（发酵工程专业论文）产壳聚糖酶菌株的选育及产酶发酵工艺研究.pdf

摘要 通过富集培养，初筛，复筛，秸度快速测定以及薄层层析( t i c 汾析，从自然界 中分离到3 株产内切壳聚糖酶活力较高的菌株。经形态、生理生化特征鉴定以及1 6 sr d n a 序列分析，3 株均归属于m i t s u a r i as p ，分别命名为0 1 3 、和2 8 1 。其中， m i t s u a r i as p 1 4 1 的产酶能力最强。 以m i t s u a r i as p 1 4 1 为出发菌株，先后进行紫外诱变和印c o - v 射线诱变，选育 到菌株m i t s u a r i as p 1 4 1 2 ，其壳聚糖酶活力提高了3 0 0 1 。连续传5 代，每代测定 酶活力，结果表明，该菌株具有较好的遗传稳定性。 通过单因素试验和多因素试验对m i t s u a r i as p 1 4 1 2 发酵进行了研究，得到了优 化的产酶工艺：可溶性壳聚糖0 5 0 、装液量1 0 0m l ( 5 0 0n i l 三角瓶) 、起始p h 值7 0 、接种量2 、温度3 0 1 2 、摇床转速1 8 0r m i n 、培养时间4 8h ，在此条件下， 酶活力达3 6 3 1u m l 。在1 0l 容量的发酵罐中扩大培养，装液量7l 、通气量1v v m 、 搅拌速率2 0 0r m i n 、温度3 0 ，培养3 6h 壳聚糖酶活力达最高值3 2 5 8u m l 。 t l c 分析表明，壳聚糖的酶解产物中有壳二糖或其它壳寡糖存在。用乙酰丙酮 法测定产物壳聚糖的数均分子量，结果表明，1 5 的壳聚糖胶体溶液与粗酶液体积 比1 5 ：1 ，3 7 。c 、作用3 0r a i n ，产物数均分子量降到1 0 9 2 1 。保持作用条件不变，改 变体积比为1 0 ：1 、5 ：1 、2 ：1 、1 ：1 和1 ：2 ，产物的数均分子量逐渐变小，分别为5 6 8 3 、 3 0 1 8 、1 2 4 7 、7 7 9 和7 4 7 。 通过硫酸铵沉淀、离心超滤和s e p h a d e x ( 3 - 2 0 0 凝胶柱层柝，初步纯化了m i t s u a r i a 印1 4 1 2 壳聚糖酶，该酶为诱导酶，分子量3 3 6k d ，最适作用p h 值为4 0 ，最适 作用温度为3 7 4 2 1 2 ，在4 5 以下、p h 4 0 p h 8 0 的环境中较稳定。 关键词：壳聚糖；壳聚糖酶；筛选；诱变；发酵工艺；细菌鉴定；薄层层析 a b s t r a c t t h r e es t r a i n sw h i c hc o u l dp r o d u c eah i g he n d o - c h i t o s a n a s ea c t i v i t yw e r ei s o l a t e d f r o mn a t u r e ，b a s e do ne n r i c h e dc u l t u r e ，p r i m a r ys c r e e n i n g , s e c o n d a r ys c r e e n i n g , v i s c o s i t y r a p i dd e t e r m i n a t i o na n d t ica n a l y s i s t h r o u g t h i d e n t i f y i n g t h e i rm o r p h o l o g i c a l ， p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d1 6sr d n a , a l lo fs t r a i n sw e r e a t t r i b u t e dt om i t s u a r i as p ，n a m e dm i t s u a r i as p 0 1 3 ，1 4 1a n d2 8 1 ，r e s p e c t i v e l y , i nw h i c h t h em i t s u a r i as p 1 4 1w i t ht h eh i g h e s tc h i t o s a n a s e a c t i v i t y t ot a k em i t s u a r i as p 1 4 1a st h eo r i g i n a ls t r a i n ，c o n d u c e db yu va n d6 0 c oy - r a y m u t u g e n e s i s ，t h em u t a n tm i t s u a r i as p 1 4 1 2w h o s ec h i t o s a n a s ea c t i v i t yi n c r e a s e d3 0 0 1 w a so b t a i n e d , a n dt h eh i g hc h i t o s a n a s ea c t i v i t yo ft h em u t a n tc o u l db ei n h e r i t e da f t e r c o n t i n u o u sp a s s a g e sc u l t u r e b yt h es i n g l ef a c t o rt e s ta n do r t h o g o n a lt e s t ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o no fm i t s u a r i as p 1 4 1 2f o rt h ep r o d u c t i o no fc h i t o s a n a s ew a sd e t e r m i n e d ：c o l l o i dc h i t o s a n0 5 0 m e d i u m v o l u m e1 0 0m l i n5 0 0m l f l a s k , i n i t i a lp h 7 0 ，i n o c u l a t i o na m o u n t2 ，t e m p e r a t u r e3 0 c ， s h a k e rs p e e d1 8 0r m i n ，c u l t u r et i m e4 8h u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h ec h i t o s a n a s e a c t i v i t yr e a c h e d3 6 3 1u m le x p a n dc u l t u r ei n1 0lf e r m e n t e r , w i t hm e d i u mv o l u m e7 l ，a g i t a t i o ni n t e n s i t y2 0 0r m i n , a e r a t i o nr a t e1v v l n ，c u l t u r et i m e3 6h ，t h ec h i t o s a n a s e a c t i v i t yo ff e r m e n t a t i o nl i q u i dr e a c h e dt h eh i g h e s ta t3 2 5 8u m l t l ca n a l y s i ss h o w e dd i s a c c h a r i d eo ro t h e rc h i t o o l i g o s a c c h a r i d e se x i s ti nt h e h y d r o l y s a t e so fc h i t o s a n t od e t e r m i n et h en u m b e ra v e r a g em o l e c u l a rm a s so fc h i t o s a n 诮t ht h ea c e t y l a c e t o n em e t h o d , t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h er a t i oo fv o l u m eo f1 5 c o l l o i d a lc h i t o s a nt oc r u d ee n z y m ew i t s1 5 ：1 ，3 7 ，r e a c t i o n3 0m i n ，t h en u m b e ra v e r a g e m o l e c u l a rw e i g h to fh y d r o l y s a t e sd r o p p e dt 01 0 9 2 1 c h a n g et h ev o l u m er a t i ot o1 0 ：1 ，5 ：1 ， 2 ：1 ，i ：ia n d1 ：2 ，t h em o l e c u l a rw e i g h to fh y d r o l y s a t e sb e c a m es m a l l e ra n ds m a l l e r , r e s p e c t i v e l ya s5 6 8 3 ，3 0 1 8 ，1 2 4 7 ，7 7 9a n d7 4 7 t h ei n d u c e d - c h i t o s a n a s eo fm i t s u a r i as p 1 4 1 2w a sp u r i f i e db ya m m o n i u ms u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ，c e n t r i f u g a lu l t r a f i l t r a t i o na n ds e p h a d e xg - 2 0 0g e lc h r o m a t o g r a p h y t h e m o l e c u l a rw e i g h to fc h i t o s a n a s ew a se s t i m a t e dt ob ea b o u t3 3 6k db ys d s p a g e t h e o p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r ew e r e4 0a n d3 7 c - 4 2 c ，r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m ea c t i v i t y w a sr e l a t i v e l ys t a b l eb e l o w4 5 i nar a n g eo fp h 4 0 - p h 8 0 k e yw o r d s ：c h i t o s a n ；c h i t o s a n a s e ；s c r e e n i n g ；m u t a g e n e s i s ；f e r m e n t i o nt e c h n o l o g y ； i d e n t i f i c a t i o no fb a c t e r i a ；t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y h 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密香 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：韧魄 时问：乒口? 年 ，月，多甘 黼始稍莲荔撇彬呼 签名日期：矗歹年石月，莎日 签名日期：二- - 2 年名月d 日 华中农业大学2 0 0 7 届硕士毕业论文 1 前言 1 1 壳聚糖概述 甲壳素，又称几丁质、甲壳质、聚乙酰氨基葡萄糖等，通过b - d 一( 1 ，4 ) 一糖苷键 连接而成的线性聚合物，平均分子量在1 1 0 5 - - 2 x 1 0 6 。甲壳素广泛存在于甲壳纲动 物、软体动物、昆虫、真菌以及高等植物中，自然界每年生成的甲壳素将近1 0 0 亿 吨，是地球上含量仅次于纤维素的天然高分子化合物、数量最大的含氮有机化合物。 纯的甲壳素是一种白色或灰白色、半透明片状固体，无味，不溶于水、稀酸和一般 有机溶剂。 壳聚糖，又称壳多糖、甲壳胺、脱乙酰甲壳素、聚氨基葡萄糖等，是甲壳素脱 乙酰化后的产物。一般而言，n - 乙酰基脱去5 5 以上，或者说能在1 乙酸或1 盐酸中溶解1 的脱乙酰甲壳素，称之为壳聚糖。作为工业品的壳聚糖，n - 脱乙酰 度在7 0 以上。壳聚糖一方面来自甲壳素，另一方面在自然界中也大量存在，是迄 今为止发现的唯一的天然碱性多糖。壳聚糖呈白色或灰白色，平均分子量在1 2 x 1 0 5 左右，不溶于水、碱性溶液或普通有机溶剂，但可溶于盐酸、硝酸、甲酸、乙酸等 稀酸( 蒋挺大，2 0 0 1 ) 。 睁o j n r = n h c o c h 3 甲壳素 r = i q h 2 壳聚糖 r - - o h 纤维素 图1 1 甲壳素、壳聚糖和纤维素的化学结构 f i g 1 1t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo f t h ec 砒自毗c h i t o s a na n dc e l l u l o s e 甲壳素、壳聚糖、纤维素三者的结构非常相近，都是由b - d ( 1 ，4 ) 一糖苷键连接 而成的多糖聚合物( 图1 1 ) 。一般生物都不能直接利用甲壳素、壳聚糖或纤维素， 只有少数生物可以降解这类物质。人类利用和研究纤维素已有数千年的历史，而对 甲壳素和壳聚糖的利用和研究还是近百年来的事，真正引起人们重视仅仅是从2 0 世纪7 0 年代开始的，但发展迅速。目前，甲壳素、壳聚糖以其优良特性( 生物相 容性、降解性、无毒性、吸附性等) ，己在医药、食品、化工、农业、环保等领域 得到广泛应用，并于1 9 9 1 年被日本、美国、欧洲等地的医学界和营养食品研究机 构认定为在碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质之后的第六大生命要素。 有关壳聚糖的研究已成为世界各国科学研究中最为热门的领域之一，自1 9 7 7 年第 一次国际甲壳质类专题学术研讨会在美国召开以来，至今为止已召开了八届。 产壳聚糖酶菌株的选育及产酶发酵工艺研究 1 2 壳聚糖的应用 1 2 1 在医药卫生方面的应用 近十几年来，国内外对甲壳素和壳聚糖在医学方面作了大量研究。毒理学方面， 证明它们是无毒的；药理学方面，证明它们对鼠类神经系统、心血管和呼吸系统均 无不良影响，且具有防治动脉粥样硬化、凝血、抗肿瘤和抗感染等作用。 1 9 8 5 年，s u z u k i 等( 1 9 8 6 ) 报道，在移植了s 1 的d d y 白鼠上注射壳六糖，结果 7 天后发现明显的肿瘤细胞抑制作用。采用1 0 0m g k g d ，连续注射5d ，能完全抑 制肿瘤生长。另外证明，壳六糖也对m m 4 6 实体瘤、m e t h - a 瘤细胞有明显的抑制 作用( t o k r oe ta 1 ，1 9 9 8 ) 。王中和等( 1 9 9 7 ) 利用低分子壳聚糖口服液对临床患者进行 辅助治疗，结果发现白细胞、淋巴细胞的总数保持稳定，t 淋巴细胞的数量显著上 升，说明该产品在调整机体免疫机能，减少放疗对患者免疫功能的影响方面，有显 著的疗效。 甲壳素和壳聚糖也作为药剂辅料和制剂得到了广泛的应用。在药物辅料方面， 精制的甲壳细粉可用于制备粉剂，如与柠檬酸钙细粉混合制成粉剂，局部撤布，或 喷雾，或加到绷带上，能明显促进愈合，愈合速度提高5 5 ；用壳聚糖与相关药物 制成颗粒剂，可改善口服制剂在胃肠道尤其在胃内的滞留时间，以提高药物的生物 利用率，如壳聚糖与消炎痛制成一种新型的缓释颗粒，含药5 0 ，体外溶出试验表 明，药物释放缓慢，且释放率几近1 0 0 ；另外，壳聚糖还可以作为片剂、微囊剂、 膜剂等药物辅料，提高药物利用率。在药物制剂方面，甲壳素和壳聚糖是一类很有 发展前途的新药，国内已研究制成了创伤愈合剂，洛美沙星壳聚糖口腔溃疡膜，滴 眼液，人工泪液等多种制剂，有些己投入临床应用，展示了甲壳素和壳聚糖在促进 伤口愈合，药物缓释等方面的重要作用( 蒋挺大，2 0 0 1 ) 。 1 2 2 在食品工业上的应用 在保健方面，壳聚糖是促生长因子( b f ) 的一种重要种类，它们能调节动物肠道 内微生物的代谢活动，改善肠道微生物区系的分布，促进双歧杆菌繁殖，从而提高 机体免疫力，使肠道p h 值下降，抑制肠道有害菌的生长，产生b 族维生素，分解 致癌物质，促进肠蠕动，增进蛋白质吸收( 杜昱光等，1 9 9 7 ) 。 在食品包装和添加剂方面，壳聚糖和淀粉制作成的水不溶性可食薄膜，能在水 中保持原状，可包装水分含量高的食品；壳聚糖粘度比较大，能与酸性物质结合， 可用作果汁和蔬菜的除酸剂、食品增稠剂；壳聚糖的其它功能还可用作酒类和各种 饮料的除浊剂、食醋的防沉淀剂、糖汁和糖蜜的纯化剂等( 李兆龙等，1 9 9 1 ) 。 低分子量的壳聚糖在食品中还有一定的抗菌作用，研究表明相对分子量为1 5 0 0 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士毕业论文 的寡糖，浓度1g l ，p h 6 0 时，具有很好的抑菌效果；相对分子量为4 4 0 0 0 0 的壳 聚糖，浓度为2 5g l ，p i - 1 5 2 时，抑菌效果与前者相当( 夏文水等，1 9 9 8 ) 。 目前，浙江金壳生物化学有限公司，生产的壳寡糖( 聚合度2 0 的聚氨基葡萄 糖) 和高密度壳聚糖等系列保健食品，已销往海内外，武汉海瑞生物科技有限公司， 生产的康源新一代甲壳素保健品，已推向市场。在国外，日本三荣工业公司和甲阳 化学公司开发出的，作为保健食品添加剂的壳寡糖产品已上市出售。 1 2 3 在饲料工业上的应用 由于甲壳寡糖和壳寡糖具有提高机体免疫力、促进双歧杆菌生长、提高机体抗 病能力等功能，把它们作为饲料添加剂与动物饲料混合，可制成多功能饲料，提高 牲畜的产量和质量。 早在1 9 9 4 年，日本生产的1 届的壳寡糖便已用作饲料添加剂，4 0 的猪饲料中 都添加了这类寡糖( 石宝明等，2 0 0 0 ) 。目前，这类产品在亚洲、北美、欧洲的生 产和使用都呈上升势头。我国动物营养界从2 0 世纪9 0 年代中后期才接触到此类添 加剂，并受到了国家的极度重视，业界也普遍看好这类产品的应用前景。甲壳寡糖 和壳寡糖作为一种新的功能性饲料添加剂，已成为动物营养研究的新动向，这也正 是甲壳素、壳聚糖被誉为第六大生命要素的原因之一。 1 2 4 在化学工业上的应用 在化学工业上，壳聚糖具有耐碱、耐晒、耐热、耐腐蚀等特性，是一种很好的 功能性特种材料。 壳聚糖具有良好的吸附性，对织物、皮革有牢固的附着力，可用来生产涂料、 印染助剂等。壳聚糖分子中有氨基，对蛋白质有很高的亲和力，可作为各种酶和活 细胞的固定化载体。甲壳素、壳聚糖还可制成生物可降解塑料、高性能分离膜和纤 维、螯合树脂等。低聚壳聚糖有优良的水溶性，其吸湿和保湿能力明显高于透明质 酸、乳酸钠和甘油，因此在化妆品中，它可作为保湿剂取代传统的透明质酸，还能 使化妆品具有良好的稳定性和储藏性，用于护发用品中，可以防止头发在烫发、染 发时破裂受损，使头发具有自然光泽，易梳理( 吴潇韫，2 0 0 2 ) 。此外，壳聚糖的 一些衍生物，可作为工业催化剂，壳聚糖紧密的晶体结构和高分子量，还有望成为 一种新型的天然高分子液晶材料。 1 3 壳寡糖的制备 尽管甲壳素、壳聚糖的来源丰富，功能优越，但由于它们的分子量大，结构紧 密，不溶于水和普通溶剂，这使它们在应用方面受大了极大限制，生产上需要用适 3 产壳聚糖酶菌株的选育及产酶发酵工艺研究 当的方法将其降解成2 1 0 个聚合度的甲壳寡糖或壳寡糖。甲壳寡糖和壳寡糖不仅 水溶性好，而且表现出比甲壳素、壳聚糖更优良的性质和生理功能。常用的制备方 法有酸水解法、氧化法和酶解法。 1 3 1 酸水解法 壳聚糖在酸性溶液中是不稳定的，会发生长链的部分水解，即糖苷键的断裂， 形成许多相对分子质量大小不等的片段，严重水解则大部分变成单糖，因此，酸水 解法是制备单糖和寡糖的主要途径之一。 1 9 5 8 年，b a r k e r 用盐酸水解壳聚糖制备壳寡糖，得到聚合度为1 7 的糖；c a p o n 和f o s t e r 把甲壳素用盐酸水解等一系列处理，制备得到壳寡糖，并研究了其聚合度 和含量的分布：r u p l e y 比较系统地研究了浓盐酸对甲壳素的水解情况；除盐酸法外， 利用乙酸、磷酸、氢氟酸也可水解得到壳寡糖( 蒋挺大，2 0 0 1 ) 。 利用酸水解法制备壳寡糖的研究历史最为悠久，但是酸水解法仍然存在不可避 免的缺点：水解过程不好控制、污染环境、制备过程中主要得到的是单糖和双糖， 很难得到活性寡糖等，这些因素导致酸水解法难以得到很好的推广。 1 3 2 氧化法 氧化降解法近年来研究较多，其中以过氧化氢法为主，已经用于生产。过氧化 氢法有酸法、碱法与中性法三种，介绍如下： 酸法是均相反应，将壳聚糖溶于1 乙酸中，加入适量的h 2 0 2 水溶液，调节v i i 值为3 5 进行降解；碱法是非均相反应，调节壳聚糖溶液的p i i 值为1 1 5 ，温度 7 0 左右，分批加入h 2 0 2 溶液，进行降解反应；中性法是指壳聚糖不溶于稀酸中， 也不调成碱性，而是直接将壳聚糖分散在水中，加热到所需温度，在搅拌下分批加 入h 2 0 2 溶液，进行反应。利用这些方法，均可得到水溶性壳寡糖，科研人员研究 了不同反应条件、不同介质、不同h 2 0 2 浓度对降解的影响( 蒋挺大，2 0 0 1 ) 。 此外，壳聚糖的氧化降解方法还有过硼酸钠法和次氯酸钠法。过硼酸钠法特点 为：反应温和、过程较易控制、价格低廉，但产物相对分子量较高，后处理较为麻 烦，很难将硼酸盐彻底除去，这种方法得到了一定的应用。次氯酸钠法可得到分子 质量在1 0 0 0 以下的低聚糖。 1 3 3 酶解法 酶解法是利用生物酶类对甲壳素、壳聚糖进行降解的方法。根据酶的作用类型， 分为专一性酶和非专一性酶。专一性酶有甲壳素酶，壳聚糖酶、甲壳素脱乙酰化酶 和溶菌酶，非专一性酶有，纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶等，其中来源于微生物 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士毕业论文 的专一性酶类对甲壳素、壳聚糖的降解起关键作用。在整个酶解过程中，无其它试 剂加入，不至于发生其它副反应，且反应条件温和、易于控制、产率高、污染小， 成为近年来，国内外研究的热点。目前已发现大约有3 0 多种酶可用于甲壳素和壳 聚糖的降解反应( 金鑫荣等，1 9 9 8 ) ，我国从2 0 世纪8 0 年代末开始，己用酶解法 生产低聚壳聚糖，且批量出口。 甲壳素酶广泛分布于细菌、真菌、放线菌等多种微生物，以及植物组织和动物 消化系统中，对线性结构的乙酰氨基葡萄糖苷键有专一性水解作用，水解的最终产 物是甲壳二糖。甲壳素酶系通常分为三类，甲壳素内切酶、外切酶和b n 乙酰氨基 葡萄糖酶，其降解甲壳素的生化途径是：先由降解酶系统水解甲壳素的糖苷键，如 外切酶从甲壳素分子链的非还原端开始，以甲壳二糖为单位，依次酶解，内切酶则 随机水解糖苷键，再由b - n 乙酰氨基葡萄糖酶作用生成的甲壳二糖，水解成单糖( 图 1 2 ，吴潇韫，2 0 0 2 ) 。 甲壳素脱乙酰化酶 甲壳素- 壳聚糖 ii l 甲壳素酶i 壳聚糖酶 甲壳素脱乙酰化酶 + 甲壳寡糖( n = 2 1 0 ) - 壳寡糖( n = 2 - - 1 0 ) l 甲壳素酶耋柔茗馨鬻 甲悫二糖氨基葡萄糖 j 甲壳二糖酶 n 乙酰氨基葡萄糖 图1 2 甲壳素和壳聚糖的酶解途径 f i g 1 2t h eh y d r o l y s i sa p p r o a c ho fe h i ma n dc h i t o s a n 甲壳素酶除作用于甲壳素外，还可以作用于部分乙酰化的壳聚糖。研究人员采 用不同n 乙酰化壳聚糖为底物研究甲壳素酶对其降解作用，从分离纯化到的降解产 物中发现，壳聚糖的n - 乙酰化度不同，产物的分子大小也不同，n - 乙酰化度影响甲 壳素酶的作用位点，但产物的降解端都有g l c n a c 残基，这说明甲壳素酶除了水解 甲壳素外，还可以水解部分乙酰化的壳聚糖( 夏秋瑜等，2 0 0 6 ) 。 由于甲壳素不溶于稀酸，酶反应是在非均相下进行的，降解缓慢，实际上研究 得更多的是壳聚糖的降解，这就依赖于壳聚糖酶。与甲壳素酶一样，壳聚糖酶来源 广泛、多数为诱导性胞外酶，不同的是它们一般为内切酶，能随意作用壳聚糖的b ( 1 ，4 ) 氨基葡萄糖苷键，产生壳聚糖二聚体、三聚体和寡聚体的混合物。在生产过程 中，壳聚糖溶解于稀酸成为胶体溶液，与壳聚糖酶发生作用，得到壳寡糖，还可进 一步与氨基葡萄糖苷酶作用，得到氨基葡萄糖( g l e n ) 。 5 产壳聚糖酶菌株的选育及产酶发酵工艺研究 溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 存在于鸡蛋、人的眼泪及唾液中，它能以几丁质及部分n 乙酰 化壳聚糖为底物，裂解b ( 1 ，4 ) 糖苷键，水合碳正离子中间产物并使其进一步发生转 糖苷化反应。在该酶的作用下，低聚合度寡糖能利用转糖苷化反应，加长糖链成为 高聚合度的寡糖。a i b a 等( 1 9 9 4 ) 利用溶菌酶降解壳聚糖，得到主要是4 糖以下的寡糖， 聚合度高的产物难以获得。溶菌酶还有一个不足之处，与其它降解壳聚糖的酶类相 比，降解效率较低。 目前，非专一性酶中，已发现有多种水解酶，如蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶等都 可以降解壳聚糖。从这些酶结构上看，不存在共同的催化基团，具体的作用机制尚 不清楚，但它们的降解反应有几个共同点：水解最适p h 值为3 o 5 0 ；水解初期以 内切酶作用为主，溶液粘度迅速下降；随脱乙酰化程度的提高，酶的水解活性增强； 以水溶性甲壳素为底物时，酶活性最高；反应不遵守米氏方程，无论是提高酶、还 是底物的质量分数都可以提高反应速度，是一种生产寡糖的较好途径。 纤维素酶是非专一性酶中研究得最多的一类酶，来源于t r i c h o d e r m ar i r i d e 来的 纤维素酶，在5 0 、p h 值为5 6 的条件下水解壳聚糖，得到主要为聚合度6 8 的壳寡 糖( m u r a l 【ie ta 1 。1 9 9 3 ) 。用复合纤维素酶水解溶于稀h c i 溶液中壳聚糖，在p h 5 0 、5 0 水浴的条件下，酶解4 8h ，经提取、分离纯化，产物主要成分为聚合度6 7 的壳 寡糖( 纪莹等，2 0 0 3 ) 。 除纤维素酶外，木瓜蛋白酶、脂酶a m 、菠萝蛋白酶、巯基蛋白酶及酸性胃蛋 白酶的水解作用亦相当显著。 单一水解酶降解壳聚糖的能力有限，增加酶量也难以提高水解程度，水解产物 平均分子质量在1 0k d 以上。若将非专一性水解酶按比例配合，利用酶之间的协同 效应或互补效应，可进一步提高壳聚糖的水解程度。研究壳寡糖的复合酶降解法发 现，用纤维素酶、a 淀粉酶和蛋白酶复合降解脱乙酰度为2 4 的甲壳素，可得到聚 合度为3 1 0 的寡糖( 夏秋瑜等，2 0 0 6 ) 。 1 4 壳聚糖酶研究进展 1 4 。1 产壳聚糖酶微生物的来源 1 9 7 3 年，m o n a g h a n 等在研究得用水解酶抑制病原真菌的可能性时，通过对2 0 0 多种微生物的研究，首次提出了壳聚糖酶，并解释它是一种不同于甲壳素酶的新酶， 这种酶对胶态甲壳素不水解，但是能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖，所以它被认为 是对线性的壳聚糖具有专一性水解作用的一种酶，并于1 9 8 4 年向国际酶学委员会申 请登记编号：e c 3 2 1 9 9 。此后，经过3 0 多年的研究，人们又相继从多种微生物( 包 括细菌、放线菌、真菌以及病毒等) 及单子叶和双子叶植物的不同组织中发现有壳 聚糖酶活性( 产壳聚糖酶的微生物见表1 1 ) 。 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士毕业论文 表1 1 产壳聚糖酶微生物及部分酶学性质 t a b l e1 1c h i t e s a n a s e - p r o d u c i n gm i c r o o r g a n i s ma n dp r o p e r t i e so f c h i t o s a n a s e s m o l “l a r p l 印t i m 。o p t i m “referesoruce n c e s m s s ( k d a ) 一p h 盂p ( ) ”8 s t r e p h t o m y c e ss p n o 6 2 6 ( s ) 4 5 55 0p d e ea n ds t o r c k ，1 9 7 5 s t r e p h t o m y c e sg r i s e sh u t 6 0 3 73 5 ( s ) 9 78 03 7o h t a k a r ae ta l ，1 9 8 4 s t r e p t o m y c e s 印n 一1 7 42 9 5 ( s ) 7 5 5 56 5b o u c h e re ta 1 ，1 9 9 2 n o c a r d i ao r i e n t a l i si f 0 1 2 8 0 6 2 6 ( s ) 4 05 0 - 6 0 5 0s a k a ie ta l ，1 9 9 1 n o c a r d i a e s k - 0 12 78 8 5 05 5 - - 6 0o h j i m ae ta l ，1 9 9 5 b a c i l l u ss p n o 7 - m 4 1 ( s ) 6 05 0u c h i d aa n do h t a j 【a 坞1 9 8 8 b a c i l u sr - 4 3 1 ( g ) 8 3 5 6 柏t o m i n a g a a n dt s n j j s a 】h , 1 9 7 5 b a c i l l u sc i r c u l a u sm h - k 1 3 2 ( s ) 9 2 6 55 0s a i t oe ta t 1 9 9 9 b a c i l l u sm e g a t e r i u mp lc h a 4 3 ( s ) 1 0 14 5 - - 6 _ 55 0p e l l e f i e ra n ds y g u s c k , 1 9 9 0 b a c i l l u ss p p 1 7 s 4 3 ( s ) 5 03 7s a i n oe ta 1 ，1 9 9 1 b a c i l l u ss u b b i l i1 6 8 ( p q c l 2 7 45 7 6 0 p a r r oe ta l ，1 9 9 7 b a c i l l u sc h i m e u s i s3 1 6 0 4 0 a k i y a m ae ta 1 。1 9 9 9 b a c i l l u ss u b t i l i sk h l 2 8 ( s ) 8 3 7 05 0 o m l m a s a b ae ta 1 ，2 0 0 0 b a c i l l u ss p c k 4 3 1 ( s ) 6 5 6 0y o o ne ta l ，2 0 0 0 b a c i l l u s s 1 4 5 ( s ) 66 0k u r a k a k ee ta l ，2 0 0 0 p s e u d o m o n a s h - 1 4 3 5 ( s ) 1 0 14 03 0y o s h i h a r ae ta l ，1 9 9 2 p s e u d o m o n u ss p v i i i t 3 9 5 1 3 ( s ) 6 5 2 5 - 3 2 蔡静平和王钦宏，2 0 0 1 e n t e r b a c t e rs p g - 15 57 05 0 y a m a s a k ie ta 1 ，1 9 9 3 m a t s u e b a c t e rc h i t o s a n o t a b i d u s 3 49 64 03 0 - 4 0p a r ke ta l ，1 9 9 9 a m y c o l a t o p s i ss p c s o - 22 7 ( s ) 8 8 5 35 5 o k a j i m ae ta l ，1 9 9 4 a c i n e t o b a c t e rs p c h b l 0 1 西i 3 75 - 96 5 c hi i3 05 0s h i m o s a k ae ta 1 ，1 9 9 5 c h a2 85 - 9 彳s p e r g i l l u s 。r y z a 。鼍2 6 6 0 叫4 0 ( 鳓 z h a n ge ta 1 ，2 0 0 1 b g l c n a s e i i1 3 5 ( s ) a s p e r g i n u sf u m i g a t u sk h 9 41 0 8 ( s 1 8 44 5 巧55 0 6 0c h e n ga n du ，2 0 0 0 p e n i c i l l u mi s l a n d i c u m 3 0 ( o ) 4 24 5 - 6 0 4 5f e n t o ne ta 1 ，1 9 8 1 r h o d a t a r u ag r a c i l l s1 0 0 ( g ) 4 5 4 5s o m a s h e k a ra n dj o s e p h , 1 9 9 6 胁。u x i i c c h hb a砸8 4 ：9 5 0 5 5 0 5 a l f o n s oe ta l , 1 9 9 2 5 8 ( s ) 4 7c h b 5 0 a s p e r g i l l u ss p y 2 k2 5 ( g ) 8 4 6 56 5 - 7 0c h e n ge ta 1 ，2 0 0 0 f u s a r i u ms o l a n i s p p h a s e o l i 3 6 ( s ) 5 64 0s h i m o s a k ae ta 1 ，1 9 9 3 注：“s ”和“g ”分别表示通过s d s - p a g e 凝胶电泳和凝胶过滤色谱测定的相对分子质量。 7 产壳聚糖酶菌株的选育及产酶发酵工艺研究 1 4 2 壳聚糖酶的理化性质 壳聚糖酶对底物具有一定的专一性，一般都可水解胶状壳聚糖、壳聚糖的衍生 物如乙二醇壳聚糖等，产物是聚合度为2 1 0 的壳寡糖混合物。绝大多数壳聚糖酶为 胞外型，在微生物体内产生后分泌到胞外，胞内型的壳聚糖酶只存在于植物和接合 菌中。另外，壳聚糖酶还有组成型和诱导型之分，其中大多数属于诱导型。 一般微生物所产壳聚糖酶为碱性蛋白，等电点p i 在8 0 1 0 1 之间，酶作用最适 p h d 4 0 8 0 ，最适作用温度3 0 c 7 0 ，相对分子质量1 0k d 5 0k d 。由于甲壳 素和壳聚糖的区别仅在于其脱乙酰度的不同，甲壳素中也含有部分脱乙酰化的氨基 葡萄糖残基，壳聚糖中也会有部分n 乙酰氨基葡萄糖，这些导致区分甲壳素酶和壳 聚糖酶的界限不是很明确。通常壳聚糖酶的分子量比甲壳素小，这可以作为两种酶 的分类依据之一，但也有例外，比如r h o d o t o r u l ag r a c i l i sc f r 1 所产壳聚糖酶相对分 子质量为1 0 0k d ，b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i eu t k 和a s p e r g i h u sy 2 k 所产的外切壳聚糖 酶的相对分子质量分别为1 0 8k d ，1 3 5k d ( 表1 1 ；戴芸和朱旭芬，2 0 0 4 ) 。 1 4 3 壳聚糖酶的特征及分类 不同微生物来源的壳聚糖酶水解作用模式不同，其作用底物壳聚糖可看作是部 分脱乙酰化或完全脱乙酰化的甲壳素。因此，壳聚糖分子中一般包含4 种糖苷键， g l c n a c g i c n a c 、g l c n - g i c n 、g 1 c n g i c n a c 和g i c n a c - g i c n ，各种糖苷键比例取 决于脱乙酰化程度。壳聚糖酶被认为是能作用于壳聚糖分子中的g l c n g i c n 糖苷键， 而不作用g l c n a c - g l e n a c 糖苷键。因此，根据其作用底物糖苷键的类型，壳聚糖酶 被分为3 类：作用g i c n - g i c n ，g l c n a c - g i c n 的为i 类；只作用g i c n - g i c n 的为类； 作用g l c n g l c n 和g i c n - g i c n a c 的为类。其中第1 类的代表有p e n i c i l l i u m i s l a n d i c u m ，b a c i l l u s p u m i l u s ，s t r e p t o m y c e ss p n 1 7 4 ；第1 i 类的代表有踟c i l l u ss p n o 7 - m ，b a c i l l u ss p p i - 7 s 第类的代表有s t r p p t o m y c e sg r i s e u sh u t 6 0 3 7 和b a c i l l u s c i r c u l a n sm h k 1 ( 戴芸和朱旭芬，2 0 0 4 ) 。 根据酶解产物的不同，壳聚糖酶可分为内切酶和外切酶。内切酶作用方式是随 机切断壳聚糖链，产生壳低分子量的壳聚糖的混合物，外切酶则是从糖链的非还原 性末端逐个切下单糖残基，产物为氨基葡萄糖。从已报道文献来看，大部分微生物 产生的壳聚糖酶为内切酶，有的微生物既产壳聚糖内切酶，又产壳聚糖外切酶，如 b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n su i k 、a s p e r g i l l u so r y z a ei a m 2 6 6 0 等。 根据酶的氨基酸序列的相似性，糖苷水解酶可分为许多家族，目前已测得序列 的壳聚糖酶大致归为4 6 、7 5 、8 0 、8 四类糖苷水解酶家庭。4 6 家族的壳聚糖酶主要来 自细菌和放线菌，7 5 家族的主要来自真菌，8 0 、8 家庭的成员较少。研究表明：大多 数壳聚糖酶属于糖苷水解酶的4 6 家族，该家族壳聚糖酶包括1 2 种氨基酸序列，其中 8 华中农业大学2 7 届硕士毕业论文 1 0 种在细菌中发现，2 种在病毒中发现；7 5 家族的真菌产壳聚糖酶，b p f u s a r i u ms o l a n i fs p p h a s e o l i 所产的壳聚糖酶与细菌所产的壳聚糖酶没有同源性；8 0 家族的细菌产壳 聚糖酶目前只在朋h 纽 b 妇c t 盯c h i t o s a n o t a b i d u s 和s p h i m g o b a c t e r i u mm u l t i r o r u m 中发 现，该家族与4 6 家族有一个保持酶活所必需的共同的特征单元，e d n q 一x ( 8 ，1 7 ) 一y x ( 7 ) - d - x 【r d 】- 【g p l x - i t s 一x ( 3 ) 一【舢 v f i ，y 】一g 一( 5 ，1 1 ) d ；8 家族的壳聚糖酶只在两 种芽孢杆菌中发现( t r e m b l a ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。不同来源的壳聚糖酶的氨基酸序列差别较 大，通常只有n 末端及一小部分肽链上的氨基酸序列相同，这给壳聚糖酶在分子生 物学上的研究带来了困难( h e n r i s s a ta n db a i r c h , 1 9 9 6 ；t r t n n b l ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 5 本课题研究的目的和意义 壳聚糖及其水解产物壳寡糖的广泛应用，潜在的多种生物活性，展现了广阔的 前景。然而，壳聚糖的应用开发，仍有许多问题亟待解决，如溶解性差、缓释膜机 械强度小、药物释放速度慢、产量低、成本高等。如何低成本、高产率、规模化生 产壳寡糖，并制成体内环境下易溶、易吸收、使用方便的药剂，成为壳聚糖研究重 点之一。 传统工业上，通过酸解法或氧化法制备壳寡糖不仅工艺复杂、成本高，而且易 污染环境，因而使其生产及应用受到了极大的限制。微生物法可以用来大规模生产 壳寡糖，且反应条件温和、易于控制、产率高、污染小，在日益重视环保节能的当 今社会，应用微生物法生产壳聚糖是大势所趋。 虽然，我国是一个甲壳素、壳聚糖的生产大国，但相对于我国极其丰富的甲壳 素、壳聚糖天然资源和它们的广泛用途来说，其研究开发力度是远远不够的。并且， 在生产这些产品的过程中，使用了大量的盐酸等化学物质，危害环境，产品也主要 是作为廉价的原料出口，在国外完成高附加值的深加工。改变这一被动的局面，己 迫在眉睫。 我国从2 0 世纪5 0 年代开