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基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 摘要 随着人类活动及工农业生产的快速发展，海洋为我们提供丰富食品和能源的 同时，其自身的环境却日趋恶化，赤潮等海洋灾害频繁发生。而目前的赤潮检测 手段不仅劳动强度大，且影响到检测数据的准确性、代表性和时效性，达不到海 洋环境预报对赤潮检测实时快速的要求。因此，研制船载快速现场检测系统成为 海水水质检测的迫切需要。本课题就是在这样的背景情况下提出来的。 本课题属于国家高技术研究发展计划( 8 6 3 计划) 资源环境领域的海洋监测 技术课题。核心任务是研制船载快速现场检测系统，使我国具备海洋生态环境现 场快速监测能力。基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪是将d n a 分子 探针生物技术与机械设计、计算机控制技术、检测技术、电机控制技术等有机融 合为体的船载型机电一体化精密仪器。分析仪采用三自由度机械手作为传输机 构，集成了海水采样预处理系统及生化分析所需的供应装置、电予移液器、孵育 器、洗板机、酶标仪等仪器模块，实现了赤潮藻采样、处理、分析的全自动化。 在生物分析技术研究和功能分析的基础上，将基于双特异分子探针赤潮藻检 测技术与机电控制技术有机融合，制定了总体方案，设计了分析仪总体结构；对 自动生化分析工艺流程中的关键技术进彳亍了深入研究，采用了模块化设计思路， 研发了一些新颖的机一电一气一体化模块，准确地实现连续过滤、超声波破碎、移 液、加液及恒温震荡等复杂动作；设计了具有夹持定量移液器和转移酶标板双重 功能，并可按规划路径完成动作的机械手，开发了控制程序，机械手工作可靠， 运动灵活：利用虚拟样机技术完成了对分析仪的实体模型和运动仿真，缩短了研 制周期，提高了分析仪的设计质量；通过对分析仪安装、调试和运行过程的分析 总结，对自动生化分析仪的改进设计进行了展望。 关键词：赤潮藻；自动生化分析；海洋环境监测；模块化；康拟样机技术 r e s e a r c ho nb i o c h e m i c a l a n a l y s i si n s t r u m e n tf o r r e dt i d e a l g a b a s e do nd o u b l e - d i f f e r e n t i a l - m o l e c u l e - p r o b e t e c h n i q u e a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，w i t ht h ef u r t h e rd e v e l o p m e n to fo c e a nr e s o u r c e s ，t h em a r i t i m e e c o l o g i c a le n v i r o n m e n tw o r s e n sd a yb yd a y o c e a n i cc a l a m r i e s ，s u c ha sr e dt i d e f r e q u e n t l yt a k ep l a c e f o rt h ec o n t i n u a b l ed e v e l o p m e n to fo c e a n i ti si m p e r a t i v et o a c c e l e r a t et h em o n i t o r i n ga n dc o n t r o lo ft h eq u a l i t yo fs e aw a t e r b u tt r a d i t i o n a l m e t h o d so fs e aw a t e rq u a l i t yd e t e c t i o na r es oi n e f f i c i e n tt h a tt h e yc a l l tm e e tt h en e e d o fr e a l t i m e q u a l i t yd e t e c t i o no fs e aw a t e r t h e r e f o r e i ti su r g e n tt od e v e l o p s h i p c a r r y i n gs p o tm o n i t o r i n gs y s t e mf o rs e aw a t e rq u a l i t yd e t e c t i o n t h i ss u b j e c ti s p u tf o r w a r do ns u c hab a c k g r o u n d t h i sp r o g r a mi sas u b t a s ko fam a r i t i m em o n i t o r i n gt e c h n o l o g ys u b j e c ti n r e s o u r c ea n de n v i r o n m e n tf i e l d ，w h i c hb e l o n g st ot h en a t i o n a lh i g h t e c hr e s e a r c h a n dd e v e l o p m e n tp r o g r a m ( 8 6 3t o r c hp r o g r a m ) n l ec o r et a s ki st o d e v e l o p s h i p c a r r y i n gs p o tm o n i t o r i n gs y s t e mw h i c hw i l le n a b l eu s t om o n i t o rm a r i t i m e e c o l o g i c a le n v i r o n m e n ti nt i m e t h es h i p c a r r y i n ga u t o m a t i cb i o c h e m i c a la n a l y s i si n s t m m e n td e v e l o p e di nt h i s s u b j e c ti sa ni n t e g r a t i v es y s t e mo fm e c h a n i s ma n de l e c t r o n i c s w h i c hc o m b i n e sd n a m o l e c u l e , p r o b eb i o c h e m i c a lt e c h n i q u ew i t l lm e c h a n i c a ld e s i g nt e c h n o l o g y c o m p u t e r c o n t r o lt e c h n o l o g y , s e n s o rd e t e c t i n g t e c h n o l o g y , c o m m u n i c a t i o nt e c h n o l o g y ， e l e c t r o m o t o rc o n t r o lt e c h n o l o g ya n ds oo n t h ei n s t r u m e n ta d o p t sar e c t a n g u l a r c o o r d i n a t es e r v om a n i p u l a t o rw i t ht h r e eu n r e s t r i c t e dm o v e m e n to r i e n t a t i o n sa s t r a n s m i t t i n gm o d u l ea n di n t e g r a t e ss e aw a t e rs a m p l i n gp r e t r e a t m e n ts y s t e ma n ds o m e n e c e s s a r yb i o c h e m i c a la p p a r a t u sm o d u l e ss u c ha s ，b i o c h e m i c a lp l a t es t o r e r o o m ， e l e c t r o n i cp i p e t t o r , i n c u b a t o r , b i o c h e m i c a lp l a t ew a s h e r , b i o c h e m i c a lp l a t ed e t e c t a p p a r a t u sa n ds oo n 。t h i si n s t n l m e n tr e a l i z e sc o m p l e t ea u t o m a t i o no fs a m p l i n g ， p r o c e s s i n ga n da n a l y z i n gf o rs e ap h y t o p l a n k t o n ( r e dt i d ea l g a ) i nt h i sp a p e r , t h et a s k sw ea r eg o i n gt oi n t r o d u c ea r ea sf o l l o w ：e n g a g em y s e l fi n t h er e s e a r c ho nb i o c h e m i c a la n a l y s i st e c h n i q u e a n dd e s i g n 也eg e n e r a lf r a m eo ft h i s a u t o m a t i cb i o c h e r o i c a la n a l y s i si n s t m m e n t ；p e n e t r a t ei n t ot h ek e yt e c h n o l o g yo ft h i s a u t o m a t i cb i o c h e m i c a la n a l y s i si n s t r u m e n t n o v e lm o d u l e sw h i c he m p l o ym e c h a n i s m e l e c t r o n i c sa n dp n e u m a t i ct e c h n o l o g i e sh a v eb e e nd e s i g n e da n da c c u r a t e l yr e a l i z et h e c o m p l e xm o t i o n so ff i l t r a t i o n ，b r e a k i n g u p ，t r a n s f e r r i n go ft h el i q u o r , k e e p i n g t e m p e r a t u r e c o n c u s s i o na n ds oo n ；m a n i p u l a t o rh a sb e e nd e s i g n e dw h i c hc a r lg r a s p t h ef i x q u a n t i f y - p i p e t t o ra n dt r a n s f e rt h eb i o c h e m i c a lp l a t e s i tg o e sa c c o r d i n gt ot h e p r o g r a m m i n gp a t hs m o o t h l y ；t h r o u g h t h ev i r t u a l p r o t o t y p i n gt e c h n o l o g y ，t h e t h r e e d i m e n s i o n a lm o d e lh a sb e e nd e s i g n e da n dm o v e m e n ts i m u l a t i o nh a sb e e n p e r f o r m e d ，w h i c hs h o r t e nt h er e s e a r c hp e r i o da n di m p r o v eq u n i t yo ft h i si n s m m a e n t g r e a t l y i nt h ee n d ，g i v eap r o s p e c to ft h eb e t t e r m e n ts c h e m ef o rt h i sa u t o m a t i c b i o c h e m i c a la n a l y s i si n s t r u m e n t 2 k e yw o r d s ：r e dt i d ea l g a ；a u t o m a t i cb i o c h e m i c a la n a l y s i s ；m a r i t i m ee n v i r o n m e n t m o n i t o r i n g ；m o d u l a r i z a t i o n ；v i r t u a lp r o t o t y p i n gt e c h n o l o g y 3 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 1 绪论 1 1 课题研究背景及来源 11 1 研究背景 二十世纪是海洋的世纪，随着航海技术、通讯技术、勘探技术及水产养殖 等技术的蓬勃发展，人类认识海洋、开发海洋的步伐日趋加快海洋为我们提供 丰富的食品和能源的同时，其自身的环境却日趋恶化。据国家海洋局发布的二十 世纪末中国海洋环境质量公报，污染范围日益扩大，近海海域受营养盐和有机盐 污染日益严重，近海海洋生物污染加剧，海洋灾害频繁发生，海洋生态破坏加剧 。1 “。其中赤潮是最为严重的海洋灾害之一。 赤潮是海洋中某些微小的浮游藻类、原生动物或细菌在一定的条件下爆发性 繁殖或聚集而引起水体变色的一种有害生态异鬻现象。赤潮藻的存在是赤潮发生 最基本的条件，只有当赤潮藻大量繁殖的时候，富营养化的水体才会显著地改变 水体的溶解氧、水色等条件，从丽导致水体质量显著下降“。”。从全球来讲，海 洋浮游微藻是引发赤潮的主要生物，在四千多种海洋浮游微藻中有2 6 0 多种能形 成赤潮，其中有7 0 多种能产生毒素，赤潮发生时鱼类和贝类大量死亡，导致重 大经济损失和严重的海洋生态灾难；毒索还会富集在贝类和鱼类体内，人类食用 后会引发疾病。因此，加快海洋海水水质检测，做好赤潮预报及治理显得尤为重 要，是关系海洋可持续发展的大事。如能够实时监控海水中浮游微藻的种类和数 量，获得大量的监测数据，并且能成功预报赤潮，及时对养殖区的鱼、贝类采取 措施，将避免重大经济损失，保护海洋生态系统，保证沿海地区经济和社会稳定 发展。 目前，海水水质检测的主要手段是利用采样船采集水样，然后将水样在实验 室中由专门的检测人员处理，利用各种相互独立的检测仪器检测水样的成分o ”。 这样的检测手段劳动强度大、耗时长、效率低，达不鳓赤潮预报对海水检测实时 快速的勇求。因此，研制一种船载赤潮藻全自动分析仪已成为提高赤潮预报能力 的迫切需求。 1 12 课题来源 为此，国家高新技术发展( 8 6 3 ) 计划展开了有关资源与环境领域海洋环境 监测主题研究，围绕维护海洋权益、发展海洋经济、保护海洋环境、预警海洋灾 害等重大需求，研究和发展海洋监测的前沿高技术，力争在海洋监测关键技术取 得重要突破，提高我国海洋生态环境快速现场监测能力和海洋动力环境立体监铡 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 能力；深入开发实用化的海洋环境监铡等方面的技术，研制一批具有国际先进水 平的海洋监测技术产品并促成其产业化，为国家海洋监测系统提供核心技术与主 要装备；培养一批高水平的海洋监测技术人才，从整体上提高我国海洋监测能力。 该课题从属于海洋监测技术主题的第二专题即海洋生态环境要素现场 快速监测系统技术。本专题核心任务是建立船载快速现场驻测系统，使我国具备 海洋生态环境现场快速监测能力。主要发展一批重要现场分析技术和原位监测技 术，研制相关的仪器或装备，通过技术集成，形成船载海洋生态环境现场监测集 成示范系统，服务于渤海湾环境建设，相关仪器集成在海洋环境监测2 1 号船上， 对海洋环境参量进行长时间序列观测。集成的课题依次为船载海洋生态环境现场 监测集成示范系统；海水营养盐现场自动分析技术：海水中有机污染物的现场光 学综合分析技术；海水重金属元素( p b 、c d 、h g , a s 、z n 、c u 、f e 、m n 、c r 等) 的现场测定技术；海水化学耗氧量( c o d ) 的现场分析技术；海水中有机磷的现 场分析技术：海洋环境污染现场监测生物芯片技术；海洋环境腐蚀能力现场监测 技术；赤潮藻综合钡4 量系统及分析技术：海水生物耗氧量( b o d ) 的现场监测技 术。 本课题即赤潮藻综合测量系统及分析技术( 2 0 0 i a 矗6 3 0 5 0 9 ) 。研究近海赤潮 生消过程中海洋赤潮藻种类分类、识别及总量的测量及分析技术，建立赤潮生消 过程中赤潮藻测量系统，研制海水中赤潮藻种类和数量的自动分析仪，并符合本 专题课题一( 船载海洋生态环境现场监测集成示范系统) 的整体集成设计。使我 国的海洋浮游生物综合测量达国际现有水平。 1 2 赤潮监测的国内外现状及研究意义 1 ，2 1 赤潮监测的国内外现状 减少赤潮发生，做好科学监测和准确预报是两个重要环节，目前，赤潮监测 有船舶监测、航空遥感监测、卫星遥感监测、应急监测及自愿者监测等方法以及 相互结合的立体监测方案。其中船舶监测在赤潮浮游微藻的定性和定量检测发挥 着重要作用，可直接提供大量的检测数据，在做好赤潮监测和预报占有很重要的 地位“1 。现国内外大多采用人工采样实验室分析、泵吸式自动水质监测站、自 动浮沉式水质监测站、水质监测浮标系统等多种形式，也就是说船舶监测主要是 船舶定点或岸基定点监测的方法，这样不仅劳动强度大，而且由于中间环节过多， 直接影响了数据和结论的准确性、代表性和时效性，无法满足海洋环境预报对赤 潮监测实时快速的要求，船载实验室在线赤潮藻全自动分析系统在国内外尚无实 际应用先例，目前，船月在线自动分析设各是各国研究的热点，船载型无人值守 全自动赤潮藻分析技术及生化仪的研究与开发尤为迫切。 基于积特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 2 2 研究意义 该课题是基于双特异分子探针技术的赤潮藻检测新方法的基础上，将生物技 术与机电控制技术有机融合，集生物技术、机械设计、精密仪器、工业控制、电 机技术、传感技术、通讯技术、计算机技术于一体的船载型机电一体化仪器设备， 是为满足海洋环境检测实时快速、无人值守自动检测、舰船载的要求而研制的， 主要应用于对海水中浮游生物( 海藻) 的现场实时采样、处理及分析，整个处理、 检测过程通过三维机器手在计算机控制下完成，实现了取样、处理、生化分析的 余自动，丈大提高了工作效率，满足了海洋环境预报对海水检测实时快速的要求， 为海洋环境的实时、快速预报提供了可能。整个过程实现了无人值守，提高了海 洋海水检测的现代化水平和海洋环境预报能力，对减少赤潮海洋灾害给人们的生 产生活带来的危害，具有巨大的现实意义和实际应用价值，代表了赤潮监测和预 报的最新发展动态和趋势。其研究成果、方法和关键技术还可以推广应用于生命 科学、临床医学等相关仪器，具有广泛的应用前景。 1 3 赤潮藻分析技术简介 3 1 赤潮藻分析技术发展状况 目d t 鉴定赤潮浮游藻类的方法主要通过光学或电子显微镜n “。训j 练有素的专 家通过光学显微镜能鉴定大多数微藻，但有些属内的藻很难在种水平上用普通光 学显微镜分开，一些特殊的荧光染料配以荧光显微镜用以区分它们，或者用电子 显微镜也可以观察分类学上的细微差别，但这些方法不仅对技术要求高，而日既 费时又费力“。“”。”1 。研究表明，赤潮藻的b n a 区域与藻的进化和分类有密切的 关系，g e n b a n k 上有关微藻的数据主要集中在这个区域“7 “”。通过比较相近 微藻的该区域，找出每个种特有的核酸作为寡核苷酸引物和探针，利用分子杂交 技术进行定性、定量鉴定。主要有定量p c r 、金细胞杂交和“兰明治”杂交技术 。”1 。定量p c r 技术是一种高灵敏度高特异性的援酸检测技术。它在微藻鉴定 中的应用才刚刚起步，但由于现有的定量p c r 技术要求高纯度的i ) n a 作为检测样 本，而且目前该项技术对仪器和操作人员要求比较高，限制了其在微藻检测中的 普及应片 “2 ”2 4 。 全细胞杂交的原理是收集藻细胞，然后用含有荧光素标记的特异性探针与藻 细胞内的d n a 杂交，在荧光显微镜下观察，对相应的藻种作出鉴定和定量计数； 或以寡核苷酸探针结合后，以特定波长在流式细胞计数仪上计数。前者仍未摆脱 操作繁琐、费时费力的缺点，后者与定量p c r 技术类似，对仪器和操作人员要求 操作繁琐、费时费力的缺点，后者与定量p c r 技术类似，对仪器和操作人员要求 e 比较高“1 ”3 。 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 1 2 2 研究意义 该课题是基于双特异分子探针技术的赤潮藻检测新方法的基础上，将生物技 术与机电控制技术有机融合，集生物技术、机械设计、精密仪器、工业控制、电 机技术、传感技术、通讯技术、计算机技术于一体的船载型机电一体化仪器设备， 是为满足海洋环境检测实时快速、无人值守自动检测、舰船载的要求而研制的， 主要应用于对海水中浮游生物( 海藻) 的现场实时采样、处理及分析，整个处理、 检测过程通过三维机器手在计算机控制下完成，实现了取样、处理、生化分析的 仝自动，大大提高了工作效率，满足了海洋环境预报对海水检测实时快速的要求， 为海洋环境的实时、快速预报提供了可能。整个过程实现了无人值守，提高了海 洋海水检测的现代化水平和海洋环境预报能力，对减少赤潮海洋灾害给人们的生 产生活带来的危害，具有巨大的现实意义和实际应用价值，代表了赤潮监测和预 报的最新发展动态和趋势。其研究成果、方法和关键技术还可以推广应用于生命 科学、临床医学等相关仪器，具有广泛的应用前景。 1 3 赤潮藻分析技术简介 131 赤潮藻分析技术发展状况 目前鉴定赤潮浮游藻类的方法主要通过光学或电子显微镜“。训练有素的专 家通过光学显微镜能鉴定大多数微藻，但有些属内的藻很难在种水平上用普通光 学显微镜分开，一些特殊的荧光染料配以荧光显微镜用以区分它们，或者用电子 显微镜也可以观察分类学上的细微差别，但这些方法不仅对技术要求高，而且既 费时又费力“。”i s 1 6 。研究表明，赤潮藻的d n a 区域与藻的进化和分类有密切的 关系，g e n b a n k 上有关微藻的数据主要集中在这个区域“7 ”。2 “川。通过比较相近 微藻的该区域，找出每个种特有的核酸作为寡核苷酸引物和探针，利用分子杂交 技术进行定性，定量鉴定。主要有定量p c r 、全细胞杂交和“三明治”杂交技术 2 2 ”72 “。定量p c r 技术是一种高灵敏度高特异性的核酸检测技术。它在微藻鉴定 中的应用才刚刚起步，但由于现有的定量p c r 技术要求高纯度的d n a 作为检测样 本而且目前该项技术对仪器和操作入员要求比较高，限制了其在徼藻检测中的 普及应用 2 5 , 2 6 , 2 7 , 2 8 , 2 9 , 3 0 3o 全细胞杂交的原理是收集藻细胞，然后用含有荧光素标记的特异性攘针与藻 细胞内的d n a 杂交，在荧光显微镜下观察，对相应的藻种作出鉴定和定量计数； 或以寡核苷酸探针结合后，以特定波长在流式绍胞计数仪上计数。前者仍未摆脱 操作繁琐、费时费力的缺点，后者与定量p c r 技术类似，对仪器和操作人员要求 也比较高”“”3 。 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 “三明治”杂交技术是近年来发展起来的一项核酸快速诊断技术，由于d n a 被认为与藻类的系统进化密切相关的序列，而且真核生物细胞中d n a 含量非常 高，可以达到1 0 6 1 0 7 个拷贝，d n a 是夹心杂交很好的靶点。3 “+ ”。1 9 9 6 年， c h r i s t o p h e ra s c h o l ir l 等将提取的d n a 或者藻细胞裂解液在一定条件下与结 合在9 6 孔板上的寡核苷酸探针杂交后，再用一标记的信号探针与之杂交，最后 是酶标抗体显色反应。“”4 ，如图卜l 所示。该技术现在海洋藻类的监测中已经 有所应用，但到目前为止，能够检测的微藻只限于有限的几种，且d n a 在扩增等 反应过程中极其不稳定，对检测定量的准确性有很大的影响，该项技术不太适合 应用到海洋样品中的微藻实时监控研究。 图卜lc h r i s t o p h e ra s c h o l i n 等发展的夹心杂交技术示意图 因此迫切需要研究出针对赤潮藻稳定性、专一性强，简单又易于实现自动化 控制的分析技术，并建立自动化分析系统，定性、定量检测赤潮藻，以便准确、 实时地得到分析结果进而对赤潮发生的机率做出可靠的判断和预报。 13 2 双特异分子探针分析技术简介 在比较上述分析技术的基础上，课题组先前通过大量的理论及实验研究，采 用针对d n a 的s 1 酶保护分析探针和夹心杂交技术对藻类进行快速定性与定量分 析的分子生物学方法，即基于双特异分子探针分析技术，发展了一种全新的针对 于d n a 的定性定量分析方法，从而实现对浮游藻类的快速定性和定量。其关键在 于：设计以针对待检生物的d n a 特定区域的s l 保护分析探针为核心的一套相互 关联的探针；联合s l 酶保护分析和夹心杂交技术实现对d n a 的定性定量分析。 该分析技术如图卜2 所示，其实现步骤如下： ( 1 ) 分子探针的设计 s 1 酶保护分析探针的设计：通过测定生物的d n a 序列，进行多序列比较， 寻找出与待检测生物的特征序列；根据特征序列设计s l 酶保护分析探针，该探 针长约5 0 7 0 个核苷酸，设计时注意尽量不要有严重的发夹结构存在。 4 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 夹心杂交所需其他探针的设计：抓捕探针大约为1 5 3 5 个核苷酸，与s l 酶保护探针的一端互补：连接探针长约4 5 7 0 个核苷酸，与s 1 酶保护探针的一 端( 不同于与固定探针互补结合的一端) 互补。信号探针长约2 0 4 0 个核苷酸， 以地高辛、荧光素、生物素或者辣根过氧化物酶等作了标记，与连接探针的一端 ( 不同于与s l 酶保护探针互补结合的一端) 互补。 图1 - 2 基于双特异分子探针技术的赤潮藻检测分析过程示意图 ( 2 ) s l 酶保护分析 s l 酶是分子量约为3 2 0 0 0 的含z n “的糖蛋白，是一种单链特异性的核酸内切 酶，能将d k a 降解成为酸可溶性5 l p 核替酸，最终9 0 以上被降解为5 0 p 单核 苷酸。也可以降解双链核酸中的单链部分。如果所用s 1 酶的用量过大，则双链 核酸可以被完全消化i 而中等量的s l 酶可在切口或小缺口处切割双链b l q a 。箕 最适宜于p h 4 5 附近，作用时必需有辅因子z n ”，定浓度的e d t a 和磷酸化合 物，是该酶的抑制剂。其属于依赖z n ”的糖蛋白履，对热极其稳定，在底物存在 下6 5 7 0 仍能表现活性。 在本分析技术中约5 0 7 0 个核黄酸的s l 酶保护分专斤探针与待检烈生物的 o n a 杂交后，用适当浓度的s 1 酶消化去过量游离的探针：当该探针与其他非目 标d n a 反应时，由于杂交体存在切口或小缺口，s 1 酶亦能将该探针切断；最终 保留下与完全匹配的s 1 酶保护分析探针和目标生物的d n a 形成的d n a 双链，而 且该双链的量代表了样本中相应的d n a 的量。加入中和溶液后加热，即可变性 s 1 酶保护分析探针和目标生物的d n a 形成的杂合体，释放出保留下来的s 1 酶保 护探针。 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 ( 3 ) 夹心杂交与信号检测 预制夹心杂交的检测载体：即将抓捕探针固定于固体基质，通过高盐吸附、 化学合成或者亲和素与生物素作用结合固定在酶标板或者玻璃片、尼龙膜以及纤 维素膜上。 夹心杂交：保留有s 1 酶保护探针的溶液与预先固定于固体基质上的抓捕探 针杂交后，s 1 酶保护探针被特异性地抓捕在固体基质上；洗涤除去非特异的结 合；用连接探针与s 1 酶保护探针杂交；洗涤除去非特异的结合；用带有特殊标 记的信号探针再与连接探针杂交；洗涤除去非特异的结合。 信号检测：信号探针上可以标记上荧光信号，这样通过激发荧光来读取数据； 也可以在信号探针上标记上地高辛、生物素或者f l u o r e s c e i n 等，然后通过辣根 过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗体或者亲和素与之反应；最后加入发光底物或 者显色底物( t m b 或者n p p 等) ，通过探测发光强弱或者吸光度来判读信号。 1 33 基于双特异分子探针检测技术的应用 夹心杂交特异识别的关键是抓捕探针的特异性。一般情况抓捕探针长约 2 0 3 0 核苷酸，该探针要具有特异性，必须与其他非目标生物的d n a 分子有较 大的差异，尽管不同生物的d n a 在进化上会有差异，但在找到并成功验证亲缘关 系较近的生物之间的特异性探针并不是一件容易的事，这可能也是夹心杂交技术 发展到现在只有找到很少量抓捕探针的原因之一。基于双特异分子探针分析技术 中涉及的s 1 酶保护分析探针，尽管长度在6 0 个核苷酸左右，但并不要求探针全 长都要有特异性，而只要求探针的中间区域有几个核苷酸的差异即可，这大大方 便了特异探针的寻找和实现。 由于夹心杂交技术成功执行的关键之一在于保证d n a 分子在整个过程不被 降解，特别要保证抓捕探针与信号探针之间的那段目标d n a 分子( 可能在几十到 几百个核苷酸之间) 在整个实验过程的完好无损。但由于实验过程涉及抗原抗体 反应和多次洗涤步骤，这为d n a 酶对d n a 分子降解提供了较多机会，因此要保证 目标d n a 分子不被降解有非常大的难度。即使最终能够定性分析，但定量分析的 可信度也大大打了折扣。而基于双特异分子探针的检测技术中直接与d n a 分子相 关的过程只有s 1 酶傈护分析探针与d n a 分子杂交这一步，只要杂交裂解液加入 适当的d n a 酶抑制剂就能保证杂交时d n a 分子不被降解或很少被降解，实验操作 的其他步骤都是针对稳定的d n a 分子进行的，相对比较容易执行。因此基于双特 异分子探针技术的分析方法比其它夹心杂交技术有更好的稳定性。 目前，采用基于双特异分子探针分析技术已设计验证塔玛亚历山大藻探针、 海洋原甲藻探针、微型原甲藻探针、红色裸甲藻探针、裸甲藻探针、棕囊藻探针、 尖刺菱形藻探针、锥状斯克里普藻探针、中肋骨条藻探针、角毛藻探针等1 5 种 6 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 探针，在国际上首次用于生物体的定性、定量鉴定。该分析技术中分子探针间结 合的特异性更好，生化分析的数据可靠性更强，容易实现自动化控制。由此本课 题定位于基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动分析仪的研制。 1 4 研究目标、研究内容及技术路线 141 研究目标 将基于双特异分子探针分析方法与机械设计、精密仪器、工业控制、电机技 术、传感技术、通讯技术、计算机技术有机交叉融合，研制基于双特异分子探针 技术的船载近海赤潮自动化分析仪工程样机如图1 - 3 所示。实现用分子生物学方 法监控与预报赤潮，形成赤潮早期预瞀系统。一方面为在分子水平上开展赤潮研 究，进而从分子水平认识赤潮藻遗传特征打基础，另一方面，在赤潮生消过程中 展开对赤潮藻的实时检测，实现对赤潮灾害做出及时的预报，提高赤潮监铡的现 代化水平和海洋环境预报能力，减少海洋灾害给人们的生产生活带来的危害。 图卜3 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动分析仪工程样机 14 2 研究内容 7 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 根据研究目标，具体研究内容包括： ( 1 ) 自动分析仪总体设计 根据生化工艺分析方法的功能需求、与上级水样实时采集系统之闻的协议、 检测通量等技术要求以及船载作业的特殊性，合理安排检测工序和工位数，优化 自动检测工艺路线；兼顾进船舱及船舱空间小等实际情况，初步探讨分析仪中的 预处理模块、定量移液模块、s 1 酶保护分析模块、夹心杂交孵育模块、供应装 置模块、酶标洗板模块以及机械手动作的实现方案，完成分析仪的总体规划。 ( 2 ) 自动分析仪关键技术研究 考虑船载环境的特殊性，深入研究分析仪中的过滤、分离、超声破碎、定量 分液移液、不同温区、供应、摇匀等功能，设计相应定位机构以及液位检测，提 出实现方案，进行结构设计，研发可靠的功能模块，保证各模块的有机衔接。 ( 3 ) 自动分析仪虚拟样机技术“1 利用三维p r o e 软件强大的三维建模功能，对分析仪中的所有零部件进行三 维实体造型，通过虚拟装配，获得分析仪虚拟样机；运用a d a m s 仿真软件强大的 运动仿真功能，进行模块内部及分析仪的运动学分析，对设计进行检查和修改， 生成二维工程图，确定各零部件的加工制造尺寸和公差要求。 ( 4 ) 微型气动、液流控制系统设计 设计气动控制系统，以压缩空气为介质，实现动力传递和工程控制，兼顾船 载需要，减小各模块所占空间体积，采甩阀板集成技术及选用微型超薄型气缸； 采用具有电磁换向阀断电保持功能的双电控制方式，形成闭环控制，保证气动控 制的可靠性。设讦液流控制回路，实现水样接口协议及清洗功能等。 ( 5 ) 工作台、机械手的设计与选用 根据各模块情况，设计工作台，确定组合方案和尺寸。结合仪器的特点，考 虑位置精度、重复定位精度、运动控制方式及操作环境等因素，确定三维机械手 臂的尺寸及行程等。 ( 6 ) 自动控制系统的研究与开发 确定自动化生化分析仪电气控制系统方案，采用上位p c 机监控和下位单片 机实时控制模式。上位p c 机监控系统负责与船载环境监测系统、下位单片机实 时控制系统的通讯。下位单片机实时控制系统采用“单片枫十c p l d ”的设计模 式，采用集中控制方式，实现自动化生化分析仪各个仪器模块的自动控制“3 。 对机械手的运动轨迹进行规划和优化。针对机械手具有夹持定量移液器以及 转移酶标板双重功能，设计相应的机械手夹持机构；根据不同模块间的液体、酶 标板转移以及分子探针液定量添加等机械手的运动要求，规划和优化机械手的运 动路线。 ( 7 ) 调试和运行 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 零部件装配与各功能模块的调试；气动、液流回路系统的管路连接与调试； 电气控制系统的接线和程序的预调；整机安装与联合调试，检验分析仪可靠性实 验与测试结果分析；解决调试中出现的问题，实现分析仪正常运行。 1 4 3 技术路线 本研究技术路线如图卜4 所示。 9 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 图1 _ 4 技术路线图 1 0 基于取特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪吲埔4 2 分析仪的功能需求分析与总体结构 21 分析仪功能需求分析 211 分析仪的检测工艺研究 本分析仪的生化分析工艺：使用d n a 生物学方法，定性、定量检测近海海水 优势赤潮藻。 依据上述基于双特异分子探针分析技术，定性、定量检测具有优势地位的 1 2 种浮游生物。根据实验室研究结果，检测原理秘工艺由收集藻细胞、释放d n a 、 s l 酶保护分析( 第一阶段特异性杂交) 、夹心杂交( 第二阶段特异性杂交) 及信 号检测等部分组成，如图2 一l 所示。收集完藻细胞届需添加一定量的基因破碎剂， 并在超声波的辅助作用下，释放出d n a ，转移破碎后的藻细胞到s l 酶保护分析 器中，在恒温下进行变性处理，目的是将杂乱的单链d n a 进一步理顺，雨后转移 另一恒温区，添加定量的s 1 酶保护分析探针液，进行碱基配对，与目标藻单链 d n a 形成双链得以保护再转移该液体到另一恒温区中，进行变性处理，溶解捧 海水水样 u 收集藻细胞 u 释放d n a u s 1 酶保护分析 u 夹心杂交 点土 信号检测( 读数) 图2 - 1 分析仪赤潮藻检测原理图 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 未正确杂交的s l 酶保护分析探针及目标d n a 。随后将该液体分样1 2 份到提前预 最好对应抓捕探针的基质( 酶标板) 上，添加各探针液进行夹心杂交，来确定该 s l 酶保护分析探针的数量，最后通过酶标仪得到定量结果。具体的检测工艺流 程如图2 2 所示。 定量取样 超滤膜 添加基因破碎剂a 添加变性剂b 一 添加s 1 酶搡针c 添加酶切i 如一 海水水样 过滤分离 预置l 翻障抓捕探针 添加连接探针e 添加信号探针f 卜_ 添加中止试剂g 释放d n a 获得藻细胞 超声波辅助破碎 9 5 。c 温区一卜一变性处理 _ 。，_ _ _ 。- 。- - _ _ 。_ - _ 。- 。_ 。_ _ 。- _ 。一 4 2 c 温区卜一特异杂交( 1 ) 酶标板1 鎏塑堕墼塑 r 1 _ 一添加显色剂i 5 0 。c 孵育器 洗板 酶标仪比色 结果传输 特异杂交( 2 ) 弃 板 图2 - 2 检测工艺流程倒 上述检测载体( 即基质) 采用9 6 微孔酶标板，如图2 - 3 所示。酶标板的孔 为8 x1 2 排列，要检测个水样，可同时鉴定出1 2 种赤潮藻的数量，设计好的 相对应藻种的抓捕探针需提前预置在酶标板上，比如检测海水水样一中塔玛亚历 山大藻、海洋原甲藻、微型原甲藻、红色裸甲藻、裸甲藻、棕囊藻、尖刺菱形藻、 锥状斯克里普藻、中肋骨条藻、角毛藻等1 2 种优势赤潮藻的数量，需提前将相 应藻种的抓捕探针预置在水样一列i 12 孔内，通过基于双特异分析探针分析技 术便可确定每个藻种的数量，即并可提前预报赤潮发生的可能性大小。 2 1 2 分析仪的功能需求分析 本分析仪的用途：使用基于双特异分子探针分析技术，无人值守，自动运行， 对近海优势赤潮藻种进行定性、定量检测分析，得到相应的数据，为做好赤潮预 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 报提供准确度高，实时性强的第一手资料。 图2 - 3 酶标板及标记示意图 1 使用环境 分析仪的使用环境：安装于我国海洋环境监测2 l 号船上，随船作业航行于 渤海湾；外舱门宽6 0 0 r a m ，内舱门宽7 0 0 l i 】i n 。 2 集成系统要求 分析仪需要的海水水样由专题课题一( 船载海洋生态环境现场监测集成示范 系统) 提供，该系统设有四个水箱，其中一个为清水水箱，另外三个为实时采集 的取样点表层水、中层水及底层水水箱，各海水水箱定期排空，以便进行下一检 测站位水样采集。按照集成系统的协议要求，本课题符合专题课题一( 船载海洋 生态环境现场监测集成示范系统) 的整体集成设计；能通过本分析仪自控系统实 现有选择地分析表、中、底层海水水样；分析仪酶标比色读数结果( 即检测数据) 按照集成系统规定格式上传到中心机房的监控机。 3 消耗材料 本分析仪一次性使用的消耗品如图2 - 4 所示。其中高分子滤膜的作用是将海 水水样中的水分子与海藻细胞进行过滤、分离，并将基因破碎剂与海藻细胞滞留 在其上，以便超声波辅助破碎，安装在预处理模块中；5 m l 溶液管的作用是将裂 解破碎后的基因液进行存放，另一方面用在9 5 温区一和9 5 温区二中，作为 s l 酶保护分析的容器；2 m l 溶液管用在4 2 。c 温区中，同样起到s 1 酶保护分析的 容器的作用；吸液管分为单通道作业和八通道作业两种情况，当定量添加探针液 到酶标板上时使用八通道作业，单通道作业时是将溶液进行转移或添加各探针 液。 4 功能要求 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 ( 1 ) 将各海水水样中的优势海藻细胞准确测出 使用基于双特异分子探针分析技术，完成最基本的功能即在一个水样中检测 出1 2 种优势海藻细胞的定性、定量数据。 ( a ) ( b )( c )( d ) 图2 4 一次性消耗品外观图 ( a ) 高分子超滤膜( b ) 5 m l 溶液管( c ) 2 m l 溶液管( d ) 吸液头 ( 2 ) 全自动的连续检测 检测过程中的各项操作，均为自动执行，无需人工干预，并可通过控制系统 完成对各操作动作的协调控制和连续运行。 ( 3 ) 具有良好的耐腐性和整体刚性 分析仪的使用环境是随船作业，要有较好的整体刚性，确保机械手动作等准 确可靠，避免误动作的产生；选用具有良好耐腐蚀性的材料，延长分析仪的寿命， 并保证各动作的流畅。 ( 4 ) 具有一定的海水水样的储存能力 根据相关协议，上级水样实时采集系统要根据实际情况进行下一检测站位的 选择，并进行采集，各海水水箱需定期排空。因此本分析仪要具有一定的样品储 存能力。 ( 5 ) 具有紧凑的机械结构和可拆卸性 研究分析技术，合理确定检测工艺、工序，优化分析仪各组成模块间的布局， 使所设计的分析仪结构紧凑，所占空间位置小；要充分考虑到实验室研制与拆卸 上船的可行性。 ( 6 ) 良好的液路密封性 分析仪本身具有较多的管路，再加上过滤、分离进行的过程中水样的滞留， 要保证不漏水。一方面确保所测的数据是在同样体积的海水样品中进行，另一方 面，所溢出的水会随着船的摇摆到处流动，影响到电路及其它器件的安全运行。 ( 7 ) 具有2 0 个样品的通量处理能力和一定的并行处理能力 1 4 基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制 根据协议要求，在一次性消耗品更换到位的情况下，能自动化分析2 0 个样 品的能力；同时，由于预处理、恒温区以及夹心杂交等工序都需要一定的时闯来 进行，因此，要求机械手设定优先级中断响应，优化检测过程。 2 2 设计思想及分析仪的组成 2 2 1 设计思想“” 依据上述检测工艺流程，在对其进行功能需求分析的基础上，将基于双特异 分子探针的赤潮藻分析技术与机械设计、计算机控制技术、传感技术及电机控制 技术有机融合研发生