（发酵工程专业论文）我国原料奶污染蜡样芽孢杆菌的调查与鉴定及特征性蛋白的分析研究.pdf

摘要 蜡样芽孢杆菌是一种致病性病原菌，它能引起胃肠感染和非胃肠感染。肠毒 素、催吐型毒素、溶血素、磷脂酶c 以及像b 一内酰胺酶、蛋白酶、胶原酶之类 的许多酶类都是蜡样芽孢杆菌所产生的潜在的致毒因子。蜡样芽孢杆菌菌体细胞 的s 一层具有特殊的表面结构，它在吸附宿主，吞噬作用及耐辐射性等方面起到 很重要的作用。随着与蜡样芽孢杆菌相关的疾病，尤其是由它引起的食物中毒的 增多，近年来人们对蜡样芽孢杆菌越来越关注。本研究对我国十个地区的原料奶 中微生物污染情况进行调查与鉴定，主要检测原料奶中蜡样芽孢杆菌数，以及菌 落总数和大肠菌群数，确定原料奶中微生物的污染状况与蜡样芽孢杆菌污染的关 系。同时研究和摸索了蜡样芽孢杆菌特征性蛋白的分离纯化技术。 结果表明，十个地区的蜡样芽孢杆菌数平均值均1 0 5c f u m l 。而细菌总数 平均值，天津地区为5 4 5 x1 0 5c f u m l ，张家口为7 6 1 i 0 5c f u m l ，郑州为 1 9 9 1 0 6c f u m l ，这三个地区均在国家标准线之内。而烟台、哈尔滨、肇东、 海拉尔、朔州、杭州和南京这七个地区的原料奶菌落总数平均值则在1 0 6 - 1 0 7 c f u m l ，都属于超标奶。综合分析得出蜡样芽孢杆菌数与原料奶的微生物污染状 况没有相关性。本试验也对原料奶的溯源奠定了基础。研究发现从蜡样芽孢杆菌 中分离出三种分子量约为2 8 5 、2 6 5 和2 0 k d a 的特征性蛋白，而苏云金芽孢杆 菌、巨大芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌中则没有这些特征性蛋白，为免疫金标技术的 发展奠定了基础。 关键词：原料奶：蜡样芽孢杆菌；菌落总数：大肠菌群数；特征性蛋白 a b s t r a c t b a c i l l u sc e r e u si sac a u s a t i v e a g e n t i nb o t h g a s t r o i n t e s t i n a l a n di n n o n g a s t r o i n t e s t i n a li n f e c t i o n s e n t e r o t o x i n s ，e m e t i ct o x i n ( c e r e u l i d e ) ，h e m o l y s i n s ，a n d p h o s h p o l i p a s eca sw e l la sm a n ye n z y m e ss u c ha sb e t a - l a c t a m a s e s ，p r o t e a s e sa n d c o l l a g e n a s e sa r ek n o w na sp o t e n t i a lv i r u l e n c ef a c t o r so fb c e r e u s as p e c i a ls u r f a c e s t r u c t u r eo f 及c e r e u sc e l l s 。t h es - l a y e r , h a sas i g n i f i c a n tr o l ei nt h ea d h e s i o nt oh o s t c e l l s i np h a g o c y t o s i sa n di ni n c r e a s e dr a d i a t i o nr e s i s t a n c e i n t e r e s ti n 丑c e r e u sh a s b e e ng r o w i n gl a t e l yb e c a u s ei ts e e m st h a t 最c e r e u s r e l a t e dd i s e a s e s ，i np a r t i c u l a rf o o d p o i s o n i n g s ，a r eg r o w i n gi nn u m b e r w ei n v e s t i g a t e da n di d e n t i f i e dm i c r o b i o l o g y p o l l u t i o no ft h er a wm i l ki nt e na r e a so fc h i n a w em a i n l yd e t e c t e db c e r e u sc o u n ti n r a wm i l k ，a st h es a m et i m e ，a e r o b i cb a c t e r i a lc o u n t ，c o l i f o r mg r o u p sc o u n tw e r e d e t e c t e d e s p e c i a l l yw ed e t e r m i n e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nb c e r e u sc o u n ta n d m i c r o b i o l o g i c a lc o n t a m i n a t i o n s i m u l t a n e o u s l yw es t u d i e da n dh a dt r i e dt of i n do u t t h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yo fc h a r a c t e r i s t i cp r o t e i nf r o mb c e r e u s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h em i c r o b i a lc o n t a m i n a t i o nc o n d i t i o ni nr a wm i l ki s u n o p t i m i s t i c t h eb c e r e u sc o u n ta v e r a g ev a l u e sw e r eb e l l o wo re q u a lt o10 5c f u m l i nt e na r e a s i nt e r m so ft h et o t a lb a c t e r i a lc o u n ta v e r a g ev a l u e s ，o n l yt i a n j i n ， z h a n g i i a k o ua n dz h e n g z h o uc o n f o r mt ot h en a t i o n a ls t a n d a r d s ，t h e yr e s p e c t i v e l y w e r e5 4 5 1 0 5 ，7 6 1 1 0 5a n d1 9 9x1 0 6 t h eo t h e rs e v e na r e a s ，y a n t a i ，h a e r b i n ， z h a o d o n g ，h a i l a e r , s h u o z h o u ，h a n g z h o u ，n a n ji n ge x c e e d e dt h ec r i t e r i o n ，b e t w e e n 10 6a n d10 7c f u m l s ot h e r ew e r en or e l e v a n c eb e t w e e n 丑c p 比。岱c o u n ta n d m i c r o b i o l o g i c a lc o n t a m i n a t i o no ft h er a wm i l k a n dt h er e s e a r c hl a i daf o u n d a t i o nf o r t r a c e a b i l i t yo ft h er a wm i l k w es e p a r a t e dt h r e ek i n do fc h a r a c t e r i s t i cp r o t e i ni n8 c e r e u s ，m o l e c u l a rw e i g h t s a p p r o x i m a t e l yw e r e2 8 5 、2 6 5 和2 0 k d a ，w h i l et h e b t h u r i n g i e n s i s b m e g a t e r i u ma n db m y c o i d e sd i d n th a v et h et h r e ec h a r a c t e r i s t i c p r o t e i n ，w h i c hp r o v i d eb a s i sf o ri m m u n ec o l l o i d a lg o l dc h r o m a t o g r a p h y k e yw o r d s ：t h er a wm i l k ；b a c i l l u sc e r e u s ；t h et o t a lb a c t e r i a lc o u n t ；c o l i f o r mg r o u p s ； c h a r a c t e r i s t i cp r o t e i n 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 一、发表论文 1 津晋豫鲁部分地区原料奶中微生物污染情况调查食品科学，2 0 0 8 ，2 9 ( 5 ) ： 3 7 3 3 7 7 2 我国东北部分地区原料奶c l 蜡样芽孢杆菌的污染情况调查西北农业学 报，2 0 0 9 ，18 ( 3 ) ：2 8 9 2 9 5 二、学位论文使用授权声j 本人同意授权天津商业人学将沦文的全部内容或部分内容提供给有关方 面，编入中国学位论文全文数拂：库、中国优秀博硕士学位论文全文数据库、 天津商业大学博硕士学位论文全文数据库等有关数据库进行检索，并采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅或借阅。同意学校向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和磁盘。 第一章前言 1 1 课题研究背景 第一章前言 1 1 1 蜡样芽孢杆菌研究的相关背景 1 1 1 1 蜡样芽孢杆菌简介 蜡样芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 是一种好氧产芽孢的杆形菌，为革兰氏阳性菌。它们广 泛存在于土壤、狄尘和水中。b a c i l l u sc e r e u s 的最低生长温度约为4 5 ，最高生长温度约 为4 8 - - - 5 0 c 。允许生长的p h 值范围为4 9 9 3 ，营养体生长的最小水分活度在0 9 1 2 , - - 0 9 5 0 。它们的孢子具有典型的耐热性1 。蜡样芽孢杆菌可产生致吐肠毒素和致腹泻肠毒素， 前者耐热，是引起食物中毒的主要成分瞳1 。 1 1 1 2 蜡样芽孢杆菌的命名史 在 b e r g e y 氏鉴定细菌学手册第8 版中，蜡样芽孢杆菌的分类地位为芽孢杆菌属的 第1 群，该群有2 2 个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽孢杆菌、草状芽孢 杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌属“大细胞菌种”。蜡样芽孢杆菌 其拉丁学名为b a c i l l u sc e r e u s ，中文菌名为蜡状芽孢杆菌，其拉丁别名为b a c l l l u sm e d u s a ， b a cn1u se n d o r h y t h m o s 、b a c i l l u sc e r e u sf r a n k l a n d 融a n k l a n d1 8 8 7 , 良毡人是 f r a n k l a n d1 8 8 7 。1 9 8 5 年名为b a c i l l u sc e r e u ss u b s p a l b o l a c t i s ，到1 9 5 0 改为b a c i l l u s c e r e u s o 因为芽孢杆菌属的生理特性具有异质性，所以很难将它们进行分类。通过表型特性和 基因特性的类同检测，很难将蜡样芽孢杆菌和相关菌株区别开来“5 1 。据报道炭疽芽孢杆菌、 蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌和苏云会芽孢杆菌它们的1 6 sr r n a 的初级结构相似度高达 9 9 以上n 1 。这些密切相关的菌种之间也有一些显著的特性。炭疽芽孢杆菌有两个毒性质粒， 苏云金芽孢杆菌可产生伴孢晶体和6 一毒素。蕈状芽孢杆菌菌落在血琼脂培养基上呈假根 样生长砸吲。 1 1 1 3 营养体细胞( 孢子囊) 蜡样芽孢杆菌和其他的芽孢杆菌的典型存在方式是营养体细胞和孢子。蜡样芽孢杆菌 营养体细胞在电子显微镜下的超微结构如图卜l 所示。细胞壁与细胞质膜之间是细胞质。 某些菌的细胞壁最外层有一层晶体表面蛋白层( s - 层) 嘲。能运动的蜡样芽孢杆菌有鞭毛， 但是个别不能运动的菌株也会有n 刚。 第一章前言 图卜l 蜡样芽孢杆菌孢于囊的超微结构。c m = 细胞质膜c v - 细胞壁，s = 外层。显微照片中 的横线长度代表02 p m 11 14 营养体细胞的s 一层 据报道s 层蛋白排列有两种周期形态：正方形周期形态1 和类似于倾斜的六边形的周 期形态“1 见图卜2 ，这已经经过晶体学技术的鉴定。生长在固体培养基上的临床菌株的s 蛋自的分子量是9 7 k d a ”，但是用胰蛋白酶大豆肉汤培养基在摇床下培养出的菌株的s 蛋白 的分子量是大约为8 5 k d a l 。+ 。蜡样芽孢杆菌的s 层看起来是完全覆盖在菌体的细胞壁上 而且能牢牢地吸附在其他的细胞壁结构上。营养体细胞能分泌大量的s 一层蛋白，在电子显 微镜下可以观察到游离的s 一层0 3 。 图【_ 2 蜡样芽孢杆菌0 h 5 9 9 的s 层负染色片段 11 15 芽孢 在正常的条件下蜡样芽孢杆菌能迅速地产生芽孢。芽孢通常都靠近两端呈狭长形 不究出苗体。其结构和其它芽孢杆菌相似，由细胞核，核膜、核质、内衣和外衣组成，其 结构见图卜3 。以芽孢形，存在的菌体没有代谢活动，而且对加热，冰冻、干燥和辐射等 2 第一章前言 极端地环境条件有较强的耐受性。芽孢是蜡样芽孢杆菌主要的繁殖方式，有些菌种能粘附 在人的上皮细胞上，他们的制毒机制有所不同“。研究还表明，虽然苏云金芽孢杆菌与蜡 样芽孢杆菌之间，炭疽芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌之间都有凝集作用，但是他们的芽孢抗原 有很高的特异性“。孢子的萌发和孢子囊的生长都依赖于合适的环境条件。 图卜3 蜡样芽孢午t 菌芽孢的剖面图。i m 内膜，c = 皮质，i c = 内衣，0 c = 外衣 11 16 栖息地 蜡样芽孢杆菌与其他细菌一样一般存在于土壤中。因为不需要特殊的营养条件，普遍 存在于土壤、米饭和谷草中”“。正因为具有这种特性及能形成芽孢的能力，故蜡样芽孢丰t 菌具有很强的繁情能力。 1 12 蜡样芽孢杆菌引起的胃肠型感染 在很多工业国家中由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒逐渐增加。因为有些并没有上报或 者没有接受治疗，所以说 b 蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒的准确数目并不清楚。1 9 5 0 年 一1 9 8 5 年，在匈牙利、芬兰、保加利亚和挪威这些国家发生的食物中毒主要是腹泻型的 呕吐型的主要发生在r 本和英国”。每个国家由蜡样芽孢杆菌引起的食源性疾病所占的百 分比是不同的。在1 9 7 3 一1 9 8 i 在芬兰出蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒占所有病原苗引起 的食物中毒的1 78 ，荷兰占1 15 ，苏格兰占o8 ，英格兰和威尔士占o 7 ，加拿大占 22 9 6 同本占o7 匈牙利占( 1 9 6 0 一1 9 6 8 ) 1 50 9 6 ”“。1 9 9 0 年在挪威，从食源性疾病中 分离出最多的病原菌就是蜡样芽孢杆菌“”。台湾卫生部声明1 9 9 4 年台湾共发生7 4 起食源 性疾病。在这些食物中毒中有1 49 都是由蜡样芽孢杆菌引起的“。在美国由蜡样芽孢 杆菌引起的食物中毒并不常见，1 9 7 2 一1 9 8 2 年自j 由病原菌引起的食物中毒的百分率仅 13 ”。然而也有大规模的食物中毒爆发，例如1 9 8 9 年就有1 0 0 人感染“9 “1 。因为国家 第一章前言 与国家之间的申报程序具有差异性，所以不同国家所上报的案例数目不具有可比性。 在食品行业由蜡样芽孢杆菌导致的食物中毒有很多原因。因为蜡样芽孢杆菌普遍存在 于环境中，很容易污染食品或是加工过程。经过巴士消毒和加热后孢子可能会存活随2 。 为了杀死食品中的微生物有时会用辐射的方法，可是孢子对y 一射线也有一定的抵抗性汹1 。 芽孢是疏水性的，而且能吸附表面，尤其对于乳品业来说，这是很致命的问题n 3 龆1 。大多 数蜡样芽孢杆菌菌群都是嗜温的( 甚至在4 3 下生长) ，但是有些菌株却是嗜冷的或耐寒 的，在一4 叫7 都能生长口“引一。t eg i f f e le ta 1 分析了3 3 4 份巴氏灭菌的牛奶，其 中4 0 的牛奶中都分离出了蜡样芽孢杆菌。1 0 6 株菌经过测试后发现，5 3 能在7 生长； 从奶中分离的1 3 4 株蜡样芽孢杆菌中，能发酵乳糖的占2 0 ，对于蜡样芽孢杆菌来说乳糖 是不常见的碳源让叼。有些蜡样芽孢杆菌既是嗜冷的又是能产肠毒素的【巩纷矧。r u s u l 和 y a a c o b 研究分离自乳品和湿面条的产肠毒素的蜡样芽孢杆菌，发现1 6 4 株能产肠毒素的蜡 样芽孢杆菌中有5 0 的菌株都能在5 生长 。 近来有人提议将那些嗜冷的或耐寒的蜡样芽孢杆菌菌株( 能在7 或以下生长的) 归 为第5 亚种啪1 。l e h n e re ta 1 对蜡样芽孢杆菌茵群中的耐寒菌和嗜温菌进行了研究。基 于1 6 sr d n a ，2 3 sr d n a ，1 6 s - 2 3 sr d n a 间隔区序列及主要的冷休克蛋白同系物冷激蛋白 c s p a 的基因这些特殊序列之间有差异，他们发现了最w e i c h e n s t e p h a n e n s i s 这个异常的 菌种，它能在+ 4 7 下生长，却不能在4 3 c 下生长洲。这个第五亚种可以用冷休克蛋白 基因的靶向p c r 来判定啪1 。此外，还发现1 6 sr d n a 上特有的氨基酸，与菌体的耐寒性密 切相关啪1 。 许多食物都会受到蜡样芽孢杆菌的污染：意大利细面条、意大利面、米饭、乳制品、 调味料、其他的干燥的粮食，还有肉、鸡肉，蔬菜、水果、谷物及海产品伽2 l 培卫屯施3 “3 羽。 呕吐型食物中毒多数是由于食用了污染了蜡样芽孢杆菌的米饭和面条，腹泻型的食物 中毒往往是因为食用了奶制品、蔬菜和肉引起的。州。1 9 9 1 - 1 9 9 4 年，航空飞机上提供的热 饭样品中有3 发现了蜡样芽孢杆菌。在不同国家所提供的热饭样品中，总共抽查了l o l 2 个样本乜置3 引。 蜡样芽孢杆菌引起的胃肠型感染和非胃肠型感染的致病性与产毒素的能力有关。除此 之外还与四种溶血素、三种不同形念的磷脂酶c 、催吐毒素及两种产毒素复合物有关汹t 3 。 用免疫学分析，聚合酶链式反应和生物学试验可以检测蜡样芽孢杆菌肠毒素的活性。不同 的蜡样芽孢杆菌菌株之间产生肠毒素的能力是不同的。有的菌株可能只产生溶血素b l ( h b l ) 或是非溶血性的肠毒素或是两种都产生。虬3 。因为有些蜡样芽孢杆菌菌株中既能检 4 第一章前言 测到肠毒素复合物，而且还有分解淀粉的能力，故a n d e r s s o ne t a l 提出有些蜡样芽孢杆 菌既能够产生肠毒素又能产生催吐毒素n 舶。据报道在挪威，从奶源中分离的8 5 株蜡样芽 孢杆菌中有5 9 的菌株都能产生肠毒素；在荷兰3 7 份蜡样芽孢杆菌污染的牛奶中能产毒素 的占7 卜7 6 乜屯矧。能利用乳糖的蜡样芽孢杆菌与不能利用乳糖的蜡样芽孢杆菌相比，它 们所产生的肠毒素的活性更高。研究结果显示，毒素的分泌量也与培养基的类别有关汹1 。 出现呕吐综合症的感染剂量是每克1 0 5 - 1 0 ”个细胞，出现腹泻综合症的感染剂量是每克 1 0 5 - 1 0 7 个细胞或芽孢o 。蜡样芽孢杆菌感染可导致两种不同类型的食物中毒：腹泻型和呕 吐型。腹泻型的潜伏期一般为8 - 1 6 小时，其典型症状是水样腹泻、腹部痉挛和疼痛，通常 会持续1 2 2 4 h 啪1 。两种肠毒素复合物钔1 和单个毒蛋白【让1 与腹泻型食物中毒有关；呕吐型 食物中毒是由c e r e u l i d e 毒素引起的o “刖。呕吐型食物中毒出现的主要症状是恶心、呕吐， 偶尔会腹泻，一般食入l - 5 h 之后开始发病，2 4 h 后症状会有所减轻。蚓。用商业化的免疫学 分析方法可以检测肠毒素复合物。用蜡样芽孢杆菌肠毒素反相被动乳胶凝集检测试剂盒 ( b c e t - r p l a ) 能检测出h b l 的组分l 2 ，经可视的免疫学分析，主要能检测出分子量为4 5 k d a 的n h e 蛋白m 一“侧。与肠毒素不同的是，催吐毒素有较低的抗原性，并且用免疫化学方法 很难将其检测出来，因此，人们发明了生物法来检测催吐毒素汹4 7 1 。 蜡样芽孢杆菌的营养体细胞在小肠内产生毒素，而在食物样本中却分离出催吐毒素 n 3 3 “3 6 1 。腹泻毒素的分泌是依赖于温度的，它通常都会在指数生长期产生n 刚。催吐毒素是 在稳定期产生的1 ，据报道它的产生与h - 3 、h - 5 血清型都有关，但是与h - 1 血清型关系 最为密切h 乱盯一引。在腹泻型食物中毒综合症的特征就是h - 2 ，h - 6 ，h - 8 ，h - 9 和h - l o 血清型 【4 9 】 1 1 3 蜡样芽孢杆菌引起的非胃肠型感染 蜡样芽孢杆菌是一种能引起食物中毒的普通微生物，但是它也能致使某些特殊人群出 现全身性感染或局部性感染，这些特殊人群主要包括免疫妥协性病人、初生婴儿、吸毒者、 有伤口的人等唧畸羽。导致非胃肠型感染的蜡样芽孢杆菌能够合成坏死性毒素，如溶血素和 磷脂酶娜矾孔矧。蜡样芽孢卞下菌合成的皮肤坏死性血管渗透因子h b l 可引起手术后的刀口或 是伤口感染和发热跚侧。通常局部性感染是比较温和的，但有时候也会出现深度感染引起 坏死甚至化脓。蜡样芽孢杆菌会引起眼部疾病：角膜炎、眼内炎、全眼球炎等。1 9 9 3 年 d r o b n i e w s k i 指出2 0 世纪共发生3 5 例由蜡样芽孢杆菌引起的眼部疾病瞄刳。有人认为h b l 是引起眼内炎的主要毒性网子，能导致视网膜脱落和坏死甚至永久性失明伤瓦硎。但是m c 第一章前言 c a l l e g a ne ta 1 研究表明，那些能产生h b l 的菌株所导致的眼内炎与那些未产生h b l 的 菌株所导致的眼内炎相比，其炎症反应并没有加剧嘲1 。 蜡样芽孢杆菌引起的全身性感染并不常见。大多数情况下会血症对人体是无害的，但 是偶尔也会引起严重感染。 1 1 4 蜡样芽孢杆菌产生的毒性因子 1 1 4 1 毒素 蜡样芽孢杆菌之所以能够致病最主要原因就是它能合成毒素。研究发现有许多种蛋白 质都参与了腹泻型食物中毒的感染过程。在一次食物中毒中，t h o m p s o ne ta 1 发现屋 c e r e u sb - 4 a c 可产生复合蛋白体，由分子量为3 8 ，3 9 5 ，和4 3k d a 的蛋白组成，是其发 挥毒性作用所必需的汹1 。此肠毒素复合物与h b l 具有相同的特性“0 1 。h b l 是一个三元复合 物，由b ( 3 5 k d a ) 、l i 和l 2 组成( 3 6 和4 5k d a ) 呻1 。此外，有人认为另外一种三元肠毒 素复合物与腹泻型食物中毒综合症有关，它是非溶血性的由三种蛋白组成( 3 9 ，4 5 ， 1 0 5 k d a ) ，与h b l 毒素很相似1 。也有报道说单体蛋白能引起毒素反应。s h i n a g a w ae t a l 发现一种分子量为4 5 k d a 的非溶血性蛋白，它具有典型毒素的生物学特性。g r a n u m 和 n i s s e n 从肠毒素复合物中分离出三种蛋白，分子量分别为3 4 ，4 0 ，4 8 k d a ，并阐明了这三 种蛋白在生物学特性方面的差异刳。分子量为4 0 k d a 的蛋白的细胞毒性最大，而分子量为 4 8 k d a 的蛋白则没有影响。分子量为3 4 k d a 的蛋白是溶血性的，仅有一点细胞毒性，等同 于神经磷脂酶m 。6 3 1 。a g a t ae ta 1 发现了b c e t 基因编码的单体蛋白，此蛋白的分子量为 4 1 k d a ，对细胞的培养有毒害作用 i s o 然而，在7 株蜡样芽孢杆菌中仅有两株菌检测到了 b c e t 基因，并且不能确定这个蛋白是否在感染中发挥作用阳1 。o m b u ie ta 1 解决了这个 问题，他发现毒素的合成与蜡样芽孢杆菌是否存在b c e t 基因之间并没有任何的联系嘀1 。 通常认为h b l 和n h e 这两个复合肠毒素是导致腹泻型食物中毒的主要因素洲。 催吐毒素可引起人体呕吐型食物中毒综合症。h u g h e se ta 1 认为蜡样芽孢杆菌细胞 的培养基过滤液可诱导h e p - 2 细胞形成液泡，并合成催吐毒素嘲1 。经电子显微镜研究证实， 液泡是一个彭胀的线粒体，液泡的彭胀应该与线粒体的氧化磷酸化有关呻钉。线粒体的结构 已经很清楚，但是它的作用后来才得到证实n l 侣嘏1 。将催吐毒素分离纯化后对其进行结构 分析，发现它是环状的d o d e c a d e p s i p e p t i d e ，将其命名为c e r e u l i d e 帆7 0 1 。c e r e u l i d e 毒 素在1 2 1 下仍然具有活 ，l j ，耐受p h 范围为p h 2 一p h l l ，经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后稳 定性也很好口。我们假定c e r e u li d e 不是遗传产物，但是在生长培养基中却能够合成口习。 第一章前言 c e r e u l i d e 的功能是通过5 一h t 3 受体来刺激迷走神经的传入。还有研究表明，c e r e u l i d e 能够抑制肝脏线粒体的脂肪酸氧化作用，会导致肝功能衰竭口。a n d e r s s o ne ta 1 发明了 一种检测蜡样芽孢杆菌催吐毒素的生物学方法m 1 。催吐毒素c e r e u l i d e 作为一种通道式的 离子载体，能够抑制氧化磷酸化作用而使线粒体膨胀，进而致使公猪的精子失去活性m 1 。 后来m i k k o l ae ta 1 研究发现c e r e u li d e 是k + 型离子载体呻1 。 溶血素能引起溶血，还与蜡样芽孢杆菌引起的感染有关嘞_ 引。c e r e o l y s i n 是不耐热的、 硫烃激活的溶血素，与链球菌溶血素o 很相似汹1 。它受假定的膜受体胆固醇的抑制汹1 。不 耐热的溶血素和溶血素l i 不受胆固醇的抑制，研究表明它们与在蜡样芽孢杆菌引起的鼠呕 吐型食物中毒中分离的鼠致死毒素相似仃羽。最近溶血素基因h l y - i i i 的序列也测出来了，它 能编码溶血素i i i 口3 1 。溶血素i i i 可在红细胞之间形成跨膜的孔而导致红细胞溶解口钔。神经磷 脂酶是一个分子量为3 4 k d a 的溶血蛋白，与红细胞的磷脂相结合砸酬。g r a n u m 和n i s s e n 认为神经磷脂酶是蜡样芽孢杆菌肠毒素复合物的一部分。 人们都将磷脂酶c 视为许多致病菌的毒性因子。它能诱导人的中性粒细胞的脱粒作用， 进而导致组织损伤m 矧。蜡样芽孢杆菌可产生三种不同类型的磷脂酶c ，他们的结构不同。 磷脂酰环己六醇水解酶、卵磷脂水解酶和溶血性神经磷脂酶m 1 。磷脂酰环己六醇水解酶可 水解磷脂酰环己六醇及其糖基化衍生物口剐，卵磷脂水解酶可水解磷脂酶、磷脂酰乙醇胺和 磷脂酰丝氨酸，神经磷脂酶则能水解鞘磷脂。蚓。研究表明蜡样芽孢杆菌的广谱性磷脂酶c 可诱导人体上皮细胞合成基质金属蛋白酶( m m p ) ，尤其是蛐v i p - 9 的合成( 9 2 k d a 的明胶酶) 。也就是说，基质金属蛋白酶通过破坏感染组织的上皮细胞，加剧上皮下的基质的降解 作用，来影响患者的治愈进程。 1 1 4 2b 一内酰胺酶及其他酶类 随着深入的研究发现，b 一内酰胺酶是b 一内酰胺类抗生素抗药性的主要原因。据证实 蜡样芽孢杆菌菌株共有三种形式的b 一内酰胺酶。b 一内酰胺酶i 属于a 类b 一内酰胺酶， 是胞外青霉素酶，在活性位点上有一个丝氨酸盯引。b 一内酰胺酶属于b 类b 一内酰胺酶， 必须与二价z n ( i i ) 和c o ( i i ) 离子结合才能得到活化m 1 。蜡样芽孢杆菌5 6 9 分泌的b 一内酰 胺酶i i i 属于a 类膜结合性脂蛋白 s o o 从感染体身上分离出来的蜡样芽孢杆菌菌株往往对b 一内酰胺类抗生素甚至第三代先锋霉素组抗菌素都会产生抗药性，但是对氯霉素、氯林可 霉素、万古霉素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素和链霉素却很敏感啪。l 引瑚j k 刎。 源于口腔的展c e r e u s s o c6 7 经分离纯化后得到胶原酶，它能分解溶解性胶原和非溶 解性胶原、a z o c o l l 、明胶和血管舒缓激肽m 引。有人从牙周组织分离出两株蜡样芽孢杆菌 第一章前言 s o c6 7 和p l y1 9 ，研究发现在龈沟液中，这两株菌在厌氧条件下分泌的胶原酶的活性比 在好氧条件下分泌的胶原酶的活性更强。尽管在胶原分解过程中牙周组织感染或牙周炎 患者自身分泌的蛋白酶似乎发挥着主导作用，但是牙斑菌合成的溶胶原蛋白酶可能会影响 牙龈底膜的破坏口射。在蜡样芽孢杆菌引起的非胃肠型感染中蛋白酶也发挥着一定的作用。 从一株致毒的蜡样芽孢杆菌菌株中分离纯化出一种中性蛋白酶，据证实它能水解血红蛋 白、白蛋白和酪蛋白阳1 。从蜡样芽孢杆菌细胞质膜中已经分离出了膜结合型酪蛋白酶和胰 岛素裂解型膜蛋白酶，而从休眠体芽孢中分离出了半胱氨酸依赖型丝氨酸蛋白酶。 1 1 5s 蛋白对附着、吞噬作用和辐射敏感陛的影响 附着对于细菌保持或发挥其毒力来说是必不可少的。细菌的表面特性、结构和分子在 粘附过程中起着非常重要的作用。芽孢的疏水性越强其吸附疏水性表面的能力就越强。与 蜡样芽孢杆菌营养体细胞相比，芽孢无论是对疏水性表面还是对亲水性表面都有更强的附 着力。蜡样芽孢杆菌芽孢具有很高的疏水性，再加上芽孢表面上的附着物，这些都有助 于增强芽孢对小肠上皮细胞的吸附能力，增强他们的毒性“3 1 。如果在腹泻型食物中毒综合 症患者体内形芽孢并且合成肠毒素，这会引起更严重的症状。 研究证明细胞表层晶体蛋白( s - 层) 是使细胞表面呈疏水性的决定性因素阱1 。 k o t i r a n t ae ta 1 研究了盈c e r e u s0 h 5 9 9 和o h 6 0 0 两株临床菌株，他认为这两株菌的早 期细胞的表层晶体是斜三角形的聆1 ，这个时期的菌体细胞是亲水性的，而且与没有s 一层的 标准菌株& c e r e u sa t c c1 4 5 7 9 t 和a t c c4 3 4 2 相比，它们对i 型胶原、层粘连蛋白、 纤连蛋白和纤维蛋白原有更强的附着力。s 一层受损会增强细胞的疏水性，一旦与基质蛋白 结合其疏水性就会显著地减弱m 。 吞噬作用是宿主抵抗感染的最重要的防卫机制。当有调理性抗体和补体蛋白存在的情 况下，吞噬作用是最有效的方式：而在没有调理性蛋白存在的情况下，细菌可以被多核型 白细胞摄取。当菌体中没有调理素时，细胞表面疏水性的增强与其敏感性和吞噬作用的增 强有关脚咖1 ，k o t i r a n t ae ta 1 从口腔中分离出一株具有s 一层的菌株，研究发现在没有 调理素存在的情况下，该菌株能迅速被多核型白细胞( p m n s ) 吞噬。剥落s 层后发现，即 使细胞的疏水性有所增强，但是会失去吞噬活性。结果表明蜡样芽孢杆菌的s 层或者那些 粘附在s 层上的小分子，不仅能调节菌体与某些宿主的基质蛋白的结合，还能参与菌体细 胞与吞噬性多核型白细胞的结合憎】。 为了保存食物，预防食源性疾病的发生，食品工业中一般用卜1 0 k g y 的辐射剂量来处 第一章前言 理食品。微生物对y 一射线的敏感性取决于环境因素、菌体本身固有的特性及菌体之间的 相互作用啪1 。众所周知，芽孢对辐射有较强的耐受性。最近研究发现，蜡样芽孢杆菌的s 层可增强菌体对y 一射线的耐受性d 2 o 有s 层的蜡样芽孢杆菌对辐射的耐受性要比没有s 层的蜡样芽孢杆菌的耐受性高三倍。 1 1 6 食源性致病菌的相关检测方法 1 1 6 1 微生物专用酶快速反应系统的检测技术 根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应 的底物和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化， 确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。 1 1 6 2 利用肠毒素的快速检测方法 1 1 6 2 1 免疫学方法 检测蜡样芽泡杆菌肠毒素的免疫学方法主要有乳胶凝集试验( i m m u n o - l a t e x a g g l u t i n a t i o ni n h i b i t o r yt e s t ) 、免疫扩散法、反向间接凝血试验( r p h a ) 、反向被动乳 胶凝集试验( r e v e r s e dp a s s i v el a t e xa g g l u t i n a t i o n ，r p l a ) 、放射免疫法( r i a ) 、免疫 荧光技术( 用荧光素标记的抗体检测抗原或抗体的免疫学标记技术，又称荧光抗体技术) 、 酶联免疫测试技术( e l i s a ) 及免疫印迹法( i m m u u n o b l o t t i n g ) 。 1 1 6 2 2 基因探针技术 自1 9 7 5 年s o u t h e m 首次提出了d n a 探针杂交技术以来，d n a 探针技术在许多方面都已 获得了改进和发展。基因探针技术检测微生物的依据是核酸杂交，其工作原理是2 条碱基 互补的d n a 链在适当的条件下可以按碱基配对原则，形成杂交d n a 分子。已知每个生物的 各种性质和特征都是由其所含的遗传基因所决定，因此，从理论上讲，任何一个决定生物 体特定生物学特征的d n a 序列都应该是独特的。通过将微生物的特征基因的一条d n a 链进 行标记，即可制成d n a 探针。戴亚斌等用基因芯片技术成功的检测出蜡样芽抱杆菌等细菌。 1 1 6 2 3 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np c r ) 技术 常用方法有p c r 、限制性片段长度多念性p c r ( p c r r f l p ) 、多重p c r 、等位基因特异 性扩增、随机引物扩增d n a 多态性分析( r a p d ) 分型技术等；荧光标记的高通量( h i g h t h o u g h p u t ) 基因型检测则同益普及，如寡核苷酸连接分析、杂合子直接测序等；而高密度 芯片阵列分析和质谱分析( m a s ss p e c t r o m e t r y ) 是基因型检测的最新技术。新的基因突变 或多念性可通过构像突变筛查和杂合子的直接高通量来测序。c h a n gy h 等。”和v e s am 等 o 第一章前言 蚴分别报导了用p c r 方法检测肠毒素。a r t u r orr 等p ”用r e p e t i t i v ee x t r a g e n i c p a l i n d r o m i cs e q u e n c e b a s e dp c r 方法对蜡样芽孢杆菌进行了型的分离。 1 1 6 2 4 气相色谱和高效液相色谱的分析的应用 主要是依据不同病原体的化学组成或所产生的代谢产物各异，利用上述色谱检查可直 接分析各种体液中的细菌代谢产物、细菌中的脂肪酸、蛋白、氨基酸、多肽、多糖等，以 确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测，其中以气相色谱应用较多。 尽管该法具有简单、快速、可靠，在数小时内即可得出结果的特点，但由于使用的仪器设 备相对比较昂贵，所以不适应现场的快速检测，特别是食品加工过程中的h a c c p 中的关键 控制点的检测；另外其特异性也不明显。 1 1 6 2 5 生物传感技术 生物传感科学是一门新兴的交叉学科，它主要是由生物工程和各种技术学科的相互渗 透发展起来的。生物传感器的原理是将待测定底物在特定的酶或细胞存在下转化为产物， 产物与底物浓度成正比，可用电化学准确测定。生物传感器由于将生物活性物质专一识别 功能产生的很强特异性和生物反应讯号放大导致的高度敏感性结合在一起，因此具有分析 速度快、廉价、检样微量、生物功能膜可反复多次使用等特点，可用于许多物质的检测。 1 1 6 2 6 分光光度法系统 光度法，用二价离子耦合质粒再提取耦合质粒消解测定金属离子间接测定的方法，此 还未完全成熟，基本上在5 - 8 h 完成。 1 1 7 食品中蜡样芽孢杆菌检测方法研究现状 目前国内外对于蜡样芽抱杆菌的检测方法主要采用常规的检测方法，另外还有一些快 速的检测方法，如p c r 等。 1 1 7 1 常规的检测方法 传统检测方法是将分离培养后的可疑菌落做生化反应试验，溶血试验，协同溶血试验， 动物试验，典型运动等鉴定，被确定为蜡样芽孢杆菌后进一步进行血清分型。目前我国常 用的蜡样芽孢杆菌的检验方法主要是国标法( g b4 7 8 9 1 4 - 2 0 0 3 ) 。蜡样芽孢杆菌的常规检 验检验程序：样品一增菌一分离培养( 并作菌数测定) 一分离纯化一革兰染色镜检生化及 菌落观察生化反应试验肠毒素检查。这种方法费时、费力，而且需要较长时间进行选择 性增菌过程国裳。目前常用的选择性培养基主要有p e m b a 、m y p ，显色培养基主要是b c m 。 他们的主要组成成分见表1 - 1 。 1 0 第一章前言 表卜ip e m b mm y p 和b c m 三种培养基的主要组成成分比较 1 17 t 1 蜡样芽孢杆菌选择琼脂( p e m b a ) p e m b a ( p o l y m i x i np y r u v a t ee g gy o l km a n n i t o tb r o m o t h y m o lb l u ea g a r ) 和m y p ( m a n n i t o l e g gy o l k p o l y m y x i na g a r ) 己经是国际标准化组织( i s o ) 公认的检验蜡样 芽他杆菌的选择性培养基。蜡样芽孢杆菌在p e m b a 上的菌落里孔雀蓝，周围有沉淀环( 见 图卜4 ) 。蜡样芽孢丰t 菌选择琼脂p e m b a ( p o l y m j x i np y r u v a t ee g gy o l km a n n i t o l b r o m o t h y m o lb l u ea g a r ) e 要用于临床样本。 爹戳1 【t l 番，t3 蚓 隧岁 图卜4 蜡样芽孢杆菌在p e m b a 上的生长情7 兕 第一章前言 1 1 7 1 2 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基( m y p ) 甘露醇卵黄多粘菌素培养基( 吖p ) 广泛用于蜡样芽孢杆菌的分离和计数。h a r l m o n 等利 用蜡样芽孢杆菌在选择培养基上( m y p ) 能水解卵磷脂( 卵黄反应) 的特性来分离可疑的 蜡样芽孢杆菌。蜡样芽孢十t 菌在m y p 上的菌落是干燥的、平坦的、半透明或透明的，呈粉 红色( 表明不发酵甘露醇) ，菌落周田绕有晕圈( 表示菌株有卵磷脂酶产生，可分解卵磷 脂) 。但是菌落周围的带之自j 往往倾向于结合在一起，导致很难进行菌落计数。这也是该 培养基的一个主要的缺点。在w p 培养基上生长的其他卵黄阳性反应菌株还有：苏云金芽 孢丰t 菌( bt h u r i n g i e n s i s ) 、炭疽杆菌( b a n l h r a c i s ) 、簟状芽孢杆菌( 丑m y c o i d e s ) 和侧孢 短芽孢杆菌( 丑l a t e r o s p o r u s ) ( g o e p f e r te ta l ，r h o d e h a m e la n dh a r m o n m l ) 。然后根 据其形态学观察、理化试验等来进一步鉴定出蜡样芽孢杆菌。 l _ 1 7 13 显色培养基( b c m ) “1 b c m 是一种新的选择性培养基，其中包括蜡样芽孢杆菌苏云盒芽孢杆菌中的磷脂酰肌 醇特异的磷脂酶c 的发色底物5 一溴一4 一氯一3 一羟基吲哚肌醇一1 一磷酸。该底物能与磷脂 酰肌醇特异的磷脂酶c 特异性结台而发生颜色反应，从而将二者分离出来。 将b c m 与m y p 进行比较( 见图卜5 ) 。b c m 培养基3 5 ( 2 培养2 4 h 后，只有蜡样芽孢杆菌 和苏云余芽孢杆菌形成大的( 2 - 7 m m ) 、绿松石色的平坦的苗落有时产生绿松石色的晕圈， 而其他的芽孢丰t 菌则形成白色的卜2 m m 的菌落或是受到抑制。某些李斯特菌在b c m 培养基 中形成小于i m m 的、白色的或绿松石色的菌落。两个培养基中对于蜡样芽孢杆菌的发现并 没有显著的差别。但是在b c h 培养基中菌落计数和分离更容易因为有较高的选择性、能 形成离散的不连在一起的蔺落。 图l 一5 不同稀释度的蜡样芽孢丰菌t 儿一1 4 在b c m