（应用化学专业论文）羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 生命活动的代谢过程中不断产生各种活性氧自由基( r o s ) ，羟基自由 基( 0 h ) ，超氧自由基( 0 2 e ) 是其中具有代表性的两种自由基，它们与 生物体的衰老及许多疾病的发生都有重要关系。 o h 是一种氧化能力很强的自由基，能很容易地氧化各种有机物和无 机物，氧化效率高，反应速率快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋 白质和多糖分解的活性氧，与机体的衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有 关。0 2 。不仅自身具有毒性，而且可以经过一系列反应生成其它活性氧自 由基，进一步对生物体产生损伤作用，且停留时间较长。 人体内总自由基中约9 5 以上属于活性氧自由基，因此活性氧自由基 的研究对人体有着特殊的意义。通过对活性氧自由基的检测研究，可以帮 助我们更好的解释疾病产生的原因，加强有效的预防措施，减少机体的伤 害程度。另外在衡量保健食品的抗氧化能力和中草药抗氧化物质的筛选中 具有重要的指导意义和理论价值。 活性氧自由基反应性强，存在时间短，不易进行直接测定。目前国内 外已有较多间接测定o h 和0 2 的方法。本研究在全面了解这些方法的基 础上，研究了利用荧光分析技术测定活性氧自由基的方法，因为此技术具 有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点。本文合成了两种新型荧光探针， 同时对这两种探针进行了检测选择性的研究，探讨了部分抗氧化剂对活性 氧自由基的清除作用。具体研究内容分为以下三点： ( 1 ) 通过鸟苷与过氧化氢光解反应，形成荧光物质8 羟基鸟苷，分析 8 羟基鸟苷在不同条件下存在的形式及不同存在形式与荧光强度的关系。 探讨羟基自由基产生及其与鸟苷反应的条件，根据荧光强度与羟基自由基 的量效关系，研究羟基自由基与鸟苷作用的分子机理，探讨茶叶提取液和 大蒜提取液通过清除羟基自由基对鸟苷的保护作用。 ( 2 ) 设计合成一种新的荧光探针试剂- 2 ( 2 吡啶亚胺甲基) 苯酚， 建立检测0 2 。和s o d 活性的荧光方法，研究测定方法的最佳条件，并用 于大蒜、菠菜、木瓜中s o d 活性的测定，并与邻苯三酚自氧化法测定出 的s o d 活性进行了比较。 ( 3 ) 建立了一种以2 ( 2 噻吩基) 苯并噻唑啉为新型荧光探针测定 羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究 0 2 和s o d 活性的荧光分析方法，探讨了其它物质对体系的干扰影响及荧 光探针的检测单一性，研究测定方法的灵敏度，精密度，本法成功应用于 大蒜、洋葱等生物样品中s o d 活性的测定。 本论文首次对羟基自由基与鸟苷作用分子机理的荧光分析做了相关 研究，并合成了新型荧光探针，用于0 2 和s o d 活性的测定，且2 ( 2 噻吩基) 苯并噻唑啉对0 2 的检测具有专一性，得到较为满意的结果，但 是也存在一些不足之处，如鸟苷与过氧化氢光解反应体系中测定o h 的含 量时灵敏度还不够高，还需进一步探讨。活性氧自由基的测定方法还未能 很好的应用于动物体的检测，有待进一步完善。 关键词：荧光分析法；羟自由基；超氧阴离子自由基；超氧化物歧化酶； 荧光探针 i i 山东农业大学硕士学位论文 a bs t r a c t n u m e r o u sr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) a l eg e n e r a t e di nt h ec o u r s eo f b i o l o g ym e t a b o l i s m h y d r o x y lr a d i c a l s ( o h ) ，s u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l ( 0 2 。) a r et w ot y p i c a lo n e s t h e yh a v ei m p o r t a n tr e l a t i o n sw i t ha g i n ga n dd i s e a s e s o hi saf r e er a d i c a l ，w h i c hh a sah i 曲o x i d a t i o n i tc a no x i d i z en u m e r o u s o r g a n i ca n di n o r g a n i cc o m p o u n d se a s i l yw i t hh i g ho x i d a t i o ne f f i c i e n c ya n d f a s tr e a c t i o nr a t e i th a sr e l a t i o nw i t ht u m o r s ，r a d i a t i o nd a m a g e sa n d p h a g o c y t o s i s 0 2 h a st o x i ca n dc a ng e n e r a t eo t h e rr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sb y as e r i e so fr e a c t i o n s t h e s er e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sh a v ef u r t h e rd a m a g e st o o r g a n i s m sa n dl o n gr e s i d e n tt i m e a b o u t9 5 o ft h et o t a lf r e er a d i c a l si nt h eb o d ya r er e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ；t h e r e f o r et h er e s e a r c ho n t h er o sh a sas p e c i a ls i g n i f i c a n c et oh u m a n b o d y r e s e a r c h e so fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sc a nh e l pu se x p l a i nt h ec a u s e so f d i s e a s e sb e t t e r ，s t r e n g t h e ne f f e c t i v ep r e v e n t i v em e a s u r e sa n dr e d u c et h ei n j u r y e x t e n to ft h eb o d y i na d d i t i o n ，i th a sg r e a tg u i d i n gs i g n i f i c a n c ea n dt h e o r e t i c a l v a l u ei nm e a s u r e m e n to fh e a l t hf o o di nt h ea n t i o x i d a n tc a p a c i t ya n dt h e s e l e c t i o no fa n t i o x i d a n ts u b s t a n c e si nc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e b e c a u s er o si sa c t i v e ，d i r e c td e t e r m i n a t i o ni sd i f f i c u l t a tp r e s e n t ，m a n y m e t h o d sf o rt h ei n d i r e c td e t e r m i n a t i o no fs u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l sa n d h y d r o x y l r a d i c a l sh a v e b e e nd e v e l o p e d a f t e rh a v i n gac o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n go ft h e s em e t h o d s ，b a s e d o nf l u o r e s c e n c ea n a l y s i sw i t ht h e a d v a n t a g e s o f h i g hs e n s i t i v i t y ，s e l e c t i v i t y a n d s i m p l eo p e r a t i o n ，t h e s p e c t r o f l u o r i m e t r i cm e t h o dw a su s e dt od e t e c tr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s i nt h e p a p e r ，t w of l u o r e s c e n tp r o b e sw e r es y n t h e s i z e da n dt h e i rs e l e c t i v i t yf o r0 2 。 w e r es t u d i e d i na d d i t i o n ，t h ee f f e c t so fs c a v e n g i n go fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s b ys o m ea n t i o x i d a n t sw e r ed i s c u s s e d t h r e ea s p e c t so fi n v e s t i g a t i o nh a v e b e e n c a r r i e do u ts p e c i f i c a l l y ： ( 1 ) t h ef l u o r e s c e n tm a t e r i a l ，8 - h y d r o x y g u a n o s i n e ，w a sap r o d u c to ft h e r e a c t i o nb e t w e e ng u a n o s i n ea n dh 2 0 2b yu v l i g h tp h o t o l y s i s t h ef l u o r e s c e n t c h a r a c t e r i s t i c so f8 - h y d r o x y g u a n o s i n ef o r m e di nd i f f e r e n tc o n d i t i o n sw e r e s t u d i e d ，a n dt h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h ed i f f e r e n tf o r m sa n dt h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yo f8 - h y d r o x y g u a n o s i n ew e r ea n a l y z e d t h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s f o rt h e g e n e r a t i o n o f h y d r o x y l r a d i c a la n dt h ed e t e r m i n a t i o no f 8 - h y d r o x y g u a n o s i n ew e r eo p t i m i z e d b a s e do nt h ed o s e e f f e c tr e l a t i o n s h i po f h i 羟基自由摹和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究 f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya n dh y d r o x y l h y d r o x y lr a d i c a la n dg u a n o s i n ew a s a n dg a r l i co nh y d r o x y lr a d i c a lw e r e r a d i c a lt og u a n o s i n e r a d i c a l ，也er e a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e n r e s e a r c h e d t h es c a v e n g i n ge f f e c t so ft e a s t u d i e dt oa l l e v i a t et h eh a r mo fh y d r o x y l ( 2 ) an o v e lf l u o r e s c e n tp r o b e ，2 - ( 2 - p y r i d y l i m i n o m e t h y l ) p h e n o lw a s s y n t h e s i z e d t h es p e c t r o f l u o r i m e t r i c m e t h o d w a s d e v e l o p e d f o rt h e d e t e r m i n a t i o no f0 2 a n ds o d a c t i v i t y t h eo p t i m u me x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s w e r ed i s c u s s e d f u r t h e r m o r e ，s o da c t i v i t yi ng a r l i c ，p a p a y aa n ds p i n a c hw e r e s u c c e s s f u l l yd e t e r m i n e d t h er e s u l t so b t a i n e db yt h es u g g e s t e dm e t h o dw e r e a l s oc o m p a r e d 、v i t l lt h o s eo b t a i n e df r o mt h es t a n d a r dm e t h o d ( 3 ) an o v e ls p e c t r o f l u o r i m e t r i cm e t h o du s i n g2 一( 2 - t h i e n y l ) b e n z o t h i a z o l i n ea sf l u o r e s c e n tp r o b ew a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f0 2 a n ds o d a c t i v i t y t h ee f f e c t so fi n t e r f e r e n c e sa n dt h es e l e c t i v i t yf o r0 2 o ft h e f l u o r e s c e n tp r o b ew e r ei n v e s t i g a t e d t h e s e n s i t i v i t ya n dp r e c i s i o no ft h e m e t h o dw e r es t u d i e d i tw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e r m i n es o d a c t i v i t yi n g a r l i ca n do n i o ns a m p l e s i nt h ep a p e r ，t h e s t u d yo nm o l e c u l a rm e c h a n i s mo ft h ei n t e r a c t i o n b e t w e e n h y d r o x y l r a d i c a l g e n e r a t e d a n d g u a n o s i n eb y f l u o r e s c e n t s p e c t r o s c o p yw a sc a r r i e do u tf i r s t l y ，a n dt w on o v e lf l u o r e s c e n tp r o b e sf o rt h e d e t e r m i n a t i o no f0 2 a n ds o d a c t i v i t y w e r e s y n t h e s i z e d m o r e o v e r ， 2 - ( 2 - t h i e n y l ) b e n z o t h i a z o l i n eh a sag o o ds e l e c t i v i t yf o r0 2 ，t h e s er e s u l t sa r e s a t i s f i e d h o w e v e r ，t h e r ea r es t i l ls o m ei n a d e q u a c i e s f o re x a m p l e ，t h e s p e c t r o f l u o r i m e t r i cm e t h o di sn o ts e n s i t i v ee n o u g hi nt h eu v h 2 0 2s y s t e ma n d t h ed e t e c t i o nm e t h o do fr o si sn o ta p p l i e di nt h ea n i m a ls a m p l e ，w h i c hn e e d s f u r t h e ri m p r o v e m e n ta n dd i s c u s s i o n k e y w o r d s ：s p e c t r o f l u o r o m e t r i cm e t h o d ；h y d r o x y lr a d i c a l ；s u p e r o x i d ea n i o n r a d i c a l ；s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ；f l u o r e s c e n tp r o b e c e e c d c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s - e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n c z e a d d m s o e s r g s h - p x h p l c h p l c - e c d n b t - o h 0 2 p b n s o d t b t c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s - a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n d i m e t h y ls u l f o x i d e e l e c t r o ns p i nr e s o n a c e g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - e l e c t r o c h e m i c a l d e r e c t i o n n i t r ob l u et e t r a z o l i u mm e t h o d h y d r o x y lr a d i c a l s s u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l s n t e r t - b u t y l - a - p h e n y l n i t r o n e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 2 - ( 2 - p y r i d y l i m i n o m e t h y l ) p h e n o l 毛细管电泳电化学 检测法 毛细管区带电泳一安 培检测法 二甲亚砜 电子白旋共振法 谷胱甘肽过氧化物酶 高效液相色谱法 高效液相色谱电化 学检测法 氯化硝基四唑氮蓝 羟基自由基 超氧阴离子自由基 n - 叔丁基苯硝酮 超氧化物歧化酶 2 - ( 2 一噻吩基) 苯并 噻唑啉 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并向 社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：曼鲢、 导师签名：盔互刽 日期：趔2 ：f 乃 山东农业大学硕士学位论文 l 引言 生物体内的活性氧自由基是活性态氧代谢的产物，主要包括超氧阴离 子自由基( 0 2 。) ，羟基自由基( 0 h ) 、单线态氧( 1 0 2 ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 等。它们在生命活动的代谢过程中不断产生，与生物体的衰老及许多疾病 的发生都有重要关系( h a l l i w e l lbe ta 1 ，1 9 9 8 ；k e a n e yjjfe ta 1 ，1 9 9 5 ；a l i se ta 1 ，2 0 0 8 ；m c c a b ed re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。1 9 6 9 年m c c o r d ( m c c o r djm e ta 1 ， 1 9 6 9 ) 发现了清除超氧化物自由基的超氧化物歧化酶( s o d ) 并研究其生 物学作用，提出了氧毒性的超氧化物自由基学说，人们开始逐步认识到自 由基在生物体内存在的危害。 o h 是一种氧化能力很强的自由基，能很容易地氧化各种有机物和无 机物，氧化效率高，反应速率快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋 白质和多糖分解的活性氧( 徐向荣等，1 9 9 8 ) ，与机体的衰老、肿瘤、辐射 损伤和细胞吞噬有关。 0 2 不仅自身具有毒性，而且可以经过一系列反应生成其它活性氧自 由基，进一步对生物体产生损伤作用，且停留时间较长。超氧自由基是生 物活性最高的氧中心自由基之一，它在生命过程和化学反应中作为电子受 体，形成不同的活性氧自由基链中的第一个自由基，经过一系列反应生成 其它的氧自由基。和其它的活性氧相比，超氧自由基不是很活泼，但其寿 命很长，因此，超氧自由基危害较大，捕获超氧自由基进行研究具有重要 的意义。 人体内总自由基中约9 5 以上属于活性氧自由基，因此活性氧自由基 对人体有着特殊的意义。自1 9 0 0 年c o m b e r g 提出有机自由基以来，有关自 由基在生命体系中生物学作用的研究相继开展了很多。1 9 5 6 年，h a r m a n 等发现放射线诱导突变和诱发肿瘤的发病机理与自由基有关，该研究是自 由基医学史上的里程碑。1 9 6 8 年，m c c o r d 和f r i d o v i c h 报道了超氧化物歧 化酶抗氧化的生物学作用，开创了自由基生物学的新篇章。近年来，在基 础医学、临床医学、预防医学、药学等领域，对活性氧自由基进行了广泛 的研究工作。 羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究 1 1 活性氧自由基的性质 1 1 1 羟基自由基的性质 o h 具有高度活性，主要通过电子转移、亲电加成、脱氢反应等途径 无选择地直接与各种有机化合物作用而将其降解为c 0 2 ，h 2 0 和其他无害 物质。它具有以下特点： ( 1 ) 氧化能力强，其标准电极电势达n 2 8 0v ( 如表1 1 ) ，仅次于 氟，是一种氧化能力极强的氧化剂； ( 2 ) 反应速率常数大，0 h 非常活泼，与大多数有机物反应的速率 常数达到1 0 6 1 0 1 0lm o l 1s ( e s p l u g a sse ta 1 ，2 0 0 2 ) ； 表1 1羟基反应的二级速率常数( 邓淑芳等，2 0 0 4 ) ! 垒! ：! ：! ! 垒皇兰曼! q 旦垒! ! 型! 塾呈呈旦望! 垒坚生旦! 垒z 堂竺苎y ! ! 垒垒i 曼垒! 望! 竺! i 旦璺 反应速率常数反应速率常数 化合物 p h， 化合物 p h， ( l m o l 以s 1 ) ( l m o l qs q ) f e 2 +2 12 5 1 0 8 鸟嘌呤一 1 o 1 0 1 0 h 2 0 2 腺嘌呤 苯 苯甲酸 过氧化氢酶 胞嘧啶核苷 胞嘧啶 脱氧鸟苷酸 脱氧核糖 乙酸 葡萄糖 甘氨酰甘氨酸 7 o 7 4 7 o 3 o 2 0 7 0 7 0 7 0 7 0 2 o 4 5 1 0 7 3 0 1 0 9 3 2 1 0 9 4 3 1 0 9 2 6 1 0 l l 3 2 1 0 9 2 9 1 0 9 4 1 1 0 9 1 9 x 1 0 9 7 2 1 0 8 1 0 x 1 0 9 7 8 x 1 0 7 血红蛋白 一 组氨酸 6 0 7 0 卵磷脂 一 甲醇7 0 酚 7 0 正丙醇 7 0 核糖核酸酶 一 核糖 7 0 血清白蛋白 一 胸腺嘧啶 7 0 尿嘧啶 7 0 3 6 1 0 l o 3 0 x 1 0 9 5 0 x 1 0 8 4 7 x 1 0 8 4 2 1 0 9 1 5 x 1 0 9 1 9 1 0 l o 1 2 x 1 0 9 2 3 1 0 1 0 3 1 x 1 0 9 3 1 x 1 0 9 ( 3 ) 寿命短，在不同的环境介质中，其存在时间有一定的差别，一 般小于1 0 s ，液相中仅1 0 一s ； 2 山东农业大学硕士学位论文 ( 4 ) 选择性低，且与反应物浓度无关。o h 一旦形成，会诱发一系 列的自由基链反应，氧化分解所有的有机物质、生物体，最终降解为c 0 2 、 h 2 0 和微量无机盐，不存在有害有毒的残留物。实现零污染物、零废物排 放； ( 5 ) 剩余的羟基最终生成物是无毒害的h 2 0 、0 2 。 1 1 2 超氧阴离子自由基的性质 超氧自由基在水中可认为是一种碱，它可以接受一个h + 形成质子化的 超氧自由基h o o 。超氧自由基在水溶液中的存活时间约为1 s ，在脂溶性 介质中的存活时间约为1 h 。和其它的活性氧相比，超氧自由基不是很活泼， 但由于其寿命很长，能扩散到很远的距离，达到靶位置。它可以发生歧化 反应、单电子还原反应、单电子氧化反应等。 1 2 活性氧自由基的产生 1 2 1 羟基自由基的产生 ( 1 ) 脉冲辐射分解法 在n 2 0 的存在下产生o h ，采用这种方法产生的o h 可达到9 0 ，这 种方法也可产生较高浓度的0 2 。 ( 2 ) 臭氧法 臭氧氧化能力很强，在碱性条件下，可以发生分解，产生羟基自由基 ( b e n i t e zfje ta 1 ，1 9 9 4 ) ，其反应式如下： 0 3 + o h 。_ h 0 2 + 0 2 - 0 3 + 0 2 ：0 3 + 0 2 0 3 + h 0 2 。o h + 2 0 2 0 3 在u v 作用下可提高羟基自由基的产率，对此机理的解释有两种， 即： 羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究 0 3 o + 0 2 o + h 2 0 。2 o h h v 0 3 + h 2 0 一o + h ，o ， h v h 2 0 2 _ 2 o h ( 3 ) f e n t o n 型h a b e r w e i s s 反应 过去曾认为通过h a b e r w e i s s 反应可产生羟自由基( 方允中等，1 9 8 9 ) 0 2 二+ h 2 0 2 _ o h + o h 。+ 0 2 但是上述反应的速度很慢，其反应速率常数( 尼) 仅仅为0 1 3lm o l 。s 1 但在f e 3 + 的螫合物如( f e a d p ，f e e d t a ) 存在下的f e n t o n 型 h a b e r w e i s s 反应可以产生o h ，其反应如下： f e ) + + 0 2 二rf e 2 + +0 2 f e 2 + + h 2 0 2 _ i 卜f e 3 + + 。o h 十o h 0 2 + h 2 0 2 卜o h + o h + 0 2 在f e n t o n 型h a b e r w e i s s 反应 f e 3 + 或f e 2 + 起催化剂作用。此反应也可 简称为f e n t o n 反应。f e n t o n 反应是生物体内存在的体外模拟反应，对研究 羟自由基具有重要作用。 大量的实验证据指出，生物体内的产生也可以通过类似f e n t o n 型 h a b e r w e i s s 反应进行( 韩鹤友等，2 0 01 ) 。 1 2 2 超氧化物自由基的产生 ( 1 ) 自氧化法 包括一些蛋白质、低分子化合物在内的物质在一定条件下自动氧化， 可以产生0 2 。自氧化能产生0 2 - 的蛋白质有：血红蛋白、肌红蛋白等。 自氧化可产生0 2 的低分子化合物包括：黄素单核苷酸( f m n ) 、辅酶i ( n a d ) 、6 羟基多巴胺、焦性没食子酸等。 ( 2 ) 电化学反应 用滴汞作为阴极，在一定实验条件下，通电后可使水溶液产生以下反 应： 4 山东农业大学硕士学位论文 滴汞( e ) + 0 2 坚滴汞+ 0 2 二 ( 1 ) 滴汞( e ) + h 2 0 + 0 2 二滴汞+ h o z 。+ o h ( 2 ) 但在表面剂喹啉或氧化三苯膦的存在下，滴汞电极表面有一层表面剂 分子的疏水膜。由于不会发生反应( 2 ) ，0 2 - 遂可穿过疏水膜进入水溶液 中。 ( 3 ) 光化学法 有些光敏燃料，如甲基蓝、黄素、邻联茴香胺等，遇光照射可以被还 原，但在暗处又可再氧化，这一氧化还原过程可伴有0 2 。的生成。除此以 外，能产生0 2 的方法还有物理法、电化学法等，用1 0 4 。或c d + 氧化h 2 0 2 也可产生0 2 。后者也可从对苯二酚衍生物与0 2 的反应中产生。b a u o u 等( b a l l o uae ta 1 ，1 9 6 9 ) 报道，采用快速冰冻猝灭、电子顺磁共振以及 光学等技术，可观察到黄素自氧化与0 2 的产生有关。在实验室中除用自 氧化法产生0 2 外，尚有酶促反应法。 ( 4 ) 酶促反应法 许多氧化酶均可促使0 2 发生单电子还原，形成0 2 。这类氧化酶包 括黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶、n a d p h 氧化酶等。由黄嘌呤氧化酶催化生 成0 2 的反应如下： 黄嘌呤+ h ，o + 2 0 ，尿酸+ 2 i - i + + o ，二 l - 3 活性氧自由基的检测方法 1 3 1 羟基自由基的检测方法 羟自由基能与许多有机化合物，尤其芳香族化合物发生羟化反应，通 过测定反应体系的羟化产物生成量，间接检测o h 含量( 姚波等，2 0 0 6 ) 。 ( 1 ) 电子自旋共振法 电子自旋共振法( e l e c t r o ns p i nr e s o n a c e ，简称为e s r ) 是1 9 4 5 年发 展起来的，主要的研究对象为具有未成对电子的自由基和过渡金属离子及 其化合物。自旋捕集技术的建立，为化学反应中的自由基中间体和生命过 程中的短寿命自由基的e s r 检测开辟了新的途径( 张健中等，1 9 8 7 ) 。此 方法是利用捕集剂与短寿命自由基结合生成相对稳定的自由基。由于自旋 加合物的寿命很短，因此必须在捕集之后立即进行e s r 钡, t l 定，从而限制了 羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究 许多实验研究。丛建波等( 丛建波等，1 9 9 3 ) 采用液氮( 7 7k ) 保存自旋 加合物的方法，延长了自旋加合物的寿命，结果表明，低温贮存d m p o 。o h 加合物可保持几天后浓度基本不变。刘乃丰等( 刘乃丰等，1 9 9 4 ) 用水溶 性自旋捕集剂d m p o 捕获由体外组离子催化的低密度肢蛋白( l d l ) 产生 的羟自由基，实验认为此方法可用作研究l d l 在动脉粥样硬化中的自由基 作用。s t o k e s 等( s t o k e snje ta 1 ，1 9 9 4 ) 用浸渍有捕获剂的滤纸捕集空气 中的o h ，用甲苯萃取后进行e s r 、狈t j 定。p o u 等( p o use ta 1 ，1 9 9 4 ) 用紫 外线照射h 2 0 2 产生o h ，o h 与c h 3 c h 2 0 h 反应，产生c h 3 c h o h ，再用a ( 4 毗啶基1 氧化物) n 叔丁基硝酸灵捕获c h 3 c h o h ，e s r 淤 定自旋加 合物。该方法可用于生物体内o h 的检测。o t t a v i a n i 等( o t t a v i a n imfe ta l 。， 2 0 0 1 ) 用u 苯基- n 叔丁基氮氧化物( p b n ) 捕集橄榄油中的o h ，e s r 测 定，o h 最大浓度为1 2 5i ，t m o ll 。 ( 2 ) 高效液相色谱法 5 高效液相色谱法( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，简称为 h p l c ) 可用于间接测定自由基。测定过程中必须选择合适的化合物捕集 被测体系中的自由基，使之生成具有一定稳定性，且能被液相色谱分离与 检测的产物，然后用h p l c 进行测定。多种物质均可作为羟基自由基的捕 获剂，如水杨酸、二甲亚砜、苯丙氨酸等。 采用水杨酸捕集羟基自由基的h p l c 测定方法 用水杨酸( 邻羟基苯甲酸) 捕捉o h 的原理如下： 奇c o o h 嘣+ 手 产物中的2 ，3 二羟基苯甲酸和2 ，5 二羟基苯甲酸可用h p l c 进行分 离与测定。吴建林等( 吴建林等，2 0 0 7 ) 在体系p h 为3 1 2 的条件下，以 水杨酸为o h 捕获剂，用高效液相色谱法检测水杨酸与o h 反应的生成物 2 ，3 一二羟基苯甲酸( 2 ，3 - d h b a ) 和2 ，5 一二羟基苯甲酸( 2 ，5 - d h b a ) ，间 接验证了辉光放电等离子体中羟基自由基的存在，半定量地计算了辉光放 电电解过程中o h 的产量与实验条件之间的关系。 采用二甲亚砜( d m s o ) 捕集羟基自由基的h p l c 测定方法 6 山东农业大学硕士学位论文 二甲基亚砜( d m s o ) 是一种常见的溶剂，近年来国内外均有报道利 用d m s o 捕集羟基自由基，定量测定o h 的产率。其测定原理是通过 d m s o 与o h 反应生成甲基亚磺酸( c h 3 s 0 2 h ) 和甲基自由基，然后用 重氮盐与甲基亚磺酸反应，生成的偶氮化合物利用h p l c 测定，其测定原 理如下： ( c h 3 h s o + h o _ c h 3 s 0 2 h + c h 3 ( d m s o ) ( 甲基亚磺酸) o + i c h 3 s 0 2 h + a r n - - = n x ，a r n ：n 一专一c h l i 。 o a 卜玳表芳基或取代芳基， 醐表酸根 甲基亚磺酸是一种稳定的非自由基化合物，通常在被测体系中原先不 存在，因此体系中甲基亚磺酸的生成量与反应物o h 的浓度之间存在着定 量关系。f u k u i 等( f u k u ise ta 1 ，1 9 9 3 ) 利用二甲基亚砜捕捉o h ，产物为 甲基亚磺酸，用重氮盐坚牢黄g c 盐与生成的甲基亚磺酸反应，将生成的 邻一氯苯重氮甲基砜用乙酸乙酯萃取，然后用h p l c 定量地测定了f e n t o n 反 应体系中产生的o h 。g a m o h 等( g a m o hke ta 1 ，1 9 9 4 ) 用d m s o 捕获o h 生成甲基亚磺酸，再同坚牢蓝b b 盐反应生成偶氮砜。在4 0o c ，s t r - o d s i i 柱，8 0 乙腈作流动相分离，4 2 0n m 检测，线性范围达n o 0 1m o ll 。 该法用于f e n t o n 反应和紫外光解h 2 0 2 产生的o h ，可望用于生物体系中 o h 的测定。t a i 等( t a ice ta 1 ，2 0 0 2 ) 用d m s o 捕获o h 生成甲醛，再同 2 ，4 一二硝基苯肼( d n p h ) 反应生成相应的腙( h c h o d ) h ) 。x d b c l s 柱，甲醇水( 6 0 ：4 0 ) 作流动相( 流速1m lm i n 1 ) 分离，检出限为0 5 4 岬o l l - 1 ，该法已用于深度氧化过程中o h 的测定。 在h p l c 法中用来捕集o h 的化合物还有酚类( k i l i n cee ta 1 ，2 0 0 5 ) 松萜( v a n h e e sie ta 1 ，2 0 0 1 ) 、苯甲酸( d a sdke ta 1 ，1 9 9 1 ) 、苯丙氨酸、 酯类物质等。t a k e d a 等( t a k e d ak e ta 1 ，2 0 0 4 ) 通过苯捕获湖水和河水中 光化学产生的o h 生成苯酚，h p l c 在线分析，证明了1 0 8 0 的o h 来 自硝酸根和亚硝酸根离子。 7 羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究 ( 3 ) 荧光分析法 利用荧光检测法检测化合物的荧光强度或变化，可间接对o h 进行定 性或定量分析，灵敏度比较高。s e t s u k i n a i 等( s e t s u k i n a ike ta 1 ，2 0 0 0 ) 合 成了一种选择性极高的测定o h 的新型荧光探针，这种荧光探针能够与 o h 发生特异性反应，而不与超氧阴离子自由基、双氧水、单线态氧等其 它活性氧反应。y a n g 等( y a n gx fe ta 1 ，2 0 0 1 ) 利用f e n t o n 反应产生的o h 与d m s o 反应，产生的甲基自由基与硝基萘反应，通过荧光的加强间接测 定o h ，最低检出限为1 0 。7m o ll 。n e w t o n 等( n e w t o ngle ta 1 ，2 0 0 6 ) 利用苯甲酸盐、香豆素类化合物与辐射水体系产生的o h 反应生成荧光物 质的特性对o h 进行了分析，分别测定了o h 和荧光物质产生的速率常数。 g e r a l d 等( g e r a l dlne ta 1 ，2 0 0 6 ) 通过苯甲酸酯、香豆素、吩嗯嗪与o h 发生羟基化产生的荧光对o h 进行了测定。o h 反应常数2 1 0 9 - 2 1 0 1 0l m o l 。1s ，o h 产率为5 1 1 。l o u i t 等( l o u i tge ta 1 ，2 0 0 5 ) 用弱荧光的 香豆素与o h 反应生成7 一羟基香豆素加成物，产物在3 3 2n l i l 光的激发下， 在4 5 6n l t l 处有较强的荧光，间接测定o h 量。高峰等( 高峰等，2 0 0 6 ) 利 用f e n t o n 反应产生的o h 与亮绿s f 反应，使其荧光猝灭，测定3 1 2n l n 处荧 光强度的变化值f ，间接测定了f e n t o n 反应中羟自由基的生成量。杨小峰 等( 杨小峰等，2 0 0 1 ) 设计了利用哌啶类氮氧自由基自旋标记荧光探针表 征o h 。刘立明等( 刘立明等，2 0 0 3 ) 研究s n 催化h 2 0 2 产生的o h 的反应， h 2 0 2 与c e ”作用后生成无荧光的c e 4 + ，通过测定c e 3 + 的荧光强度的变化可 间接测定所产生的羟基自由基。l i 等( l ilxe ta 1 ，2 0 0 4 ) 用对苯二甲酸 捕集f e n t o n 反应的o h ，生成具有荧光性质的2 羟基对苯二甲酸，利用l c 荧光检测法间接测定体系中的o h 。t a n g 等( t a n gbe ta 1 ，2 0 0 5 ) 用流动 注射荧光法检测对苯二酸钠c 0 2 + - h 2 0 2 体系产生的o h ，测定羟基化产物 2 一羟基对苯二酸钠在4 3 1n m 处的荧光