信号变化，将可以获得反应的吸附和解离 常数，被测物的浓度等非常有用的参数。 第三章s p r 传感技术的理论批础 3 2s p r 传感器的动力学分析 真正令s p r 生物传感器成为标准的生物分子相互作用分析手段的，是它能进 行亲和反应动力学分析的特点，正是这一特点使它成为独特而有力的分析工具。 k a r l s s o n 。”等第一次报道了用于对抗原抗体免疫反应进行动力学分析的成熟方 法，应该指出的是，这个动力学分析方法几乎可以不加修改的用于许多其他的亲 和反应类别。在这个方法的基础上，许多用于其他类别的生物分子亲和反应动力 学分析法很快地建立起来，这主要是b i a c o r e 公司研究团队，及其合作实验室的 贡献”2 2 ”。在生物分子亲和反应检测和动力学分析的另一个重大的突破是s p r 成功实现了对溶液中小分子( 5 0 0 0 d ) 的检测和动力学分析”“。 大量的论文也讨论了有关质量传递对于s p r 动力学分析的影响。e d w a r d s 等 对质量传递对固相表面亲和反应的影响作了详细的理论分析”。s p r 传感器是基 于表面的检测手段，当液相溶液中的溶质结合于固相表面时，会造成固液表面附 近的液相薄层中的溶质浓度降低，这样就会形成这个薄层与外层液相本体的浓度 差，这个浓度差会产生质量传递效应，反过来促进这个浓度差的消除。这种效应 也同样的存在于解离过程。在固一液表面亲和反应中，表面亲和反应和质量传递 是同时进行的，因此实际上s p r 动力学分析结果反应的是两个分步反应的总体动 力学参数，总体动力学参数接近限速步骤的常数。所以，如果质量传递成为限速 步骤或者对总体反应速率影响比较大，s p r 传感器分析的k 并l j b 将严重偏离要检 测的表面亲和反应的动力学常数。只有当质量传递足够快，检测到的信号爿比较 真实的反映表面亲和反应，分析的动力学常数才会比较真实。有效地解决方法就 是加快流动系统流速，不过这样也会加大单次检测的耗样量。一般而言，当反应 处于质量传递限制的模式下时，s p r 传感器主要用于平衡分析，因为平衡分析实 际上是对反应热力学特性的分析，与过程无关。不过有不少研究小组报道了在质 量传递限制下如何进行动力学分析。“，这将有助于节省耗样量。 1 4 第三章s p r 传感技术的理论拱础 3 3s p r 传感器的实现方式 s p r 传感器有多种实现方式，包括基于棱镜耦合方式，基于光栅耦合方式， 基于光波导，基于光纤等结构。 其中，最容易实现和最广泛使用的s p r 传感器结构是基于棱镜耦合方式的 k r e t s c h m a n n 结构。如图1 3 所示： 幽1 3k r e t s c h m a n n 结构 一束单色光以入射角臼照射在棱镜和金属( 厚度约为5 0 n m ) 表面，当疗大于 全反射临界角以时，由于金属层的存在，发生了衰减全反射现象。消逝波穿透金 属层，并在金属层的外表面，即与被测物接触的表面激发产生表面等离子体波。 改变入射角度口，将有可能满足谐振条件式t 。= k 。，从而产生s p r 现象。利用 反射光强r 与相应入射角度p 可以画出s p r 峰值曲线。典型的s p r 峰值曲线如图 1 4 所示。 第三章s p r 传感技术的理论拱础 图1 4 典型的s p r 峰值曲线 总的来说，基于棱镜耦合的a t r 方法简单实用，较容易达到很高的灵敏度。 3 4 基于棱镜耦合的s p r 的理论分析 根据经典的d r u d e 金属自由电子气模型，金属中的自由电子就像是电子的 海洋，它们的体密度高达1 0 ”绷。它们和理想的气体分子一样，符合波尔兹曼 分布。假设金属内自由电子密度为n ，电子群在某一时刻由于运动偏离了其平衡 位置x ，在x 方向移动了距离血，那么电子群将会受到使它们返回平衡位置的 恢复力；当到达平衡位置时，根据能量守恒定律，此时势能为零，动能最大，电 子群将继续通过平衡位置z 。向前运动，直至全部动能转变为势能。如此继续，电 子这种简单的周期性运动被称为电子集体振荡，振荡的能量自甜，= 4 刀m 2 i m 。， 约为l o e v 量级。 进而考虑金属表面的自由电子振荡的情形。在金属表面，电子的横向 ( t r a n s v e r s a l ，垂直于表面) 运动受到表面的阻碍，在表面上形成了电子浓度 的梯度分布，表现为局限于表面的等离子体振荡3 ( s u r f a c ep l a s m o n ，s p ) 。这 些电子振荡被局限在z 方向上的t h o m a s f e r m i 屏蔽长度内，约为1 爿，伴随表面 等离子体的振荡，产生了一种沿x 方向传播，并且幅度沿z 方向衰减的电磁波， 这种沿金属表面传播的电磁波被称为表面等离子体波( s u r f a c ep l a s m o nw a v e ， 第三章s p r 传感技术的理论基础 s p w ) ，它可以用下式来描述： e = 2 。e x p + i ( k ，x t ：z 一“) + 屯 j印 l k i 8 t 一 介质层 b h 半无限大的金属层 图1 5 表面等离子体波研金属表面传播。e 2 代表介质层的介电常数；。代表半无限大金属 层的介电常数；h ，平行于y 方向，表明这是一种p 偏振电磁波；右边的图显示了电磁场t 分量在z 2 0 处幅值最大，随着h 的增大而衰减。 图1 5 形象的描述了s p w 在金属表面的分布和传播。根据m a x w e l l 方程，在 半无限大金属表面和介质层的界面处，s p w 满足以下的色散关系： d 。：生+ 生：0 1 2 并且 s ，( 詈) 一= t ，2 + t 。2 ，z = ，z c s ， 由于通过突变界面时，电矢量的切线分量是连续的1 ，色散关系式( 4 ) 可以 改写为： t = 文蓑) l ，2 由于和s ：都是实数，而金属的介电常数q 通常为复数，并有s ，”c i ，因 此七也是一个复数，它的实部和虚部分别为： “= 文寰) l 2 畔( 寰) 3 2 赫 第三章s p r 传感技术的理论基础 对于绝大多数金属来说，q c o 且i ，z ，这保证了，是实数，而且t ，詈。 t 决定了s p w 的振动频率，t ”则相当于s p w 波的阻尼因子，导致s p w 在沿x 方 向传播过程中，振幅呈负指数规律衰减。 根据式( 3 ) 可以得知，s p w 沿z 方向随着h 的增大而成指数衰减，它在z 方 向的传播长度为： t 2 网1 ( 9 ) 以金属a g 为例，假设s p w 的波长为a = 6 0 0 n m ，那么在介质层岛的传播长 度t ：= 3 9 0 n m ，在金属层的传播长度t ，= 3 1 n m 。s p w 波在金属层内部的传播长 度是一个很重要的参数，它对s p r 现象的特性有着重要的影响。 由于t 是复数，它沿x 方向表现为衰减振荡传播，当它的振幅衰减为1 e 时的传播长度为 小南 ( 1 0 ) 同样以金属银为例，假设s p w 的波长为a = 5 1 4 5 n m ，那么t = 2 2 彬。 当p 偏振的入射光波波矢t 在x 方向上的投影女i 满足： = 文寰厂 ， 时，入射光波的x 分量将与s p w 发生谐振，此时，入射光波的绝大部分能量被 s p w 吸收，大大增强了s p w 的振幅，从而导致反射光的光强急剧降低，这种现象 就被称为光激发表面等离子体谐振。上式就是发生谐振的条件。 p 偏振的入射光直接从空气或者真空中入射到金属层表面，并不能激发s p r 现象，因为据前面的分析可知，大部分金属均满足的t 。，竺条件，而真空中的入 射光波矢在x 方向上的投影： t ，t ：竺s i n 0 竺( 1 2 ) k r e t s c h m a n n 和r a e t h e r 。”提出了棱镜耦合的方式来实现s p r 现象。如图1 6 第三章s p r 传感技术的理论基础 所示。 镜 空气 金属 图1 6 两种基于棱镜实现s p r 现象的结构 ( a ) k r e t s c h m a n n r e a t h e r 结构：金属层与棱镜接触； ( b ) o t t o 结构：很薄的介质层( 空气) 介于棱镜和金属之间； 从色散曲线图1 7 上可以很清楚地看出上述结构是如何利用棱镜来满足谐振 条件式( 2 9 ) 的。 t = 詈石s i n 岛 图1 7k r e t s c h m a n n r a e t h e r 棱镜耦 合的色散关系变化图：由于加入了介 电常数为。的棱镜，棱镜的色散曲线 c 、与s p w 的色散曲线有了交点p ， p 点以下的d r 曲线段总有可能找到合 适的入射光频率o j 或者入射光角度 舅、，满足谐振条件，在1 2 ( 金属空 气) 表面作用于s p w 。 k r e t s c h m a n n r a e t h e r 结构在棱镜表面镀上一层厚度约为几十纳米的金属 膜( a u 或者a g ) ，入射光波在o 1 ( 棱镜金属) 界面处产生的消逝波穿透了金 属膜，在传播过程中以指数形式衰减，并在1 2 ( 金属空气) 界面处与s p w 相 互作用。由于k r e t s c h m a n n r a e t h e r 结构非常简单，容易实现，并且能够获得很 高的精度，所以它是目前商业化的s p r 产品中大多采用的一种结构。本论文所采 用的棱镜耦合方式也是k r e t s c h m a n n r a e t h e r 结构。 另一种棱镜耦合的方式o t t o 结构，如图4 ( b ) 所示，金属膜与棱镜界面之 间有距离约为光波长a 的间隙，消逝波与金膜的s p w 在1 2 ( 金属空气) 界面 第三章s p r 传感技术的理论基础 处耦合并相互作用。o t t o 模型主要用于研究单晶体表面的声偶极子。 3 5 本论文采用结构模型的数值化分析 本论文所采用的k r e t s c h m a n n 棱镜结构如图6 所示，它由棱镜、载玻片、 金属膜、被检测的生物膜和缓冲液5 层构成，。是各层的介电常数，i = 0 ，4 ，d ，是 中间三层各层的厚度，i = 1 ，3 。通常使用时，先通过真空电子溅射的方法在载玻 片上镀上一层金属膜，然后通过折射率匹配液将载玻片的玻璃面与棱镜的平面附 着在一起。 幽1 8 五层结构的k r e t s c h m a n n 结构 其中是各层的介电常数，i = o ，4 ，d 。是各层的厚度，i = 1 ，3 在蔡浩原的论文1 中，已经将此5 层结构模型进行了数学模拟，下面是他的 结果： 1 ) 生物膜厚度d 3 ，折射率n 3 与0s p r 的关系 从图7 中可以看到，对于同一种生物膜，它的折射率n 3 固定不变，当附着 在金属膜上的厚度d 3 增加时，谐振峰，也随之增大，并且在如c 2 0 0 n m 时，增 加的速率较快，随后则趋于平缓。这与消逝波在生物膜层和缓冲液层的穿透深度 有关。 第三章s p r 传感技术的理论綦础 。( 度) 0 2 0 0 n o = 1 6 5 ： n l _ 1 5 6 ；d 1 - o ： 占2 = 一1 3 4 + 1 4 j n 4 = 1 3 3 入= 6 7 0 n m 4 0 06 0 08 0 0 d 2 2 5 0 n m 西m 妒 图1 9 s p r 谐振峰9 与生物膜厚度d ，折射率n 3 的关系 如果考虑0 c d ，c 1 2 n m 的情况，如图2 0 所示，对于固定的h ，谐振峰与厚 度呈线性关系。 。t 凌1 n o = 1 6 5 ： n 1 = l ，5 6 ；d l = o n m 岛= - 1 3 4 + i 4 j n 4 = 1 3 3 = 6 7 0 n m d 2 = 5 0 n m 024681 01 2 以( r i m ) 图2 0 ( 0 d 3 1 2 n m ) s p r 谐振峰o s 与生物膜厚度d 3 ，折射率”3 的关系 2 ) 金属膜厚度d 2 ，折射率n 2 与0s p r 的关系 金属膜厚度d ：和不同材质的金属膜( 从而有不同的折射率n ：) 对的影响 是十分显著的。计算和实验均表明。”1 ，金属膜的折射率n ，越大，那么s p r 曲线就 会越尖锐，可能达到的检测灵敏度会更高。金属银的s p r 曲线就要比金的s p r 曲线要尖锐的多，但在实际应用中，a g 膜在空气中容易氧化，因此普遍地使用 金膜作为敏感金属膜。 2 1 伯 m 的 第三章s p r 传感技术的理论基础 1 g0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0l 0 5 05 5 6 06 57 0 0 ( 度) n o = i 6 5 ： n l = i 5 6 ；d 1 - o ： 吒= - 1 2 4 - , lj 4 n 3 = i3 ：d 3 = 1 6 0 n r a n 4 = 1 3 3 凡= 6 7 0 n m 图2 1 反射率r 与入射角0 在不同波长的入射光条件f 的关系曲线 图2 1 表明了不同厚度的金膜对应的小同的s p r 曲线。当d ，= 5 0 h m 时，最小 的光强反射率非常的接近于o ，在制作金膜时，将金膜的厚度控制在5 0 纳米附 近是十分重要的，这样习可能使s p r 传感芯片获得更好的灵敏度。从图2 7 还可 以看出，不同厚度的金属膜虽然改变了s p r 曲线的半峰宽度和最小反射率r 。 但对应的眭。，的位置却变化很小。 3 ) 入射光波长 与0s p r 的关系 在给定其他参数的条件下，改变入射光波长 ，如图2 2 所示，当a = 6 7 0 n t o 时，s p rf i i 线最尖锐。 5 05 56 06 5 7 0 口( 度) 图2 2 不同波艮的入射光对应的s p r 曲线 4 ) 载玻片厚度d 1 与0s p r 的关系 n o = 1 6 5 ： n 1 = 15 6 ；d l = o 、 岛= 一13 4 + 1 4 ， n 3 = l3 ：d 3 = 1 6 0 n m n 4 - l3 3 d 2 = 5 0 n m l 9 8 7 6 5 4 3 2 l o n n n n 0 o o o 0 r 第三章s p r 传感技术的理论基础 载玻片层的加入，使入射光线在棱镜和载玻片层之间形成了等倾干涉，从而 在光滑的s p r 曲线上增加了许多的明暗相问的干涉条纹，通常采用低通滤波或者 最小二乘法拟和方法消除干涉的影响。3 。一i 第四章小型s p r 生物传感器的研制 第四章小型s p r 生物传感器的研制 4 1 小型s p r 生物传感器的光路及机械结构 4 1 1 光路结构 本仪器采用的s p r 传感器结构是基于棱镜耦合方式的k r e t s c h m a n n 结构。关 于k r e t s c h m a n n 结构已在上文说明。 仪器采用了改进的光路结构，示意图如下： 图2 3 小型s p r 生化传感器光路不总图 激光器产生线偏振的平行光，通过激光器顶端的一个柱透镜，在如图所示的 方向发生会聚( 在垂直于纸面的方向并不会聚) ，折射进入三棱镜后，在三棱镜 上表面发生全反射，此时会聚光在棱镜上表面会聚成为一条垂直于纸面的直线。 实验时，将特制的镀金玻片( 很薄的玻璃片镀上一层5 0 n m 厚的金箔) 用匹配油 粘贴到棱镜的上表面，其上再压上单通道流通池，其通道为垂直于纸面方向，使 流通池的通道完全覆盖住上述会聚光所会聚成的直线。全反射后的光线再照射到 线阵c c d 上，光线照射到c c d 上时为一个椭圆形的光斑，其长轴即被线阵c c d 所检测到。 由图2 3 中可以看出，会聚光在流通池通道处会聚于一点，并且具有梯度的 i-ik 薷凹章小型$ p r 生物传感器的研制 入射角，当流通池中通有待测液体时，由于s p r 现象，必然有某一角度的光强产 生了s p r 吸收峰，反应到