（发酵工程专业论文）引起麦汁混浊的微生物的筛选与鉴定.pdf

关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目： 互i 起麦泣湿浊的邀生物笪箍选皇鉴定 本学位论文作者完全了解大连工业大学有关保留、使用学位论文的规 定，大连工业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 是) ，保密期至2 0 1 0 年3 月15 日为止。 学生签名弹墨重导师签趔 m 年多月1 1 - 日 、 ， 摘要 摘要 大麦在形成、收获和储藏的过程中，往往会遭受微生物的侵染，这些微生物包括细 菌、真菌、酵母菌等。虽然细菌和酵母菌都存在，但对麦芽质量影响最严重的是真菌。 生产中发现使用被微生物污染的麦芽品质低劣，并且用此类麦芽生产得到的麦汁，易产 生混浊。 针对麦芽生产中存在的问题，本论文从澳大利亚h o r d e u ms p g a i r d n e r 大麦中分离微 生物。经过针对性的筛选，筛出一株对麦汁浊度危害严重的微生物。经过小型制麦研究 发现，被该菌污染的麦芽制成的麦汁，浊度增加，过滤时间延长，色度增加。形态学以 及2 6 s 区序列分析表明，该菌属于曲霉，与黄曲霉( a b 3 6 3 7 4 5 1 ) 的大亚基部分序列之间 存在1 0 0 的同源性。 通过将黄曲霉( a b 3 6 3 7 4 5 1 ) 添加于小型制麦中发现，被黄曲霉污染的大麦在制麦过 程中麦芽酶活力受到抑制，利用协定法制成麦汁并进行常规分析，微生物对麦汁糖化时 间、过滤时间、粘度、浸出率、糖化力、总氮、可溶性氮、库值、q - a n 、争葡均有一定 程度的影响，但是都在国标范围内。但是浊度、色度、煮沸色度、总酸、p h 均有较大 程度的影响。 本文研究了生长过程中所分泌的蛋白对麦汁浊度的影响。通过s e p h a d e xg 2 5 和 d e a e 5 2 对黄曲霉( a b 3 6 3 7 4 5 1 ) 所分泌的蛋白进行分离纯化，找出能显著影响麦汁浊度 的蛋白，结果显示当此蛋白浓度为0 2m g m l 时，可使麦汁浊度升高3 1 9 ；s d s p a g e 电泳结果显示其为单亚基蛋白，相对分子质量为8 0k d a 。 关键词：大麦，黄曲霉，麦汁，浊度 a b s t r a c t a b s t r a c t t h eb a r l e yw a se a s i l yi n f e c t e db yt h em i c r o o r g a n i s mi nt h ep r o c e s so fg r o w t h ，h a r v e s t i n g a n ds t o r a g e ，s u c ho r g a n i s m sc o v e r e dav a r i e t yo fs p e c i e si n c l u d i n gt h eb a c t e r i a , f i l a m e n t o u s f u n g ia n dy e a s t s 1 1 1 ed o r m a n tm i c r o o r g a n i s mp o p u l a t i o np r e s e n ti nb a r l e yw o u l db ea c t i v a t e d i ns t e e p i n ga n dg e r m i n a t i o np r o c e s s t h ef a v o r a b l ec o n d i t i o n ss u i t a b l ef o rm a l t i n ga l s oe n a b l e t h ec o n t a m i n a t e dm i c r o o r g a n i s mt or a p i d l ym u l t i p l yt h e m s e l v e sa n dm a ye v e n t u a l l yl e a dt oa s e r i o u sd e v a s t a t i o nt ot h em a l tq u a l i t y , s u c ha sw o r tt u r b i d i t y t h i sp a p e ra i m e dt oi n v e s t i g a t et h em i c r o b i a lf a c t o r sw h i c ha f f e c t e dt h ee b cc o n g r e s s w o r tt u r b i d i t y af u n g a ls t r a i nw a ss c r e e n e df r o mt h ea u s t r a l i ab a r l e yg a i r d n e r , w h i c hw a s c o n s i d e r e da st h em o s ti n f l u e n t i a lm i c r o o r g a n i s mc o n t r i b u t i n gt ot h ee n h a n c e dw o r tt u r b i d i t y a n dp r o l o n g e df i l t r a t i o nt i m e b a s e do nt h em o r p h o l o g yd e t e c t i o na n ds e q u e n c ea n a l y s i so f 2 6 sr 【) n ad o m a i ng e n e ，t h es e q u e n c es h o w e dc o m p l e t eh o m o g e n e i t yw i t ht h el a r g er r n a s u b u n i to ft h ec o n t r o l l e ds t r a i na s p e r g i l l u sf l a v u sa b 3 6 3 7 4 5 1a n dt h es t r a i nw a si d e n t i f i e d a sa s p e r g i l l u sf l a v u s ar e m a r k a b l yt u r b i d i t y - i n d u c e dp r o t e i ns e c r e t e df r o ma s p e r g i l l u s f l a v u sw a si s o l a t e da n d p u r i f i e d w i t h s e p h a d e xg 2 5 a n dd e a e - c e l l u l o s ed e 5 2 c h r o m a t o g r a p h i cm e t h o d n e8 0k d as u b u n i tp r o t e i nd e t e r m i n e db ys d s p a g ea n a l y s i s c o u l dl e a dt oa3 9 2 i n c r c a s eo ft h ee b cc o n g r e s sw o r tt u r b i d i t ya tac o n c e n t r a t i o no f0 2 m g l ，c o m p a r e dw i t ht h a to ft h ec o n t r o lw o r tw i t h o u ta d d i t i o no ft h ep u r i f i e df u n g a lp r o t e i n k e yw o r d s ： b a rie y ，a s p e r g i i ，u sf l a v u s ，1 1 1 8it ，w o r tt u r bidit y 目录 目录 第一章文献综述l 1 1 大麦微生物l 1 1 1 田间大麦表面微生物l 1 1 2 贮存大麦表面微生物l 1 1 3 大麦表面微生物在制麦过程中的变化2 1 2 微生物制麦的研究进展3 1 2 1 微生物麦芽概念的提出阶段”3 1 2 2 作为大麦发芽过程中的微生物控制剂阶段”3 1 2 3 利用微生物酶体系帮助麦芽溶解阶段3 1 3 微生物对生产的影响”4 1 3 1 大麦表面微生物对麦芽的影响”4 i 3 2 大麦表面微生物对发酵的影响”5 1 3 3 大麦表面微生物对成品啤酒的影响5 1 3 4 大麦表面微生物对麦汁浊度的影响”6 1 3 5 大麦表面微生物对食品安全性的影响”7 第二章材料与方法8 2 1 实验材料8 2 1 1 大麦8 2 1 2 仪器8 2 2 微生物分离与筛选9 2 2 1 培养基的配制9 2 2 2 微生物的分离及培养9 2 2 3 微生物的纯培养及鉴定“1 0 2 3 微生物制麦1o 2 3 1 菌液的制备l o 2 3 2 制麦工艺l l i i 目录 2 4 制麦过程中酶活力的测定1l 2 4 1 样品酶液的提取1 1 2 4 2a 淀粉酶活力的测定l l 2 4 3 b 淀粉酶活力的测定1 2 2 4 4 小葡糖苷酶活力的测定1 3 2 4 5 纤维素酶活力的测定l3 2 4 6 木聚糖酶活力的测定1 4 2 4 7 果胶酶活力的测定1 4 2 4 8 蛋白酶活力的测定15 2 5 大麦萌发过程中各组分含量测定方法1 6 2 5 1 含水率的测定l6 2 5 2 可溶性糖含量测定l6 2 5 3 争葡聚糖含量的测定l7 2 5 4 戊聚糖含量测定，l7 2 5 5 蛋白含量测l7 2 6 麦汁指标测定l8 2 6 1 协定法糖化麦汁l8 2 6 2 糖化时间的测定1 9 2 6 3 过滤速度的测定1 9 2 6 4 p h 值的测定”1 9 2 6 5 总酸的测定“1 9 2 6 6 色度的测定2 0 2 6 7 浊度的测定”2 0 2 6 8a o a n 的测定2 l 2 6 9 总氮的测定2 2 2 7 蛋白质的分离纯化2 3 2 7 1 黄曲霉分泌蛋白的提取2 3 2 7 2 凝胶层析2 3 2 7 3 离子交换层析2 5 2 7 4 电泳”2 5 第三章结果与讨论2 8 目录 3 1 大麦表面微生物的分离2 8 3 1 1 细菌的分离结果”2 8 3 1 2 放线菌的分离结果。2 8 3 1 3 霉菌的分离结果2 9 3 1 4 大麦带菌率及分离频率检验3 0 3 1 5 小结”3 0 3 2 有害微生物的筛选3 0 3 2 1 霉菌对麦汁过滤时间的影响”3 0 3 2 2 霉菌对麦汁色度的影响”3 l 3 2 3 霉菌对麦汁浊度的影响3 2 3 2 4 小结“3 3 3 3 有害微生物的鉴定3 3 3 3 1 形态学鉴定3 3 3 3 22 6 s 区域鉴定“3 4 3 3 3 小结“3 5 3 4 黄曲霉对制麦的影响3 5 3 4 1 黄曲霉对制麦吸水性的影响3 5 3 4 2 黄曲霉对酶活的影响3 6 3 4 3 黄曲霉对大麦萌发过程中各组分的影响”4 3 3 4 4 小结”4 6 3 5 黄曲霉对麦汁的影响4 7 3 6 黄曲霉分泌蛋白对浊度的影响”4 8 3 6 1 黄曲霉不同成分对麦汁浊度的影响4 8 3 6 2 黄曲霉分泌蛋白的葡聚糖凝胶层析4 9 3 6 3 黄曲霉分泌蛋白的离子交换层析5 0 3 6 4 黄曲霉分泌蛋白电泳图谱分析5 l 3 6 5 小结”5 2 结论5 3 参考文献”5 5 硕士期间参与的科研项目及成果6 0 致谢”“”6 l v 第一章文献综述 1 1 大麦微生物 第一章文献综述 大麦总是携带着大量的微生物( 嗜温的、嗜热的和耐热的) ，如细菌、丝状真菌( 霉菌) 和酵母【l 卅。有时也会存在放线菌、黏滑霉菌、病毒、线虫类，甚至是原生动物不同 种类的微生物对水分的需求也不同，最适生长条件在1 0 - - 4 5 ，有一些甚至可以在低于 o 生长这些微生物混合在谷物表面，松散在灰尘中，黏在或生长在果皮、皮壳中或 在大麦层之间，1g 制麦大麦( 接近2 5 粒谷物) 可能产生成百上千个丝状真菌、成千上万 个酵母和几百万个细菌。 1 1 1田间大麦表面微生物 田问大麦上存在的微生物系统大多是来源于空气和土壤中，包括细菌、野生酵母、 丝状真菌等。 微生物种类的多样性大多取决于生长区域、抗病性和气候【5 1 ，其中，气候对其的影 响最为重要。田间大麦微生物的种类主要是细菌、酵母菌和丝状真菌。细菌的数量占绝 大多数，丝状真菌和野生酵母分别占总数的l 和0 1 l 纠l 。其中细菌主要包括：欧文氏 菌、黄单胞菌、微球菌和芽胞杆菌属的某些属，放线菌比较少见。酵母菌主要是掷拟酵 母和红酵母占优势。丝状真菌是以活菌丝或孢子的形式存在于谷粒的外层，谷粒上最常 见的真菌是交链孢霉和芽枝霉。其他的腐生真菌如稻紫附球霉和暗金黄担子菌也很常 见。另外，田间大麦微生物的种类也受大麦产地的影响，如对于收割前大麦上的霉菌的 优势种群，在欧洲为芽枝霉，在美国则为交链孢霉。 1 1 2贮存大麦表面微生物 微生物通常存在于谷物的壳或者果皮外面，侵入胚乳内部也时有发生【引。贮存大麦 微生物的种类主要是真菌，其主要来源。一是在田间感染。把未经表面杀菌的大麦直接 置于琼脂培养基上，发现有曲霉和青霉长出l 二是在收获过程中被联合收割机扬起的 第一章文献综述 土壤和作物的秸杆以及叶上的真菌孢子所污染。收割后，这些大麦上污染的真菌进行繁 殖。因为大麦在进入贮藏时就已经被各种微生物污染，所以大麦的贮存条件，基本上就 决定了这些微生物能否在大麦上进一步生长。 在大麦的贮存条件中，大麦的含水量是很重要的。但其他一些相关因素，包括谷皮 的温度、通风情况、大麦中夹杂的谷物、野草种子以及寄生虫、螨类等都对大麦贮存微 生物的繁殖有一定的影响。 1 1 3大麦表面微生物在制麦过程中的变化 微生物的生长除了发生在田间和贮藏时，也发生在制麦和麦芽贮藏期间【n 1 4 】。因为 制麦因素( 温度、湿度和通风) 也影响了大麦微生物群的生长。在浸麦和发芽期间，真菌 尤其是镰孢菌( 霉) 属大量生长f i 孓嘲，但是在焙焦时大部分都会死亡。大麦总的微生物量 相对不会变化，只是种类不同1 1 7 1 。 大麦浸水时激活了休眠的微生物：霉菌孢子发芽、菌丝体生长，酵母和细菌繁殖。 实验室中的制麦研究发现，在浸麦过程中细菌数量增长了5 3 6 倍，酵母数量在病害大 麦中增长了1 1 倍，在正常大麦中增长了5 倍i 协一9 1 。在商业化制麦中，d o u g l a s 发现： 当在第一次浸水结束进行断水时，谷粒上细菌数量比第一次浸水时增加了化5 倍，而 到发芽床箱中增加了3 5 - 4 5 倍。在第一次浸水时，大麦上的细菌包括：浅金黄杆菌、伊 朗棍状菌、密执安棍状菌、酉旨香黄杆菌、蛾微杆菌、草生欧文氏菌、荧光假单胞菌和 恶臭假单胞菌等种类，范围要少于干大麦。在第二次浸水结束，微生物范围增加，特别 是格兰氏阳性杆菌占有优势。乳杆菌发生实质性的变化，增加了将近4 0 倍，增加比例 要比活细菌总数要大的多。 浸麦时虽然激活了休眠霉菌，但也洗去了表面污染物，例如担子菌、枝孢霉菌、毛 霉菌和青霉菌等霉菌。部分污染菌沉积到其它麦粒上。在微型制麦中，h a i k a r a 等报道 了麦粒上镰孢霉菌从1 5 增加到9 0 ，然而f a l l s t a d 和c h r i s t e r s e n 早先注意到浸麦时 受枝孢霉菌污染的麦粒从4 7 下降到3 。当然，增长的原因部分因为霉菌菌丝体在一 个麦粒长到另一个麦粒上。d o u g l a s 观测到，在某些商业制麦中，第一次浸水结束时， 麦粒上污染镰孢霉菌和活菌体总数都可能会增加，表明浸麦时微生物的萌发。 研究表明某些真菌能抗热，它们会继续在麦芽上生长1 2 0 1 ( 如曲霉、分支孢子菌属、 青霉菌) ，还有一些甚至可以在焙燥前期温度下迅速的重新繁殖( 如根霉菌属、毛霉菌属) 。 焙燥时对麦芽的细菌数量有显著的影响。f a u s t a d 和c l u i s t e n s e n 发现绿麦芽中细菌很多， 2 i 第一章文献综述 减少到大约是浸麦前大麦上的6 3 ，到原来的8 倍左右。h a i k a r a 等记录到下降9 5 ， 尽管是还没有浸麦的大麦的2 0 倍。酵母数没有减少，仍然维持在原来大麦的1 0 0 倍左 右。对比最后的记录，f a l l s t a d 发现酵母下降到原来大麦的6 2 7 倍。 麦芽一旦烘干，贮藏麦芽的水分含量会对微生物的存活有决定性的作用。水分在 “时，一个1 8 个月的周期中微生物的数量几乎没有变化。而当水分达到1 4 时，真 菌如曲霉会激进地生长。水分高于2 0 时，青霉菌成为主角。贮存温度和二氧化碳水平 一样很重要。真菌的最适生长温度为2 5 3 5 1 2 ，而多于1 0 的二氧化碳会抑制真菌的生 长【2 l l 。 1 2 微生物制麦的研究进展 1 2 1微生物麦芽概念的提出阶段 早在1 9 5 9 年d i x o n l 2 2 l 就提出了在制麦过程中添加乳酸菌进行酸化的工艺。最早出现 的乳酸麦芽是用来增加糖化醪的缓冲作用及降低麦醪的p h 值而产生的。对使用残留碱 度高的碱性酿造用水，该方法效果更为显著。但是乳酸麦芽所含的乳酸并非由麦芽的内 容物质转变而来，而是将麦芽外部产生的乳酸以吸附状态存在其中。该阶段的特点是微 生物生长过程和大麦发芽过程处于分割状态。 1 2 2作为大麦发芽过程中的微生物控制剂阶段 在该阶段，乳酸菌的生长过程中能够分泌某些抗生素多肽类物质，抑制其它微生物 的生长，进而起到作为微生物控制剂的效果。此外，该阶段微生物的使用种类也走向了 多样化。1 9 8 1 年p e k h t e r e v a 等1 2 3 j 研究了在浸麦过程中添加假单孢菌( p e s u d o m o r n s ) 对提 高麦芽发芽力的影响。1 9 8 8 年b o l 等【2 4 】报道了产葡聚糖酶的菌株用于制麦能够提高绿 麦芽的酶活性。1 9 9 3 年h a i k a r a 2 习，1 9 9 4 年h a i k a r a 和m a t t i l a - s a n d h o l m l 2 6 1 、1 9 9 5 年h a i k a r a 和l a e t i l a t 2 7 1 、1 9 9 7 年l t i i a l 2 8 i 都对利用乳酸菌作为制麦过程中的微生物控制剂做出了 研究报道。 1 2 3利用微生物酶体系帮助麦芽溶解阶段 19 9 5 年a h a i k a r a 和a l a i t i l a t 2 7 1 筛选到了一株乳酸菌，既能用作微生物控制剂，又 3 第一章文献综述 能改善麦芽胚乳细胞壁的溶解性。而在此之前所研究的微生物是不能改善麦芽胚乳细胞 壁溶解性能的，甚至可能起到反面的作用。此后，微生物的选择开始渐渐由作为微生物 控制剂的观点转为利用其产酶作用。 从微生物产酶的角度出发，近年有人分别研究了曲霉、地霉、毛霉、根霉的制麦效 果，研究结果证明根霉的效果较好。 1 3 微生物对生产的影响 1 3 1大麦表面微生物对麦芽的影响 浸麦过程中，贮存大麦上的休眠微生物开始被激活，结果导致污染微生物数量成倍 增长，致使制麦过程中的麦芽溶解受到很大影响，并对蛋白分解产物、淀粉分解产物的 种类和数量造成差异。大麦中存在真菌，脂肪经这类微生物作用可变成甲基烷基酮等酮 类物质，开成酸败味。霉菌导致蛋白质质量发生变化，出现蛋白溶解度降低，纯蛋白质 的含量减少，而氨态氮增加等现象。这些菌在生长代谢过程中，代谢的产物如酸等，也 会影响麦芽溶解四l 。 如果大麦上微生物含量过高，将会促使种子休眠，发芽力下降，制麦损失增加。淀 粉更容易被降解。淀粉的降解是因为微生物分泌的水解酶【3 1 ( 包括洳淀粉酶和蛋白酶 等) 。 有些例子中，浸麦呼吸和制麦损失都增加，根的生长减少，但是异常的情况下它也 会增加。一些分离物会导致麦芽中可溶性氮含量的增加，氮的溶解指数增加，甲醛氮含 量也增加。存在微生物的大麦在发芽期间淀粉要更容易被分解掉。这种分解的增多是因 为额外的微生物产生了淀粉水解酶和蛋白水解酶等。特殊的例子中，浸出物、糖化力和 小淀粉酶水平都增加。一些麦芽具有不寻常的或令人讨厌的气味或风味( 糖蜜味、燃烧过 的味、不干净味、酒味、粗糙味、香料味、苦味、水果味、涩味等) ，有时颗粒也会脱 色。 麦芽品质好坏直接影响麦汁品质。微生物会产生一系列有机酸物质和酶、小分子肽 等代谢产物，影响正常的大麦发芽过程。同时，微生物的代谢产物还会增加麦汁的色度， 影响麦芽中蛋白质的组成。研究中发现，若存在微生物，麦汁中b 葡聚糖浓度降低，可 溶性糖浓度增加。通过测定一些其它可溶性营养物质和游离氨基的浓度，发现由于在发 芽过程中微生物的生长使淀粉改性增加争葡聚糖浓度的降低导致了麦汁黏度降低但 4 第一章文献综述 是会使啤酒泡沫丰富。 1 3 2大麦表面微生物对发酵的影响 大麦微生物引起的麦芽品质的低劣与反常的发酵相关。包括以下几点d z j ： 1 微生物释放的物质包括可溶性的营养物质和游离氨基已被证实能够增加发酵过 程中的度数。 2 发酵的速度减慢，导致发酵不彻底，使酵母不能发酵而悬浮。 3 在发酵完成之前酵母就形成絮状沉淀。 酵母提前絮凝( p r e m a t u r ey e a s tf l o c c u l a t i o n ，p y f ) 是酵母在发酵完全之前出现的絮 凝，会造成酵母细胞数的大幅下降，这些都会影响啤酒质量。酵母提前絮凝( p y f ) 是啤 酒酿造过程中经常出现的问题p 引。 研究发现 3 4 1 ，p y f 因子源自大麦，这些因子表现为一种高分子量的多糖，其平均分 子量为4 0k d a ，主要由酸性阿拉伯糖和木糖组成，还有一些氮类物质。后者对于p y f 的活性相当重要。a x c e l 等提出这些由基本的多肽组成的氮类组分，在制麦过程中由污 染真菌产生。植物组织，例如大麦种子，受到微生物污染会引发很多不同的抵御反应， 包括产生抗菌因子，这是植物为保护自身避免更多侵害的免疫体系。微生物自身也产生 抗菌因子，这是源于在一个不同种类微生物混合的群体中进行竞争的机理。这些抗菌因 子引发啤酒酵母提前絮凝。 1 3 3大麦表面微生物对成品啤酒的影响 大麦和麦芽表面微生物对啤酒质量的影响最常见的情况是降低了啤酒的气体稳定 性，即引起啤酒的喷涌。关于啤酒喷涌的原因，目前发现主要是由于大麦和麦芽受到微 生物的污染而引起的【3 研究者们发现许多种污染微生物都能引起啤酒的喷涌：禾赤 色镰孢霉、稻恶苗霉、燕麦细镰孢霉、禾杆镰孢霉、交链孢霉、球黑孢霉、葡柄霉、灰 绿曲霉、黄青霉、特异青霉、根霉、阿姆斯特丹曲霉、烟色曲霉等。这些污染微生物之 所以引起啤酒的喷涌，主要在于它们代谢产生喷涌诱导物含肽的物质。 另外，污染微生物还能影响啤酒的胶体稳定性1 3 引。某些微生物如镰孢霉、黑曲霉、 少根根霉等能增加啤酒中的氮，这几种和赤曲霉以及赭曲霉能降低啤酒的胶体稳定性， 而交链孢霉、青霉和地霉则能提高啤酒的胶体稳定性 霉菌对啤酒质量的影响主要表现在对啤酒风味的影响上黑曲霉、赭曲霉、芽枝霉、 5 第一章文献综述 葡萄白腐菌、镰孢霉和少根根霉能使啤酒产生各种强烈的异味，如焦糖味、口味不干净、 口味粗糙、有果香味等。 同时，霉菌的存在还影响啤酒的色度。被黑曲霉、头囊菌、根霉，特别是被少根根 霉和镰孢霉污染的大麦酿制的啤酒颜色较深。另外，烟色曲霉、半根霉、燕麦细镰孢霉 和禾杆镰孢霉的存在都能加深啤酒的色度。 1 3 4大麦表面微生物对麦汁浊度的影响 啤酒浑浊可以定义为不溶性或半溶性的小颗粒物质( q 岬) 在啤酒中形成的胶体性悬 浮【3 9 1 这些颗粒散射透射的光线使啤酒的透明度降低。啤酒中颗粒物质来源于酒中的微 粒、蛋白质、蛋白质多酚复合物、淀粉及其降解产物、争葡聚糖及脂类物质等1 4 4 l 。啤 酒是一种稳定性不强的胶体溶液，在保存过程中，易产生混浊沉淀现象。啤酒由清亮变 混浊，说明啤酒胶体和稳定性受到破坏。影响啤酒浑浊形成的主要因素包括：多酚浓度、 形成浑浊的亲水蛋白浓度、氧含量、热、微粒物质、碳水化合物、金属离子( c u 、f e ) 及 光照等1 4 引。啤酒混浊一般分为两大类：即生物性混浊和非生物性混浊。 生物性混浊是由微生物污染所致，有时熟啤酒因杀菌不彻底，杀菌温度和时间不够， 会使啤酒中的酵母在温度适度的条件下发酵而引起啤酒混浊，可由镜检决定。 下面主要谈一谈非生物性混浊，也就是所谓的蛋白质混浊。蛋白质混浊分为两种情 况，即可逆性和不可逆性。 l 可逆性混浊：如果啤酒在外界温度处于0 条件下保存，或在运输过程中受到强 风刺激，可能会引起混浊，当啤酒出现混浊后，首先过滤，滤出物用1 0 n a o h 溶液溶 解，如果沉淀物消失，说明是蛋白质混浊。如果确定是蛋白质混浊，首先就把啤酒加热 到2 0 - 4 0 ，能恢复到原来的清亮透明状态的，再在0 下冷却，又出现混浊现象， 这就是通常所说的“冷混浊”，它是一种受温度影响的可逆性混浊。 2 不可逆性混浊：如果啤酒出现混浊后，通过加热不能恢复到原状态的，叫不可逆 性混浊。即通常所说的氧化混浊或永久性混浊。主要是由于啤酒中的多酚物质经过氧化 和聚合作用，达到一定程度，形成永久性混浊物而析出。 浊度高的麦汁中含有大量的高分子氮等物质，如果酵母处于高浊度的麦汁中进行发 酵，极易导致菌种退化，并且在升压后酵母数会明显减少，双乙酰还原减慢，酒龄延长， 对啤酒酿造产生极坏的影响l 删 6 第一章文献综述 1 3 5大麦表面微生物对食品安全性的影响 被微生物侵染的大麦，将造成大量碳水化合物转化成一些菌体毒素【47 。5 2 j ，如脱氧雪 腐镰刀菌烯醇，赭曲霉毒素，t - 2 毒素，玉米赤霉烯酮，伏马菌素等【5 弘5 6 1 ，使麦芽品质 严重下降。当呕吐毒素的积累达到一定量时，对人体有高度危害性，可致呕吐、腹泻、 发烧等急性中毒症状。黄曲霉，镰孢霉有高致病性，黄曲霉有致癌作用。t - 2 毒素影响 小淀粉酶的活性。啤酒或麦芽上极少会发现痕量的真菌毒素。但是在特殊的地方，在个 别的季节中，大麦会感染能形成真菌毒素的真菌，不可能自我清除。消化真菌毒素可引 起包括死亡、破坏肝肾、诱导癌症、呕吐、腹泻、大出血、血液形成系统产生问题以及 再生问题。单一种类真菌不同的分离物中，形成真菌毒素的能力以及它们产生有毒试剂 的范围也有很大变化。 7 第二章材料与方法 一一_ 一 2 1 实验材料 第二章材料与方法 2 1 1 大麦 大麦品种：澳大利亚h o r d e u ms p g a i r d n e r 大麦 2 1 2 仪器 z p s 2 5 0h 智能恒温恒湿培养箱 u n i c 7 2 0 0 紫外分光光度计 低速离心机l d 4 2 a ( 2 8 0 0 g ) 高速冷冻离心机b 2 2m 凝胶成相系统c h e m is y s t e m 超纯水系统b a m s t e a d 2 1 0 0 p 型自动糖化器 2 10 0 p 便携式浊度仪 t a k a r at h e r m a lc y c l e rd i c et p 6 0 0p c r 仪 m u p i d 电泳仪 i m a g e m a s t e rv d s 电泳成像装置 a b ip r i s m3 7 3 0 x ld n as e q u e n c e r 测序仪 精密电子称 电热鼓风干燥箱 标准e b c 麦芽粉碎机 h h 6 数显恒温水浴锅 j e ow h i t e 微型制麦设备 8 黑龙江东拓仪器有限公司 上海尤尼柯仪器有限公司 北京医用离心机厂 美国i e c 美国u v p 公司 美国b & t 公司 德国l b 公司 美国h a c h 公司 1 i a k a r ab i on 寸c a d v a n c e b i oc o ，l t d p h a r m a c i ab i o t e c h a p p l i e db i o s y s t e m 公司 上海精密仪器四厂 大连第四仪表厂 德国制造 金坛市荣华仪器制造有限公司 澳大利亚 第二章材料与方法 2 2 微生物分离与筛选 2 2 1 培养基的配制 2 2 1 1 淀粉琼脂培养基( 高氏一号) 成分：k n 0 3lg ，n a c io 5g ，k 2 h p 0 4 0 5g ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5g ，f e s 0 4 。7 h 2 00 0 1 9 ， 可溶性淀粉2 0 9 ，琼脂2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h7 2 - - 7 4 。 制法：先用少量水把淀粉调成糊状，再取7 0 0m l 水在电炉上加热，然后边搅拌边 将淀粉糊加入，同时需要保持沸腾。然后将其它成份加入，溶解后补足水分至1 0 0 0m l ， 调节p h 。 2 2 1 2 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 成分：牛肉膏5g ，蛋白胨1 0g ，n a c l5g ，琼脂2 0g ，蒸馏水1 0 0 0m l ，p h7 0 - - 7 2 。 2 2 1 3 查式培养基 成分：蔗糖3 0g ，n a n 0 33g ，k 2 h p 0 4lg ，m g s 0 4 7 h 2 00 5g ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 1g ， k c l0 5g ，琼脂2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 自然 2 2 1 4 马丁氏培养基 成分：m g s 0 4 7 h 2 00 5g ，k 2 h p 0 4lg ，蛋白胨5g ，葡萄糖1 0g ，琼脂2 0g ，蒸馏 水1 0 0 0m l ，p h 自然。ll 培养基中加入3 3r n ll 孟加拉红水溶液。临用时，每1 0 0m l 培养基加o 3m l 链霉素。 2 2 2 微生物的分离及培养 2 2 2 1h o r d e u m s p g a i r d n e r 大麦表面微生物分离 取大麦粒l og ，放入灭菌的1 5 0m l 三角瓶中，加入2 0m l 无菌蒸馏水，充分震荡 1 - 2r a i n ，重复两次。洗涤液定容至5 0m l ，1 5 0 0r m i n 离心1 5m i n 。取离心管底层lc m 菌悬液，以平板划线分离 9 第二章材料与方法 2 2 2 2 带菌率及优势菌确定 参照a c k e r m a n n 的方法【5 7 】，将h o r d e u ms p g a i r d n e r 大麦在1 o 的n a c i o 溶液中 浸泡5r a i n 进行表面消毒，用无菌水冲洗3 次。将大麦均匀接种于9c m 的p d a 平板 上，设4 次重复，在2 5 2 8 1 2 恒温箱中暗培养5 7d 后检查，记录种子带菌率、微生物 及分离频率。 大麦带菌率= 霍淼1 。0 2 2 3 微生物的纯培养及鉴定 分离频率= 磊黼枷o 2 2 3 1 菌株形态学观察 将微生物接种于平板中央，在3 0 下倒置培养培养4 7d 观察菌落，记录菌落特征。用接种针挑起一点菌落，加到加有一滴乳酸酚苦味酸的 载玻片上，盖上盖玻片，避免产生气泡。将载玻片至于显微镜下观裂5 引，以相应特征鉴 别菌株【5 2 2 3 2 菌株2 6 s 区域鉴定 从平板培养菌落中挑起菌于裂解液中，8 5 c 变性后取lp j 为模板，使用t a k a r af u n g i i d e m i f i c a t i o np c rk i t ( c o d en o d 3 1 7 ) p c r 扩增目的片段。取5 山进行琼脂糖凝胶电泳 使用t a k a r aa g a r o s cg e ld n ap u r i f i c a t i o nk i tv e r 2 0 ( c o d en o d v 8 0 s a ) 切胶回收 目的片段，取l 止进行琼脂糖凝胶电泳。 以相应引物对p c r 回收产物进行测序将所获得的序列输入g e n b a n k ，以b l a s t 程 序对数据库中的所有序列进行比较分析硎 2 3 微生物制麦 2 3 1 菌液的制备 采用查式液体培养基，于3 0 摇床培养3d ，制成菌液。 1 0 第二章材料与方法 2 3 2 制麦工艺 菌液黜等_ 1 沉：撇淀- - - - - - , o o - 。罘盎悬液 2 3 2 1 浸麦 w 6 d 1 2 w 5 d 5 ，水温1 6 。 2 3 2 2 发芽 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 2 ，1 2 0h 。回风比：3 0 3 0 - 3 0 5 0 5 0 。 2 3 2 3 干燥 4 5 3h 1h - 5 5 3h 1h 6 5 3h 1h 7 0 3h - lh - 8 3 3h 。 备注s 浸麦结束时，称大麦重量计算浸麦度：数露点率；接种菌液。 发芽2 4h ，4 8h 补水至最高绿麦水分( 绿麦水分4 5 ) 。 发芽期间每日称重并翻麦一次。 2 4 制麦过程中酶活力的测定 2 4 1 样品酶液的提取 取10 0 粒大麦( 已粉粹好的) 放入离心管中，加入2 5m l ( 含0 12m o l ln a c i ) 0 0 2m o l l p h6 8 磷酸缓冲液，4 提取3 0m i n ( 每隔5m i n 振荡一次) 然后8 0 0 0r m i n 冷冻离心， 再在沉淀中加入2 5m l 上述缓冲液，重复提取3 0m i n ，将两次提取液混合，即为酶液。 2 4 2g t 淀粉酶活力的测定 2 4 2 1 试剂 d n s ：3 ，5 一二硝基水杨酸2 5g 溶于5 0m l 2m o l l 的n a o h 中，再加入7 5 2g 酒石 酸钠和1 0 0m l 水，微热溶解定容至2 5 0m l ，棕色瓶保存 第二章材料与方法 磷酸缓冲液。 2g 淀粉溶于1 0 0m l p h6 0 磷酸缓冲液中。 液：称取干燥恒重的葡萄糖1 0 0m g 溶解后定容至1 0 0m l 。 2 4 2 2 制作标准曲线 1 0m l 比色管7 个，分别加入0 1 葡萄糖标准液0 、0 2 、0 4 、0 6 、0 8 、1 2 、1 6m l ， 然后加蒸馏水使各管达到2 0m l ，再各加入d n s1 0m l ，沸水浴5m i n ，用冷水冷却， 稀释定容至1 0m l ，5 4 0n l n 测o d 值【6 3 删 2 4 2 3 样品的测定 取酶液3m l ，加入p h6 0 磷酸缓冲液6m l 7 0 保温1 5m i n ，钝化争淀粉酶活力。 1 5m i n 后取0 5m l 酶液，加入2m l2 淀粉溶液恒温水浴6 0 酶反应1 0m i n ，加入 d n slm l ，沸水浴5m i n ，用冷水冷却，稀释定容至1 0m l ，于5 4 0r i m 测o d 值。 参比：用煮沸失活的酶液0 5m l ，其余同上。 空白：取蒸馏水o 5m l 代替酶液，其余同上。 酶活力单位定义：在6 0 和p h6 0 条件下，每lm i n 水解淀粉生成l 嵋葡萄糖的 酶量为一个甜淀粉酶活力单位。 2 4 3 p - 淀粉酶活力的测定 2 4 3 1 试剂 p h3 6 醋酸缓冲液。 2 淀粉：上述缓冲液配置。 2 4 3 2 测定方法 取酶液3m l ，加入p h3 6 醋酸缓冲液6m l ，0 2 0m i n ，钝化小淀粉酶活力。2 0 r a i n 后取0 5m l 酶液，加入2 淀粉2m l 恒温水浴4 0 保温反应1 0m i n ，加入d n slm l ， 沸水浴5m i n ，用冷水冷却，稀释定容至1 0m l ，5 4 0 啪测o d 值6 5 i 。 参比：用煮沸失活的酶液0 5m l ，其余同上。 空白：取蒸馏水0 5m l 代替酶液，其余同上 酶活力单位定义。在4 0 和p h3 6 条件下，lm i n 水解淀粉生成l 腭葡萄糖的酶 1 2 第二章材料与方法 量为一个p 淀粉酶活力单位( u ) 。 2 4 4 洳葡糖苷酶活力的测定