（发酵工程专业论文）d泛解酸内酯水解酶产生菌的筛选及条件优化的研究.pdf

山东轻工业学院硕士学位论文 摘要 本文从收集到的4 3 种霉菌、5 种酵母菌中，利用简单、直观的指示剂变色圈 法对菌株进行了初筛。通过观察变色圈与菌落直径之比的大小，来确定是否为产 酶菌株和产酶量的高低，筛选8 株可能产酶菌株。分别进行摇瓶发酵，以菌体作 酶源水解1 0 d l - 泛解酸内酯溶液一定时间后，用旋光仪测定反应液的旋光度。测 得旋光度为正，数值越大者，水解能力越强。为了进一步鉴定产物和转化率，利 用h p l c 进行了分析测定，结果表明6 株为产酶菌株。经过复筛，最终确定了l 株酶活性较高、专一性好的菌株为出发菌株。经过初步鉴定，确认这株菌株为尖 镰孢菌。再经过诱变选育，得到了突变株尖镰孢菌c z 4 3 7 。经6 次传代实验，发 现此菌株产酶高，稳定性好。 通过对该菌株培养基营养组成和发酵条件优化，结果发现培养基的最佳碳源 为：葡萄糖和甘油；最佳氮源为：蛋白胨、玉米浆和酵母浸膏。最佳无机盐为c a c 0 3 ， 其添加量为5 9 l 。最佳发酵产酶条件为：培养基p h 为7 o ，装液量为5 0 m l 2 5 0 m l ： 接种量8 ；发酵温度为2 8 ；摇床转速为2 0 0 r m i n ，培养时间为7 2 h 。在此条件下， 尖镰孢菌c z 4 3 7 发酵后菌体的生物量达到7 0 8 9 l ，酶活达到7 0 3 u l 。 利用在最佳发酵条件下发酵得到的尖镰孢菌c z 4 3 7 菌体，对d l 泛解酸内酯水 解条件进行了优化，最佳水解条件为：底物浓度为2 0 ；菌体添加浓度为1 4 ；摇 床转速为2 0 0 r m i n ；温度为2 8 ；p n 值调节控$ 1 j 至l j 7 5 。在最适水解条件下，底物 溶液水解1 6 h 后，水解液的旋光度变化值为+ 3 7 。，底物水解率达到3 0 以上。 关键词：d l - 泛解酸内酯；d 一泛解酸内酯水解酶：筛选；尖镰孢菌；优化 山东轻工业学院硕士学位论文 a b s t r a c t t h et h e s i ss t a r t e dw i t hf o r t y - t h r e ek i n d so fs t r e p t o m y c e sa n df i v ek i n d so f y e a s t c o l l e c t e d w ep r e l i m i n a r ys c r e e n e dt h es t r a i n st h r o u g ha ni n t u i t i v e , s i m p l e , i n d i c a t o r c o l o r - c i r c l em e t h o d w eo b t a i n e de i g h ts t r a i n sw h i c hm a y b ep r o d u c ed - p a n t o l a e t o n e h y d r o l a s ea c c o r d i n gt od e t e r m i n ew h e t h e rt h es t r a i np r o d u c ee n z y m ea n dt h ea b i l i t yo f e n z y m ep r o d u c t i o nb yo b s e r v i n gt h ed i a m e t e rr a t i oo fc o l o r - c i r c l ea n dc o l o n y t h i s e i g h ts t r a i n sw e r er e s p e c t i v e l yc u l t i v a t e di nl i q u i dm e d i u m , t h e nu s e dt h em y e e l i u m s o b t a i n e da st h ec n z y l n et o h y d r o l y z e10 d l - p a n t o l a c t o n es o l u t i o ni nac e r t a i n c o n d i t i o n t h es p e c i f i cr o t a t i o no fm i x t u r er e a c t i o ns o l u t i o nw e r em e a s u r e db yt h e p o l a r i m e t e r t h es p e c i f i cr o t a t i o ni sp o s i t i v ev a l u ea n dt h el a r g e ro fp o s i t i v ev a l u e ，t h e s t r o n g e rt h ea b i l i t yo ft h eh y d r o l y s i s i no r d e rt of u r t h e ri d e n t i f yt h ep r o d u c ta n dt h e c o n v e r s i o nr a t e ，w em e a s u r e da n da n a l y z e dt h em i x t u r er e a c t i o ns o l u t i o nb yt h eh p l c t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts i xs t r a i n sc a np r o d u c ed - p a n t o l a c t o n eh y d r o l a s e w e u l t i m a t e l yd e t e r m i n e das t r a i na st h es t a r t i n gs t r a i nw h oh a dt h eh i g h e ra c t i v i t ya n dg o o d s p e c i f i c i t yb yr e - s c r e e n i n g a f t e rai n i t i a li d e n t i f i c a t i o n , w ec o n f i r m e dt h a tt h i ss t r a i n w a sf u s a r i u mo x y s p o r u m a f t e rm u t a t i o nb r e e d i n g ，am o r ep r o d u c t i v em u t a n tf u n g u s w a sa h t a i n e d ：f u s a r i u mo x y s p o r u mc z - 4 3 7 t h r o u g hs i xg e n e r a t i o ne x p e r i m e n t s ，w e f o u n dt h a tf u s a r i u mo x y s p o r u mc z 一4 3 7n o to n l yh i g h l yp r o d u c e d 钮 l z y m eb u ta l s oh a d g o o ds t a b i l i t yi np r o d u c i n ge n z y m e w es t u d i e dt h ec o n d i t i o n sf o re n z y m ef o r m a t i o no ff u s a r i u mo x y s p o r u mc z - 4 3 7 i n c l u d i n gt h en u t r i t i o n a lc o m p o s i t i o no ft h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dt h eo p t i m i z e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s a c c o r d i n gt h er e s e a r c h , w ed e t e r m i n e dt h es u i t a b l ec a r b o n s o u r c eo ff e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r eg l u c o s ea n dg l y c e r o l ；t h es u i t a b l en i t r o g e ns o u r c e o ff e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r cp e p t o n e ，c o r ns t e e pl i q u o ra n dy e a s te x t r a c t t h eb e s t i n o r g a n i cs a l tw a sc a c 0 3 ( 5 9 l ) t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ： t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e ：2 8 ；i n i t i a lp hf o re n z y m ef o r m a t i o n ：p h 7 o ；l i q u i d v o l u m e ：5 0 m l 2 5 0 m l ；i n o c u l u ms i z e ：8 ；s p e e d ：2 0 0 r m i n w h e nt h eo r g a n i s mw a s c u l t u r e di nt h es h a k ef l a s ku n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o r7 2 h , a b o u t7 0 8 9d r y c e u s la n d7 0 3 u lw e r eo b t a i n e d f i r s t l y , w eo b t a i n e dt h em y c e l i u m so f f u s a r i u mo x y s p o r u mc z 一4 3 7i no p t i m u m f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s s e c o n d l mw es t u d i e dt h ec o n d i t i o n sf o re n z y m eh y d r o l y z eo f f u s a r i u mo x y s p o r u mc z 一4 3 7 a c c o r d i n gt h er e s e a r c h , w ed e t e r m i n e dt h es u i t a b l e a b s t r a c t c o n d i t i o n sf o re n z y m eh y d r o l y z e ：s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ：2 0 ：w e tc e l lc o n c e n t r a t i o n ： 14 ；s p e e d ：2 0 0 r m i n ；h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e ：2 8 。c d u r i n gt h eh y d r o l y s i sp r o c e s s ，p h s h o u l db er e g u l a r l ya d j u s tt o7 5w i t hn h 3 i no p t i m i z ec o n d i t i o n , a f t e rt h es u b s t r a t e h y d r o l y z e d1 6 h , t h es p e c i f i cr o t a t i o no fm i x t u r er e a c t i o ns o l u t i o nc a nr e a c ht o + 3 7 0 s u b s t r a t eh y d r o l y s i sr a t ew a sm o r et h a n3 0 k e yw o r d s ：d l - p a n t o l a c t o n e ，d - p a n t o l a c t o n e ，h y d r o l a s e ，s c r e e n i n g ，f u s a r i u mo x y s p o ru m ， o p t i m i z e i i 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 篡驿莉菊 日期： 2 卫旦华年吐月j 生日 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 羔l药药 日期： 趁旦望年红匆此日 导师签名： 五蒸 日期：茸年4 月掣日 山东轻工业学院硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 d 一泛解酸内酯和泛酸系列产品的概述 d 泛解酸内酯( d p a n t o l a c t o n e ) 是生产d 泛酸钙、d 泛醇、d 泛硫乙胺等泛 酸系列产品的重要手性中间体。泛酸是b 族维生素物质，是辅酶a 的组成部分， 参与糖、脂肪、蛋白质代谢。也有人【l 】称泛酸是辅酶a 的辅酶，辅酶a 是泛酸与 3 磷酸腺苷、焦磷酸和1 3 巯乙胺相结合的复合分子，因此辅酶a 的作用即是泛酸 的生理功能：参与体内脂肪酸降解、脂肪酸合成、柠檬酸循环、胆碱( 一种神经 冲动传导物质) 乙酰化、抗体的合成( 增强对病原体的抵抗力) 等代谢。由于辅 酶a 的生理功能，泛酸的存在有利于各种营养物质的吸收和利用，因此d 泛酸广 泛用于医药、食品、饲料工业，其活性成分为d 构型的右旋泛酸( 维生素b 3 ) ， 但因泛酸不稳定，其商品形式主要为d 泛酸钙。d 泛醇( 维生素原b s ) 是以液体 形式存在的d 泛酸钙的同效物，进入动物体内能转化为泛酸。由于泛酸在p h 3 5 时比泛酸的盐类具有更好的稳定性，因此在多维生物溶液中用来代替泛酸【2 】。 1 1 1d 一泛解酸内酯 d 泛解酸内酯( d p a n t o l a c t o n e ) 是白色吸湿性结晶，易溶于水，熔点为9 2 0 c 。 分子式为c 6 i - i 1 0 0 3 ，化学名称为a 羟基一p ，肛二甲基吖一丁内酯，相对分子量为1 3 0 0 3 ， 旋光度为【0 c 】d 2 0 = 一5 0 7 0 ( 2 0 5 水溶液) p j 。 d 泛解酸内酯结构式如下。 h 筘 图1 1d 泛解酸内酯分子结构 d 泛解酸内酯作为一种重要的医药中间体，主要用于合成维生素类药d - 泛醇 及神经营养药d 泛酸钙。d 一泛醇和d 泛酸钙可以通过d l 泛解酸内酯分别与p 氨基 丙醇、d 氨基丁酸反应合成出各自的外消旋体再拆分的路线得到，但这种路线一直 未见工业化生产的报道，主要原因在于该方法要损失近一倍的成本较高的p 氨基丙 醇、d 氨基丁酸，导致其生产成本过高。目前国内外d 泛醇、d 高泛酸钙的工业 生产中，均为先拆分d l 泛解酸内酯，将得到的d 泛解酸内酯和各自的另一中间体 直接合成。d 泛解酸内酯的制备一般采用以下两种方法。 第1 章绪论 ( 1 ) 利用高度选择性的酶。将d l 泛解酸内酯中的l 泛解酸内酯加氢分解，得 到d 泛解酸内酯。该工艺不适于工业化生产，原因之一：加氢分解能力低，使得 到的n 泛解酸内酯旋光纯度低；原因之二：酶的活性难以保持，难以再生，使工 业生产不易操作；原因之三：酶的选择加氢使5 0 的泛解酸内酯被破坏掉，从而增 加原料成本【”】。 ( 2 ) 化学拆分法。用手性试剂与d l 泛解酸内酯形成复盐，利用复盐在溶剂中 的溶解度不同，将d 一型和l - 型的复盐分离，然后通过化学处理，得到d 型的泛解 酸内酯，并且回收l 型泛解酸内酯和拆分试剂。文献报导【5 6 ，7 1 ，拆分d l 泛解酸内 酯的手性拆分试剂有奎宁、番木鳖碱、麻黄素等有机生物碱，这些生物碱不仅价 格太高，而且不易得到，不适于工业化生产。随着d 泛醇、d 高泛酸钙市场的不 断扩大，d 泛解酸内酯的需求量日益增大。探求其新的拆分方法，完善生产工艺， 提高产品质量，一直成为研究者和生产者追求的目的。 1 1 2 泛酸 ( 1 ) 泛酸的性质和结构组成 泛酸( p a n t o t h e n i ca c i d ) ，又称本多生酸、维生素b 5 、维生素b 3 ，泛酸分子式 为c 9 h 1 7 0 5 n ，相对分子质量为2 1 9 2 0 。化学名称为d ( + ) n ( a ，p 二羟基p ，1 3 - 二甲 基丁酰) p - 丙氨酸 d ( + ) - n ( a ，p d 蛐x 弘d ，i b - d i m e t h y l b u y t l ) 1 3 一a l a n i n e 。泛酸是水 溶性维生素b 族的一种，存在于所有有生命的组织里，并广泛分布于自然界中。因 此又称为遍多酸。其活性成分为d 构型的右旋泛酸。泛酸结构式如下。 h 。q 苍洲一 图1 2 泛酸分子结构 d 泛酸为淡黄色粘滞油状液体，带有强旋光性， 0 c 】d 2 6 - + 3 7 5 0 ，易溶于水、乙 酸乙酯、二恶烷和冰醋酸，微溶于乙醚和戊醇，不溶于苯和氯仿。它对热及碱都 不稳定，因此通常使用的产品是其右旋钙盐d 泛酸钙( c a l c i u mp a n t o t h e n a t e ) 3 1 。 ( 2 ) 泛酸的生理功能 泛酸在体内主要以辅酶( c o e n z y m e ，c o a ) 形式参与糖、脂、蛋白质代谢， c o a 在代谢中主要起转酰基的作用【8 】。泛酸缺乏时，过氧化物酶体脂肪酸d 一氧化 受到抑制，并可能诱导脑部伤害。另外，泛酸具有抗脂质过氧化作用，可能的机 制主要有两种：以c o a 的形式清除自由基，保护细胞质膜不受损害；c o a 通过促进磷脂合成帮助细胞修复【9 1 。 据报道，泛酸可延长全饥饿小鼠饥饿耐受时间【1 0 1 和果蝇热环境生存时间【1 1 】， 对于猪和禽类的繁殖与生产能力亦有明显促进作用【1 2 , 1 3 ，还可促进红枣离体快速 2 山东轻工业学院硕士学位论文 育斟1 4 1 。 ( 3 ) 吸收机制 有机酸在不断进化过程中产生了主动积累泛酸的内在机制，依靠一种广泛存 在于机体的n a + 依赖转运体转运泛酸进入细胞。该转运体为泛酸、硫辛酸、生物素 所共享，但亲和性依次降低；被称为n a + 依赖的多维生素转运体( s o d i u m - d e p e n d e n t m u l t i v i t a m i nt r a n s p o r t e r s m v t ) 该转运体可能属于n a + 依赖的葡萄糖载体家族成 员，具有种间相似性。由膜内负电位活化，每转运一个泛酸需要两个n a + 协同【1 5 】。 1 1 3d 泛酸钙 ( 1 ) d 泛酸钙性质和结构组成 d 泛酸钙( c a l c i u mp a n t o t h e n a t e ) ，法定编号c a s l 3 7 0 8 6 ，化学名称为( r ) n ( 3 ，2 二甲基2 ，4 - - 羟基一1 氧代丁基) - 3 丙氨酸钙盐，分子式为( c 9 h 1 6 0 2 n ) 2 c a ，相对分子质量为4 7 6 5 。外观为白色结晶性粉末，无臭，味微苦，吸湿性极 强，易溶于水( 约4 0 9 l o o m l ) 、甘油，在乙醇、甲醇中微溶，不溶于乙醚、丙酮 和三氯甲烷；【0 【】d 2 6 川4 3 。；熔点2 0 0 c ( 分解) ；水溶液在p h 5 7 之间最稳定； d l 泛酸钙吸水性强，当含水量达到7 0 时容易脱氨失活；不耐酸、碱、高温，在 酸性和碱性溶液中易受热被破坏，在强酸性中加热极易水解为内酯及肛氨基丙酸； 在3 5 c 贮存2 年，损失高达7 0 ；在中性溶液中比较稳定，对氧化剂和还原剂极 为稳赳1 6 1 。 d 泛酸钙产品规格：外观自由流动细粉末；颜色白色；阻】d 2 0 = + 2 5 + 2 8 。； 干燥失重( 1 0 0 1 0 5 c ) 为5 ；d 一泛酸钙含量( 干物) 为9 8 。d 泛酸钙结构式 如下。 h 。世o h 洲h c o ( 2 ) d 泛酸钙的生理功能 泛酸钙进入人体内可释放出泛酸和钙元素，泛酸作为辅酶a 前体物质，能调 节蛋白质、碳水化合物及脂肪的代谢，促进对病原体有抵抗力的抗体的合成。泛 酸的不足，可使机体的许多器官和组织受损，表现出皮肤和粘膜以及羽毛发生病 变、发炎、肠道和呼吸道易患疾病。生殖机能紊乱，生长缓慢体重减轻，神经系 统紊乱，抗体形成受到抑制【1 7 】。人体缺乏泛酸会引起肌肉酸痛或痉挛，肾上腺机 能不足和减退、注意力不集中、手脚麻木，易怒、便秘、足部灼痛或足跟疼痛、 第1 章绪论 精力缺乏、轻微锻炼后即筋疲力尽、忧虑、紧张以及磨牙等症状。泛酸钙以其特 有的生化功能广泛应用于饲料，医药、食品等工业【l 引。 缺乏泛酸的症状【l9 】：缺乏泛酸会导致家禽、家畜生长迟缓，生殖机能发生障 碍，适应性降低，其主要症状表现为皮肤粗糙，毛发无光或脱落，眼角周围呈现 深黄色粘状分泌物，肠胃道消化功能紊乱，食欲不振和腹泻、孵化率低和胚胎死 亡率高，趾和嘴有痂疤，行走不协调等，出现一种“鹅步”病的病态。 1 1 4d - 泛醇 d 泛醇( d p a n t h a n 0 1 ) 法定编号c a s 8 1 1 3 0 ，化学名称为d ( + ) 2 4 二羟基 - n ( 3 羟丙基) 3 3 二甲丁酰胺，分子式为c g h l 9 0 4 n ，相对分子质量为2 0 5 2 5 。是 一种无色透明、粘稠、稍具吸湿性的液体，略带特殊气味，微苦。相对密度为1 2 ， 沸点1 1 8 1 2 0 ，静置时可出现结晶。d 一泛醇进入人体内能转化为泛酸，进而合成 辅酶a ，促进人体蛋白质、脂肪、糖类的代谢，保护皮肤表面的粘膜和毛发光泽、 防止疾病的发生，缺乏d 泛醇就会导致皮肤病变及生理障碍。人类及动物对d 泛酸有生理上的需求，而d 泛酸极不稳定，其商品形式的固体d 泛酸钙在应用范 围受到很大的限制，而d 泛醇是以液体形式存在的同效物，能弥补d 。泛酸钙在应 用领域的不足。与泛酸比较，特别是液体配方中。d 泛醇有较高的稳定性，是一 种既稳定而又在生物学上呈现活性状态的b 族维生素。泛醇比泛酸的盐类具有更 大的稳定性，因此在多维生素溶液中常用d 泛醇而不用泛酸。常温下d 泛醇易溶 于水、乙醇、和丙二醇、因此d 泛醇作为营养补剂使用方便，特别适用于医药和 食品行业，也是在化妆品中使用频率最高的维生素【1 6 , 1 7 , 1 8 , 1 9 】。d 泛醇结构式如下。 c on h c h2 0 h 图1 4d - 泛醇的分子结构 1 1 5d - 泛硫乙胺 泛硫乙胺( p a n t e t h i n e ) ，又名潘特生。为无色或浅黄色澄清、粘稠液体；易溶 于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚、丙酮和氯仿，见光易分解；分子式为c 2 2 h 4 2 n 4 0 8 s 2 ， 相对分子质量为5 5 4 7 3 ，泛硫乙胺化学名称为d 双( n - 泛酰一1 3 氨基乙基) 二硫， 是维生素b 5 的更有效形式 2 们。结构式如下。 4 山东轻工业学院硕士学位论文 e 卫l ：伽：一豇嗍，：锄 il c r i 二e i l 舭一止s 图1 5 泛硫乙胺的分子结构式 1 2d 一泛解酸内酯的应用 1 2 1d _ 泛解酸内酯生产d - 泛酸钙及其用途 d 泛解酸内酯是生产d 泛酸钙的重要手性中间体。生产d 泛酸钙也是d 泛 解酸内酯最主要的应用方面。d - 泛解酸内酯与氨基丙酸钙酰胺化反应，即可得到 d 泛酸钙。在合成过程中控制水分是很重要的，有水存在时发生副反应，严重影 响d 泛酸钙的收率。 工业合成d 泛酸钙的方法：3 0 0 0 l 搪玻璃反应釜中，加入经合成并准确测定 含量的氨基丙酸钙甲醇溶液，投入d 泛解酸内酯。控制2 50 1 2 左右搅拌反应1 6 h 。 降温到i o 。c 结晶1 6 h ，出料到离心机甩滤。滤饼经流化床或真空回转干燥到规定 始终并经标准化包装后成为d 泛酸钙产品。 d 泛酸钙是泛酸系列产品中产量最大的一种，也是泛酸最主要的商品形式， 广泛用于医药、食品、饲料工业，作为食品和饲料添加剂的需求量很大。目前世 界d 泛酸钙年消费量1 0 0 0 0 1 2 0 0 0 t ，其中7 0 用于饲料工业【2 ，2 1 1 。 ( 1 ) 作为微生素药物 d 泛酸钙属于维生素类物质，它是辅酶a 的组成部分，参与蛋白质、脂肪、 糖代谢，起乙酰化作用。 有文献介绍 1 9 】，人体缺乏泛酸钙可出现如下症状：生长停止，体重减少， 突然死亡；皮肤、毛发障碍：神经系统障碍；消化器官失常，肝功能障 碍；影响抗体形成；副肾障碍。 因为泛酸广泛存在于食物中，所以人类一般不缺乏泛酸。临床上也尚无泛酸 被证实的治疗作用，但却一直用于治疗一些疾病，与其他b 族维生素一起用于维 生素b 缺乏症、周围神经炎、手术后肠梗阻、链霉菌中毒及类风湿等。与维生素 c 和用于治疗播散性红斑狼疮，还用于制造其他药物。国内医药行业估计用量为 1 5 0 t a 。 第1 章绪论 有人认为，人类的一些没有明显特征的疾病都可归咎于泛酸缺乏。例如在脚 气病、核黄素缺乏和粗皮病的患者血液中常观察到泛酸的水平很低。另据报道， 周围神经炎、麻痹肠梗阻、k o r s a k o f f 综合症及震颤性谵妄等，这些疾病用其他b 族维生素治疗无效时，用泛酸治疗却能起到一定效果。因此，目前泛酸在临床医 疗上广为应用。制剂有单纯片剂、复方维生素b 和多种维生素制剂等多种剂型。 ( 2 ) 作为食品添加剂 泛酸虽然广泛存在于食品中，但由于大量使用的加工食品中泛酸含量不足， 导致饮食中的泛酸含量降低，其原因主要是由于泛酸在食品加工过程中要损失 2 0 。4 0 ，甚至高达5 0 。因此，专家们建议应补充泛酸，使精制面粉、糖和脂 肪中泛酸的含量更丰富些。其他如肉类和鱼类制成品中也需要添加泛酸。一般建 议维持组织正常的摄入量应为7 8 m g d ，孕妇特别是年轻孕妇所需更多。婴儿的食 品中一般都添加泛酸，其用量为3 2 m g k g 以下。此外，泛酸还添加于特别需要营 养的食品中。 d 泛酸钙作为营养强化剂、营养增补剂，目前还用于添加到各种营养保健食 品中，改善营养成分含量，维持人体健康和提高精神适应能力。一般营养增补剂 的泛酸钙使用量在1 ( 以钙计) 以下。奶粉强化时为1 0 m g 1 0 0 9 。烧酒、威士忌 酒中添加0 0 2 可防止冬季结晶。添加泛酸还能缓解咖啡因及糖精等的苦味。据估 计，食品行业用量多于医药行业，估计国内需求量约为5 0 0 t a e 2 1 2 2 1 。 ( 3 ) 作为饲料添加剂 泛酸钙大量用于饲料工业，泛酸作为辅酶a 的组分参与调节蛋白、糖和脂肪 代谢。泛酸钙作为维生素类饲料添加剂，在畜禽养殖中具有重要的作用，对于维 持皮肤和粘膜功能的正常化、毛发的着色和抗感染能力都是不可缺少的，动物缺 少泛酸时会出现各种代谢、神经、肠胃等方面生理机能的紊乱。例如发生皮肤和 粘膜病变、发炎，肠道和呼吸道疾病，生殖机能紊乱，耐紧张能力降低等症状， 猪患“鹅步”病，家禽产蛋量降低、胚胎死亡率高等。 牛、羊等反刍动物可自己合成泛酸，一般可不添加泛酸。猪、鸡等单胃动物 及鱼类也可合成少量泛酸，但不能满足需要。猪、鸡对泛酸需求量大，其饲料中 都需要添 j h d 泛酸钙。一般认为，l k g 猪或鸡饲料需要1 0 m g 泛酸。由于许多动植物 性饲料中也含少量的泛酸，在饲料混配时要经过计算，不够时则需要添加【2 引。 另见有关部门提供的资料，禽畜所需要的泛酸钙如下。 鸡、鸭、鹅： 7 1 0 m g ( d 只) 猪、牛： 1 0 1 5 m g ( d 只) 马： 1 5 4 5 m g ( d 只) 泛酸钙作为一种重要的维生素类饲料添加剂，在畜禽养殖中具有重要的作用， 现大量用于饲料工业。在饲料添加剂中，泛酸钙的消费量仅次于烟酸，居于1 3 种 6 山东轻工业学院硕士学位论文 维生素的第2 位。商品泛酸大部分用作畜禽饲料添加剂，日本国内消费的d 泛酸 钙中，饲料用7 0 ，医药用2 5 ，食品添加剂用5 。美国消费的泛酸钙中，7 5 用作猪和家禽的饲料添加剂，2 5 用于食品强化剂和多种维生素制剂。 近年来，国内饲料工业发展很快，对泛酸钙的需求量也相应增加，估计国内 d 泛酸钙需求量超过5 0 0 t a 1 2 1 2 3 1 。 1 2 2d - 泛解酸内酯生产d - 泛醇及其用途 d 泛解酸内酯与b 丙氨醇反应即得到d 泛醇。d 泛醇只能用拆分法生产的 d 泛解酸内酯合成，而不能用先合成d l - 泛醇再导结晶的方法生产。由于d 泛醇 合成过程中没有结晶工序，因此对中间体有更高质量要求。d 泛解酸内酯需要在 使用前先行精制【2 0 川。 工业合成d 泛醇的方法：3 0 0 0 l 搪玻璃反应釜中加入p 氨基丙醇，投入d 泛 解酸内酯，控制一定温度反应2 4 h ，产品经脱气、脱味处理后包装，得到d 泛醇 成品。 d 泛醇主要应用于医药，日化、食品和饲料行业。泛醇属维生素类物质，原 来只供药用，世界销量不过数百吨。2 0 世纪9 0 年代初西方研究人员发现，泛醇是 一种优异的皮肤与头发保护剂，使泛醇迅速成为风行世界、销量大增的保护品、 护发品的主要原料，由此泛醇一跃成为千吨级产品。目前只有瑞士的罗氏公司、 德国的巴斯夫公司、日本第一制药株式会社等少数几家公司生产，我国只有浙江 鑫富生产d 泛醇【2 4 】。由于采用化学拆分d l - 泛解酸内酯，合成工艺路线长而且复 杂，一般厂家生产规模都不大。美国目前没有d 泛醇生产企业。 由于d 一泛醇相对价格较高，只有在需用d 泛酸而又不适宜使用d 泛酸钙时， 才考虑用其代替。还有，泛醇在p h 3 5 时比泛酸的盐类具有更高的稳定性，因此 在多维生素溶液中，以及营养输液中，常用d 泛醇来代替泛酸。 ( 1 ) 作为b 族维生素类药物 d 泛醇进入人体即转化成d 泛酸，进而合成辅酶a ，促进人体蛋白质、脂肪、 糖类的代谢。与泛酸比较，它既稳定而又在生物学上成活性状态，特别是液体配 方中有较高的稳定性。在2 0 世纪8 0 年代以前就用于医药工业，主要用于复合维 生素b 针剂、输液、眼药水等及其他液体制剂。泛醇在表皮组织的形成中扮演重 要的角色，因此，泛醇可作为活性成分用作外用药物成分，可促进创口愈合和用 于增强皮肤营养。 ( 2 ) 作为营养增补剂 d 泛醇作为营养增补剂，可广泛用于食品和饲料工业。因其使用方便，可作 为食品与饲料添加剂，应用于液体制剂，如复合维生素b 口服液、饮料、食品、 保健品等，广受用户亲睐。由于游离泛酸及不稳定，极易吸潮，很少应用。因此， 7 第1 章绪论 作为饲料添加剂应用者多选用稳定性好的固体泛酸钙。在液体饲料中，则应用泛 酸的同效物泛醇更好。又如在含磷酸盐的饲料中，使用泛酸钙会因形成磷酸钙而 降低效用，若使用泛醇则很有利。 ( 3 ) 作为化妆品中的营养剂 维生素是皮肤保健和美容所不可缺少的营养剂，国外很多化妆品中均含维生 素。目前d 一泛醇很大的市场是用作化妆品的添加剂。d 泛醇是一种有益的皮肤与 头发保护剂，作为泛酸的同效物，泛醇在毛发和皮肤中能转化为泛酸，渗入发根、 透过皮肤，并以泛酸的形式存在于细胞内，作为辅酶a 的成分之一。若在护肤品 或护发品中添加一定量的泛醇，其分子可渗入皮肤角质层及毛发中并很快在酶的 作用下还原成维生素b 5 ( 泛酸) ，可使皮肤保持柔嫩、毛发光亮油润。化妆品专家 研究发现，维生素a 、维生素e 、泛醇和它们的衍生物能通过化妆品渗入皮肤生效； 此外，泛醇同样能改善指甲的生长与色泽( 泛醇能渗透入头发和指甲) ，这些原因 是泛醇成为畅销世界的护肤品、护发品的一种主要原料，在化妆品方面可用于乳 剂、洗剂、头发喷雾剂、软膏和唇膏等。在一些已开发应用的化妆品配方中，d 泛醇的用量为0 1 一0 2 ( 质量分数) ，在头发修护霜中的用量为1 ( 质量分数) 。 1 2 3d - 泛解酸内酯生产d - 泛硫乙胺及其用途 成品泛硫乙胺由右旋泛酸盐与胱胺盐酸盐在甲醇中缩合而得。泛硫乙胺是双 分子泛酰巯基乙胺的一种化合物，是辅酶a ( c o a ) 的组成成分。泛酰毓基乙胺自 身是泛酸( 维生素b 5 ) 和d 巯基丙氨酸的一种化合物，泛硫乙胺是辅酶a 的前驱 物，临界驱动点在三羧酸能量产生的循环之中。辅酶a 又称舌下腺辅酶b 5 的前驱 物，这种舌下腺维生素的益处在于：它们先被转变为具有活性的辅酶形态，以它 的活性形态直接进入血液中并能迅速发生反应，有利于被人体吸收，不仅在消化 过程中，而且在肝脏的转化过程中都避免了浪引1 6 , 2 0 。 泛硫乙胺在医药工业中作为降血脂药，能降低血清中总胆固醇、甘油三酯及 增高血清中的高密度脂蛋白胆固醇。泛硫乙胺作为辅酶a 的前驱物质，能使蛋白 质代谢异常改善，并有改善血管壁脂质代谢异常和改善血小板机能异常等作用。 ( 1 ) 泛硫乙胺在降血脂药中的作用 心脑血管疾病是人类健康主要杀手，改善脂质代谢、调节血脂是有效的防治 手段。血脂成分主要涉及两种类型，胆固醇( c h ) 是动脉粥样硬化板块中的主要 成分。上世纪8 0 年代成功开发以l o v a s t a t i n 为代表的“他类药物，可抑制内源 性c h 的合成，使得高胆固醇( h t g ) 被有效控制。但冠心病( c h d ) 事件及冠 状动粥样板块( a s ) 的发展并未又大幅度缓解。其后证实高甘油三酯( h t g ) 也 是诱发c h d 的独立危险因素，此外h t g 又会降低组织的胰岛素敏感性，造成胰 岛素抵抗( i r ) 及活化凝血因子、增加血栓出现频率。目前主要应用苯氧酸类衍 山东轻工业学院硕士学位论文 生物“贝物类药物治疗h t g ，该药可使临床心血管事件降低7 1 ，但这类药物 对肝、肾等组织有较严重的不良反应，不易作为中老年人的长期乃至终生用药。 国内需要药物治疗高血脂患者不少于5 0 0 0 万，大多分布在4 5 岁以上人群。由于 我国的膳食特征是以碳水化合物为主，血脂成分与西方人群有差异，以高甘油三 酯为特征的高血脂占总数的8 0 以上。 2 0 世纪8 0 年代日本成功的将泛硫乙胺开发成降脂药物“潘特生”每日剂量为 2 0 0 6 0 0 m g 。泛硫乙胺e l 服后能在肝脏中转化生成c o a ，不仅能大幅度降低用药 剂量、减少治疗费用，而且又可避免增加肝脏的额外负荷，毒副作用轻微。 国内外尚未发现有c o a 的口服剂以及直接用c o a 治疗高血脂的报道。美国 c o e n z y m ea 技术公司有一种名称为c o c n z y m ca 的胶囊产品，其实是泛硫乙胺的 复合制剂，其成分为泛硫乙胺、乙酰肉碱、丙酮酸钙及胱氨酸，其中并无c o a 。 c o a 的胶囊作为降脂药物具有高效、廉价及无毒之特点。c o a 治疗剂量每日为 0 2 5 0 5 0 r a g ，仅为一般调脂药物剂量的1 1 0 0 0 ，治疗费每年约4 0 0 元人民币，相 当于常用降脂药费用的1 1 0 - - 1 5 ，更主要的是c o a 为一种普通存在于体内各组织 的生源性物质，以正常生理途径代谢除去血液中过量的脂质，不会产生有害的副 作用。 ( 2 ) 泛硫乙胺在脂肪肝治疗中的作用 目前临床实验表明：与辅酶a 相关的物质一泛硫乙胺，具有温和的调节血 脂作用，对脂肪肝及酒精中毒性肝损害有一定治疗效果，且能抑制脂质过氧化和 血小板聚集，故可适用于脂肪肝的治疗，但需进一步证其安全性及疗效。 1 3 泛酸生产工艺及与国内外研究情况 1 3 1 化学法 生产d 泛酸的传统方法是采用s t i l l e r 法( 异丁醛甲醛氰化钠法) 或者乙醛酸 异丁醛法合成泛解酸内酯，再将p 丙氨酸钙与泛解酸内酯直接缩合即得到d l - 泛 酸钙 5 ，6 ，7 1 。泛解酸内酯与b 丙氨醇反应即得到泛醇。生产d 泛酸和泛醇的主要技 术关键是具有高光学纯度的d 一构型泛解酸内酯中间体的手性拆分技术。 d l 泛酸钙的拆分大都是采用化学法拆分，用手性拆分剂( 手性胺、奎宁化合 物、二甲马钱子碱等) 拆分泛酸钙合成的中间体泛解酸或泛解酸内酯，化学法拆 分缺点是拆分剂贵、成本高、分离困难、还有严重的环境污染和毒性问题。国内 采用物理方法诱导结晶法拆分泛酸钙，在d l 一泛酸钙甲醇溶液中，加入d 泛酸钙 晶种，可诱导溶液中的d 泛酸钙结晶出来。但是诱导结晶法工艺收率低、光学纯 度差，成本高，生产量小，因此该方法只可以生产泛酸钙，无法用于其他泛酸衍 生物如d 泛醇、d 一泛酰巯基乙胺等的生产【2 。 9 第1 章绪论 1 3 2 直接发酵法 微生物发酵生产泛酸含量极低，长期以来未见到成功发酵的报道。直至1 j 1 9 9 0 年，日本武田药品工业株式会社的专利，报道了m i k ih i r o s h i 等人将e s h e r i c h i ac o l i i f 0 3 3 0 1 的泛酸合成基因，用( 大肠杆菌c 6 0 0 ) e c o l ic 0 6 0 营养缺陷型中互补的方 法克隆，携带克隆基因e c o l i ，在d l - 泛解酸和p 丙氨酸存在下培养，得到了d 泛 酸，光学纯度1 0 0 ，化学纯度9 9 t 2 5 1 。1 9 9 4 年，武田药品工业株式会社开发了培 养能从葡萄糖生物合成d 泛解酸的基因重组微生物的方法，仅添加d 丙氨酸，直 接发酵葡萄糖生产d 泛酸【2 5 ，2 6 2 7 ，2 8 1 。此后，日本武田药品工业株式会社在中国审请 了发酵法“生产d 泛酸钙的方法”的专利【2 9 】。 直接发酵法较简单，与化学合成法相比更有效，因为发酵法不需要繁杂的合 成步骤，更主要的是不需要旋光拆分。直接发酵法的问题是发酵液组分复杂，特 别是有大约占产物泛酸2 7 的单糖和寡糖，很难用离子交换、结晶等方法去除，浓 缩、结晶时由于粘，操作困难，溶剂消耗大，产品颜色深，提取收率低。此方法 未见到进一步放大或生产的报道。 1 3 3 微生物酶法 酶是有效的生物催化剂，特别是微生物酶，具有许多突出的优点。关于酶法 生产d 泛酸盐的方法，报道较多的是用微生物酶法拆分d l 泛解酸内酯，即将化 学合成的中间体d l - 泛解酸内酯，用特异性酶拆分，得到d 泛解酸内酯，再与p 丙氨酸钙缩合生产d 泛酸钙。该方法经济实用，对环境友好。已报道的酶转化或 拆分方法主要有以下几种。 ( 1 ) 不对称还原酮基泛解酸内酯 1 9 4 2 年，k u h n 和w i e l a n d 发现可以用酵母细胞悬浮液还原酮基泛解酸，得到 泛解酸，暗示着可能可以用微生物不对称还原酮基泛解酸得到d 泛解酸。1 9 7 4 年， 美国加州有机化学研究所的r a y m o n dp l a n z i l o t t a 等报道了1 9 0 株不同属的霉菌、 酵母、细菌和放线菌的筛选结果，用筛选得到的b y s s o c h 1 a m y s f u l v a 催化还原 3 0 m g m l 酮基泛解酸内酯底物，反应4 8 h ，转化率达9 0 ，提取后的d 一泛解酸内 酯光学纯度接近1 0 0 3 0 】。2 0 世纪8 0 年代，不对称还原酮基泛解酸或其内酯的路 线成为研究热点，例如日本京都大学清水昌( s a k a y us h i m i z u ) 教授研究组相继发表 了数1 0 篇文献和专利【3 。 在实际实验中，筛选到立体选择性较好的以平滑假丝酵母c a n d i d a p a r a p s i l o s i s 及小红酵母r h o d o t o r u l am i n u t a 为生物催化剂，葡萄糖作为能源，进行还原反应， 在2 8 ，p h 4 6 下反应2 天，还原率达到1 0 0 ，反应液中d 泛解酸内酯的浓度可以 达蛰j 5 0 9 l ，光学纯度达到9 4 9 8 【3 2 】。 由于酮基泛解酸内酯可以由异丁醛、甲醇钠、二乙酸和甲醛在室温下进行反 l o 山东轻工业学院硕士学位论文 应，合成产率达到6 5 6 ，产物纯度达到9 6 4 ，而且酮基泛解酸内酯的制备过程 中不用n a c n ，与合成d l - 泛解酸内酯相比，具有一定有利之处。但由于在还原反