（环境工程专业论文）不同ph条件活性污泥亚硝酸细菌的分离、初步鉴定及氨氧化特性.pdf

摘要 亚硝酸细菌催化氨氮氧化的硝化作用是氮循环的关键步骤，也是现代污水处理 厂生物处理氨氮废水的重要环节。巍然状况下的化能冤机自养驻硝酸细菌具有生长 速率低、生物量小和对p h 、n a c i 、氨氮浓度等环境因子敏感等生理特点。其中p h 值与废水中的游离氨( f a ) 和游离亚硝酸删a ) 的浓度相关，是影响脱氮的重要因素。 本文在实验室条件下通过控制好氧污泥驯化的p h 值，使目的菌株不断增殖，逐渐成 为优势菌株，然后对驯化污淀中的贬硝酸细菌进行分离培养和研究。通过定性检测 皿硝酸的生成进行筛选，分别在各个p h 条件下分离得到了一株皿硝酸细菌。本文对 这6 株细菌进行了初步鉴定，并研究了其氨氧化特性。研究结果表明： ( 1 ) 驯化后的活性污泥在相应p h 条件下具有氨氧化能力，均有亚硝酸细菌的生 长。 ( 2 ) 根据形态及生理生化实验将分离得到6 株细菌鉴定为亚硝酸球菌属 ( n i t r o s o c o c c u s ) 。 0 ) 通过对各菌株进一步的研究，表羁在p h 为5 和6 条件下筛选出来的菌株 a o b p h 5 和a o b p h 6 对p h 有较为广泛的适应性，在p h 条件为9 和1 0 条件下筛选 密来的菌株a o b p h 9 帮a o b p h l 0 对碱性条件有较强耐受性，焉在p h 祭件力7 秘8 条件下筛选出来的菌株a o b p h 7 和a o b p h 8 则只在中性和弱碱性条件下氨氧化能力 较好。 。( 4 ) a o b p h 5 在n a c l 浓度为5 9 l 时氨氧化能力最强，并且较高氨氮浓度促进细 菌的氨氧化能力升高；a o b p h 6 的最适n a c l 浓度为2 0 9 l ，最佳氨氮初始浓度为 5 0 m g l ；a o b p h 7 在较高n a c l 浓度和n h ：- n 起始浓度下有利于细菌的氨氧化能力 的提高；a o b p h 8 其氨氧化能力随n a c l 浓度和n h ：- n 起始浓度升高而增加； a o b p h 9 在n a c l 浓度为5 9 l 对氨氧化麓力最强，并且较高氨氮浓度促进细菌的氨 氧化能力升高；a o b p h l 0 在碱性环境条件下有较为广泛的适应性最佳n a c l 浓度和 n h ：一n 起始浓度分别在10 9 l 和2 0 m g l 。 关键词：活性污泥；亚硝酸细菌；环境因子；氨氧化 乍雳 a b s 拓a c t n i t r i f i c a t i o n ，p e r f o r m e do x i d a t i o no fa m m o n i at on i t r a t eb ya m m o n i a - o x i d i z e r si sa k e yp r o c e s si nt h ec y c l i n go fn i t r o g e na n d a l li m p o t e n tc o m p o n e n to fm o d e mw a s t e w a t e r t r e a t m e n t 。a m m o n i a - o x i d i z e r sh a v em a n yu n f a v o r a b l ep h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ， n a m e l y , s l o wg r o w t h , s m a l lb i o m a s sa n ds u s c e p t i b l et oe n v i r o n m e n t a lf a c t o r s a m o n gt h e t o t a l ，p hv a l u ei sc o r r e l a t e d 诫也f aa n df n a l e v e lo fw a s t e w a t e r , t h i sm a k ei tt ob et h e i m p o r t a n tf a c t o ro fd e n i t r o g e n a t i o n w ed i r e c t l ye n r i c h e da m m o n i a - o x i d i z e r so fa c t i v a t e d s l u d g ev i ac o n t r o l l i n gp hf a c t o r so fs l u d g ea c c l i m a t i z a t i o n ，t oi n c r e a s et h eb i o m a s so f d e s t i n a t i o nb a c t e r i ag r a d u a l l yt ob et h ea s c e n d a n c ys t r a i n b yt h ep r o c e d u r e so fp r i m a r y s c r e e n i n gi nw h i c ha m m o n i u mo x i d a t i o nw a sm e a s u r e dq u a l i t a t i v e l y , s i xs t r a i n so f a m m o n i a - o x i d i z e r su n d e rt h e r ec o r r e s p o n d i n gp hc o n d i t i o n s w ei d e n t i f i e dt h e s es i x b a c t e r i aa n ds t u d i e dt h e i rc h a r a c t e ro fo x i d i z ea m m o n i a t h er e s u l t sa r es u m m a r i z e di nt h e f o l l o w i n g ： ( 1 ) t h ea c c l i m a t e da c t i v es l u d g eh a dc a p a c i t yo fo x i d i z ea m m o n i au n d e rt h e i r c o r r e s p o n d i n gp hf a c t o r s ，a n d 氇祥h a da m m o n i a - o x i d i z e r s 。 ( 2 ) t h r o u g ha n a l y z i n gp h y s i o l o g i c a lp r o p e r t i e s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es i xs t r a i n s a l li d e n t i f i e da sn i t r o s o c o c c u s ( 3 ) d u r i n gt h es t u d y ，t h ea o b p h 5a n da o b p h 6s c r e e n e df r o mt h ep h c o n d i t i o n so f 5a n d6 ，s h o w e dt h eh a dw i d ep ha d a p t a b i l i t y a n da o b p h 9a n da o b p h l0s c r e e n e df r o m t h ep hc o n d i t i o n so f9a n d10h a db e t t e rt o l e r a t i o no fa l k a l i n i t y a o b p h 7a n da o b p h 8 s c r e e n e df r o mt h ep hc o n d i t i o n so f7a n d8o n l yh a db e t t e ra m m o n i u mo x i d a t i o ni n n e u t r a l i t ya n d w e a kb a s ec o n d i t i o n 。 ( 4 ) a o b p h 5h a dt h eb e s tc a p a c i t yo fo x i d i z ea m m o n i aw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f n a c lw a s5 9 怒，a n di ti n c r e a s e d 诫搬t h er i s i n go fc o n c e n t r a t i o no fa m m o n i an i t r o g e n 。t h e b e s tc o n c e n t r a t i o no fn a c lt oa o b p h 6w a s2 0 9 l ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fa m m o n i a n i t r o g e nw a s5 0 m g l ，t h eh i g h e rc o n c e n t r a t i o no fn a c la n da m m o n i an i t r o g e nw a sb e t t e r t oa o b p h 7 t oa o b p h 8 ，t h ec a p a c i t yo fo x i d i z ea m m o n i ai n c r e a s e d 谢mt h er i s i n go f c o n c e n t r a t i o no fa m m o n i an i t r o g e n a o b p h 9h a dt h eb e s tc a p a c i t yo fo x i d i z ea m m o n i a w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fn a c l w a s5 m g l ，a n di ti n c r e a s e dw i t ht h er i s i n go f c o n c e n t r a t i o no fa m m o n i an i t r o g e n t h eb e s tc o n c e n t r a t i o no f n a c la n da m m o n i an i t r o g e n t oa o b p h i ow a slo 班a n d 2 0 m g l 。 k e yw o r d s ：a c t i v es l u d g e ，a m m o n i a - o x i d i z e r s ，e n v i r o n m e n t a lf a c t o r , a m m o n i u m o x i d a t i o n 论文独创性声明 本人郑重声磷：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作 掰取得酌残暴。尽我所知，除了文孛特剐如戳标注秘致谢熬地方外，学位论 文申不包含其链个入或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含力获得 四川农业大学或其它教育机构的学位或涯书所使用过的材料。与我固王作 的同志对本研究所做的任何贡献均已程论文中作了明确的说明并表示了谢 意。 磷究生签名：馁嘭夕绮 刖了年 月f 丑 关于论文使用授权的声明 本入究全了髂蹬川农韭大学有关僚磐、使用学控论文的规定，鳏：学校裔投保留并囱 罄家鸯关部 l 或枫构送交论文懿复印 孛和毫子教，允许论文被查阅黎借溯，霹跌罴溺影窜、 缩印或捆描等复制学段保存、汇编学位论文。同意四川农业火学可以用不同方式在不同媒体 上发袭、健播学谴论文靛全都或部分壳容。 硪究生签名： 导帮签名： 饭矽行 m 年1 月歹羁 魏脚亭年7 雳? 嚣 1 文献综述 1 1 研究背景 由于近年来含氮化合物排放量的急剧增加，氮素已成为严重的水体污染物。许 多氨氮复合物对鱼类和某些水生生物具有毒害作用，未经处理的工业和生活污水中 的氨氮可以使水体富营养化，甚至破坏整个水环境的生态平衡，从而引发一系列的 环境问题和医学问题( h o v a n e c 等，1 9 9 6 年；b u r r e u 等，1 9 9 8 年) 。因此，有关含氮 废水的脱氮处理研究己成为环境科学领域的一个重要研究内容而日益受到重视。目 前脱氮的基本方法可分为物理处理法、化学处理法和生物处理法。生物脱氮工艺因 具有处理效果好、处理成本低和操作管理方便等优点而广泛应用，成为含氮废水处 理的有效手段。 废水生物脱氮的原理主要是利用微生物的硝化反硝化作用来去除废水中氨氮对 环境的污染。其中硝化作用是由亚硝酸细菌和硝酸细菌共同完成。而亚硝酸细菌的 氨氧化作用在脱氮过程中是决定反应速率的关键阶段( 有马启等，1 9 9 0 年) ，控制着 硝化作用的整个过程( e c k e n f e l d e r 等，2 0 0 0 年) ，投加亚硝酸细菌和硝化细菌加速废 水处理系统中硝化反硝化的反应速度是提高生物脱氮效率的有效途径( 马文漪等， 1 9 9 8 年) 。氨的氧化反应实际是一个主要由硝化细菌参与的连续的生物氧化反应过 程。氨氮通过硝化反应被氧化成为亚硝酸盐，随后亚硝酸盐又被氧化成硝酸盐。 w a r i n g t o n 在1 8 7 9 年首先证实了硝化作用分两个步骤，并且证明整个反应过程是由 两种不同类型的细菌完成，随后w i n o g r a d s k y 等相继分离并命名了一些硝化细菌种 属。包括两个细菌亚群，一类是亚硝酸细菌( 又称氨氧化菌) ，将氨氧化成亚硝酸， 另一类是硝酸细菌( 又称硝化细菌) ，将亚硝酸氧化成硝酸。这两类菌能分别从以上 氧化过程中获得生长所需要的能量，但其能量利用率不高，故生长较缓慢，其平均 代时( 即细菌繁殖一代所需要的时间) 在1 0 小时以上。亚硝酸细菌，在硝化作用过 程中负责将氨氧化为亚硝酸盐，实现亚硝化作用，是硝化过程中必不可少的步骤， 同时也是其限速反应( 刘志培等，2 0 0 4 ) ，w e b s t e r 等研究表明硝化作用的耗时较长 主要是由于亚硝酸细菌生长需时较长( w e b s t e r 等，2 0 0 5 ) 。由于亚硝酸细菌为化能 无机自养菌，具有代谢率低、产能少、生长速率慢、生物量小等生理特点，使得其 分离、培养和纯化十分困难，且对环境因子的变化又极为敏感，所以它的研究进展 相对缓慢。 工业氨氮废水水质复杂，在微生物处理前往往需要对水质进行调节，加大了污 水处理的翦处理费用。颜糕铜酞善的纯化过程孛产生的压滤母液和冲洗水中氨氮含 量达到1 0 0 0 m g l ，p h 值为t - 2 ( ! e 士联等，1 9 9 9 年) ，味精生产过程中产生的废水 具有酸性强( p i - 1 2 3 ) 、高c o d 、高氨氮等特点( 王金铨，2 0 0 7 年) ，磷胺和鸟嘌呤生产 企业的氨氮废水p h 值均可达到2 左右( 曾经等，2 0 0 4 年；胡立伟等，2 0 0 0 年) ，而 在印染行业废水具有水量大、有机污染物含量嵩、色度高、碱性大( p 嚣7 l o ) 、永质 变化大等特点( 龚丽雯等，2 0 0 3 年) 。 1 2 氮素的来源及危害 县前水体中氨氮的来源主要为生活污水( 生活污水中含氮有机物受微生物作用 的分解产物) 、工业废水( 如焦化废水、化肥厂废水、洗毛厂废水、制革厂废水、造 纸厂废水、印染厂废水、食品厂废水、饲养厂废水等) 和农困排水( 郑平等，1 9 9 7 年：z u m f t ，1 9 9 7 年) 。废水中氮的存在形式以有机氮化合物和氨氮为燕，传统的活 性污泥法能将有机氮化合物转化为氨氮，却不能有效的去除氨氮( 夏淑芬等，1 9 8 8 年) ，进入水系的一部分氮主要以氨的形式，加重了自然水系的负荷。氨氮( m - i ；- n ) 以游离氨( n i - 1 3 ) 或铵盐( ：) 形式存在于水中，两者的组成比取决于水的p h 值。 当p h 值偏高时，游离氨的比例较高，反之则铵盐的比例为高。在无氧环境中，水中 存在的亚硝酸盐亦可受微生物作用还原为氨。氨氮超标排放进入自然界的严重后果 之一是导致水体的富营养化现象。 氨氮是水体中诱发富营养化的因子之一，水体富营养化在多数情况下对环境是 不利嚣，尤其是封闭水体的极度富营养纯。水体富营养纯的后果主要有：1 ) 湖泊中着 到水华或淡水赤潮，而在内海和海湾则看到宥赤潮的发生。另外在河流附着的藻类 显著增多，从焉律为观光旅游的价值也随之减少。2 ) 5 把湖泊水或水库水作为童来水 的水源来使用时，将会造成滤池堵塞、异臭等。3 ) 蛙和鳟等好品种鱼类消失，而经济 价僮低的鱼类却多起来。4 ) 繁殖的藻类曲】蓝绿藻) 的代谢产物会产生影晌鱼类、家畜 及其它生物的有害物质，从而在藻类繁殖时，水质也随之恶化。5 ) 大量的藻类或水生 植物枯死时，墨其厌氧分解，产生恶臭。6 ) 蓝绿藻等在湖底污泥蓄积起来，使湖交浅。 其次氨氮的耗氧特性也会使水体的溶解氧降低，严重时造成水体黑臭( 中国化工防 治污染技术协会，2 0 0 0 年) 。含氮凌水还会影响鱼类勰的氧传递使鱼类致死，氨氮转 2 化后所形成的亚硝酸盐及硝酸盐可诱发入巍铁鱼红蛋自症，蕊这些耍硝酸盐或硝酸 盐还有可麓转纯为一释具“三致”效瘫的强诱变裁噩磷胺，终l p p m 麴水平藏麓威胁人 类健康( 白晓慧簿，1 9 9 8 年； y erw 等，1 9 9 4 年；夏淑芬等，1 9 8 8 年) ，壤和 水体中的氨氮经微生物异莽作用转交成氨气，成为大气的污染物，土壤孛过量的氨 还能严重影响植物根的生长( 夏淑芬等，1 9 8 8 年) ，氨氮还会与氯作用生成氯胺，因 两在蠢来零涪毒时，簧增加氯消耗量，加大囊来永厂处理成本，蹭攘了水酶气味( 夏 淑芬等，1 9 8 8 年；郑平等，1 9 9 7 年_ ) 。氨氮在硝化细菌和反硝化细菌麴代谢活动过 程孛，还会转交为一氧纯氮、一氧化二氮气体( z u m f l w & ，1 9 9 7 年) 。一氧他二氮 是一种除了二氧化碳以外的具很强温室效应的气体，其1 2 0 1 3 0 年的生命周期使得其 温室效应潜力可达孚烷的1 0 - - 一1 0 0 0 倍，二氧化碳的1 0 0 - 1 0 0 0 倍( k r a m l i c h 等，1 9 9 4 年；i p c c - i n t e r g o v e m m e n t a lp a n e l0 1 1c l i m a t ec h a n g e ，19 9 6 年) 。一氧化二氮还可以 在大气平流层率与原子氧反应生成一氧纯氦，丽氧化氮是破坏臭氧屡的关键气体 之一。 在我国，由予以前对氨氮废水排放的控制不严，入们的环僳意识不强，晕致了 许多生态环境离题。i9 9 1 年我蓍共发生了赤瀚3 8 次，1 9 9 2 年增至弼次，造或鱼类 翱其它水生生物大量死亡，对海洋渔业资源造成极大破坏。如2 0 0 4 年三胃我国嬲沱 江污染事故，其主要污染物就是氨氮翻亚硝酸盐，零l 起这次沱江拳袋特大涛染事故 的主要原因是，川化集团公司第二化肥厂氨氮严重超标排放，导致沱江简阳至资中 段的水域中2 0 万公斤鱼死亡，妻接经济损失达1 6 0 余万元。 1 3 氮索的污染处蠼方法 嚣前脱氮的基本方法可分为物理处理法、化学处理法和生物处理法。生物脱氮 工艺因具有处理效果好，处理过程稳定可靠，处理成本低，操作管理方便等优点而 得到广泛应用，为水体中氮的去除提供了有效手段。自1 9 3 0 年w u h r m a n n 最先提出 以微生物细胞内物质作为脱氮还原硝酸盐供氢体的微生物生物脱氮法以来，微生物 脱氮研究进展很快，各种处理氨氮的设备帮工艺不断出现。1 9 6 0 年b r i n g m a n n 开发 了外翔碳源麴生物聪氮工艺。1 9 6 9 年b a r t h 提出了活性污泥法脱氮熬传统工艺，又 称力三级活性污泥法。8 0 年代初开发出来了将反硝化设备放置在处理系统最前匿的 兹置硝化微生物脱氮法a o 脱氮工艺。1 9 7 5 年v o e t 首次提出短程硝化。反硝化生物 脱氮( s h o r t c u tn i t r i f i c a t i o n 。d e n i t r i f i c a t i o n ) ，该工艺具有节省氧供应量、减少投碱量、 缩短反应时间、降低能耗和减少污泥生成量等优点( 袁林溅等，2 0 0 0 年) 。近年来， 人们在丰富脱氮工艺中微生物知识的基础上，不断完善传统的生物脱氮工艺，或者 开发出新型的脱氮工艺以满足人类改善皂身生存环境的各种需要，尤其是能源危机 问题促使研究人员开发出能耗低、效率高翡脱氮工艺。如荷兰d e l f t 技术大学开发的 s h a r o n 工艺( s i n g l er e a c t o r ，f o rh i g ha c t i v i t ya m m o n i ar e m o v a lo v e rn i t r i t e ) ，与 传统a o 工艺相比，s h a r o n 工艺简化了流程，缩短了水力停露时间，减小了反应 器体积和占地两积，降低了处理费用( b l i e f e r t ，1 9 9 4 ) 。 1 4 囊硝酸细菌及其氨氧化作用一 1 4 。l 亚硝酸细菌研究进展 - 。 亚硝酸细菌属革兰氏阴性专性化能鸯养细菌：以氮盐的氧化满足其能量霈求， 喜欢微偏碱性的环境，生长极为缓慢在适宜的条件下需2 4 h 左右才能完成一次分裂 髑麓，最适p r 傻戈7 。0 - - 8 5 ，最逶温度势2 4 - - 2 8 ( h o l t 等，1 9 9 4 年) ，普遍分布 。 ， 在自然界的土壤、海洋及淡水中，但只占其中细菌总量的极小比例，且不同种属的 迈硝酸缨菌所分布的环境不周( 周娟等，2 0 0 1 年) 。亚硝酸细菠对污水组成、有机物、 p h 、d o 和温度等因子都敏感( v o y t e k 等，1 9 9 5 年) ，其中有机物韵对于亚硝浚细菌 是否具有负面影响还有待进一步研究，越来越多的研究表明有机物本身对亚硝酸细 - 蒲的生长并无童接影响( c h e n 等，1 9 8 2 年) 。 f， 甄硝酸缨蘸作为化熊自养型细菌，氧化氨氮为贬硝酸盐氮是其进行岛养生长的 唯一能源。从热力学观点来看，亚硝酸缨菌利用的基质力低级能源( w r a g e 等，2 0 0 1 年；郑平等，1 9 9 9 年) 。皿硝酸细菌中不存在基质水平磷酸化，它们依靠氧化磷酸化 来贮存麓量。在2 5 c ，p h 7 的条件下n h 3 氯化为n o i 的吉毒蜥岛由能为一2 7 4 。7 k j m o l n ，即使全都转化为a t p ，也只能产生8 9 m o l a t p m o l n 。实际上与呼吸链上的电子 载体相比，n h 3 的氧化还原电健值 黠( n o ；槲；) = 3 4 0 m v 偏高，氧化磷酸化效 率很低，所能产生的a t p 非常有限( 郑平等，1 9 9 9 年) 。n h 3 氧化所释放的电子只 能传递给呼吸链上较低端的物质，因此n h 3 的氧化反应不可熊直接耦联到呼吸链上 第一个成分烟酰胺腺嘌呤二核替酸( n i c o t i n ea m i d ed i n u c l e o t i d e ，n a d ) i 觚原反应，能 4 量不得不用于使电子跃迁到这较高能级，即用于所谓的逆电子流过程中( w r a g e 等，2 0 0 1 年) 。这些因素使得亚硝酸细菌生长很缓慢，世代期为8 3 6 h ，经过7 - 1 0 天的培养菌落很微小，大多直径在1 0 0 1 1 1 左右。利用相同数量的能量，亚硝化单胞 菌所产生的细胞物质仅达异养菌的1 - 4 ，这是因为需要消耗a t p 和还原力来还原 c 0 2 ，而异养菌则是生长于完全还原的碳源中( 夏淑芬等，1 9 8 8 年) i 它们对底物相 对苛刻的要求也使它们难于培养。它们转化无机氨态氮为亚硝酸盐氮，与亚硝酸细 菌、硝酸细菌反硝化细菌等其它微生物共同作用，推动氮素循环的不断进行，是生 态圈中物质循环的重要成员之一，它们所进行的氨氧化作用构成了氮素循环的重要 环。在环境保护方面的应用在于它是生物脱氮工艺硝化段的关键微生物之一。 1 4 1 1 亚硝酸细菌分离研究概况 由于亚硝酸细菌在一般的自然土壤和污水处理系统中的含量较低，具有生长在 固体表面上的习性，在液体培养基中主要附着在固体颗粒和器壁上，粘连在一起， 在实验室对氨氧化细菌的分离通常比较困难，以致有关它们的细菌学和生物化学的 研究工作进展缓慢( 郭爱莲等，1 9 9 6 年) 。 平板培养方法是一种传统的微生物学实验方法，人们通常通过在培养基上培养 菌落和分离细菌细胞来鉴定微生物。硅胶平板培养法是对氨氧化细菌进行生长情况 观察并作为分离和鉴定的常用方法( 章家恩等，2 0 0 4 年；马万里等，2 0 0 4 年) 。胡 君利在比较了各种方法分离土壤中亚硝酸细菌( 胡君利等，2 0 0 5 年) ，结果表明使用 未经富集培养的土壤悬液直接接种到琼脂平板上，菌落颜色与形态丰富多样，包括 有细菌、放线菌、真菌等多种类别，其中部分可能为异养硝化微生物( 王。明等 2 0 0 3 年) ，即培养选择性不强：若接种到硅胶平板上，只有部分培养基上能够观察到 数量极其稀少的针尖大小菌落。经过富集培养后接种到琼脂平板和硅胶平板上，菌 落数量多，以圆形无色透明和略显黄色为主，但琼脂平板培养时间稍长就往往会出 现杂菌生长，而硅胶平板容易出现失水性干裂。硅胶平板与琼脂平板均可分离氨氧 化细菌，而且效果较好。在相同无菌室接种和恒温室培养条件下，琼脂平板所需培 养时间相对要短，但容易出现杂菌生长，影响亚硝酸细菌的分离纯化；而硅胶平板 选择性强，基本无污染，但培养时间长，且生长的茵落小而单一，影响对亚硝酸细 菌群落多样性的认识。 i 4 1 。2 亚硝酸细菌检测鉴定研究概况 1 ) m p n 计数法 。 1 9 1 5 年，m c c r a d y 首次发表了用m p n 法( m o s t - p r o b a b l e - n u m b e r ) 来估葬细麓浓 度的方法，这是种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。由于亚硝酸细菌具有代 谢效率低、产能少、生长速率慢、生物量小等生理特点，传统的计数研究方法如选 择平板计数法效率低、误差大( 许光辉等，1 9 8 6 年) 。 2 ) f i s h 检测技术 、】9 8 8 年，o i o v a n n o n i ( 1 9 8 8 年) 将原位杂交技术引入了细菌学的研究中，他首 先采用放射性标记r r n a 寡核苷酸探针显微探测细菌。随着安全性较强的荧光技术 的发展，1 9 8 9 年，d e l o n g 首先采用荧光标记的寡核苷酸探针来探测独立的微生物细 胞。此项技术即荧光原位杂交( f l u o r e s c e n ti ns i r eh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 技术，由于它安 全、方便、实用，从而在环境微生物监测中得到广泛应用。 出于皿硝酸细菌是一类生理上非常特殊的化能自养细菌，传统的研究方法要经? t 过富集、分离、分类和鉴定步骤，耗时长( 4 - - - 8 周) ，而且因为所用的培养基有选择 性，使得菜些易于培养的类群超过了其他缁菌，在培养基中处予竞争优势，因此得 到的优势类群与样品中的真实情况有差异；传统的方法对培养圈难的亚硝酸缨慧无 法进行研究，f i s h 技术的引入解决了上述困难。随着人工设计合成的亚硝酸细菌及 氨氧化菌探针的不断推出，f i s h 技术被广泛地应用于活性污泥系统、硝化流化床反 应器和膜一生物反应器等污水处理系统中( 孙寓姣等，2 0 0 4 年；左剑恶等，2 0 0 6 年) 。 3 ) p c r 检测鉴定技术 基于培养的传统方法如m p n 计数法和选择平板培养法费时、费力、计数效率低， 更为重要的是实验室培养环境常常会造成鉴定结果与实际生境中的优势菌种不相符 合的缺 辂( m o b a r r y 等，1 9 9 6 年；s a n d e n 等，2 0 0 0 年) 。采用各种类型的免疫检测法 检测各种水体和土壤环境中亚硝酸细菌( s a r a s w a t 等，1 9 9 4 年；w a r da n dp e r r y ，1 9 8 0 年；s a n d e n 等，2 0 0 0 年) ，此方法的前提条件是要获得产生抗体的纯培养菌体，不能 准确的反应环境中亚硝酸细菌的群落变化。随着分子生物学技术的飞速发展，特别 是p c r 技术的广泛疲用，利用分子方法检测和鉴定硝化细菌成为可能。弦改等 6 ( 1 9 9 5 年) 利用嵌套萼| 物两步p c r 扩增1 6 sr r n a 基陵及探针杂交法检测了分离菌 种和环境样品中p r o t e o b a c t e r i a 亚纲的辽硝酸菌。 p c r 技术建立以前免疫荧光技术是亚硝酸细菌检测的主要方法。p c r 技术是 1 9 8 5 年由美国p e 。c e t u s 公司人类遗传实验室的m u l l i s 发明的，它是一种在体外模拟 体内d n a 复制过程的核酸扩增技术( m u l l i s 等，1 9 8 6 年) 。随着p c r 技术的建立和 发展，它在距硝酸细菌的检测中的优势很快就显现出来。建立在p c r 技术和基因探 针技术基础上的研究一般是针对皿硝酸细菌的1 6 s r n a 基因。这类研究包括4 种：1 ) 先对1 6 s r n a 序列片段进行特异或半特异性的p c r 扩增，然后进行直接的或克隆辅 助的序列分析，利用这种方法己经发现了新的基嚣序列，僵这种方法费时，不适于 对环境中的大量样品进行检测：2 ) 利用直接获褥麴r r n a 或r d n a 寡核苷酸探针进 行杂交，这孝孛方法迅速，它的缺点在子探针对于稀有序列或检测目标区域之外的序 列变化不稳定；3 ) 荧光寡核苷酸探针进行全细胞杂交，它可以提供准确的空间信静 4 ) 变性梯度凝胶电泳d g g e ( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 。，这几种方法 可以单独运用，也可以结合运用。将m p n 与p c r 技术相结合，可以快速方便确菇 疆硝酸细菌进行定量研究，可大大缩短计数时间。 p c r 技术在亚硝酸细菌检测和鉴定实验中得到了广泛运用。w e b s t e r 等( 渤5 一 年) 通过p c r 技术对牧草地土壤中亚硝酸细菌1 6 s rr n a 进行扩增，分析了牧草 壤中氨氧化菌种类、功能的不同和硝化动力学之闯的联系。f r e i t a g 运用d g g e 技术 分析了沿淡水盐水梯度的沉淀物中的多蛋巍亚硝骏细菌群落结构和活性的变化，在 海水含量高的采样点的亚硝酸细菌群落中亚稍化螺菌属种量占支配地位，嚣那些淡 水含量高豹采样点则以亚硝化单胞菌属等占支配地位，在盐度适中的地方群落中广 泛分布的主要是亚硝化单胞菌属s p 。n m l 4 3 ( f r e i t a g 等，2 0 0 6 年) 。s h a h i d 和j a m e s ( 2 0 0 6 年) 在研究人工合成羊尿对牧场土壤中亚硝酸细菌群落的影响时，用d g g e 技术同时扩增了样品的d n a 和1 6 s rr n a ，比较得出的结果表明以r n a 为基础分析 比以d n a 为基础的分析具有更好可蒋生性和更好的刻度性，但是会导致少数非氨 氧化菌序列的扩增。c o r t e s l o r e n z o 等( 2 0 0 6 年) 通过p c r j t g g e ( t e m p e r a t u r e g r a d i e n t g e le l e c t r o p h o r e s i s ) 技术，分析了处理高氨、高酚含量工业污水中的驻硝酸缀菌多样性。 尽管人们利用1 6 s rr n a 基因对噩硝酸细菌进行了大量的研究，并取得很多重要 7 的成果，但利用1 6 s r r n a 基因特异扩增有一个缺点，就是利用此方法对含有复杂微 生物基因池( g e n ep 0 0 1 ) 的环境样品进行分析时，特异p c r 引物可能会与其它系统 和生理类群的1 6 sr r n a 基因的相结合，从而使实验结果产生较大误差( r o w e 等， 1 9 9 7 年) 。s h a h i d 等( 2 0 0 6 年) 研究发现了不同p c r 基础引物鉴定亚硝酸细菌群落 有可能得到不同的结果，表明通过p c r 鉴定亚硝酸细菌具有一定误差，以及引物选 择的重要性。s i n i g a l l i a n o 等( 1 9 9 5 年) 利用p c r 技术检测纯培养亚硝酸细菌a m o a 基因，同时也对接种到经过滤处理海水中的氨氧化菌以及海水中存在的土著菌群进 行了检测。对纯培养的n i t r o s o m o n a se u t o p a e a ，n i t r o s o m o n a sc r y o t o l e r a n s ， n i t r o s o c o c c u so c e a n u s 菌种及从近f l o r i d a 弯海岸获得的亚硝酸细菌扩增产物( 6 6 5 b p ) 进行序列测定，结果证明它们是a m o a 基因。a m o a 基因扩增为研究环境中化能无机 自养亚硝酸细菌的分布和种群进化关系提供了一种有效方法。 ? 1 4 2 亚硝酸细菌的生物类群 传统意义上认为化能无机自养硝化细菌是一个亲缘关系较近的类群( w a s t o n 等， i9 8 9 年j ，硝化细菌的最初分类主要是根据氧化的底物是氨还是亚硝酸盐，其次考，鬈 细胞的形状和细胞质膜的结构特征进行的( v d y t e k 等，1 9 9 5 年；w a s t o n 等，1 9 8 9 年) 。亚硝酸细菌的分类主要根据细菌形态的表型特征、细胞内细胞质膜的分布及它 们1 6 s r n a 序列的同源性( 见表1 ) 。伯杰氏细菌系统分类学第九版把亚硝酸细 菌归为硝化杆菌科，包括四个属：亚硝化单胞菌属( n i t r o s o m o n a s ) 。亚硝化螺菌属 ( n i t r o s o s p r i a ) 、亚硝化球菌属( n i t r o s o c o c c u s ) 和亚硝化叶菌属( n i t r o s o l o b u s ) 。从 形态上看，有球形、杆状、螺旋形等，但均为无芽孢的革兰氏阴性菌；运动或不运 动，如亚硝化叶菌，借周身鞭毛运动；专性化能自养细菌，氧化氨成亚硝酸盐，固 定c 0 2 以满足能量和碳素的需要；细胞富有细胞色素，它使细胞悬浮液呈现一种淡 黄到淡红的颜色( h o l t 等，1 9 9 4 年) 。 表1 亚硝酸细菌的种属特征( h o l t 等，1 9 9 4 年) t a b l elt h ec h a r a c t e r i s t i c so f t h ea m m o n i a o x i d i z e r s 目前则倾向于把亚硝酸细菌分为两个单一细胞起源的群体，它们分别属于变形 菌纲的亚纲和y 亚纲。在对这两个亚纲的亚硝酸细菌作进一步的分类时，不同钧蓑 者还有些细微的差别。v o t e k 等认为除了海洋亚硝酸球菌属于变形菌，亚纲外，其它 的亚硝酸细菌即亚硝酸单孢菌和亚硝酸螺旋菌两个种群属于变形菌亚纲( ；碉 等，1 9 9 5 年) ，p h i l i p s 等认为海洋亚硝化球菌和n h a l o p h i l u s 属于变形菌y 亚纲，其 它的亚硝酸细菌属于变形菌亚纲，包括亚硝化单孢菌属和亚硝化螺旋菌属 ( j u r e t s c h k o 等，1 9 9 8 年) 。j u r e t s c h k o 同样认为海洋亚硝化球菌和n h a l o p h i l u s 属于 变形菌厂亚纲，但是他认为于变形菌亚纲亚硝酸细菌应包括四个属，即亚硝化单胞 菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化叶菌属和亚硝化弧菌属( p h l l i p s 等，1 9 9 9 年) 。 随着硝化细菌研究的不断深入，特别是将分子生物学方法应用于硝化细菌系统 发育的研究，从d n a 水平，对某些保守序列进行比较分析，构建种群系统进化树 ( h e a d 等，1 9 9 3 年；t e s k e 等，1 9 9 4 年；m o b a r r y 等，1 9 9 6 年) ，新的属种不断被发 现，亚硝酸细菌的分类也在不断更新和变化。 1 4 3 亚硝酸细菌氧化氨的机制、相关酶类及基因 1 4 3 1 亚硝酸细菌氧化氨的机制 亚硝酸菌氧化氨的机制模型如图1 所示，首先在氨单加氧酶( a m o ) 的催化下将 9 氨氧化成羟氨，再经羟氨氧化还原酶( e a o ) t 均催化下将羟氨氧化成亚硝酸，进而由硝 化细菌的贬硝酸盐氧化还原酶催化形成硝酸。 t e r m i n a lo x i d 穗s e a n dn a d 4 - 图1 噩磷酸细菌鳇氧化枧割( a r p 等，2 0 0 2 年) f i g1t h ea m m o n i ao m d a t i o no fa m m o n i a o x i d i z e r s 1 4 t 3 。2 氨单加氧酶( a m m o n i am o n o o x y g e n a s e ，a m o ) 及其基因 ： 氨单加氧酶( a m o ) 是亚硝酸菌中能够催化氨转化为羟氨的酶，其催化反应为： n h 3 专0 2 + 2 e 2 一n h 2 0 牛壬 2 0 n h 2 0 h + h 2 0 一n o ；+ s w 。 a m o 只能催化非离予氨( n i l 3 ) 氧化，而不能催化离子氨( n 雕：) 氧化，而在环境中 n i - i ：与n h 3 的动态平衡中，倾向于n h ：的方向，使得n h 3 的浓度很低，这也是在硝 化作用中氨的氧化成为限速步骤的原因；此外，a m o 催化n h 3 氧化过程中，只能将 0 2 中的一个o 原子加入到n h 3 中形成羟氨f n i - 1 2 0 h ) ，另一个o 原子形成h 2 0 ，因此 需要提供额外的对电子。除了n h 3 外，a m o 还可以氧化e 疆键和c = c 键。 编码a m o 的基因簇r i t i o 至少含有3 个基 ( a m o a ，a m o b 和a m o c ) ，它们位子 1 n 一个操纵子中( a l z e r r e c a 等，1 9 9 9 年) ，其排列顺序为a m o c 、a m o a 、a m o b 。不同 种之间的r r l l o 基因的排列相同且具有很高的相似性( k l o t z 等，1 9 9 5 年) ，在一个细 胞中一般含有3 个拷贝的8 1 t i o ，且不同拷贝之间具有很高的保守性( 9 9 ) ( n o r t o n 等，2 0 0 2 年) 。在欧洲亚硝化单胞菌中，a m o 基因的转录有3 种不同的m r n a 产物 ( s a y a v e d r a s o t o 等，1 9 9 8 年) 其一对应于a m o c ，其二对应于a m o a b ，其三对应 于a m o c a b ，或是源于m r n a 的加工过程，或是源于不同的转录起始位点。通过突 变研究表明，锄。基因的3 个拷贝都是功能型的，但表达的程度不同。这些基因受 氨及亚硝酸的诱导表达( m a r t i ng 等，2 0 0 8 年) 。 1 4 4 亚硝酸细菌在生物脱氮方面的应用 废水中氮的存在形式，以有机氮化合物和氨氮为主。传统的活性污泥法能通过 硝化反应将有机氮氧化为硝酸盐，却不能有效的去除氮。传统的生物脱氮指的是全 程生物脱氮，即先在好氧条件下，自养型亚硝酸细菌将氨氮转化为亚硝酸盐氮，z ：继 而氧化成硝酸盐氮，然后在厌氧条件下，由兼性异养菌将硝酸盐氮还原成亚硝酸盐 氮，最后转变成氮气逸出。 1 9 3 0 年w u h r r n a n n 首先发现，在生物滤池的深处，氮的浓度减少，他还通过试 验证明，在生物滤池和曝气池中均可存在硝化作用和反硝化作用，并提出以微生物 细胞内物质作为脱氮菌还原硝酸盐的供氢体的微生物脱氮法。1 9 6 0 年前后， b r i n g m a n n 提出，利用城市污水的有机物作为反硝化细菌代 身 反应所需的有机碳源。 在这两种微生物脱氮法的基础上，1 9 6 0 年以后，微生物脱氮方面的研究进展很快。i 1 9 7 0 年后便出现了用以去除b o d 和氮的生物脱氮系统：即去碳、硝化、反硝化各自 分开的三级生物脱氮系统。这三种系统都需在硝化阶段投加碱，在反硝化阶段投加 有机物，这使生物脱氮系统的运行费用较高。为改进这些缺点，2 0 世纪8 0 年代前后， 又产生了将反硝化设备放置在处理系统最前面的前置反硝化微生物脱氮法，又称缺 氧、好氧生物脱氮法( a o 法) ，以及厌氧缺氧好氧生物脱氮法( a 2 o 法) 等，这些是 目前广泛采用的以传统活性污泥工艺为基础的脱氮工艺。这些工艺都利用了氨氧化 细菌最为人们所熟知的生化代谢机理一氨氮氧化为亚硝酸盐氮的代谢( 马文漪等， 1 9 9 8 年) 。 然而传统的生物脱氮工艺存在着几个主要的不足，一是能耗大，氨氮的氧当量 是4 5 7 9 ，即1 9 氨氮完全硝化需要氧4 5 7 9 ，要供氧就有能耗。其次，在反硝化过程 当中必须盘有机物( 有机碳) 提供电子供体，若污永的c n 比不足，脱氮效果