（环境工程专业论文）偶氮染料高效降解基因工程菌构建与特性研究.pdf

大连理工大学博士学位论文 摘要 偶氮染料的生物降解已得到较为深入的研究，分离得到多种具有偶氮染料脱色活性 的微生物，并有数种偶氮还原酶基因经大肠杆菌表达获得高纯度、高效率的偶氮还原酶， 但是酶制剂的应用受到各种条件的限制，成本较高。因此，考虑提高微生物本身的偶氮 染料脱色活性，以便于工程应用。 本文的目的是构建一株具有较高偶氮染料脱色活性的基因工程菌，并考察其对偶氮 染料的脱色特性。该工程菌是以沼泽红假单胞菌大肠杆菌穿梭质粒为载体，将外源基因 ( 来自球形红细菌r h o d o b a c 把rs p h a e r o i d e sa s l 1 7 3 7 的偶氮还原酶基因) 导入受体菌 ( 沼泽红假单胞菌r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i sa s l 2 3 5 2 ) ，使受体菌表达外源偶氮还 原酶，从而提高该工程菌的偶氮染料脱色能力。为达到以上目标，首先，在工程菌构建 之前，通过考察外源偶氮还原酶基因的供体菌( 球形红细菌) 和受体菌( 沼泽红假单胞 菌) 的偶氮染料脱色活性，以及受体菌细胞中质粒d n a 的种数及其复制等相关情况， 验证该构建途径的可行性；进而构建穿梭质粒及工程菌；最后，以原始受体菌为对照， 考察工程菌的生长及脱色特性。 对球形红细菌r h o d o b a c 耙rs p h a e r o i d e sa s l 1 7 3 7 的菌体及其胞内粗酶的偶氮染料脱 色活性进行考察。菌体在光照缺氧条件可将多种偶氮染料脱色，部分染料2 4 小时脱色 率可达9 0 以上。染料不能作为该菌生长的唯一碳源。3 5 4 0 。c ，中性偏碱环境( p h 7 8 ) 具有较高脱色率。超声破碎菌体，获得胞内粗酶，经r e ds e p h a r o s ec l 一6 b 凝胶纯 化，粗酶中偶氮还原酶的含量有一定提高。以甲基橙作为模型染料时，5 0 、p h8 0 为 其粗酶酶促反应的最佳条件，并且该酶催化的脱色反应符合双底物的乒乓机理。甲基橙、 n a d h 表观米氏常数分别为0 4 5m m 和1 2 5m m o 前期研究发现，沼泽红假单胞菌r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i sa s l 2 3 5 2 具有偶氮染 料脱色能力，其胞内粗酶亦具有偶氮还原酶活性，催化过程符合乒乓机理。而纺织印染 助剂中包括多种表面活性剂，对生物具有一定的毒性，因此，考察表面活性剂对该菌脱 色能力的影响具有实际意义。实验发现，该菌对两种阴离子表面活性剂( l a s ，s o d i u m l i n e a ra l k y l b e n z e n es u l p h o n a t e ；s d s ，s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) 有较强的耐受能力，并且 能够在好氧条件下将其降解；l a s 对菌体生长的抑制作用明显大于s d s ：o 1 s d s 存 在时染料脱色受到一定的抑制，较高温度( 3 0 以上) 时，抑制情况随温度提高迅速加 重。 为考察沼泽红假单胞菌r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i sa s l 2 3 5 2 中存在的质粒d n a 的情况，根据该菌的特点和常规提取方法应用中遇到的问题，在碱裂解法基础上，对其 宋智勇：偶氮染料高效降解基因工程菌构建与特性研究 野生质粒提取方法进行了优化，所得质粒d n a 纯度和质量均满足进步操作的需要。 反向p c r 技术结合生物信息学方法，鉴定该菌的野生质粒，发现菌株中携带四种野生 质粒，对其中一种质粒进行全序列测定，长2 3 0 6b p ，g e n b a n k 注册号d q 3 1 8 9 5 8 。经 b l a s t 检索，该序列与e s c h e r i c h i ac o l ip l a s m i dp e c l 5 7r o m l i k ep r o t e i ng e n e 有9 7 8 的 同源性。其中6 8 2 个碱基与ec o l ip l a s m i dp 1 5 af r a g m e n ts p e c i t y i n gt h eo r i g i no f r e p l i c a t i o n 有9 5 同源性。可见，该菌株中能够同时存在多种质粒，并且与大肠杆菌质 粒有很高的同源性，这一特性有利于进一步的分子生物学操作。 通过p c r 方法，将沼泽红假单胞菌中的其它基因的启动子，以及r h o d o p s e u d o m o n a s p a l u s t r i sa s l 2 3 5 2 用来编码f o r mi ir u b i s c o ( c b b m ) 的结构基因上游的核糖体结合位 点和下游终止子，分别引入到目的基因r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e sa s1 1 7 3 7 偶氮还原酶基 因片断a z r 的上下游。然后，将目的基因片段( 包括：启动子、核糖体结合位点、结构 基因a z r 和终止子) 克隆到沼泽红假单胞菌大肠杆菌穿梭克隆载体p h s g - m g 上。 经测序鉴定，和定点突变，修改四处错配中对翻译有重大影响的两处，获得了符合设计 意图的载体p h s g a z r 。 将p h s g a z r 电击转化入沼泽红假单胞菌，经p c r 检菌，证实转化成功，即获 得了所设计的基因工程菌。考察并对比工程菌与原始菌的生长及脱色情况。两株菌对3 0 1 2 0 0m g l 酸性红b 的脱色率都可达9 0 以上，并且工程菌的脱色速率比原始菌高 2 0 左右。不同初始p h 时，工程菌与原始菌的生长趋势基本一致，中性偏碱较适合 生长；p h7 9 工程茵的脱色速率比原始菌高2 0 左右。工程菌的最大脱色速率出现 在3 0 。c ，原始菌则在2 5 - 4 5 c 范围内逐步升高。该范围内，工程菌比原始菌的脱色速 率高3 0 1 0 0 。0 1 s d s 对两株菌的脱色均有较强的抑制作用，脱色速率相应降低 3 0 。8 0 ，温度越高，抑制作用越大，工程菌的脱色速率仍高于原始菌，可见外源基 因的引入和表达没有对受体茵的阴离子表面活性剂耐受能力造成很大影响。工程菌胞内 粗酶的偶氮还原酶活性是原始菌的2 倍左右。 关键词：球形红细菌；沼泽红假单胞菌；穿梭质粒：偶氮还原酶：基因工程菌 j ： 大连理工大学博士学位论文 c o n s t r u c t i o no fag e n e t i c a l l ye n g i n e e r e db a c t e r i u mf o re f f i c i e n t l y d e g r a d i n g a z od y e s a b s t r a c t b i o d e g r a d m i o no fa z od y e sh a sb e e ns t u d i e df o ry e a r s ，a n dm a n ym i c r o o r g a n i s m d e g r a d i n ga z od y e sw e r es c r e e n e d s o m ea z o r e d u c t a s eg e n e sw e r ec l o n e da n de x p r e s s e di ne c o l ie f f i c i e n t l y ，w h i l ee n z y m ea p p l i c a t i o ni nw a s t ew a t e rt r e a t m e n ti sl i m i t e db yi t sh i g hc o s t t h e nm i c r o o r g a n i s mi t s e l fi sa s k e dt ob em o r ee f f i c i e n tt op r o m o t ep r a c t i c a lt r e a t m e n t t h ep u r p o s eo ft h i sd i s s e r t a t i o ni st oc o n s t r u c tag e n e t i c a l l ye n g i n e e r e db a c t e r i u mw i t h h j 【g h e ra z o r e d u c t a s ea c t i v i t y i no r d e rt og e tt h i sg o a l ，t h ea z o r e d u c t a s eg e n ef r o mt h ed o n o r ( r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e sa s1 1 7 3 7 ) i si n s e r t e di n ar h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i s e c o l i s h u t t l ev e c t o r ，w h i c hi st r a n s f o r m e di n t ot h ea c c e p t o r 僻h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i s a s 1 2 3 5 2 ) a n dt h ef e a s i b i l i t yo ft h i sp r o c e s si sp r o v e db yi n v e s t i g a t i n gt h ea z od y e d e c o l o r i z a t i o nb yd o n o ra n da c c e p t o rs t r a i n s ，a n dt h ek n o w l e d g eo np l a s m i d si na c c e p t o r c e l l s t h ed e c o l o r i z a t i o no fa z od y e sb yc e l l sa n dc r u d ee n z y m eo fr h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s a s l 1 7 3 7w a si n v e s t i g a t e d a n ds e v e r a lk i n d so f a z od y e sc a nb ed e c o l o r i z e do v e r9 0 i n2 4 h w h i l ea z od y e sc a nn o tb et h es o l ec a r b o ns o u r c ef o rg r o w t ho ft h i ss t r a i n b e s i d e s ，t h e o p t i m a lc o n d i t i o n so fd e c o l o r i z a t i o na r e3 5 4 0 ca n dp h7 - 8 n l ec r u d ee n z y m ee x t r a c t e d f r o m 。t i f f ss t r f i nh a sa z o r e d u c t a s ea c t i v i t y ，b u gc a nn o tb ev ? e l lp u r i f i e dwr e ds e p h a r o s e c l 一6 b m a k i n gm e t h y lo r a n g ea sm o d e ld y e ，t h eo p t i m a ld e c o l o r i z a t i o nc o n d i t i o n sa r e5 0 。c a n dp h8 0 ，a n dt h ec a t a l y s i sc o r r e s p o n d e dt op i n g - p o n gm e c h 哪s m ，w h e r et h em i c h a e l i s - m e n t e nc o n s t a n t sf o rm e t h y lr e da n dn a d ha r eo 4 5m ma n d1 2 5m m r e s p e c t i v e l y t h ea z o r e d u c t a s e a c t i v i t i e so ft h ec e l l sa n di n t r a c e l l u l a rc r u d ee n z y m eo f r h o d o p s e u d o m o n a s p a l u s t r i sa s l 2 3 5 2w e r er e p o r t e d ，a n dl a s ( s o d i u m l i n e a ra l k y l b e n z e n e s u l p h o n a t e ) a n ds d s ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) w e r ea d d e di nc u l t u r e st os i m u l a t ep r a c t i c a l d y e i n gw a s t e w a t e r i ti sf o u n dt h a tt h i s s t r a i nc a ne n d u r es u r f a c t a n ta n dd e g r a d et h e m a e r o b i c a l l y ，a n di n h i b i t i o n so fl a so ng r o w t ha n dd e c o l o r i z a t i o na r eh i g l l e rt h a ns d s b e s i d e s ，t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r eo fd e c o l o r i z a t i o nw i t hs d s ( 3 0 c ) i sm u c hl o w e rt h a nt h a t w i t h o u ts d s ，w h i c hs h o w st h a ts d sm a d et h ed e c o l o r i z a t i o no ft h i ss t r a i ns e n s i t i v et oh i g h e r t e m p e r a t u r e s t h ep l a s m i de x t r a c t i o no f r h o d o p s e u d o m o n a s p a l u s t r i sw a so p t i m i z e d ，s ot h a tt h en a t i v e p l a s m i d s o ft h i ss t r a i nc o u l db eo b t a i n e d w i t hh i g h e rq u a n t i t ya n dq u a l i t yf o rf u r t h e r o p e r a t i o n s a n df o u rk i n d so fp l a s m i d sw e r ef o a n d i nt h i ss t r a i n ，o n eo fw h i c hw a si d e n t i f i e d 宋智勇：偶氮染料高效降解基因工程菌构建与特性研究 b yr e v e r s ep c ra n ds e q u e n c e dw i t h2 3 0 6b p ，g e n e b a n ka c c e s s i o nn u m b e rd q 3 1 8 9 5 8 1 1 1 e r e s u l t so fb l a s ts h o w e dt h a tt h ep l a s m i ds h a r e da9 7 8 s i m i l a r i t vw i t he s c h e r i c h i ac o l i p l a s m i dp e c l 5 7r o m l i k ep r o t e i ng e n e ，a n d6 8 2b po ft h ep l a s m i ds h a r e da9 5 s i m i l a r i t y w i t he c o l ip l a s m i dp 1 5 af r a g m e n ts p e c i f y i n gt h eo r i g i no fr e p l i c a t i o n t h e s er e s u l t ss h o w t h a tk i n d so f p l a s m i d sc a ne x i s ti nt h es t r a i n t h ep r o m o t e r r i b o s o m eb i n d i n gs i t e ( m 3 s ) a n dt e r m i n a t o rf r o mr h o d o p s e u d o m o n a s p a l u s t r i sw e r el i n k e do n t ot h eu oa n dd o w n s t r e a mo fa z o r e d a c t a s eg e n ef r o mr h o d o b a c 把r s p h a e r o i d e sb yp c r ，w h i c hw a st h e ni n s e r t e di n t ot h ev e c t o r ( p h s g m g ) f o l l o w i n gt h e s e q u e n c i n ga n ds i t e d i r e c t e dm u t a t i o n ，t h ev e c t o r ( p h s g a z r ) 、v i t hd e s i g n e df u c t i o nw a s o b t a i n e d t h ep h s g a z rv e c t o rw a st r a n s f o r r n e di n t or h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i sa s l 2 3 5 2 w h i c hw a sv e r i f i e db yp c r t h en e ws t r a i nw i t hp h s g o a z rv e c t o rc a nd e c o l o r i z e3 0 1 2 0 0 m g la c i dr e dbo v e r9 0 ，a n dt h er a t e so fd e c o l o r i z a t i o na r eh i g h e rt h a nt h a to fn a t i v e s t r a i n b o t ho f t h es t r a i n sh a v es i m i l a rt r e n do nd i f f e r e n tp h ，7 - 9a so p t i m a lp h h o w e v e r , t h e o p t i m a lt e m p e r a t u r e sa r ed i f f e r e n tb e t w e e nt h e m 3 0 f o rn e ws t r a i na n d4 5 f o rn a t i v e s t r a i n s d si n h i b i t e sb o t ho ft 1 1 es t r a i n sa b o u t3 0 一8 0 o nd e c o l o r i z a t i o nr a t e 。w h i l et h e e x p r e s s i o no ff o r e i g ng e n ed o e s n ta f f e c tt h i sc h a r a c t e rv e r ym u c h n l ea z o r e d u c t a s ea c t i v i t y o fi n t r a c e l l u l a re n z y m ef r o mt r a n s f o n - n e ds t r a i ni si n c r e a s e do n et i m e s 也a nt h a tf r o mn a t i v e o n e k e yw o r d s ：r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s ；r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i s ；p l a s m i dv e c t o r ； a z o r e d u e t a s e ；g e n e t i c a l l ye n g i n e e r e db a c t e r i u m 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：童垫日期：洳ff 矽 ：二k l_ 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名： 导师签名 堡塑 埠 竺尘年月丛日 大连理工大学博士学位论文 1 文献综述 随着染料与印染工业的发展，其生产废水已成为当前最主要的水体污染源之一。染 料作为环境重要污染源的首要特点是污染量大，我国年染料出口约3 0 万吨，进口5 万 吨，布料印染使用染料约2 0 万吨，位居世界前列。在染料的生产和使用中约有1 0 一 1 5 随废水排入环境。另外染料种类多、结构复杂。印染和染料废水色度大，有机物 浓度高，组分复杂，难生物降解物质多，含有大量的无机盐、硫化物等，属于难处理的 工业废水。染料分子为在水环境以及光照和有氧化剂的条件下稳定存在，设计有复杂的 芳香烃分子结构而更加难于去除。更为严重的是相当部分染料及其代谢产物为有毒难 降解有机物，化学稳定性强，具有致癌、致畸、致突变的“三致”作用。另外，废水中 残存的染料组分即使浓度很低，也会造成水体透光率降低，导致水体生态系统的破坏。 因此，对染料废水进行有效的处理成为重要的课题。 名耙料废水的生物处理方式因其经济性受到广泛的重视，各国己筛选出数株具有偶氮 染料脱色活性的微生物，并对偶氮还原酶及其基因作了深入研究，已报道的克隆至大肠 杆菌并表达的偶氮还原酶活性均有很大提高。本实验室亦在一株球形红细菌中获得偶氮 还原酶基因，并在大肠杆菌中获得高效表达，经h p l c m s 证明该酶催化的偶氮染料 脱色反应为偶氮键断裂所引起，并且存在加氢偶氮苯类结构的中间体。 但是，以上研究均止于偶氮还原酶在大肠杆菌中的高效表达，而该酶催化的反应需 要辅酶的参与，加之环境因素易导致酶失活等特性，使得酶制剂在污染治理中的应用受 到很大限制。因此，考虑提高微生物本身的降解能力，从而提高应用价值。 本实验室对沼泽红假单胞菌的c 0 2 固定基因有较为深入的研究，并且以原始菌( 沼 泽红假单胞菌) 为受体，利用穿梭质粒引入该基因，增加其表达量，从而获得更高c 0 2 固定能力的基因工程菌。同时该菌亦具有偶氮染料脱色活性，并且具有光合细菌所有的 多代谢途径、广泛底物范围等优良特性，因此，本文以这株沼泽红假单胞菌的原始菌为 受体，通过类似的构建穿梭质粒载体的方式，引入来自球形红细菌的偶氮还原酶基因， 在受体菌中表达外源偶氮还原酶，以提高其偶氮染料脱色活性。 以此构建偶氮染料高效降解基因工程菌，将在原始菌基础上提高偶氮染料脱色活 性，相对酶制剂，其应用成本更低廉、反应条件要求更低、范围更广泛。 宋智勇：偶氮染料高效降解基因工程菌构建与特性研究 1 1 染料的分类、结构与发色机理 1 1 1 染料的分类 染料是指能在水溶液或其它介质中，使纤维染成各种颜色的有色有机化合物。染料 的分类方法有两种 1 1 ： 其一是根据染料的化学结构，可分为偶氮染料、葸醌染料、靛族、芳甲基、酞菁、 三芳基甲烷染料等种类。 其二是按照染料的应用方法，可分为直接染料、硫化染料、还原染料、酸性染料、 酸性络合染料、活性染料、纳夫妥染料( 冰染染料) 、氧化染料、分散染料和阳离子染 料等。 一般来说，分离、筛选染料脱色微生物应选用“按化学结构分类”的染料，主要目 的在于判断脱色机制可能作用的基团和价键；而测定微生物染料脱色的能力则常选择按 应用分类的染料，以便取得与实际生产更接近的结果。 1 1 2 染料结构与发色机理 理论认为，染料的颜色与其结构有密切的关系。1 8 7 6 年出现染料发色团说，认为染 料颜色是由双键引起的，含双键的基团称为发色团。关系如下： ( 1 ) 在共轭双键体系中，共轭双键增长，电子活动性增高，激化能随之减少，吸收 的光线波长愈长，产生不同的深色反应。 ( 2 ) 共轭体系两端若存在极性基团，颜色加深。 ( 3 ) 分子离子化后，如果给电子基的给电子性或吸电子基的吸电子性加强，电子活 动性增大，分子的激化能降低，分子颜色加深。反之，则变浅。 ( 4 ) 分子平面性对颜色的影响：在共轭双键体系中，只有原子和原子团在同一个平 面时才具有最大的共轭效应。电子的活动性与分子的共平面性有关，如果分子的共平 面性遭到破坏，共轭双键体系也会被破坏，电子的活动性降低，颜色变浅。 ( 5 ) 染料共轭系统中的原子或原子团与金属原子形成配位键时，电子云分布状态发 生变化，从而影响共轭体系的流动性，引起颜色变化。 染料的结构与生色机理对判断微生物染料脱色具有重要的理论分析意义。 1 2 偶氮染料的生产应用以及对环境的危害 1 8 5 6 年英国有机化学家p e r k i n 合成出苯胺紫，1 8 5 8 年j o h a n n 发现了重氮反应，1 8 6 3 年阵t m a r t i u s 成功实现了首例商品化偶氮染料b i s m a r kb r o w n l 2 】。从此偶氮染料的生产和开 大连理工大学 尊士学位论文 发正式开始，新品种不断出现，色谱齐全、工艺成熟、成本低廉，居于染料市场主导地 位( 约占6 0 ) 。 偶氮染料的分子中一般含有1 个偶氮键“- n = n ”，键上连有苯或萘基，苯或萘基 又有_ n h 2 、c 1 、c h 3 、- n 0 2 、一s 0 3 及一o h 等取代基团。 1 2 1 我国现阶段染料生产以及使用状况 我国染料年出口约3 0 万吨，进口5 万吨，布料印染使用染料约2 0 万吨。其以 偶氮和蒽醌类为主，具有较好的应用性能和优良的牢度性能。0 1 - 0 3 年新增品种2 2 4 个 【3 】。染料生产有约一半作为出口，但是由于国产染料品种质量的问题，每年还要大量进 口染料，其中活性染料占进口总量4 0 以上，因此我国也是染料进口大国。具体的生 产和使用状况如下： ( 1 ) 分散染料：涤纶全部采用分散染料印染，在国产染料中比重最大( 4 3 3 ) ， 出口量也最大( 出口总量4 6 2 ) 。 ( 2 ) 酸性染料：主要用于毛、丝、锦纶的印染，也用于皮革、纸张的着色，进出口 都有相当比例。 ( 3 ) 碱性( 阳离子) 染料：普通碱性染料已很少用于纺织，主要用于纸张着色和制 造色淀颜料，而适用于晴纶染色的阳离子染料较多，占碱性染料的一半以上。 ( 4 ) 直接染料：用于棉、粘胶、丝绸和麻的印染，大量用于纸张和皮革着色，纸用 染料约6 0 为直接染料。国产直接染料约1 3 是直接混纺染料，1 1 3 是禁用染料。德 国在1 9 9 4 年7 月公布的1 1 8 个禁用染料中，直接染料占7 7 个。近年来主要关注 纸用直接染料、直接耐晒染料和禁用染料代用品。 ( 5 ) 活性染料：用途广泛，在棉、毛、丝绸、锦纶、造纸、皮革、墨水等方面都有 应用。我国生产品种仅占国外工业化品种的1 8 。在各类染料中比例最低，是我国大 量进口的原因之一。 ( 6 ) 其他染料：还原染料、冰染料、硫化染料、媒介染料等使用量均不大。其中媒 介染料因为高价铬和其他重金属离子污染，处于下滑，但是有的品种可作为金属络合 染料的原料，仍保持一定量的生产。 1 2 ：2 偶氮染料的其他应用方式 利用偶氮发色机理，开发的对某些物质进行高效测定的方法。比如h 荣等h j 基于六 价铬在稀盐酸介质中氧化盐酸羟胺产生亚硝酸根，而亚硝酸根可使对硝基苯胺重氮化并 与a 一萘胺偶联产生红色偶氮染料，提出了分光光度法测定六价铬的新方法。 宋智勇：偶氮染料高效降解基因工程菌构建与特性研究 余倩等【5 j 在p h1 0 4 的n h 4 c 1 2 一n h y h 2 0 缓冲溶液中，对磺基氯化重氮苯可与芦 丁、桑色素、染料木甙、槲皮素、橙皮甙、黄岑甙和大豆甙等7 种黄酮化合物发生偶 氮显色反应，反应产物的最大吸收波长，除黄岑甙为3 8 0n l r l 外，其余均在4 3 0m ， 显色反应的灵敏度依上述顺序逐渐减弱。它比铝( i ) 盐光度法的灵敏度高，并可用于 异黄酮的测定，使分光光度法测定黄酮化合物的实用性增强，应用范围扩大。 偶氮官能团的光致异构机制的应用【6 】偶氮发色团n = n 存在的形式有反式结构 ( tr a n s ) 和顺式结构( c i s ) 两种。通常条件下，偶氮分子主要处于稳定的反式态，但在共 振光作用下，反式态的偶氮分子吸收一个光子后可以变为顺式态。而顺式态分子不稳定， 可以通过热驰豫或光照射由顺式态变为反式态，因此具有光致变色特性而在光存储、光 调制及光致双折射等领域具有潜在的应用价值。 阮剑利等【7 】对偶氮染料的光敏性进行了对比研究。结果为光敏行如下排列，芴酮类 双偶氮蒽醌类 单偶氮葸醌类。 偶氮染料通过分子修饰，其k 。可红移到近红外光区。适用于光动力疗法中的光 敏剂、激光防护吸收染料以及电子照相用红外吸收染料等瞄】。 1 2 3 偶氮染料的危害以及对策 在染料的生产和使用中约有1 0 一1 5 随废水排入环境【9 j 。另外染料种类多、结构 复杂。印染和染料废水色度大：有机物浓度高，组分复杂；难生物降解物质多；含有大 量的无机盐、硫化物等，属于难处理的工业废水。染料分子为在水环境以及光照和有氧 化剂的条件下稳定存在，设计有复杂的芳香烃分子结构而更加难于去除。更为严重的是 相当一部分染料及其代谢产物为有毒难降解有机物，化学稳定性强，具有致癌、致畸、 致突变的“三致”作用。另外，废水中残存的染料组分即使浓度很低，也会造成水体透 光率降低，导致水体生态系统的破坏 1 0 】。 1 8 9 5 年，r e h n 就在生产品红的工人身上发现了膀胱癌，引起高度重视，纷纷对偶 氮染料毒性、致癌作用以及诱变活性进行广泛研究【2 】。 戴乾圆等】证明偶单染料中的4 - 二甲氨基偶氮苯以及其他集中致癌物质由于d n a 互补碱对股间交联，而导致癌变。这是所谓的“双区理论”。绝大多数环境中的致癌剂 均在体内代谢成双官能烷化剂，其在d n a 股碱互补碱对的共价横向交联，是启动细胞 癌变的关键步骤。这种交联以极小的几率，使转录酶的基因变异成为逆转录酶的基因， 经历潜伏期后引起细胞癌变。 探讨诱变( 或致癌) 的原因，以及诱变( 或致癌) 与分子结构的内在关系，可以为 非诱变偶氮染料分子设计提供了一定的理论基础 5 j 。 大连理工大学博士学位论文 由于偶氮染料的毒性一般为慢性，用毒性测试和致癌作用测试都不方便不现实。因 此一般采用美国生物学家设计的方法“a m e st e s t ”( a m e s s a l m o n e l l aa s s a y ) 。此方法简 单时间短，而且9 0 呈正性反应的染料被证明致癌，因此被广泛用于偶氮染料诱变性能 的测试。 偶氮染料代谢产物可能具有很强的致癌作用。偶氮还原酶的开裂作用是生物体内的 主要反应。一般认为这种反应主要发生在动物的肝脏和胃肠道。因为肝细胞胞液( c y t o s 0 1 ) 与微粒体( m i c r o s o m a l ) 中均含有偶氮还原酶；而胃肠道则有胃肠道细菌群( i n t e s t i n a l m i c r o f l o r a ) 滋生，也具有偶氮还原酶活性。其中包括大肠杆菌【l ”，而此菌同时存在于人 的体表，人体皮肤也就成了联苯胺系偶氮染料潜在的代谢场所，这也正是起被禁止生产 使用的主要原因之一。 但是并非所有偶氮染料开裂反应都是致癌活化途径。对由联苯胺和萘胺为母体衍生 的偶氮染料，这一反应为致癌活化途径，对氨基偶氮染料来说，这一反应为致癌非活化 甚至去活化途径。不管何种偶氮染料，只要在动物体内代谢为芳氮稀正离子a r 真a 则势必 诱发癌变。 尹志刚掣1 3 1 总结了偶氮染料及其芳氨中间体结构与其诱变性之间的关系，并且提出 了非诱变偶氮染料的设计方法： ( 1 ) 芳胺中间体的结构诱变相关性 由于形成芳氮稀结构后才致癌，因此凡有助于a 函- r 形成的因素是比提高芳香胺 的诱变活性。如在氨基邻、对位引入供电子基则导致诱变活性提高。相反i 吸电子基则 不利于a r 裔r 形成，从而减弱甚至消除苯胺系列中间体诱交活性。 当分子中有羟基、磺酸( 钠) 基和羧基存在时，可以明显降低或者消除诱变性，这 是由于羟基具有形成环羟基化作用( r i n g h y d r o x y l a t i o n ) ，正好是芳胺非活化途径的代谢 物，另外，羧基和磺酸基除了吸电子以外，还能增强水溶性而使芳胺分子容易排出体外。 苯系二胺中间体多为诱变物或致癌物。在氨基邻位引入较大体积的丁氧基可明显减 弱诱变活性，可能是因为立体障碍对氨基代谢起的抑制作用。 萘胺和萘酚系中间体均为偶氮染料常用中间体，酚类比胺类更安全，而且在分子中 引入水溶性较大的基团( 如磺酸基) ，会降低甚至消除诱变活性。 ( 2 ) 偶氮染料分子结构一诱变相关性 偶氮苯在动物体内因不能代谢为芳氮稀阳离子n ：j r 而一直被认为是非致癌物， 但7 0 年代则被n c i ( t h e n a t i o n a lc a n c e ri n s t i t u t eo f u s a ) 定为致癌物，因其可以从动 物肝细胞的黄素蛋白( f i a v o p r o t e i n ) 中接受电子形成被认为可致癌的负离子自由基。 宋智勇：偶氮染料高效降解基因工程菌构建与特性研究 氨基偶氮芳香化合物诱变性还与分子中氨基和偶氮基的相对位置有关。互为对位多 为致癌物；邻位时则多为非致癌物。原因有：1 ，形成分子内氢键；2 ，空间障碍；3 ， 形成苯并三唑( b e n o t r i a z o l e ) 。三个因素均抑制氨基进入代谢系统，因此诱变活性大为降 低。 ( 3 ) 非诱变偶氮染料分子设计方法 使用非诱变中间体，避免体内代谢出诱变中间体。 当使用诱变中间体时，必须保证由该中间体合成的偶氮染料不会因光、热和动物代 谢再生出这些中间体。 设计具体方法：通过芳环引入亲水性基团，在氨基邻为引入烃基或烷氧基( 尤其空 间体积较大者) 来抑制诱变。另外，开发类联苯胺中间体，保持其大共轭体系，从而保 证染料色调和亲和力，破坏共轭体系的均为致癌中间体。 苏洁【1 4 】等也对禁用染料以及中间体的结构进行了总结，得到了与以上相似的结论。 大致存在以下规律： ( 1 ) 氨基位于萘环的2 位和联苯对位的化合物，均有较强的致癌性，位于萘环的1 位和联苯问位的化合物有较弱致癌性，而在联苯邻位的化合物无致癌性。 ( 2 ) 苯环中的氨基的邻位或对位为甲基、甲氧基、氯基所取代的化合物有致癌性。 ( 3 ) 氨基位于偶氮苯、二苯甲烷、二苯醚及二苯硫醚对位的化合物也有致癌性。 ( 4 ) 这些芳胺均为非水溶性。其中致癌毒性最强的为2 2 萘胺，其次为联苯胺和1 2 萘胺，其导致膀胱癌的潜伏期分别为1 6y 、2 0y 、2 2 y 。 1 2 4 各国对于偶氮染料的相关政策 自1 9 9 4 年7 月1 5 日德国颁布禁止使用部分偶氮染料的法令以来，荷兰、奥地 利、土耳其、美国、澳大利亚、加拿大、以及东南亚等国纷纷效仿，相继采取措施禁止 或者限制在纺织品中使用有害化学物质【”】。 2 0 0 4 年1 月2 1 日欧盟向w t o 厂r b t 委员会通告的关于化学品注册、许可、 评估和限制制度( r e a c h ) 最终文本，及欧盟未来化学品新政策，属于强制标准。 包括： 。 ( 1 ) 禁止和限制使用的染料； ( 2 ) 禁止在织物上使用在特定( 即还原) 条件下会裂解产生2 4 种致癌芳香胺的偶 氮染料； ( 3 ) 禁止9 种致癌诱变或对生殖有害的染料； ( 4 ) 禁止1 8 种耐汗渍牢度小于4 级的潜在过敏染料； 大连理工大学博士学位论文 ( 5 ) 禁止使用铬媒染料； ( 6 ) 限制使用含铜、铬、镍的金属络合染料； ( 7 ) 限制染料中重金属和甲醛的含量。 欧盟9 4 6 2 e c 包装和包装废弃物法令( 简称包装法令) ，自1 9 9 4 年底发布和 实施，检测项目也从有害重金属扩展到要求检测禁用偶氮染料( a z o ) 、甲醛( h c h o ) 和 臭氧层消耗物质( o d s 主要是氯氟烃c f c s ) 等u “。 印度也在准备禁止某些种类偶氮染料的生产和使用【1 7 】。 1 3 含偶氮染料废水的处理方法 传统的水处理方法包括物理吸附法、化学氧化、絮凝以及生物处理方法，对于偶氮 染料废水的处理方式也可如此分类。 1 3 1 物理吸附法 利用吸附剂如活性炭、硅聚物、高岭土吸附废水中的染料的方法，不同的吸附剂对 染料吸附具有选择性。目前主要还是采用活性炭吸附法。此法适用于可溶性染料，不需 要设备投资，c o d 、b o d 去除效果也不错，但活性炭吸附后清洗困难，成本高，且对 某些大分子染料吸附力不够i 马子川【l8 】等以化学法合成的新生m n 0 2 作吸附剂，对水中甲基橙染料进行吸附脱 色研究，探讨了影响吸附的因素和吸附机理。结果表明：新生m n 0 2 对甲基橙的吸附符 合l a n g m t f l r 吸附等温式，吸附速率大，吸附前溶液p h 值是影响染料脱色效果的最主要 因素，吸附后溶液p h 值和温度影响较小。在实验条件下可使甲基橙脱色率达9 9 。 此外国内还有应用活性硅藻土和煤渣处理传统印染工艺废水的方法，费用较低，脱 色效果较好，但缺点是泥渣产生量大且处理困难。 1 3 2 化学法 通过加入化学品的方法将特殊污染物转化成不可溶解的形式而吸附在不可溶的固 状物上；或者将污染物氧化成可生物降解的化合物；或在一定条件下，甚至将污染物完 全转化成c 0 2 和水。主要电解 1 9 , 2 0 , 2 1 ，光催化 2 2 - 2 6 1 以及湿式过氧化氢氧化法【2 7 】。但若化 学法处理不当，则会产生如a o x 的二次污染，而达不到治污的最终目的【2 8 1 。 采用无机、有机化学絮凝剂，如碱式氯化铝( p a c ) 和聚丙烯酰胺( p a m ) 等，水解 产生的胶体吸附染料，适用于难溶及不溶性染料，其原料来源广泛，制备简单，投资少， 经济实用，对c o d b o d 去除率也较高，但会产生化学污泥的二次污染，色度去除率也 不尽如人意。 宋智勇：偶氮染料高效降解基因工程菌构建与特性研究 1 3 3 生物法 是目前比较普遍采用的方法，并且具有处理费用低的特点。下面将重点介绍生物处 理方法。 初期研究主要集中在对具有偶氮染料废水脱色活性的微生物的筛选上，现已得到多 种具有此活性的菌株，如表1 1 ，多数是从污水处理厂污泥或土壤中获得。 1 3 4 环境因素对偶氮染料生物脱色的影响 各菌株生长的最佳温度一般处于3 0 3 7 ；p h 多在中性附近。属于一般生物生长 所需的温和条件。 由表1 1 可见多数对偶氮染料的生物脱色都是在厌氧条件下通过偶氮还原酶催化进 行的，如s p h i n g o b a c t e r i u mt h a l p o p i l u m 2 9 1 , 假单胞菌l u t e o l a 3 4 - 3 7 1 ，8 h i g e l l ad y s e n t e r i a e 3 9 1 等等。只有少数的报道是在好氧条件下的：k l e b s i e l l a p n e u m o n i a er s 1 3 t 3 2 1 ，a s c o m y c e t e y e a s tc a n d i d az e y l a n o i d e s l 3 8 j 等。 大多数的具有脱色活性的细菌不能以染料及其降解产物为唯一碳源和能量来源。