（植物学专业论文）霍山石斛试管开花研究.pdf

a b a 6 - b a 2 4 一d d p s e d t a g a 3 h h p l c 缩略词 l i s to fa b b r e v i a t i o n a b s c i s i ca c i d脱落酸 6 _ b e n z y l a d e n i n e 6 一苄基嘌呤 2 ，4 一d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d2 ，4 - 2 氯苯氧乙酸 d a t ap r o c e s s i n gs y s t e m数据处理系统 e d i t i ca c i d 乙二胺四乙酸 g i b b e r e l l i na c i d 赤霉素 h o u r小时 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h 高效液相色谱 i 从i n d o l e 一3 一a c e t i ca c i d m l n n 从 s d s t d z t e m e d z t m l n u t e a n a p h t h a l e n e a c e t i c a c i d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t h i d i a z u r o n m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e z e a t i n 4 吲哚乙酸 分钟 萘乙酸 十二烷基硫酸钠 噻苯隆 四甲基乙二胺 玉米素 ，摘要 f 霍山石斛( d e n d r o b i u mh u o s h a n n e s s ) 在自然条件下，从播种到开花需3 年 左右。研究霍山石斛的开花过程，缩短其开花年限；在理论上或是在应用上都具 有重要意义。用组织培养方法研究诱导霍山石斛花芽发端并发育成开花植株，由厂 于试管兰花一年四季都有花蕾形成，这样有助于进一步了解花的发育过程。y 本文研究了t d z 、b a 、糖浓度、低温1 5 5 ( 日夜) 、氮含量、转瓶时间 对霍山石斛组培苗花芽发生的影响。材料为4 个月苗龄的组培苗和来自于4 个 月苗龄的组培苗的假鳞茎。筛选出诱导开花的适宜培养基后，定期取材( 茎尖) ， 进行石蜡切片，试图找出花芽分化的起始时间；使用h p l c 测定植物中三种内源 激素i a a 、a b a 、g a 3 含量的变化；通过s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白组 份分析。 ， f 研究发现，在改良的m s 基本培养基( i 6 氮、5 倍磷) ，糖浓度提高到4 0 9 l ， 并加入适宜浓度( 0 0 2 r a g l ) 的t d z 可诱导霍山石斛小苗在2 5 个月开花，5 个月内统计诱导花芽发生率为5 0 左右。这种诱导提早开花现象，是发生在小苗 基部新萌发的幼苗。花芽顶生，在叶腋间也有花发生。低浓度t d z 诱导的花芽 多为顶生单花。高浓度t d z 诱导的花芽多为总状花序。b a 诱导霍山石斛开花率 较低，而且小苗褐化严重砌少培养基中氮含量和低温有利于霍山石斛花芽发生。 由于所诱导的花芽正常开放率较低，尝试着将小苗在诱导花芽发生的培养基中培 养一段时间后，转移到无激素的m s 培养基中，发现大多花芽能正常开放a 处理组为m s ( i 6 n ，5 p ) + t d z 0 0 2 ，附加蔗糖4 0g i 。，琼脂s g l ，p h 5 6 - 5 8 。 同时设置对照组：m s ，附加蔗糖3 0g ，l ，琼脂8 9 l ，p h 5 乒5 8 。通过制作石蜡 切片，观察到处理组在9 0 天时叶腋间有花芽发生。处理组内源激素i a a 含量在 9 0 。1 2 0 d 明显减少，g a 3 与诱导花芽发生关系不明显，由于某种原因，未检测到 a b a 。处理组在9 0 1 2 0 d 出现一特异蛋白。y 关键词：霍山宕新7 试管弃磊t d y a b s t r a c t t h et i m ef o rw i l dd e n d r o b i u mh u o s h a n n e s st of l o w e ri sa b o u t3 y e a r s f l o w e r i n g i sau n i q u ed e v e l o p m e n t a le v e n ti nt h el i f e c y c l eo fah i g h e rp l a n t s t u d y i n gd h u o s h a n n e s sf l o w e rb u df o r m a t i o na n dd e v e l o p m e n ta n dd e c r e a s i n gt h ej u v e n i l e p h a s e si si m p o r t a n t nv i t r of l o w e r i n gb yp l a n t l e t sp r o d u c e dt h r o u g ht i s s u ec u l t u r e w a ss t u d i e d a n di nv i t r of l o w e r i n gw a si n d u c e db y m a n yw a y si nt h ew h o l ey e a r i t i sh e l p f u lt of u r t h e ro u r u n d e r s t a n d i n go ff l o w e r i n gr e g u l a t e d t h eo b j e c t i v eo ft h i sr e s e a r c hw a st os t u d yf l o w e r i n gm a yh a v eb e e ni n d u c e d b y m a n yf a c t o r s ，s u c ha st d z ，b a ，s u c r o s e ，l o w e rt e m p e r a t u r e l 5 5 c ，n i t r o g e n ，a n dt i m e o f t r a n s f e r r i n gt on e wm e d i u m ( m s m e d i u m l a c k i n gp l a n tg r o w t hr e g u l a t o r f l o w e r i n g w a si n d u c e di n4 - m o n t h 。o l ddh u o s h a n n e s s p l a n t l e t sa n dp s e u d o b u l b si na ni nv i t r o s y s t e m a f t e rh a v i n gs c r e e n e dt h eo p t i m a lm e d i u mw h i c hi n d u c e sf l o w e rb u d i n i t i a t i o no ndh u o s h a n n e s s p l a n t l e t s ，l e v e l so f e n d o g e n o u si a a g a 3a n da b a w e r e s t u d i e db yh p l c s o l u b l ep r o t e i n sw e r es t u d i e db ys d s p a g e a tt h es a r f l et i m e m o r p h o l o g i c a l d i f f e r e n t i a t i o no f f l o r a lb u d sw e r e o b s e r v e d ，a n dt h et i m eo f f l o w e rb u d i n i t i a t i o nw a sf o u n do u t t h er e s u l t so fo u rr e s e a r c hs h o wt h a tal a r g e rn u m b e ro ff l o r a lb u d sw e r e p r o d u c e di n t h em s ( i 6 n ，5 p ) m e d i u ma d d e d4 0g ls u c r o s ea n do 0 2 9 lt d z p l a n t l e t s ，w h i c hw e r en e w s t e mg r o w t hf r o ms u b e u l t u r e dp l a n t l e t s ，w e r ei n d u c e dt o f o r mf l o r a lb u d si n2 5m o n t h s t h er o t eo ff l o w e ri n d u c t i o nw a sa b o u tf l f r yp e r c e n t t e r m i n a lo ra x i l l a r yf l o w e r sw e r ef o r m e do np l a n t l e t s t d za tl o w e rc o n c e n t r a t i o n w a ss u i t a b l ef o ri n d u c i n gt e r m i n a lf l o w e r sb u th i g h e rc o n c e n t r a t i o ni n d u c e db o t r y o s e i n f l o r e s c e n c e b aw 嬲l e s se f f e c t i v ei nt h ei n d u c t i o no f f l o r a lb u d s m sc o n t a i n i n g r e d u c e dc o n c e n t r a t i o n s o fn i t r o g e ns o t n _ c e s ，a n dl o w e rt e m p e r a t u r ep r e t r e a t m e n t p r o m o t e dt h e f o r m a t i o no ff l o r a lb u d s i no r d e rt om a k ei tf l o w e r i n gn o r m a l l y , p l a n t l e t sw e r et r a n s f e r r e dt oh o r m o n e f r e em sm e d i u m a f t e rc u l t u r e di nm e d i u mw i t h t d z t h eo p t i m a lm e d i u mf o ri n d u c i n gf l o r a lb u d si sm sm e d i u ma d d e d0 0 2m e g l t d z ，4 0g ，ls u c r o s ea n d8 9 la g a r t h ei n e f f i c i e n tm e d i u m f o ri n d u c i n gf l o r a lb u d si s 6 m sm e d i u ma d d e d4 0g ls u c r o s ea n d8 9 la g a r t h ep ho fa l lm e d i au s e di nt h i s s t u d yw a sa d j u s t e dt o 5 6 5 8w i t h1 nn a o h p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i cd u r i n g f l o w e ri n d u c t i o nw e r es t u d i e db yc u l t u r i n gt h ep l a n t l e t si nt w ok i n d so fm e d i u m r e s u l t ss h o w e dt h a ta x i l l a r yf l o r a lb u d sw e r ei n d u c e da f t e r9 0d a y so fc u l t u r e a n d t h e r ew a san o t a b l ei n c r e a s eo nt h el e v e lo f e n d o g e n o u si a ad u r i n g9 0 1 2 0d a y s c o n t r a s tt oc k t h el e v e lo f e n d o g e n o u sg a 3 w a s n tr e l a t e dt ot h ef o r m a t i o no ff l o r a l b u d s as p e c i a ls o l u b l ep r o t e i nw a sa l s of o u n dd u r i n g9 0 - 1 2 0d a y sw h e np l a n t l e t s c u l t u r e di nt h eo p t i m a lm e d i u m k e y w o r d s ：d h u o s h a n n e s si nv i t r of l o w e r i n gt d z 7 绪论 1 石斛属植物概述 石斛属d e n d r o b i u m 是兰科( o r c h i d a c e a e ) 中最大的属之一，原生种多达1 6 0 0 种以上，堪为兰中之大族；石斛属植物分布广泛，广大的热带、亚热带、温带地 区几乎都是石斛兰的原产地，从日本、韩国、中国、泰国、越南、菲律宾、马来 西亚、印度尼西亚，到澳洲、新西兰都有它的踪迹( 薛聪贤，2 0 0 1 ) 。我国有7 6 种，2 变种( 中国植物志，1 9 9 9 ) ，北自秦岭南至海南岛南部的崖县都有分布， 大多种类都集中于北纬1 5 3 0 2 5 2 1 之间，以云南、广西、贵州和台湾等为我 国的分布中心( 卢思聪，1 9 9 4 ) 。 石斛属植物为多年生草本附生植物，多生于树皮或岩石上，气根生长旺盛， 性耐旱，喜干燥( 薛聪贤，2 0 0 1 ) 。其开花多，结果少，每果可含1 0 0 万粒种子 以上。种子细如粉尘，每粒重约0 3 0 4 1 t g ，自然条件下发芽率般不及5 ( 张 明等，2 0 0 0 ) 。石斛为合轴生长，传统繁殖方式主要是分株。另有茎节扦插法、 无菌播种法、分芽法、生长点组织培养法( 薛聪贤，2 0 0 1 ) 。 在我国有关药用石斛的文献已有1 5 0 0 年以上的历史，中医常用于滋阴补肾、 清热生津。石斛也是我国古文献最早记载的九大“仙草”之一，在神农本草经 中也将其列为上品( 高树人，1 9 9 7 ) 。张明等( 2 0 0 0 ) 对我国供作药用石斛的原 植物进行了调查，发现有近4 0 种之多，包括霍山石斛dh u o s a n n e s s 、金钗石斛 d n o b i l e 、铁皮石斛do f f i c i n a l e 、铜皮石斛d m o n i l i f o r m e 、环草石斛d _ l o d d i g e s s i 等( 王天山等，1 9 9 7 ) 。药用石斛含石斛碱、石斛次碱、石斛宁等多种生物碱， 并证实它具有抗菌消炎、保喉清音的作用，可治疗多种疾病，并发现可能具有一 定的抗癌等效能( 赵天榜，1 9 9 4 ) 。 石斛属植物除药用价值外，也是重要的观赏植物。石斛兰是热带兰中栽培比 较广泛的名贵花卉，由于花形、花姿优美，艳丽多彩，种类繁多，花期长，加之 许多种类气味芳香，观赏价值极高，很受各国人民的喜爱。目前石斛的切花在兰 花市场上占有较大的比例，并里上升的趋势。石斛与卡特兰、蝴蝶兰、万带兰并 列为观赏价值最高的四大观赏兰类( 卢思聪，1 9 9 4 ) 。石斛按开花季节分为春石 斛及秋石斛两大类。春石斛属落叶性，花期春季，开花在茎节两侧，花朵多且密 集，成株不乏有上百朵者；秋石斛秋季开花，花梗从茎顶抽出，细长的花梗着花 2 0 3 0 朵，形态酷似蝴蝶兰，因此有人称为“蝴蝶兰型的石斛兰”，甚为美观。 石斛兰花形小巧，花色娇艳欲滴，尤其春石斛常开花近百朵，美丽又壮观( 薛聪 贤，2 0 0 1 ) 。 2 霍山石斛 霍山石斛产于安徽省霍山县，曾被错误地定名为铁皮石斛d e n d r o b i u m o j f i c i n a l e 和黄花石斛d e n d r o b i u mt o s e a n s e ，1 9 8 4 年我国学者厘定为d e n d r o b i u m h u o s h a n e n s e t a n g e tc h e n g 。清代补图本草备要记载：“霍山石斛，甘平，解 暑，养胃，生津止渴，清虚热( 于力文等，1 9 9 6 ) 。霍山石斛自古以来就被认为 是石斛中的上品，并以之为标准来衡量其它石斛的品质优劣( 刘守金，1 9 9 6 ) 。 霍山石斛对生长环境要求严格，自然分布区域极为狭窄，仅分布在以安徽霍 山为中心的大别山一带( 徐云鹃等，1 9 8 4 ) 。其生态条件特殊，多生于悬岩峭壁 北向阴沟凹处( 于力文等，1 9 8 7 ) 。 霍山石斛为多年生草本，因植株矮小，所以又称“米斛”，高2 5 7 5c m ， 数株丛生成团，茎直立或略有弯曲；单叶互生，叶鞘紧抱茎，通常2 3 片叶着生 于茎端，叶片长卵状披针形，长约2 3c m ，宽0 5 0 7 c m 总状花序集生枝端或 单花，淡黄色( 刘守金，1 9 9 6 ) 。 3 兰科植物试管开花研究现状 试管开花是指用组织培养的方法，使植物的开花过程是在培养容器中完成a 由于花的发育是一个复杂的生理现象，整个发育过程可分为四个阶段：( i ) 成花 诱导：由营养生长向生殖生长的转变；( 2 ) 诱导状态到分生组织的转换：花序分 生组织的形成；( 3 ) 花的发端：花器官的决定；( 4 ) 花器官的形态发生：花器官 的形成与成熟( 赵大中等，1 9 9 9 ) 。花发育过程许多的问题的阐明，应用试管开 花技术是有效的手段。 兰花试管开花最早的研究工作是法国的j u l i e n c o s t a n t i n 进行的，在研究中发 现兰花在缺少菌根时可以促进开花。随后，美国康奈尔大学植物生理专家l e w i s k n u d s o n 研究了l a e l i o c a t t l e y a ( 卡特兰属o f 打t y 口蕾丽兰属l a e l i a ) 的试管开 花。l a e l i d c a t t l e y d 也是首次报道的试管开花植物，其后是菟丝子c u s c u t a 9 r e f l e x a ( d o d d e r , c o n v o l v u l a c e a e ) 和紫菀科植物b a e r i ac h r y s o s t o m a ( a s t e r a c e a e ) 。 随后，陆续有许多植物试管开花的报道( c h i a ，e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 王熊等( 1 9 8 1 ) ，在1 9 7 3 1 9 7 4 年用建兰( 大一白) 建立了快速无性繁殖系， 并发现试管幼苗开花现象。1 9 7 9 年重新建立了秋兰和春兰快速无性繁殖系，并 探讨花芽分化规律，已能诱导秋兰试管苗一年四季都有花蕾形成。从植株形成到 花朵开放最短只需两个月( 王熊，1 9 8 4 ) 。这为我国“兰花工业”开辟了新的技 术途径。王熊等( 1 9 8 8 ) 又成功地诱导出素心建兰的试管开花。在此之前，用组 织培养方法研究诱导兰花花芽分化并发育成开花植株，国内尚未见报道。国兰花 的开花问题更无研究 到目前为止，能够诱导试管开花的兰科植物主要包括：1 ) 建兰c y m b i d i u m e 琊i f o l i u m ，春兰c y m b i d i u m g o e r i n g i i ；2 ) d o r i e l l a 变种( 五唇兰属d o r i t & 和尖 囊兰属k i n g i e l l a 的人工杂交种，d u a na n dy a z a w a ，1 9 9 41 9 9 5 ) ；3 ) 文心兰属 o n c i d i u mv a r i o s u m ( k e r b a u y , 1 9 8 4 ) ；4 ) 蝴蝶兰p h a l a e n o p s i s 杂交种( t a n a k a e ta 1 ， 1 9 8 8 ；d u a n a n d y a z a w a ，1 9 9 4 ，1 9 9 5 ) ；5 ) 石斛属d e n d r o b i u ms o n i a ( g o h ，1 9 9 6 ) 和d e n d r o b i u mt h o n g i n ( s i m ，n od a t e ) 。 试管开花主要是通过研究各种因子对植株花的发育过程的影响，从而阐明其 调控机理。这些影响因子主要是植物生长调节剂、附加物、营养条件、光周期、 温度等。现将相关的研究进展简述如下。 3 1 植物生长调节剂的影响 3 1 1 细胞分裂素的影响 g o h ( 1 9 7 3 ，1 9 7 5 ，1 9 7 9 ) 研究了杂种兰花( a r m a d a d e b o r a h ) 整体植株花芽发端 和发育的调节作用，观察到6 - b a 不仅促进花芽发端而且促使花芽发育成熟并开 花；g o h 和y a n g ( 1 9 7 8 ) 和g o h ( 1 9 7 9 ) 报道6 - b a 促进杂种石斛兰整体植株的 花芽发端。d c a n d i d u m ( 王光远等，1 9 9 7 ) 、 c y m b i d i u m ( 王熊，1 9 8 4 ) 汞q d 8 n 加6 f “小m a d 锄et h o n g i n ( g o h ，1 9 9 6 ) 的研究也发现培养基中添加b a 时，可 诱导植株开花。d h u o s h a n a s e ( 温云飞等，1 9 9 9 ) ，也系统她报道了种子到开花 的整个生长过程，所用的激素主要是b a 和2 ，4 一d ，z t 。将蝴蝶兰p h a l a e n o p s i s 的花茎节间的不定芽培养在含b a 的h y p o n e x 的培养基中，后继代在含b a 的 i o v a c i n w e n t 培养基中，苗龄为9 个月的小苗，7 0 以上有花芽形成，1 0 的花芽 开花( d u a n a n d y a z a w a , 1 9 9 5 ) 。 d u a n 和y a z a w a ( 1 9 9 4 ) 研究d o r i e l l at i n y ( - - 五唇兰属d o r i t i sp u l c h e r r i m a k i n g t e l l a p h i l i p p i n e n s i s ) 的试管开花时，发现在下述两种培养条件下生长的植株， b a 均不能诱导其花芽形成。( 1 ) 在无糖的v a c i nw e n t 培养基；( 2 ) h y p o n e x 培 养基。这表明为了使b a 诱导花芽，适宜的营养条件必须满足。另外把经过b a 诱导的花芽的植株转瓶培养在含b a 的v a c i nw e n t 或h y p o n e x 培养基中，花芽 不能开放，而转到无b a 的h y p o n e x 培养基中，花芽可以开花。这表明b a 可以 诱导花芽发生，但抑制其正常开花；( 3 ) 激动素、玉米素、2 i p 不能诱导出花芽。 3 1 2 生长素、赤霉素的影响 g o h ( 1 9 7 3 ，1 9 7 8 ) 在杂种兰花a r a n d a 与石斛兰上观察到i a a 阻止花芽形 成。王熊( 1 9 8 4 ) 将经诱导的ce n s i f o l i u m 小苗再转入含n a a 的培养基中生长， 出现畸形花或花芽枯萎死亡。cn i v e o m a r g i n a t u mm a k 试管开花研究中发现， n a a 本身不诱导开花，而生长素抑制剂2 ，3 ，5 三碘苯甲酸抑制开花 ( k o s t e n y u k ，1 9 9 9 ) 。 高浓度的g a 延缓开花，p b z ( 抗g a 剂) 完全抑制细胞分裂素或根修剪诱 导开花的作用( k o s t e n y u k ，1 9 9 9 ) 。 3 1 3a b a 、乙烯的影响 胁迫或生长抑制可能对于试管开花有影响。兰花在离体条件下，a b a 对花 芽诱导有明显影响，经过适合的浓度及合适的时间预处理，再转入含有6 - b a 的 培养基上，对花芽诱导有促进作用( 王光远，1 9 9 5 ) 。研究发现，如果先将铁皮 石斛原球茎在加有o 5 1 5 m g l a b a 的培养基上培养1 5 2 0 天，再转到含b a 的 m s 培养基上，可以得到很高的成花率( 平均8 2 8 ，有些试验中达到1 0 0 ) 。 说明内源a b a 的增加在花诱导的早期阶段中可能起有重要的作用( 王光远， 1 9 9 7 ) 。用a b a 和乙烯( 与胁迫或生长抑制相关的激素) 处理石斛属d e n d r o b i u m 和文心兰属o n c i d i u m ，加速了营养生长向生殖生长的转变。 培养实生苗的容器中，测得乙烯含量增加。因此，在某些情况下，可能是乙 烯诱导植株试管开花。乙烯促进开花植株衰老，通常在培养基中加入活性碳，通 过活性碳的吸附作用减少乙烯含量。 3 2 其它条件的影响 3 2 1 附加物的影响 将椰子汁、香蕉汁、西红柿汁等其它附加成分( 可能含有生长调节物质) 加 入到种子萌发的培养基中，但是并不能说明这些附加成分就是诱导因子。因为添 加这些附加物后，小苗试管开花无明显提高( a r d i t t ie ta 1 ，1 9 8 2 ；d u a na n d y a z a w a 1 9 9 4 ) 。 亚精胺( 王光远等，1 9 9 7 ) ，赖氨酸( t a n a k a e ta 1 1 9 9 7 ) ，六氢吡啶羧酸( f u j i o k a a n ds a k u r a i1 9 9 2 ) 和商铁氰化物( t a n a k aa n da s a g a m i1 9 8 6 ) ，都被报道有促进开花 的作用，但这些物质不能诱导c y m b i d i u m 开花( k o s t a n y u k e ta 1 19 9 9 ) 。多胺与 激素之间的关系仍不清楚。 在研究其它植物中发现糖与诱导开花有关( s c o r z a , 1 9 8 2 ) ，观察发现糖可以 促进戊糖磷酸途径的循环，这可能也与光和春化作用相关。在种子萌发和小苗培 养过程中，培养基中都含有糖，通常使用的是蔗糖。蔗糖经高压灭菌后分解，或 被小苗分解成葡萄糖和果糖。有时，也使用其它糖类，但比较少。在秋兰( c e n s i f o l o i u m ) 的研究中发现，改变糖源，提高激素浓度能使根状茎上的营养芽变 成花芽( 王光远，1 9 9 5 ) 。铁皮石斛离体开花研究中发现在培养基中加入葡萄糖， 使芽形成的时间提早，成花率增加( 王光远，1 9 9 7 ) 。d t a n 和y a z a w a ( 1 9 9 4 ) 研究d o r i e l l at i n y 时，在培养基中( 不含b a ) 加入2 5 e , 1 的蔗糖，不诱导花芽 形成；在含b a 的培养基中，改变糖浓度1 0 9 i ，8 0 9 l ，大多植株仍无花芽形成。 表明b a 诱导花芽形成时，糖浓度的大小是重要影响因子。因此，除了兰花中极 少数种，糖诱导开花具有普遍性。 3 2 2 营养条件的影响 营养水平及之间的配比影响试管开花。n h 4 n 0 3 的比值，营养成分的浓度( 高 盐的m u r a s h i g e s k o o gm e d i u m 与低盐的v a c i n a n dw e n t ) 对开花都有影响。减少 m s 培养基中氮的含量促进花芽形成；高比值的n i - h - n n 0 3 - n 有利于花芽形成 ( d u a na n dy a z a w a ，1 9 9 4 ) 。培养基中含高水平的氮，会抑制花芽形成( d u a na n d y a z a w a ，1 9 9 5 ) 。b a 诱导开花的百分率为4 0 ( 处理后9 0 天内) ，当b a 、调节 氮，磷和进行根修剪共同使用时，开花率高达9 7 5 。但仅调节氮，磷的含量， 或只进行根修剪，其诱导开花的作用不明显( k o s t e n y u k ，1 9 9 9 ) 。表明植株的营养 条件在很大程度上影响着开花对b a 的敏感性。 3 2 3 根的影响 不同的实验材料( 原球茎、无根小茁、有根的完整小植物) ，花芽形成存在 差异。发现多数成花实验中，根的形成完全或部分受到抑制。这不足以说明根自 身对花芽形成起抑制作用，而只能说明有根的小植物作为一个完整的植物体，由 于其自身的调节作用，对外源激素处理的敏感性显然比原球茎和无根小苗要低 ( 王光远等，1 9 9 7 ) 。 e n i v e o m a r g i n a t u m 试管开花研究中，当6 - b a ，根修剪，增加p ，减少n ， 这些因子联合应用时，9 0 天内，几乎l o o 的植株开花。而不修剪根时，开花率 明显下降。一些木本植物中，根修剪- - i d a 促进开花。高等植物的根部是合成细胞 分裂素的部位，而烟草根部的释放的信号物质有抑制开花的作用。所以，单独使 用根修剪时，诱导开花的作用( 虽然诱导率很低) ，但可以推测是由于通过根修 剪去除根部抑制开花的信号物质的结果( k o s t e n y u k ，1 9 9 9 ) 。 3 2 4 光周期的影响 日长( 适宜的光周期) 影响许多种植物的试管开花( d i c h e n sa n dv a f ls t a d e n 1 9 9 0 ；a l t a m u r ae ta 1 ，1 9 9 1 ) 。一些兰花具有光周期( a r d i t t i ，1 9 9 2 ) ，在适宜的光周 期会诱导这些植物开花。 e c o n o m o u 和r e a d ( 1 9 8 7 ) 报道光照直接或间接地影响试管内植株的生长。 w a n g ( 1 9 9 5 ，1 9 9 7 ) 发现当p h a l a e n o p s i s 植株生长在低温条件下，适宜的光照促进 p h a l a e n o p s i s 花茎抽出。 光周期很大程度上可能不是开花诱导的主要因子。原因如下：第一，全球范 围内，数以百万计的实生苗和组培苗生长在不同的光照和光周期环境下( a r d i a i a n de r n s t ，1 9 9 3 ) ，如果适宜的光周期可以诱导开花，依次可推得，很多实生苗和 组培苗将会在试管开花。第二，在很多试管开花的属，种间，种内杂交种里，石 斛d e n d r o b i u m , l a e l i o c a t t l e y a ( 卡特兰属c a t t l e y a 蕾丽兰属l a e l i a ) ，蝴蝶兰 p h a l a e n o p s i s ( 包括种和杂交种) 具有光周期现象( a r d i t t i ，1 9 9 2 ) 。它们无论是实生 苗还是组培苗，在不同的条件下，都有试管开花的现象。这表明它们对光周期无 特定要求。对于a r e t h u s ab u l b o s a 的实生苗开花，光周期起一定的作用。因为把 春化后的球茎从黑暗处转移到光周期为1 6 小时的环境下，发现在第6 个节间处 有花芽形成( y a n e t t i ，1 9 9 6 ) 。 3 2 5 温度的影响 影响和或诱导成花的温度条件类型有：低温( 含春化作用) 、高温( 含热击 处理) 、昼夜温差等。温度对成花的诱导作用有时可为其它因子所替代，如：光 周期、g a 、乙烯、缺氧、d n a 甲基化抑制剂等。温度处理对成花的诱导和促进 效应，即使在形态上已有所反应，在一定外界条件影响下仍然可被消除或逆转( 王 利琳等，2 0 0 2 ) 。 a r d i t t i ( 1 9 8 1a ，b ) 报道同一种的c a t t l e y a 杂种兰花，诱导其开花的光周期反应 会因温度变化的影响而表现不同。光周期或低温对兰花开花的诱导影响，可能是 通过植物内源激素起调节控制作用。 关于春化诱导其它植物开花的报道较多( s c o r z a , 1 9 8 2 ；h a l e v y , 1 9 8 5 1 9 8 9 1 。 即使春化诱导a r e t h u s a ( y a n e t t i ，1 9 9 6 ) 和c a l y p s o ( a s h r n o r e ，1 9 9 5 ) 的实生苗开花， 而低温诱导组培苗试管开花的可能性很小，低温不能诱导p h a l a e n o p s i s 试管开花 ( d u a na n dy a z a w a , 1 9 9 5 ) 。试管开花的许多属( a r e t h u s a , c a l y p s o , c y m b i d i u m , d e n d r o b i u m , o n c i d i u m , p h a l a e n o p s i s , s a r c o c h i l u s ) 包括一些具有温周期的种，它 们通常持续培养在高温，即无低温的诱导作用。 3 2 6p h 、螯合作用的影响 其它植物的开花，p h 值似乎对其有影响。例如，十字花科的欧洲油菜b r a s s i c a n a p u s 培养在含有苯氨基嘌呤( b a ，b a p ) 的培养基中，p h 值为3 9 4 6 时，诱 导开花率高( p o l o w i c ka n ds a w h n e y , 1 9 9 1 ) 。 e d t a 诱导一些植株的开花( s c o r z a ，1 9 8 2 ) ，种子萌发的培养基中常含有 1 4 e d t a ，其作用主要是螯合离子。在配置营养液时，用f e e d t a 取代f e s 0 4 7 h 2 0 对开花有年t j ( k e r b a u y , 1 9 8 4 ) 。 4 石斛属植物试管开花国内研究现状 国内关于石斛兰试管开花研究的报道主要是利用生长素类、细胞分裂素类、 脱落酸等诱导花芽发生。现将有关试验结果概述如下： 温云飞等( 1 9 9 9 ) 报道四个月苗龄的霍山石斛组培苗在m s + 2 ，4 d0 1 m g l + z t1 0 m g l 培养基上继代两个月后，可诱导出花芽数较多的正常花芽，随后将 植株转移到m s + 香蕉提取物1 0 9 l 的无激素培养基上，花芽可以正常开花。四 个月苗龄的组培苗在m s + 2 ，4 - d0 1 m g l + 6 - b a1 0 m g l 培养基上继代两个月后， 其顶端可形成花形巨大，花萼异常粗壮的大型花朵，它们约是正常花的3 4 倍。 王光远等( 1 9 9 5 ) 研究了石斛离体培养中a b a 对诱导花芽形成的影响，实 验结果表明：铁皮石斛原球茎在m s + a b ao 5 m g l 预培养后，再转入2m g l 6 b a 的m s 培养基上培养，花芽形成频率明显提高，可达8 4 4 ，且每棵植株花的数 目增加。 王光远等( 1 9 9 7 ) 将铁皮石斛原球茎分别培养在m s + n a ao 5 m g l + 6 b a 0 5 m g l ；m s + 6 - b a2 r a g l ；m s + a b a lm g l 预培养1 5 - 2 0 天后，转到m s + 6 b a 2 m g l 。5 个月内统计形成花芽的百分率依次是2 0 3 ；4 5 8 ：8 2 8 。 5t d z t d z ( t h i d i a z u r o n ) s c h e f i n g 公司1 9 7 6 年合成的新型植物生长调节剂，化学名 为- 苯基- ：l ，2 ，3 - 噻二唑( n - p h e n y l - n - 1 ，2 ，3 t h i a d i a z 0 1 5 一y l u r e a ) ，中文简称为噻 重氮苯基脲，t d z 的分子量为2 2 0 2 。 t d z 最初是作为一种棉花落叶剂而发展起来的。现在，它作为植物生长调节 剂在组织培养中应用广泛。除促进愈伤组织生长、分化及子叶膨大和诱导乙烯外， t d z 还具有解除侧芽休眠、抑制气孑l 关闭、延缓叶片衰老等多种细胞分裂素生理 功能( 杨业正，1 9 8 9 ) 。 啦鼯 t d z 具有很高的细胞分裂素活性，植物的生长及细胞分裂对低浓度 ( 1 0 4 1 0 4 m o l 1 ) 的t d z 表现非常敏感。从浓度水平上看，在小红萝h 生物测 定实验中产生同等效力时，t d z 的浓度是b a 的1 0 。2 倍；在大豆愈伤组织实验中 t d z 的浓度是z t 的1 0 4 倍。对于多数植物，0 1 1 t m o l l t d z 为中等浓度( 王关 林等，1 9 9 7 ) 。 形态发生，无论是在体内还是体外，都需要持续调节细胞分裂和分化。这主 要是生长素和细胞分裂素起调控作用，而t d z 也诱导类似的生理反应，但关于 t d z 的生理生化机制的研究报道较少。 研究石斛属植物的开花过程，阐明调控开花机理无论在理论上还是在应用上 都具有重要意义。在通常的栽培条件下，石斛由种子到开花需要2 8 年的时间， 试管石斛一年四季都有花蕾形成，用组织培养方法研究诱导石斛花芽发生并发育 成开花植株，有助于进一步了解花的发育过程。高等植物开花是复杂的生理现象， 虽然成功地诱导兰花在试管中开花，但要得到正常开花的试管植株，仍需要继续 深入研究以下几个问题：属间、种间的植物差异较大，即使同一种植物，诱导开 花的稳定性如何? 即使诱导形成了花芽，什么是花器官随后的生长发育的适宜条 件? 如何调节营养生长与生殖生长的关系? 霍山石斛作为商品药品一直以野生采集为主要来源，为保护这一名贵药材的 野生资源，以组织培养的方法进行霍山石斛种子萌发和幼苗生长的研究报道较 多。关于从无性繁殖系到有性生殖过程的研究报道却鲜见。诱导组培苗快速生成 正常花芽是霍山石斛从无性繁殖系走向有性生殖过程的基础。但由于野生条件下 其花芽生长对条件要求苛刻，通过组织培养方法建立霍山石斛试管开花系统，这 样即可在最短时间内完成从无性到有性的人工繁殖过程并应用于实际生产。此 6 外，由于霍山石斛植株矮小，花淡黄色，雅致美观，是理想的研究试管开花的试 验材料。 本实验室的谭云对霍山石斛进行较系统的胚培养、拟原球茎诱导和快速繁殖 的研究。本论文在建立了霍山石斛离体快繁体系的基础上，以霍山石斛小苗为材 料，研究了t d z 、b a 、蔗糖、大量元素、低温等因子对诱导花芽发生的影响。 一方面试图建立一种重复性好的试管开花系统，以研究植物生长调节物质等其它 影响因子在花芽形成中的作用；另一方面，由于t d z 对开花的影响尚未见报道， 该研究也为阐明t d z 对石斛兰花芽形成的影响及作用机理，提供有益的参考。 材料与方法 1 材料 霍山石斛( dh u o s h a n e n s e ) 原球茎。培养条件：温度2 5 2 ，光照强度 5 0 6 0 u m 0 1 m 。2 s ，每日照光1 4 h ，以下培养条件相同。 1 1 原球茎增殖培养 m s + n a a 0 2 m d l 1 2 原球茎分化培养 m s + b a1 0m g l + n a a 0 2 m g r t , 1 3 幼苗培养 m s ( 1 ，2 m s ) + n a a 0 2 m g l 以上培养基附加蔗糖3 0 9 l ，香蕉汁2 0 ，琼脂8 9 l ，活性炭o 5 以，p h 5 乱5 8 。 2 霍山石斛试管开花 将霍山石斛幼苗培养4 个月后，进行处理，每瓶3 株，每处理设6 0 株，重 复三次。培养过程中观察记录结果。 2 1b a 对花芽诱导的影响 ( 1 ) m s ( 2 ) m s + b a 0 5 ( 3 ) m s + b a 2 0 ( 4 ) m s + b a 5 0 以上培养基附加蔗糖3 0 9 l ，香蕉汁2 0 0 , ，琼脂8 d r , ，活性碳0 5 9 ，l ，p h 5 0 5 8 ， 2 2t d z 对花芽诱导的影响 2 2 1t d z 对花芽诱导的影响 ( 1 ) m s ( 2 ) m s + t d z 0 0 2 5 ( 3 ) m s + t d z 0 0 5 ( 5 ) m s + t