（材料学专业论文）促进神经再生的复合胶原蛋白及其中空纺丝成形研究.pdf

东华大学硕t ：五：j f 究生学位论文 促进神经再生的复合胶原蛋白及其中空纺丝成形研究 摘要 人工神经导管是利用新型生物材料用工程技术制备的一种生物相容性良 好、可降解吸收的三维支架。胶原材料对神经细胞有一定的促进作用，降解产 物对神经生长无副作用，是神经导管的合适材料。但加工可纺性能差，难以纺 丝成形，且降解周期与神经再生期不相符合。因此本课题以探索可纺性复合胶 原及其中空纺丝成形为目的，以促进长间隙缺损神经修复。 研究了i 型胶原蛋白不同的制备工艺参数如p h 值、温度、离子强度等对胶 原蛋白可纺性的影响；通过改进胶原的制备方法，改善了固含量、粘度等性能， 使得所获得的胶原具有可纺性，本实验所采取的酶促化法所制得的i 型胶原的固 含量达到了2 8 左右；在保持胶原蛋白生物活性的温度范围( 1 5 , - - - , 3 7 ) ，= 2 4 内，其粘度的范围可控制在3 - - - 1 2 1 ，a s ；且经过对所制得的胶原蛋白进行鉴定， 其各种氨基酸，羟脯氨酸含量均满足i 型胶原蛋白的要求，化学结构也与i 型胶 原蛋白相似，所以可知：所制备的为i 型胶原蛋白溶液。 研制了胶原壳聚糖复合膜，探讨制膜工艺及对其性能的影响，采取适当的 交联处理，使其吸水性、孔隙率、机械性能、降解周期等性能能更好的满足神 经生长的需要。经实验可知，当胶原膜未交联时，其吸液性一般可以达到2 0 0 左右，而通过戊二醛交联后，其吸液性大约在6 5 左右，有了很大程度的降低。 在相同的条件下，不同的交联的处理工艺中，经0 2 5 时的戊二醛的酸溶液 ( p i i = 3 ) 处理后作为神经修复材料的较好，其孔隙率可以达到1 9 6 ，抗张强度 可达到2 0 0 k p a 。胶原壳聚糖复合膜的生理盐水耐受力随着交联剂的浓度的增 大、壳聚糖的加入量增加而提高。体外降解实验表明，交联处理过的胶原膜的 降解速度远远低于未处理的胶原膜；而各种交联法处理的胶原膜，又以戊二醛 处理的胶原膜降解速率最低，热交联次之，紫外交联法的胶原膜最快。细胞增 殖实验表明，复合胶原膜对细胞没有毒性，在促进细胞吸附，生长、增殖方面 东芦人学坝一j j 研冗生学位论文 比其他材料优越。 在复合胶原膜的研究的基础上，对复合胶原的中空纺丝的可纺性进行了初步 的探索，根据复合胶原的各种工艺参数，自制了胶原蛋白中空纤维纺丝机；并着 重讨论了纺丝速度、填充液压力、致孔剂含量等纺丝工艺参数与胶原中空纤维膜 性能及结构的关系。实验表明：在松弛时间和流体在喷丝孔中切变速率一定的前 提下，应适当增加喷丝孔的长径比( r = 8 0 , - - , 1 6 0 ) ，且保持喷丝头的长度在l o c m 以上；在纺制神经导管用的中空纤维时，纺丝压力选择为0 8 1 5 m p a ；随着填 充液压力的增大，神经导管用中空纤维的内径扩大，两者呈线性关系，结果制得 了复合胶原中空纤维导管。 通过对中空纺丝成型工艺的摸索，找到最优的制备神经导管的成型工艺条件 及方法，能够一步法连续制备可促进神经再生的胶原中空纤维导管，从而最大化 的简化成型工艺、降低成本。本研究为研制具神经再生促进功能的中空胶原蛋白 人工神经导管奠定了基础。 关键词：胶原，壳聚糖，生物材料，可纺性，神经导管 东华人学硕l j 研究生学位论文 p r e p a r a t i o n a n d w e t s p i n n i n g o f c o l l a g e nc o m p o s i t e s h o l l o w f i b e rm e m b r a n ef o rn e r v er e g e n e r a t i o n a b s t r a c t n e r v ec o n d u i t si sm a d eo fc o m p a t i b l e b i o d e g r a d a b l em a t e r i a l s i ti sac a v i t y f o rn e r v er e g e n e r a t i o n c o l l a g e nc a ni n d u c en e r v er e g e n e r a t i o n ，a n dt h ed e g r a d a b l e m a t e r i a l sh a v en oe f f e c to nn e r y e c o l l a g e ni s n ts p i n n a b i l i t ya n dd e g r a d a b l et i m e d o n tm e e tw i t ht h en e r v er e g e n e r a t i o nt i m e i nt h i sp a p e r , c o l l a g e nt y p e1w a s p r e p a r e da n dp u r i f i e df r o mb o v i n e ac o m p o s i t ec o ll a g e nm e m b r a n ea n dh o l l o w f i b e r s u i t a b l et ot h en e r v er e g e n e r a t i o nw a ss u c c e s s f u l l ym a d ef r o mt h i sc o l l a g e n f i r s t l y , t h ep r e p a r a t i o np a r a m e t e r sa f f e c t i n gt h ev i s c o s i t yo fc o l l a g e nh a s b e e nd i s c u s s e d ，s u c ha sp hv a lu e ，t i m e ，t e m p e r a t u r e ，a n di o nc o n c e n t r a t i o n i m p r o v i n gt h em e t h o d sf o rm a n u f a c t u r i n gt h ec o l l a g e n ，w ec a na c q u i r e dc o ll a g e n w h i c hc o n c e n t r a t i o ni s2 8 t h ev i s c o s i t yi s3 - 1 2 p a sw h e nt h et = 1 5 3 7 ，p t t = 2 - 4 t h es t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e so fc o l l a g e nm e e tw i t hc o l l a g e nt y p ei s e c o n d l y , t h es t r u c t u r e sa n dp r o p e r t i e so fc o l l a g e n - c h i t o s a nc o m p o s i t e m e m b r a n ew e r ei n v e s t i g a t e d a b s o r p t i o na n dh o l er a t es h o wt h a tt h ec o m p o s i t ec a n i n d u c en e r v er e g e n e r a t i o na f t e rc r o s s l i n k i n g t h ea b s o r p t i o nr a t eo fn o c r o s s l i n k i n g c o l l a g e nc o m p o s i t e sm e m b r a n ei s2 0 0 ，w h i l et h ec r o s s l i n k i n gm e m b r a n ei s 6 5 t h er a t eo fh o l ei s19 6 a n dt h et e n s i l es t r e n g t hi s2 0 0 k p aw h i l et h em e m b r a n ei s c r o s s l i n k e db yt h ec o n c e n t r a t i o n so fg l u t a r a l d e h y d ew e r e0 2 5 t h er e s u l t so f p h y s i o l o g i c a l s a l i n es o l u t i o ni m m e r s i o ns h o w e dt h a t i ti sb e t t e rw h i l et h e 东华人学硕i j 研究生学位论文 c o n g c e n g t r a t i o no fc h i t o s a na n dg l u t a r a l d e h y d e i n c r e a s e d t h er e s u l t so fi n - v i t r o d e g r a d a t i o ne x p e r i m e n ts h o w e d t h a tt h ed e g r a d a t i o nr a t eo ft h ec r o s s l i n k i n go f g l u t a r a l d e h y d ec o l l a g e nc o m p o s i t em e m b r a n ew a ss m a l l e rt h a nt h eh e a t 。c r o s s l i n k i n g c o l l a g e nm e m b r a n ea n du v - c r o s s l i n k i n gm e m b r a n e t h er e s u l to fc e l lp r o l i f e r a t i o n e x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h ec o l l a g e nc o m p o s i t em e m b r a n eh a d n oc y t o t o x i c i t yf o rc e l l a d h e s i o na n dp r o l i f e r a t i o n t h er e s u l ts h o w e dt h a tm o s to fc e i l sw e r ea d h e r e dt ot h e s u r l h c e t h ec e l lm o r p h o l o g yw a sn o r m a l a st i m ep a s s e d ，t h en u m b e ro fc e l l sw a s i n c r e a s e d t h i r d l y ，i nt h eb a s eo ft h ec o n c l u s i o no fc o l l a g e nc o m p o s i t e sm e m b r a n e ，w e s t u d i e dt h es p i n n a b i l i t yo ft h ec o l l a g e nc o m p o s i t e s w em a d et h eh o l l o w - t i b e r m a c h i n ef o rs p i n n i n gc o l l a g e n w e t - s p i n n i n go fc o l l a g e nh o l l o w - f i b e rm e m b r a n ef o r i m p r o v e m e n to fn e r v er e g e n e r a t i o nh a sb e e ns t u d i e d t h ee f f e c to fs p i n n i n gs p e e d ， f l o wr a t eo ff i l l i n g l i q u i d ，p e r c e n to fh o l e f o r m i n gr e a g e n to nt h ec h a r a c t e ra n d p h y s i c so ff i b e rh a sa l s ob e e ns t u d i e d i no r d e rt of a b r i c a t e dt h ec o l l a g e nh o l l o w - f i b e r t h eg o o dp a r a m e t e ro ft e c h n i c sw e r el d = 8 0 - 1 6 0 ( l 1 0 ) ，t h ep r e s s u r eo fs p i n n i n gi s 0 8 1 5 m p a t h eh o l l o w - f i b e rd i a m e t e ri n c r e a s e sw i t ht h ep r e s s u r eo ff l o wr a t eo f f i l l i n g - l i q u i d ，i n c r e a s i n g t h er e s u l t so fp h y s i o l o g i c a ls a l i n es o l u t i o ni m m e r s i o n ，t e n s i l es t r e n g t h ， s e ma n dw v t rs h o w e dt h a tt h ec o l l a g e nc o m p o s i t ea c c o r d e dw i t ht h ed e m a n d so f n e r v ec o n d u i t s t h i s p r o v i d e s t h ef i r s t s t e p t of a b r i c a t ec o l l a g e nh o l l o w f i b e r m e m b r a n ef o ri m p r o v e m e n to fn e r v er e g e n e r a t i o nb yw e t s p i n n i n gm e t h o d k e y w o r d s ：c o l l a g e n ，c h i t o s a n ，b i o m a t e r i a l s ，s p i n n a b il i t y , n e r v ec o n d u i t i v 附件一： 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重卢明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所里交的学位论文，是本人在导师的 指导下，独立进行研究j 二作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对 所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：辞童年 日期： ) 以多年二月矸e t 东华人学硕l ：研究生学位论文 第一章前言 1 1 引言 各种外伤如压迫、牵伸、撕裂、切断，以及其他因素如局部缺血、肿瘤 等将会造成神经系统的部分或全部损伤，从而导致功能丧失和其它神经性疾 病。目前神经导管修复周围神经缺损存在如下的难题：中枢不能修复；外周 虽然可以修复，但长度有限，因个体的不同而有所区别，一般修复的长度为 l o m m 左右；感觉功能、传导功能等功能恢复不完整，从而周围神经 ( p e r i p h e r a ln e r v e ) 损伤的修复成为了近年来研究热点之一。 对于周围神经损伤的成功修复，以往应用筋膜、去钙的骨导管、间皮 管、塑料管、甚至金属材料管等n 1 修复周围神经缺损，此方法修复神经缺损 效果不令人满意，主要表现如下，生物学性能稳定，有一定的机械强度，但 有很大的感染危险，管内易于产生纤维结缔组织，压迫神经，同时由于其不 可吸收，需再次手术取出等缺点。目前应用自体、异体神经移植修复周围神 经缺损，但均有以下难以解决的问题，如：异体排斥，自体神经来源受限， 供区功能障碍( 感觉长失、可能引起痛性神经瘤、留下伤疤) 等。 目前能否制备出类似周围神经的替代品人工神经导管h 1 ，则显示了 其突出的社会和经济价值。它有两个着重点，一是研究采用具有生物相容性 和可降解特性的材料，在缺损神经的近体端和远体端通过导管搭桥，营造一 个有利于再生功能发挥的微环境，阻止周围结缔组织的长入，利用神经具有 一定的再生修复能力( 1 n m 天) 嘲，诱导神经沿导管方向再生，以促进缺损 神经的再生修复。包括对导管材料如胶原蛋白、聚乳酸、聚乙交酯丙交酯， 聚壳聚糖等的研究：对导管微结构如内置纤维方式、管壁孔径、孔隙率的研 究：对神经再生促进因子与导管材料结合方式如浸渍、填充、微包囊、化学 键合等的研究陆3 。当神经再生促进因子利用上述各种方法种植到神经导管三 维支架上，植入到周围神经损伤缺损处，三维支架在完成其支架的作用后， 完全降解被基体吸收，种植的细胞继续增生繁殖，形成新的不仅具有其原来 东华人学硕上研究生学位论文 形态，而且具有特殊功能的神经组织。王身国、顾玉东 1 、顾晓松、杨玉明、 朱康杰、劳杰、y a s u h i k os h i m i z u ，、s p e c t o rm ，i t o h s 、d a mi n ，l b 等， 在这方面都做过许多成功有益的工作，不但使修复的动物缺损神经长度有较 大的提高，而且功能的恢复也很显著。另一方面着重点是利用各种神经干细 胞、转基因雪旺细胞在现有各种导管材料上进行种植培养，构筑组织工程化 人工神经导管。这方面的研究也显示了良好的应用前景。 神经导管修复周围神经缺损的经济意义见表1 1 ： 表l l 各器官和组织的年发病率 每年做手每年做手 病症术的患者病症术的患者 ( 万) ( 万) 烧伤2 1 5 褥疤 1 5 0关节置换5 5 8 2 皮 静脉功能不全溃疡 5 0 故移植物 2 7 5 糖尿病溃疡 6 0 骨 肤 脊髓和神经 2 0 内部固定 4 8 神经肌肉紊乱 4 面重建 3 膑骨表面在光滑2 1 6胰( 糖尿病) 7 2 8 软骨软化膑骨 1 0 3 4肠 1 0 半月板修复 2 5肾 6 0 关节炎( 膝) 1 4 9 9膀胱 5 7 软 关节炎( 髋) 2 1 9 3输尿道 3 指和小关节 1 7 9尿道 5 1 9 骨 骨软骨炎 1 4疝 2 9 腱修复 3 3 乳腺 2 6 1 韧带修复 9 输血 1 8 0 0 牙齿 1 0 0 0 代谢失调 0 5 肝便化 1 7 5心脏7 5 4 肝 肝癌 2 5 血管 大小血管6 0 6 2 东华大学硕士研究生学位论文 1 2 缺损神经修复的导管桥接术 1 2 1 神经再生修复的生理过程 人工神经导管是利用新型生物材料用工程技术制备一种生物相容性良 好、可降解吸收的三维支架神经管，将神经生长因子种植到三维支架上， 植入到神经损伤处，神经导管在完成其支架作用后，将会被机体完全吸收， 使病人免受第二次手术的痛苦。通过其而生成的新的神经，不仅具有原来形 态，而且具有特殊功能的神经组织，此种技术为神经缺损带来了新的修复方 法和希望。 但从神经导管桥接术的研究现状看，目前材料提供的主要功能还仅限于 具有较好生物相容性和合适降解速度的机械桥接，远远不能满足仿生功能的 要求。在推动神经导管桥接术临床应用的过程中，非常需要研究一种新型的 神经导管仿生材料，它既具有良好的成形加工性能，又能对轴突的再生提供 引导与营养作用。 神经导管内的神经再生是一复杂的过程。1 9 7 9 年，l u n d b o r g 等m 1 利用神 经导管作为神经再生的场所，从而使研究神经再生的微环境提供了理想的途 径，从而神经导管也使人们认识到神经再生过程中的神经诱导和趋化的作 用。w i l l i a m s 等用硅胶管桥接大鼠1 0 m m 神经缺损，发现神经再生的整个过 程为：数小时内，管内充填从受损神经纤维血管中释放出来的一些液体，这 些液体中含有很高的蛋白成分，可促进神经再生；第1 周，纤维蛋白形成纵 向的支架连接神经两断端；第2 周，成纤维细胞、雪旺细胞、巨噬细胞和内 皮细胞迁移到纤维蛋白的支架上，轴突从近端神经发芽纵向沿支架生长，另 外有一些红细胞、白细胞和层粘细胞等充填在神经导管内妇1 ；4 周后，部分 轴突到达神经远端形成有髓的神经纤维。 1 2 2 修复缺损神经的神经导管的作用 采用具有生物相容性和可降解特性的材料，在缺损神经的近体端和远体 端通过导管搭桥，营造一个有利于再生功能发挥的微环境，阻止周围结缔组 织的长入，利用神经具有一定的再生修复能力( 1 r a m 天) ，诱导神经沿导管 方向再生，以促进缺损神经的再生修复。 3 东华大学硕r 上研究生学位论文 b r u n e l l i 等认为理想的神经导管应具有以下的特点：( 1 ) 导管全长有神 经再生所需要物质，能与周围组织融为一体并支持神经再生及成熟；( 2 ) 可 防止瘢痕的生成；( 3 ) 可任意制备足够的长度及内径，可提供神经再生支架 直至神经纤维形成，在再生过程中可维持它们的形状，不会塌陷。另外，神 经导管还必须满足神经再生期内提供牵引及微循环，再生结束，自行降解吸 收。除了上述几点外，其他方面也应在设计时考虑，包括：引导物质、管表 面结构特征、孔隙率、电性质、不溶性蛋白和支架的结合，可溶性物质的释 放，主要细胞的种植等。 1 3 神经导管桥接术的研究现状 目前，应用于周围神经损伤修复的神经导管材料，按来源可分为：天然材 料和人工合成材料。天然材料如胶原n 们、几丁糖、几丁质、羊膜、神经基底膜 等；人工合成材料聚氨酉戥j l 酸( p l g ) 1 2 1 3 、聚乙烯醇酸( p g a ) 、聚乳酸 聚羟基乙酸共聚体( p o l y l a c t i c c o g l y c o l i ca c i d ，p l g a ) 等。生物可吸收材料 如p l g 、p g a 、胶原、几丁糖等，生物不可吸收材料如硅胶管n 4 1 等。导管本身 又有管状和多孔两种形式其中多孔材料又分为两种：( 1 ) 定向排列的孔道，( 2 ) 交织孔洞。两种制作工艺均要求较高，孔径和孔隙率必须充分满足雪旺细胞的 爬入和代谢物质的交换。目前的研究更集中于寻求能刺激促进神经再生、修复 长段及较大神经缺损的可降解吸收的生物神经导管材料，且这一运用基因工程 技术新途径获得的智能仿生神经导管的成本可较以往开发的要低很多，从而也 为大量经济地研究开发具特定功能和安全性的组织工程骨架材料、环保功能型 纺织工程材料等开辟了新思路，具有极其显著的社会经济效益与广泛的应用前 景，对周围神经缺损的临床应用带来了新的希望，并且其的研制对临床外科医 学有巨大的推动作用，下面就目前国内外利用各种材料和方法制备神经导管作 一综述。 1 3 1 神经导管的材料 1 3 1 1 天然材料 ( 1 ) 壳聚糖( c h i t o s a n ) 历史上直接用化学方法分离得到甲壳素。是在1 8 1 1 年，法国的布拉若在 4 东华人学硕- i ：研究生学位论文 研究蘑菇时用热碱分离出了甲壳素。1 8 5 9 年法国人瑞特将甲壳素在浓氢氧化钾 溶液中煮沸后得到了改性甲壳素可溶于有机酸，即壳聚糖。目前，壳聚糖是地 球上存在数量仅次于纤维素的天然有机化合物，估计全世界每年可获得甲壳素 1 5 吨。 壳聚糖是具有强机械性能，无毒无味，无副作用，组织相容性好，壳聚糖 降解后的最终产物葡胺糖可被机体吸收，壳聚糖和胶原复合后，可以降低胶原 的降解速度，提高机械强度，弥补胶原在降解和强度方面的不足。但壳聚糖材 料也有一些不足之处，比如说：c h i t o s a n 和经过g a m m a a y 辐照过的c h i t o s a n 都没有熔点，且溶解c h i t o s a n 的乙酸溶液挥发困然，因此不易于加工。 壳聚糖是几丁质的部分或全部脱乙酰基产物，降解产物是糖单体：壳聚糖 能结合酸分子，是天然多糖中较少见的碱性多糖：研究发现，壳聚糖是一种可在 体内降解的正电荷聚合糖类，呈凝胶状，具备一定的空间构形，并有多方面的生 物学活性，它可以减少成纤维细胞的生长，减少瘢痕的形成，促进内皮细胞，毛 细血管，心肌细胞及神经轴突的生长；它广泛的应用于药物载体，人造皮肤，手 术缝合线，人造肾膜等生物医学领域。 ( 2 ) 胶原( c o l l a g e n ) 胶原的制备技术历史较长，方法多样。早在1 9 2 9 年即有以磷酸溶解动物 骨组织提取胶原的专利技术。p e i z o 等( 1 9 6 0 ) 以动物真皮组织提取胶原溶液， b l o c h 等( 1 9 6 1 ) 的专利方法实现了胶原的纯化；商业化提取胶原工艺于1 9 6 2 由u n i t e d s h o e m a c h i n a r y 公司开发成功( p c t ，9 4 1 6 5 7 0 ：b r a z p e d i d o ，8 6 0 4 3 7 1 ) 。 胶原是组成胶原纤维的蛋白质，约占哺乳动物总蛋白质的1 3 ，其在皮肤和结 缔组织中含量丰富。通常胶原由3 条多肽链构成三股螺旋结构，氨基酸的主要 组成为脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸，分子量约3 0 0 0 0 0 。目前已发现1 4 种类型的 胶原，形成所谓的胶原蛋白家族。各胶原按发现顺序分为i 型，各型 间结构差异主要由多肽链的初级结构即氨基酸顺序不同而致，其中i 型纤维状 的胶原是最主要的分子类型。 近年来随胶原提制技术的发展和对其性质、结构等方面研究的深入，促进 了胶原的应用研究。由于胶原是由3 条多肽链组成的大分子，分子之间通过共 价键搭桥交联，形成稳定的三维网状结构，水中溶解度低，有一部分未能共价 5 东华人学硕。i ：研究生学位论文 交联或者在体内未成熟的胶原可用中性盐或稀醋酸溶液提取而溶解出来，此部 分称为可溶性胶原，又称作酸溶性胶原。而大部分胶原都是以胶原纤维形式存 在，彼此又互相交叉而成网状，成为难溶性胶原。对于难溶性胶原可先用胃蛋 白酶消化水解去末端( 非螺旋型区域) 肽后再用稀醋酸溶液提取。 胶原无副作用、促进细胞粘附、增殖和保持细胞的分化、加快创口的愈合， 可降解等优点。其缺点是：降解速度受到体内胶原酶的影响，降解速度快，机 械强度差。胶原是许多组织e c m 的重要组成部分，胶原是人体和脊椎动物主要 结构蛋白，占皮肤干重的百分之七十以上。当胶原材料又有其自身的缺陷，比 如机械性能差、易降解。所以在应用胶原时，必须复合另外一种生物材料，以 改善其机械性能。 ( 3 ) 水凝胶 b e l l a m k o n d a n 5 1 等证实，神经元轴突在有三维立体结构的琼脂糖水凝胶中 再生良好，轴突再生的程度极大地依赖于水凝胶的孔径和浓度，浓度过高或孔 径太小，均抑制轴突的再生。y u 等人用琼脂糖水凝胶构建一种立体支架，然后通 过特殊工艺共价结合层黏蛋白，发现这种材料能明显促进9 d 鸡胚背根神经节细 胞( d r g ) 和p c i 2 细胞的轴突生长，与单纯的琼脂糖水凝胶材料相比，轴突长度在 第2 ，4 ，6 天分别延长了7 0 ，7 0 ，6 0 如果简单地混合层黏蛋白和琼脂糖水凝 胶，并无促进效果。提示细胞外基质蛋白( 如层黏蛋白等) 必须以某种化学建的 形式固定，才可能锚固细胞并刺激其轴突的生长。他们进一步实验，用一种微型 脂质圆筒装满神经生长因子( n g f ) 后埋入琼脂糖水凝胶中，体外证实这种释控 系统可以以生理剂量的浓度释放n g f 达7 d 之久，并能显著的促进d r g 轴突的生 长。 不仅水凝胶的浓度和孔隙率影响细胞的生长分化和轴突的再生，材料的电 荷特性也对其有影响，d i l l o n 等分别用富含阳离子的壳聚糖或富含阴离子的藻 酸盐共价结合在水凝胶上，放在背根神经节细胞培养液中培养，发现细胞在壳 聚糖水凝胶中能很好的生长，分化和再生轴突，而藻酸盐水凝胶则抑制了细胞 的生长。 k u i j p e r sajn 砌等设计了一种新的水凝胶支架，这种支架有利于神经元相 互接触，分化，以及轴突的再生，更重要的是，它可以促进神经元之间功能性突 6 东华大学硕上研究生学位论文 触的形成。其它的还有聚丙烯酸水凝胶，2 一羟丙基一甲基丙烯酸水凝胶等，但有 些材料在使用之前必须去除有毒的未聚合单体。w o e r l y 构建了一种水凝胶多聚 合重建神经组织。 ( 4 ) 羊膜1 7 3 羊膜由于含有各种神经营养因子，可降解，可塑性良好，排他反应小，也用 于神经组织工程。m o h a m m a d 等用羊膜管桥接l o m m 鼠坐骨神经缺损，2 - 4 周患肢 功能恢复比自体移植满意，1 7 周再生轴突到达神经远端，4 个月后材料完全吸收， 再生轴突数与自体移植组接近( 3 7 ，1 5 7 ：3 3 ，0 5 4 ) 。 1 3 1 2 聚合物 ( 1 )聚乳酸( p l a ) p l a 在2 0 世纪7 0 年代被美国食品与卫生管理局( f d a ) 批准用于释放载体， 是目前组织神经工程应用最广泛的一种可降解材料，具有良好的生物相容性， 可降解性，无毒副作用。 m a q u e t n 町等用p l a 构建多孔材料，发现泡沫状多孔材料( 孔隙率为8 4 ，孔 径为1 0 7 5 u m ) 比定向排列的孔道等其它各组更有利于神经节细胞的黏附生长 和轴突的再生。在桥接大鼠坐骨神经5 m m 缺损的实验中，轴突再生良好，但大部 分的再生纤维爬行于支架的外侧，可能与代谢的营养有关。材料的半渗透性允 许各种促神经生长因子进入植入物体内，同时抑制有害物质的进入。这种材料4 周后还保持一定的构型，未塌陷。 ( 2 ) 聚碳酸脂类神经导管 浙江大学的朱康杰n 钔等人公开了一种聚碳酸脂类神经导管的制备方法，其 方法和材料如下：碳酸二乙脂和二脂经催化脱醇制成环状碳酸脂单体，将其和 乙胶脂或丙胶脂进行共聚，所得的粗产物经提纯后，真空干燥制得的聚合物用 良溶剂溶解并加入添加剂，配制成1 5 一3 5 浓溶液，过滤后静置1 - 2 天除泡，注 入挤出器中，在0 1 - 0 5 m p a 的压力下挤出成形，挤出物经常温空气浴挥发 o - 5 0 c m 距离，制备成中空导管，导管经灭菌处理后干燥保存。本发明以聚碳酸脂 作为制备神经导管的材料，具有良好的生物相容性，生物可降解性和加工成型 特性。采用干一湿相转移凝固法可方便的制备神经导管。 7 东华大学硕士研究生学位论文 ( 3 ) p g a 戴传昌等将直径1 5 u m 的p g a 单丝纤维拉丝制成纵向平行排列的，具有立体 构形的纤维条索，由于支架材料之间还有一定的空隙，有利于细胞与外界的物 质交换，有利于再血管化。培养的雪旺细胞不仅可以黏附，生长，分裂，繁殖，还 可以沿着纤维条索粘附生长。动物实验表明，植入材料1 2 周后p g a 完全降解， 各段已看不到p g a 纤维，而且桥接段无缺血表现，无明显的瘢痕增生。 ( 4 ) 聚磷酸脂( p o l y p h o s p h a z e n e ) 聚磷酸脂也是一种可降解材料，无毒副作用l a n g o n e 等用玻璃毛细管为 模子制作材料，桥接大鼠坐骨神经8 m m 的缺损时发现，尽管开始( 1 0 d ) 神经再生 的速度慢于硅胶管组，但是4 5 d 以后这种差距就消失了。这种延迟现象被认为 是材料开始水解时干扰微环境和产生纤维基质所致。l a u r e n c i n 乜们等采用降低 水解速度控制降解过程的方法，较好的解决了这个问题。 1 3 2 神经导管的成型方法 目前，由于工程技术迅速发展和对神经再生的深入了解，使得设计复杂的 三维立体神经导管支架成为可能。在神经导管的支架上，加入细胞外基质分子、 重要的细胞、生长因子等以促进神经再生，或利用磁场、电刺激、中药等促进 神经再生。 制备神经导管的方法有浸涂法，溶液和熔融挤出法，旋涂法，编织法，模腔 法，中空纺，静电纺，无纺布卷成管法等等。 ( 1 ) 浸涂法 s o i c h i r oi t o h 等人利用浸涂法制备胶原神经导管，其步骤如下：原料为来 源于牛的皮肤i 型胶原，用水配制其体积百分数为2 ，p h 为3 0 的溶液，将硅胶 管插入此胶原溶液中，质子化，空气干燥，重复此过程5 次后，将硅胶管移出，则 就形成外径为3 m m ，内径为2 m m ，长为1 5 m m 的胶原管再将此胶原进行热交联具 体的交联的方法如下：( 1 ) 用剂量为5 0 0 u m c m 2 的u v 辐照4 0 m i n ：( 2 ) 将其加热至 1 2 1 保持恒温6 小时；( 3 ) 将胶原管浸于0 5 v 0 1 的g a 溶液中1 小时，接着将 其在室温下置于0 2v 的g l y c i n e 的溶液中1 小时，脱去蒸馏水，浸于甲醇中， 最后用空气干燥制得。 8 东华大学硕士研究生学位论文 ( 2 ) 旋涂冻干法 m s c h a p p a c h e r等人在制备 t r i m e t h y l e n e c a r b o n a t e c o - 一c a p r o l a c t o n e 型导管时利用旋涂法成型导管，具体步骤如下：制备所需的聚 合物原料后，将直径为1 1 m m 的玻璃心轴插入此聚合物中l m i n 后，慢慢将其抽 出，再放于冷的甲醇溶液中l m i n ，接着在空气中旋转此心轴l m i n ，从而使得溶剂 挥发，重复此过程6 次后，将此干燥2 4 小时，去除心轴，得所制神经导管美国的 s h u t u n gl i ，o a k l a n g ，n j 等也用旋涂法乜门制备神经导管，其具体方法如下：将 准备好的胶原等材料，将聚四氟乙烯心轴插入，利用旋涂成形后，在分别经冷冻 和冻干处理，去除心轴，再使之处于流体状态以去除溶剂，得神经导管。 ( 3 ) 纺丝编织法乜2 1 d e l l o na r n o l d l e e 等人利用纺丝编织法成型聚乳酸管，具体步骤如下： 用喂入型的筒型编织机，来编织p g a 聚合物纤维，此编织筒的针密度为每英 寸2 5 针，且整个圆筒机上的针数与管上的网眼不同，在织造完成后，管上的网眼 数大约为2 m m - 6 n f i i t l i d 所用的纱共有4 股，细度为4 6 旦2 1 的p g a 长丝，每股 丝中每英寸上都有2 3 个捻度，从而形成”z 字结构，用此种方法编制的管可 以作为制备神经导管的方法。 利用含有单一梭子的1 1 型克伦普顿织布机纺织p g a 聚合物纤维，可同时 利用其上的1 6 个轭具，此含有网眼的导管在每一边上均进行镶边的双层织造， 此经纬纱的细度为3p l y ，4 6d e n i e r 2 1 长丝，此p g a 纱每英寸含有5 个捻度， 从而形成”z 字结构，此网眼结构的导管每边每英寸上总共有1 2 0 个终结，且 每英寸上含有8 8 个孔，整个导管上的网眼有一定的韧性，经热处理，切割后，可 将其制成长为6 c m 的所需的结构，此网眼结构的导管柔性较好，且多孔，能满足 神经导管的要求。 ( 4 ) 注塑成形法 美国的h a d l o c k 和c s u n d b a c k 等人1 9 9 8 年，将雪旺细胞复合到多个管腔、 无孔聚乳酸神经束状材料的内表面上后，形成组织工程化的人工神经假体，桥 接2 0 m m 长鼠坐骨神经缺损的两端，结果发现，多孔腔提高了内腔的表面有利 于雪旺细胞沿神经束方向粘附，能有效地促进神经再生。2 0 0 0 年，应用低压注 射新技术，对p l g a ( p l a 和p g a 按8 5 ：1 5 ，相对分子质量为1 3 0 0 0 0 ) 进行加 9 东华大学硕上研究生学位论文 工，这种材料的空隙率达到9 0 ，并分别制备出l 、5 、1 6 、4 5 个定向平行管腔， 孔径为6 0 - 5 5 0um 不等。这些材料通过浸泡在l oug ml 的层黏蛋白溶液等 程序进行预处理后，雪旺细胞的粘附能力是未处理材料的5 倍，并可使神经营 养因子渗入。在7 m m 大鼠坐骨神经缺损的模型中，他们用5 管腔p l g a ( 孑l 径 5 0 0 hm ) 进行桥接，6 周后，优于自体神经移植组，其神经纤维的直径也比自体 神经移植组的粗，再生的效果要好得多。此后，2 0 0 3 年，进一步完善了低压注 射新技术，管腔设计成类似于周围神经体系机构来支撑单层粘附雪旺细胞，以 d l p l g & 为原料制造了纵向排列的多孔渗水管腔的神经导管，对比了直径为 1 3 5 m m 的单个管腔到直径为0 0 5 r a m 的1 0 0 个管腔所粘附的雪旺细胞的数量， 结果发现1 0 0 个管腔的表面积是单个管腔的1 2 5 倍，所粘附的雪旺细胞是单个 管腔的5 倍。除以上几种方法外，据报道，还可以采用中空纺丝法，静电纺，无纺布 ( 海绵状) 卷成管法【2 3 】等方法成型神经导管，单这些工艺尚需进一步探讨。 1 3 3 神经导管的物理性质 神经导管的几种物理性质主要表现在影响神经再生质量及程度，这些物理 性质主要包括管内径，管壁的孔隙率，管腔的表面结构和形态，内在的电性质， 管的吸水性，膨胀性，柔韧性及抗压性。 神经再生过程中，管内径是很重要的因素之一。动物实验表明：管内径 1 8 m m 比内径1 2 m m 和内径3 1 m m 的神经再生效果好，此表明管内径要求对神 经再生是重要，但由于动物种类、桥接神经缺损的部位不同，对于管径的要 求也不同。如内径较小，神经受压损伤；反之，太大会使得成纤维细胞进入 及重要神经营养物质的流失。 管的吸水性也是影响神经再生的因素之一，为了使得神经导管可以植入体 内，那么其必须含有一定的湿份，但是含水率过大，神经导管则会膨胀，一方 面照成对神经的压迫，另一方面影响管内外的成分交换。 孔隙率会影响可溶性因子从神经管的扩散，文献表明5 0 k d 分子半通透性 导管相比不透的神经管而言，前者促进神经再生的效果好。而如果孔径过大 ( 超过1 0 0 k d ) 的半通透性管，对神经再生同样也是不利的，其主要原因可能 是神经营养因子的流失，且孔径过大，则流入的物质中可能会含有损害神经 1 0 东华大学硕士研究生学位论文 再生的物质。因此，半通透性神经导管最好能设计成允许所期望的孔径。 除了上述的几种物理性质外，还应对神经导管的表面结构、材料的电荷性 质、信息、机械强度等都需作较详细的研究。 1 3 4 神经功能再生促进剂 神经导管中的微环境可以通过人为调节，从而形成最有利于神经再生的微 环境，微环境主要包括填充基质，以及可溶性的神经营养因子，趋化因子等。 导管腔内基质为神经再生过程中细胞的迁移的结合提供了特殊的表面，填 充基质的选择必须考虑到基质与导管材料和再生轴突的相容性。利用硅胶管的 模型，y a n n a s 等利用胶原和氨基葡萄糖聚糖凝胶，研究其在神经再生中的作用， 发现其的再生功能提高很多，发现可以使神经再生间距拓宽1 5 m m 左右n a v a r r o 等比较了生理盐水，胶原凝胶( 不同浓度) ，含层粘素蛋白凝胶( 不同浓度) 以及 透明质酸盐溶液作为神经导管腔内填充物对神经再生的影响，认为基质浓度的 选择是重要的，因为凝胶基质对神经再生同时存在物理阻碍和生理促进作用， 当浓度较大时，凝胶会阻碍细胞的迁移和轴突延伸，不利于神经再生。除了基质 成分，各种可溶性的神经营养因子，趋化因子也是目前研究的热点这些因子包 括神经生长因子( n g f ) ，脑源性神经营养因子( b d n f ) ，胰岛素生长因子( i g f 一1 a n di g f 一2 ) ，血小板源性生长因子( p d g f - b ba n dp d g f - a b ) ，碱性或酸性成纤维 细胞生长因子( b f g fa n da f g f ) ，睫状神经营养因子( c n t f ) 以及白细胞介素 一1 ( i l - 1 ) 等。然而，内源性因子的数量通常是不足以满足神经再生的需要的，因 此有必要加入外源性的再生促进因子。经实验证实这是可行并且有效的。目前 存在的主要的问题是这些神经营养趋化因子在神经导管中降解失活较快，且大 多数是以单个因子作为研究对象，各种因子的最佳组合配方尚不清楚。 1 3 5 临床应用 对于如此众多的神经导管，大都处于动物实验阶段，如牛，鼠，狗，猫以及 猴子等等。目前还没有一种能够在临床上代替自体神经移植修复周围神经缺 损。其主要原因是自体移植来源有限，局部功能丧失及二次手术等等问题。 研制能够具有自体神经移植效果的神经导管是非常急迫研究的课题。 东华大学硕士研究生学位论文 好的神经导管应具备以下的特征：( 1 ) 良好的塑形性；( 2 ) 操作简便；( 3 ) 可消毒；( 4 ) 在神经再生过程中能维持形状不塌陷，再生完成后能自行降解。 在设计神经导管时还应考虑管径大小，管壁通透性，管腔表面质等物理性质。 另外还存在的一些问题是：( 1 ) 神经再生的基础理论仍未臻完善；( 2 ) 仍 未找到制作神经导管的最佳材料；( 3 ) 仍未设计出能够促进周围神经快速有效 再生的神经导管模型。这些都需在今后的工作中逐步加以解决。 1 4 本研究的内容、目的与意义 1 4 1 研究目的 ( 1 ) 通过对各种生物材料的比较，选择最佳的制备神经导管材料，使其不仅 起到神经再生支架的作用，而且具有促进神经再生的功能。 ( 2 ) 通过对中空纺丝成型工艺的摸索，找到最优的制备神经导管的成型工艺 条件及方法，能够一步法