（环境工程专业论文）基于纤维素酶系功能基因生物传感器的研究.pdfVIP

幕于纤维紊酶系功能幕冈生物传感器的研究 摘要 工农业固体废物处置的一种非常有效的处理方式一一堆肥，这个过程中微生 物发挥着重要作用。对堆肥系统微生物种群跟踪监测，并对微生物功能基因动态 变化进行分析，有利于深入了解整个堆肥处理过程的微生物学机理，对微生物接 种和堆肥工艺革新具有一定的指导意义。 生物传感技术是一种对待测物快速、特异、实时、在线检测的新兴技术，它 利用生物识别作用对待测的物质进行分析测定，为环境污染物及其降解过程涉及 到的各种生物组分或代谢产物的分析检测提供了一个新的技术平台。 本文着重开展基于基因传感技术的堆肥系统微生物种群功能基因的跟踪监 测。研制出检测环境中高效降解纤维素的纤维素酶功能基因动态变化的d n a 传 感器，克服了传统的分析检测方法在环境污染控制过程实时在线检测等方面的局 限性。主要针对纤维素降解的一种关键酶一一纤维二糖水解酶( c b h ) 进行研究。 在n c b i 网站查询瑞氏木霉c b h i i 所有基因序列，根据序列运用软件分析所有序 列之间的同源性，根据同源性分析寻找到功能基因所存在的序列段，应用探针设 计软件在功能基因序列段设计杂交探针以及p c r 引物。 首先多壁碳纳米管一高分子导电聚合物复合膜以及a u s i 0 2 f e 3 0 4 核壳型纳米 材料两种纳米材料作为固定d n a 载体。载体上组装带n h 2 的瑞氏木霉纤维二糖 水解酶i i 型编码基因制成d n a 传感器，进而与目标链、信号链进行竞争型杂交。 并对载体用量、酶标用量、杂交时间等杂交条件进行优化。 基于羧基化多壁碳纳米管与电聚高分子物质( p e d o t ) 复合膜的d n a 传感器。 于j 用m w c n t s p e d o t 复合膜修饰电极能更有效地改善电极的导电性，增强传感 器的灵敏度，但带羧基的多壁碳纳米管不仅能与带n h 2 的瑞氏木霉纤维二糖水解 酶i i 型编码基因交联结合，还能与后续h r p 酶标蛋白质物质结合，实验存在干 扰仍需要进一步改良。 利用纳米颗粒粒度适中、分散性易控制，生物相溶性高以及合成成本低等优 势，运用纳米金原位扩增技术制各了一种金硅铁三层复合型核壳磁性纳米颗粒， 研制成竞争式杂交识别c b h i i 基因的电化学纳米d n a 传感器，检测下限达到10 叫 m ；并深入进行菌株堆囚组提取、p c r 技术提取纤维素酶c b h i i 编码基因，并将 提取的d n a 链运用于核壳型磁性纳米材料为d n a 载体的d n a 传感器中，做更 进一步的探讨。 关键词：堆肥；生物传感晶；核壳磁性纳米颗粒；瑞氏木霉菌；纤维二糖水解酶 硕十学f ? 论。之 a b s t r a c t c o m p o s t i n gi sc o n s i d e r e da sau s e f h lp r o c e s sf o rt h ed i s p o s a lo fm u n i c i p a la n d a g r i c u l t u r a ls o l i dw a s t e ，i nw h i c he n z y m e sp l a ya ni m p o r t a n tr o l e t bm o n i t o rt h et r a c e o fm i c r o b i a 】c o m m u n i t yd y n a m i c sa n dt h ef u n c t i o n a lg e n e si n c o m p o s t i n gs y s t e m ， w h i c hi sf a v o r e dt h et h o r o g hi n v e s t i g a t i o no ft h em i c r o b i a lm e c h a n i s mi n w a s t e c o m p o s t i n gp r o c e s sa n d e f f i c i e n ti n s t r u c t i o no ft h em i c r o b i a l i n o c u l a t i o na n d c o m p o s t i n gt e c h n i q u er e n o v a t i o n b i o s e n s i n gt e c h n o l o g yi san e wa p p r o a c hf 0 r r a p i d ，s p e c i f i c ， r e a i t i m ea n d o n 一1i n ed e t e c t i o no f a n a l y t e sb a s e do nb i o m e t r i ci d e n t i f i c a t i o n w h i c hh a sc a p a c i t yf o r r e a l - t i m ea n do n - “n ed e t e c t i o ni nc o m p l e xs y s t e mi nc o m p a r i s o nw i t hc o n v e n t i o n a l a n a l y t i c a lm e t h o d s ， a n dp r o v i d e san e wt e c h n i c a l p l a t f o r mf o rt h ea n a l y s i sa n d m e a s u r e m e n to fc o n t a m i n a n t sa n dv a r i o u sb i o l o g i c a lc o m p o n e n t so rm e t a b o l i t e si n r e l a t i v ed e g r a d a t i o n t h ep a p e rf o c u s e so nt h et r a c eo fm i c r o b i a lc o m m u n i t yd y n a m i c sa n dt h e f u n c t i o n a lg e n e si nc o m p o s t i n gs y s t e m c o n s t r u c t i n ga b i o s e n s i n gt e c h n o l o g yf o rt h e d e t e c t i o no fc o n t a m i n a n t sa n dt h e d y n a m i cc h a n g i n go ff u n c t i o n a l g e n e sa n d m e t a b o l i t e si nc o m p l e xe n v i r o n m e n t ，w h i c ho v e r c a m et h el i m i t a t i o no fc o n v e n t i o n a l a n a l y t i c a lm e t h o d sa p p l i e d i ne n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o nc o n t r o l i nt h e a s p e c t so f r e a l - t i m ea n do n li n ed e t e c t i o n ，a n de t c c e l l o b i o h y d r o l a s e ( c b h ) i sa k e ye n z y m ei n c e l l u l o s ed e g r a d a t i o n f i r s t ，a l lt h eg e n es e q u e n c e so fc b h i ii n7 y f c 乃o ( ，p ，聊口，p p s p f w e r ef b u n do nn c b i ， a n dt h eh o m o l o g yo fa l lt h e s e q u e n c e sw e r ea n a l y s i s e d a c c o r d i n gt or e s u l t so ft h ea n a l y s i s ，s o f i t w a r ed e s i g nh y b r i d i z a t i o np r o b e sa n dp c r p r i m e r sa u t o m a t i c a l l y m u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s m a c r o m o l e c u l ec o n d u c t i v e p o l y m e rc o m p l e x m e m b r a n ea n dm a g n e t i ca u s i f ec o r e s h e l ln a n o p a r t i c l e sw e r ef a b r i c a t e da sad n a c a r r i e r ，w h i c ha s s e m b l yw i t hp r o b e so fc b h i ii nt r i c h o d e r m ar e e s e i t h e ns i g n a la n d t a r g e tp r o b e sh y b r i d i z a t i o nw i t ht h ec a p t u r ep r o b e s c o m p e t i t i v e l y ， t h ea m o u n to f e n z y m ea n dc a r r i e rd o s a g e ， h y b r i d i z a t i o nt i m ea n do t h e rh v b r i d i z a t i o nc o n d i t i o n s w e r eo p t i m i z e d d n as e n s o r sb a s e do nm u l t i w a ll e d c a r b o n n a n o t u b e s p o l y( 1 e t h y l ( 3 d i m e t h y l l a m i n o p r o p y l )c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e )c o m p l e xm e m b r a n e u s eo f m w c n t s p e d o tc o m p o s i t en l mc a nb em o r ee f t e c t i v e i m d r o v e dt h ee l e c t r o d e c o n d u c t i v i t ya n de n h a n c e ds e n s i t i v i t yo ft h es e n s o r b u tw i t hac a r b o x v l i cm w n t s 黑竺羔：恐= 掣兰篙羔：禁：嚣：意：爻：l 篙： 攀厅霉烹1 l p 然竺_ 篇n 嚣e = 叭茹= i 。m 叫m v e t h es u r f a c e a ne l e c t r o c h e m i c a l n a n ou n as 叭搭u i u 4 3 。 一 j ：f h y 譬警：二慕黧三兰三：三三三三嚣篇二二：兰：= ：；蔷：= 三： 1o 。1 3m c o m b i n i n gd n a e x t r a c t l o na n dp o l y m e i a s c 叭1 。d 。”“i 一7 ：。l 兰，m 。二篙篇。三= 翟：篡n ；r ：r 篙三= i ：三：i 淼 f o rm e a s u r e dc b h l lg e n ef r a g m e n t s t r o ml 删1 u u 洲m “”“ 6 k e yw 。r d s ：c 。m p 。s t i n g ；b i 。s e n s 。r ；m a g n e t i c c 。r e s h e l ln a n 。p a r t i c l e s ；：玲f c 办。d 台r 聊口 r e e s e f ：c e l l o b i o h y d r o l a s e i v 坨 盯 让 m 暑 吖 w 如 佗 矾； n 虮 r 口 几 铲 坨 o 叫 鹏 嘲懈口 出 一 叫衙 町 眙 m m n e b 姹 c 世 m ：毳 e b 计 呛 m 弘 w 小 y 毗 m c o p似胍 基于纤维裘酶系功能堪生物传感器的研究 插图索引 图1 1 纤维素分子结构示意图1 图2 1 修饰玻碳电极制备流程图1 2 图2 2 玻碳电极在0 1mk c l 1m mk 3 f e ( c n ) 6 溶液中的性能测试图1 4 图2 3n a n o n 浓度优化图15 图2 4m w c n t s 浓度优化图15 图2 5m w n t s 分别在水和0 5 n a n o n 中分散3 0 天后的效果对比1 6 图2 6 多壁碳纳米管存在下e d o t 电化学聚合反应的循环伏安曲线1 6 图2 7 不同电极在p b s 溶液中的循环伏安图17 图2 8 不同电极在1m mf e ( c n ) 6 3 。f e ( c n ) 6 4 0 1mk c l 溶液中的交流阻抗图1 7 图2 9 杂交前后的交流阻抗图1 8 图2 1 0 杂交前后的循环伏安图1 9 图2 1 1d n a 杂交酶标后计时电流法( i t ) 扫描图1 9 图2 12 未固定d n a 直接酶标计时电流法( i t ) 扫描图2 0 图3 1 纳米颗粒制备示意图2 3 图3 2 杂交示意图2 4 图3 3 纳米颗粒扫描电镜图2 5 图3 4a u s i 0 2 一f e 3 0 4 纳米颗粒x 衍射图2 6 图3 5 不同杂交温度的影响2 7 图3 6 不同杂交时问的影响2 7 图3 7 不同链亲和素标记辣根过氧化物酶的量的影响一2 7 图3 8 不同杂交成分结果2 8 图3 9 不同信号探针浓度的自然对数与电流响应值的关系2 9 图3 1 0 不同信号探针浓度的自然对数与电流响应值的关系2 9 图4 1 粗提d n a 琼脂糖凝胶电泳图3 8 图4 2p c r 反应后琼脂糖凝胶电泳图3 8 图4 3 循环伏安叠加图4 0 图4 4 回收p c r 产物i t 值与标准曲线对比图4 0 附表索引 表1 1 纤维素酶家族一4 表2 1 在本研究中用到的低聚核苷酸序列1 3 表4 1 在本研究中用到的低聚核苷酸序列3 2 表4 2p c r 反应体系上下游引物3 2 表4 3 在本研究中用到的低聚核苷酸序列3 3 表4 4p c r 反应体系上下游引物特性3 5 表4 5p c r 反应体系一3 5 i x 硕 ：学位论文 1 1 纤维素 第1 章绪论 纤维素是地球上最丰富的天然高分子，是人类最宝贵的天然可再生资源，是 植物细胞壁的主要成分，约占植物秸秆干重2 5 5 0 ，也是自然界存在的分布最 广、含量最多的一种多糖。纤维素分子是由d 吡喃式葡萄糖基通过1 ，4 d 一糖苷键 连接而成的线性且不分支的同聚多糖，几十个纤维素分子平行排列组成小柬，几 十个小束则组成小的纤维，最后由许多小纤维构成一条植物纤维素。纤维素链之 间通过氢键的缔合作用而形成纤维素束，密度大的地方平行排列，定向良好，形 成纤维素的结晶区。密度小的地方定向变差，形成纤维素的无定形区。纤维素的 结晶程度对纤维素酶的敏感度有极大的影响，结晶度低，吸水性大，毛细孔大， 易被扭动，对酶的敏感性也就大。纤维素分子的经验式为( c 6 h l 0 0 5 ) n ，其中n 是 葡萄糖苷键数目，通常称为聚合度d p ，纤维素分子的聚合度的变化很大，一般 在8 ，o o o 1 0 ，o o o 个葡萄糖残基左右l lj 。纤维素分子中含碳4 4 4 4 、氢6 1 7 和 氧4 9 3 9 。 结构如图1 1 所示： o 图1 1 纤维素分子结构示惫图 纤维素是世晁上蕴藏量最丰富的天然高分子化合物，绝大多数由绿色植物通 过光合作用合成1 2 j 。据估计，地球纤维素每年通过光合作用的更新量约为4 o 1 0 加 吨i jj ，其中纤维素、半纤维素占一半以上，但只有极少部分为人们所利用。全世 界农作物秸秆年产餐超过2 0 亿吨，仅我国每年秸秆产量就高达7 亿吨。由于其中 含有大量的纤维素，营养价值低难以被畜禽利用，因此只有很少一部分用作饲料， 少量用来过腹还h j 或卣接还阳【4 1 ，而大约有4 5 4 7 作为燃料补充农村能源不 足，1 5 以烧荒形式烧掉或丢弃。秸秆直接利用率较低，如不对这类纤维素废物 加以有效地利用，不仪会严重污染环境，而且也造成资源的极大浪费，因此探索 基于纤维素酶系功能幕闭生物传感器的研究 纤维素类废弃物的处理措施，对其进行有效利用是2 l 世纪的重大课题。 2 0 世纪7 0 年代，美国、日本、德国等发达国家已工业化生产纤维素酶制剂， 它可将丰富的纤维资源转化为可再生资源，对解决环境污染、饲料和食品短缺、 能源危机具有重大现实意义。我国2 0 世纪7 0 年代，也开始这方面的研究，并在 酒精、白酒、酱油等行业进行实质性的应用。人们开始对纤维素酶进行大量的研 究和探讨，越来越引起人们的重视，利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤 维素则是纤维素利用的有效途径。目前，对纤维素类物质的有效合理利用主要采 用生物法，即利用微生物发酵农作物秸秆，生产纤维素酶和蛋白饲料；用秸秆材 料生产酒精、生物柴油、微生物制氢和甲烷等工业产品。微生物对纤维素的降解， 就是通过分泌到胞外的游离纤维素酶，以水解酶机制和氧化酶机制降解纤维素【5 j 。 该方法具有污染少、效率高、利于工业化生产等特点，已逐渐成为纤维素类物质 综合利用的主要途径。同时，随着分子生物学和遗传工程的迅猛发展，国内外学 者在混菌发酵以提高纤维素酶活力的菌株选育，发酵工艺方面做了大量工作，进 一步扩大了纤维素酶的应用领域。 随着石油和煤炭资源的日渐枯竭，纤维素的降解和利用越来越受到人们的重 视。纤维素酶在充分利用农作物秸秆等农副产品废弃物、降解秸秆中的纤维素、 开辟新的粮食和能源方面具有巨大的潜力。利用纤维素酶降解纤维素的优点在于 特异性高，反应条件温和，环境污染小。随着人们对纤维素酶分子结构及作用机 理等各方面的研究工作的深入，纤维素酶必将在食品、饲料、环境保护、能源和 资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用。纤维素酶将是很有发展前途的新兴 产、i 匕之一。 1 2 纤维素酶 纤维素的生物降解现象早在18 8 6 年就被发现，19 12 年首次将“纤维素酶 ( c e l l u l a s e ) ”的概念引入文献中，但直到l9 5 0 年之后才有纤维素酶相关的系统性 文章报道。 1 2 1 纤维素酶的组成 按照微生物对纤维素酶的分泌性和所产纤维素酶系活性之间的关系，大体可 分成三类：( 1 ) 对天然木质纤维素的降解能力比较弱，但可以大量合成町分泌到 胞外的纤维素酶，如常见的木霉、青霉等的纤维素酶系；( 2 ) 对天然木质纤维素 降解能力强，但分泌到胞外的纤维素酶活力较低，如担子菌纤维素酶系；( 3 ) 对 天然纤维素分解能力强，但其纤维素酶基本不分泌到胞外，而是存在于细胞擘上， 如细菌的纤维索酶系1 6 j 。 其次，固内外多根据纤维素酶的底物、作用位点和释放产物将其分为三类7 l ： 2 硕i j 学位论文 ( 1 ) 内切葡萄糖苷酶( e n d o 一1 ，4 一p d 9 1 u c a n a s e ，e c 3 2 1 4 ，简称e g ) ，其分子 量介于2 3 1 4 6k d a 之间。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解 p 。1 ，4 糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的纤维素小分子， 如纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖。如真菌的异构酶e gi 为5 3k d a ，e gi i i 约为 4 9 8k d a ，而纤维粘菌e g 有两种菌的内切酶分子量只有6 3k d a 。 ( 2 ) 外切切葡萄糖苷酶，或称纤维二糖水解酶( e x o 1 ，4 p d 。g l u c a n a s e ， e c 3 2 1 9 l ，c e l l o b i o h y d r o l a s e ，简称c b h ) ，分子量介于3 8 11 8k d a 之间这类酶 作用于纤维素线状分子末端，水解p 1 ，4 糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子， 从而破坏纤维素分子。如木霉的c b h 两种异构酶，c b h1 分子量约为6 6k d a ， c b hi i 约为5 3k d a 。 ( 3 ) p 一葡萄糖苷酶( p - g l u c o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 l ，简称b g ) ，这类酶将纤维二糖 水解成葡萄糖分子有胞内酶和胞外酶之分，分子量介于4 7 7 6k d a ( 胞外酶) 或 9 0 10 0k d a ( 胞内酶) 之间。这类酶可水解初级水解产生的纤维二糖，生成d 葡萄糖。 除了上述三大组分外，真菌中参与纤维素降解过程的还有一些短肽类化合物、 “氢键酶”、纤维二糖脱氢酶等1 8 】。它们通过氧化作用或者破坏氢键来降解纤维素 分子。 此外，纤维素酶属于糖苷水解酶。随着糖苷水解酶的氨基酸序列和3 d 结构 研究的不断增多，以及各种催化残基鉴定方法出现，在氨基酸序列相似性基础上 确立的新的糖苷水解酶分类方法将糖苷水解酶分为1 1 1 个族【9 1 ，纤维素酶占其中 的1 6 个族。对5 、6 、7 、9 、4 5 族的催化机制和功能氨基酸的研究成果较多。依 据c a r b o h y d r a t e a c t i v ee n z y m e s ( 法国，有关碳水化合物和酶的数据库) 以及相关 文献9 ，1 0 】，表1 1 列出了糖苷水解酶类纤维素酶分族的催化核心、作用机制、空间 结构以及与传统纤维素酶分类的关系等信息】。 1 2 2 纤维紊酶的理化性质 1 、等电点 等电点( p i ) 是蛋白质分子重要的理化特征。纤维素酶系中各酶系组分的等电 点随菌种来源、培养条件的变化而异。一般认为，木霉属真菌所产的c b h i 的p i 值约为4 2 ，c bh i i 的p i 值约为5 9 ，真菌e g i 的p i 值约为4 7 ，e g i i l 的p i 值大多为 4 8 5 6 ，b g 的p i 值约为7 5 8 5 。 2 、最适温度和最适p h 值 酶反应存在着一个最适温度范围。般纤维素酶的最适温度范围为4 0 6 0 。c 。 纤维索酶备组分热稳定性也存在差异，内切酶( c x ) 的最适温度范围为5 0 6 0 。c ，热 稳定性好，在9 5 。cu 、j 仍保留一一般的酶活性；不同来源的b 葡萄糖苷酶的最适温度 基于纤维豪孵系功能基冈生物传感器的研究 表1 1 纤维素酶家族 注： a ) g h f ： g l y c o s i d eh y d r o l a s ef a m i l y ； b ) s t e r e o c h e m i s t r ym e c h a n i s mo fe n z y m e h y d r o l y s i ss u b s t r a t e ：r r e t e n t i o nm e c h a n i s m i i n v e r s i o nm e c h a n i s m 【1 2 】：c ) n d ：n o td e t e c t e d 范围一般为5 0 6 0 。c 【1 3 ，14 1 。 纤维素酶酶活对环境p h 值很敏感，不同菌种、不同组分的纤维素酶最适p h 值有差异。如曲霉、青霉及木霉产生的酸性纤维素酶，一般在酸性环境p h 4 0 5 o 具有较高活性。 3 、纤维素酶的多样性 产纤维素酶微生物一般不会只产一类纤维素酶的组分。试验证明，z p 肌p r s d 胛f f 的胞外酶包括三种b g 、四种c x 酶和五种外切酶。即使只产生一类纤维素酶组分， 也往往有很多种不同的形式。同时，有些菌能在细胞外、细胞内和细胞壁上产生 几种不同的b g 。同一微生物，也可能因为不同的地区来源、不同的培养条件而使 得纤维素酶的成分有很大的差别，这也属于纤维素酶多样性的表现。 4 、纤维素酶的诱导性 真菌纤维素酶是诱导酶，在诱导物存在下才能产生酶。许多不可溶性的纤维 素、可溶性的纤维素衍生物、一些低聚糖类以及一些单糖和二糖均可以作为纤维 4 硕 ：学位论文 素的诱导物。研究发现，纤维素、纤维二糖、槐糖和纤维素衍生物等都能诱导里 氏木霉以及绿色木霉产生纤维素酶。然而值得注意的是，纤维二糖、葡萄糖等低 分子可溶性糖在低浓度时有促进作用，而较高浓度时便存在着抑制作用。当然， 对于不同的微生物来说，同一浓度或者同一物质也可能有着不同甚至完全相反的 作用。到目前为止，人们对纤维素酶合成的真正诱导物的产生仍存有争议，尚需 要做进一步的研究。 1 2 3 纤维素酶的来源 纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真 菌等都能产生纤维素酶，不同来源的纤维素酶其结构和功能相差地很大。 大多分解纤维素的细菌属厌气性，生长慢，往往产生大量粘液并且产生的纤 维素酶不是胞内酶而是吸附在细胞壁上，不能分泌到培养液中，于是便增加了提 取的难度。分解纤维素的细菌中，研究比较多的有纤维素粘菌属( c y ，d p 办口g 口) 、生 抱纤维粘菌属( 印d ，d 钞咖厅口g 口) 以及纤维杆菌属( c p ，“肠聊d 疗口s ) 。工业上很少采用细 菌来产生纤维素酶。有关产纤维素酶的放线菌研究的也很少，分解纤维素的能力 也相对的比较弱。分解纤维素能力较强的放线菌是黑红旋放线菌似f ，f 刀d m y c e s 聊e 肠”d 钞c 彪s ) 、玫瑰色放线菌( 爿加s p z ，s ) 、纤维放线菌( 彳c p ，z ，肠s 口s p ) 以及白玫瑰放 线菌。 目前，研究生产纤维素酶的微生物大多属真菌，如木霉属、曲霉属、毛霉属、 根霉属、青霉属、裂桐霉属、耙霉属、漆酶属、葡萄状穗霉属、抱霉属、阿氏菌 属等。这些微生物分解纤维素时有一个共同的特点，即合成胞外纤维素酶，但有 少量的微生物合成纤维素酶簇降解结晶纤维素【1 5 】。由于木霉产生纤维素酶活力最 高，所以目前研究最多的纤维素降解菌是木霉属( 乃j c 厅d 沈，删口j p 矽) ，如z r e p s e f ， 丁v 打f 如，z 幻刀f ，? g f f 和z 芦p “幽尼d 甩f 刀g f f 。我国在纤维素酶生产上应用的菌种大多 也属于木霉。 1 2 4 纤维素酶分子结构 纤维素酶分子结构和功能的研究始于2 0 世纪8 0 年代，由于来源于真菌的纤维 素酶大多是糖蛋白，难以得到完整的纤维素酶晶体，很长段时期内仅对纤维素 酶的结构域进行研究。不同来源和组分的纤维素酶分子之间分子量差别较大，但 纤维素酶分子都具有类似的级结构。19 8 6 年t i l b e u r g 【1 6 】用木瓜蛋白酶有限酶切 里氏木霉( z 厂p g s g f ) 的纤维二糖水解酶，得剑两个具有独立活性的结构域：一个是 具有催化功能的球状结构域( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) ，另一个是具有结合纤维素功 能的结构域( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) ，两者，乙问由一段高度糖基化的l i n k e r 相连f 1 7 】，即通过个富含脯氨酸或羟基氨琏酸的的连接桥( 1 i n k e r ) 相连。整个分子 呈楔形，球状核区表示包含催化位点和底物结合位点的c d 区【1 8j 。 摹于纤维袭酶系功能筚冈生物传感器的研究 从酶分子的高级结构来讲，不同来源的酶分子又具有不同的高级结构。如 c ，o s ，f 疥“脚c p ，甜肠1 ，d ，口刀s 包括两个多纤维素酶小体，每个小体又包含九个相同组 分的亚单位，而其中一个小体的酶活性是另一个小体活性的4 倍f 1 9 】，足以说明纤 维素酶组成的复杂性。 1 2 5 纤维素酶分子的作用机制 通常认为在纤维素的降解过程中，首先是纤维素酶分子吸附到纤维素表面， 先由内切酶在葡聚糖链的随机位点水解底物产生寡聚糖，然后由外切酶从葡聚糖 链的非还原端进行水解，主要产物为纤维二糖，最后纤维二糖被p 葡萄糖苷酶水 解为葡萄糖【2 0 23 1 。 研究表明，三种主要纤维素水解酶在酶解基质上并不具有明显的专一性，同 一种水解酶的不同异构体也有不同水解效果，导致了纤维素酶作用机制假说的多 样性。这些假说之间的区别主要体现在对各组分间作用顺序和部位及协同作用的 分子学机理等方面，但对于各组分间存有很强的协同作用及部分单一组分的水解 效果具有一定共识【“】。 最先有人提出c l 酶首先作用于纤维素，使这一部分被活化( 即起着活化因子 的作用) ，接着c x 酶在活化的部位与c l 酶协同作用分解纤维素【25 1 。但根据 p e t t e r s s o n 等人报道，在水解天然纤维素中起关键作用的c i 酶实际上是外切型 p 1 ，4 葡聚糖纤维二糖水解酶，并提出天然纤维素的水解是内切型的p 一1 ，4 葡聚糖 酶( c x 酶) 开始【2 6 1 ，具体的情形是c x 酶首先在为纤维上一些特定的薄弱位置把纤 维素分子链打开，c 。酶接着深入到纤维素分子链把氢键打开，这样就使一段段纤 维片断从微纤维上脱落下来，脱落的纤维素片断再经c x 酶和b 葡萄糖苷酶作用， 形成葡萄糖。 关于内切酶与外切酶之间协同作用的研究报告己大量出现。不同好氧真菌发 酵液之间内切酶与外切酶之间的交叉协同作用( c r o s s y n e r g i s m ) 也己被证实【2 7 j 。 w b o d 等还报道过好氧真菌纤维二糖水解酶与厌氧真菌和厌氧细菌纤维素酶问的 协同作用。 s i n n o t t 从化学机制角度在分子水平上研究阐述纤维素酶催化糖基转移机制， 认为糖菅配基的离去是涉及到两个氨基酸残基的酸碱催化反应。负责催化的氨基 酸通过底物异头碳原子位构型的保留或转化完成催化反应【2 引。但由于纤维素酶作 用的底物具有高度复杂性以及底物的多样性，纤维素水解过程的具体细节并没有 完全研究清楚。因此，纤维素酶系的降解机理还有待进一步研究和探讨。 1 2 6 纤维素酶基因结构 迄今为止，人们己经从4 0 多种细菌和数百种真菌中克降到了纤维索酶罐因， 其中大部分的核苷酸序列已被测定。比较各类纤维素酶基凶具有较多共同的特征 6 硕j ：学位论文 性结构，但不同纤维素酶基因的同源性甚低。真菌的同一类型的纤维素酶基因有 较高的同源性，但同一菌种不同类型的纤维素酶基因的同源性相对较低。真菌的 纤维素酶基因中，内含予的数目一般为2 3 个，所处的位置保守性较低，长度一 般在4 0 8 0 b p ，比高等真核基因的内含子要短得多【2 4 1 。对于真核纤维素酶的基因 的了解。目前主要来源于里氏木霉的分子生物学研究。已经克隆c b hi 、c b hi i 、 c b hi i i 、c b hi v 、e gi 、e gi i i 、e gv i i 和b g 【2 9 】8 个基因，都在e c d ，f 中得到 了表达，并测定了这些基因的核苷酸序列【3 0 】。 绿色木霉中编码内切葡聚糖酶e gi 的基因e g l l 进行了克隆和异源表达。发 现e g l l 其中编码一个含4 6 4 个氨基酸的多肽与里氏木霉e gi 有9 3 8 的同源性 【3 l ，3 2 】 o 绿色木霉的c b hi 和c b hi i 基因也己被克隆并测序【3 3 弓酬。绿色木霉c b hi 与里氏木霉c b hi 基因序列同源性达9 5 。绿色木霉c b hi 基因的外显子和内含 子其数量、长度和相对位置与里氏木霉c b hi 基因极为相似：有4 个外显子， 外显子总长相同( 1 4 l3 b p ) ，核苷酸序列同源性高达9 1 ；有3 个内含子，总长( 19 6 6 p ) 较里氏木霉c b hi 基因的内含子总长多2 6 p ，两者核苷酸序列同源性仅为5 7 。 康宁木霉纤维素酶c b hi 和c b hi i 基因被克隆【3 7 ，38 1 ，并对其序列进行了分析， 分别发现与里氏木霉c b hi 基因仅在非编码区有六个碱基的差异，因而可以编码 相同的c b hi ，发现与里氏木霉c b hi i 基因己知序列的同源性达到9 9 8 9 。 同时也发现里氏木霉e g n 与裂褶菌e gi 基因的同源性也较高，从这些结果 可知，不同类型的纤维素酶基因的进化是各自独立的，在进化之初可能只存在一 个纤维素酶基因，它编码糖酵解酶的前体，但由于进化选择，这一基因发生了突 变，通过这种歧异进化，形成一个复杂的纤维素酶基因家族。 1 2 7 纤维素酶分子生物学发展方向 纤维素物质是产量巨大的可再生资源，如何成功开发这一资源，对人类的可 持续发展具有非常重要的意义。随着人们对纤维素酶研究工作的深入，纤维素酶 必将在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作 用。 纤维素酶工业化生产要求根据不同情况提高酶的产量、改善外分泌性、耐热 性和耐低温性等性状。这些要求促使科研工作者一方面筛选天然优质的产酶菌株， 一方面改造已知的纤维素酶，以期获得优质高效纤维素酶。在提高酶的产量方面， 近年来对二于二纤维素酶基因克隆的研究较多。由于e c d f ，不能外分泌蛋白质，所以 将纤维素酶基因克隆至0 大肠杆菌中并予以表达仅限于实验室。目前，大家更多地 将日光投向真核表达系统。毕赤酵母作为一种非常优秀的真核表达系统己经被越 来越多的学者所使用。采用毕赤酵母表达系统单独表达纤维素酶系的各科，组分， 基于纤维素酶系功能幕冈生物传感器的研究 然后按照不同的应用目的将纤维素酶的各种组分以一定的比例混合，可更有效的 和更为广泛的适应不同应用过程对纤维素酶各组分比例的不同要求，从而显著提 高纤维素酶的使用效果。而将不同组分单独表达对研究各组分间的协同作用机理 也有着巨大的好处。其次，木霉本身也是优良的外源基因表达系统之一，而且木 霉具有十分成熟的批量发酵技术，还具有较强的蛋白质胞外分泌能力，所以将高 效的纤维素酶基因克隆到木霉中也将是十分具有商业诱惑力的课题之一。 1 3 纳米材料在生物传感器中应用 生物传感器技术是世界各国都非常重视的一项高新技术，它是将生物技术、 材料技术、纳米技术、微电子技术等结合起来形成的新兴高科技产品，是以生物 活性单元( 如酶、抗体、核酸、细胞等) 作为生物敏感基元，对被测物具有高度选 择性的检测器。生物传感器是由含有固定化生物物质的分子识别部分( 如酶、抗体、 全细胞、细胞器或其联合体) 和换能器组成的分析体系，可将生化信号转化为电信 号，并以离散或连续数量表达出来，从而得出被分析物的浓度。 d n a 生物传感器是一种能将被测d n a 的存在转变为可检测的电信号或光信 号的传感装置。和其他传感器一样，包含两部分，一部分是分子识别元件，即d n a 探针，另一部分是换能器。识别元件主要用来感知样品中是否含有待测目标d n a ( 或多少待测目标d n a ) ；换能器则将识别元件感知的信号转化为可以观察记录 的信号( 如电流大小、频率变化、荧光和化学发光强度以及光吸收程度等) 。d n a 生物传感器的设计通常是将s s d n a 探针固定在一定的敏感元件上如电极上，通过 分子杂交，与另一条含有一段互补碱基序列的s s d n a 进行识别，形成的双链d n a 。 d n a 的杂交反应在识别元件上直接完成，换能器把杂交后的d n a 信息通过换能 器将杂交过程1 39 | 。 1 3 1 载体型磁性复合纳米颗粒用于生物传感器 磁性高分子微球凶具有粒度、分散性难控制，生物相溶性低以及合成成本高 等缺点。近年来，国内外学者应用无机材料对磁性颗粒进行一系列改性，合成无 机磁性复合纳米材料。无机磁性复合材料备受关注，其中研究较多的为f e 3 0 4 a u ， f e 3 0 4 s i 0 2 ，f e 3 0 4 t i 0 2 三种无机磁性复合材料。 f e 3 0 4 a u 型具有很好的应用前景，原因在于金纳米复合颗粒合成简单，并且 胶体金又具有与含琉皋的抗体、疏基修饰寡核昔酸探针牢同结合等特性，已被广 泛用于免疫组化以及核酸杂交枪测等领域。国内外对其研究也最为活跃1 4 肌4 4 j ；催 亚丽【4 仉4 2 】等对纳米级f e 3 0 4 a u 复合粒予的合成及其光学一陀质进行了一系列详尽 的研究分析，证实该纳米粒予的核壳结构。在浓度小于0 0 5m 的磷酸盐缓冲液中 粒子具有较为稳定的光学吸收特点，使该新型纳米复合粒予在生物医学领域中的 硕l ：学位论艾 应用奠定了基础。f e 3 0 4 a u 纳米粒子除具有磁性粒子的可分离性、胶体金表面生 物分子可固定化等特点外，还具有纳米光学效应，这将使该新型材料有更为广泛 的应用研究。 纳米t i 0 2 无毒、性能稳定，具有抗化学和光腐蚀、光催化活性高、对水污染 中有机物降解无选择性、矿化彻底、无二次污染等优点，但纳米t i 0 2 颗粒较小， 做成催化剂，使用时易流失，难以回收，若制成催化膜则存在很多技术和经济上 的问题【4 5 1 。f e 3 0 4 是一种磁性材料，可被磁铁吸附，把t i 0 2 包覆在f e 3 0 4 表面， 可以用外加永久磁铁将其从废水中吸附出来，使之与母液分离。同时，制备过程 中渗入微量的f e 3 + 能降低t i 0 2 的禁带宽度，使吸收波长范围扩展至可见光区域 【4 6 ，4 7 1 ，提高光催化效率，所以近年来关于f e 3 0 4 t i 0 2 核壳材料的研究报道也不少 【4 5 4 9 】 o 在磁性纳米颗粒表面包埋的各种材料中，二氧化硅是被研究的最早且最广泛 的一种材料。因为s i 0 2 对外界的惰性可以提高f e 3 0 4 的抗氧化性、耐候性，从而 增加磁性复合粒子的使用寿命【5 0 ，5 ，二氧化硅层还可以为磁性表面提供羟基官能 团，方便与硅烷偶联剂的反应，从而方便进行后续实验，如表面修饰、标记抗原、 d n a 等。 1 3 2 碳纳米管复合纳米颗粒用于生物传感器 碳纳米管是一种电子离域性很大的具有金属或半导体性质的特殊材料，由单 个碳原子在一定条件下聚集形成。由于其独特的结构和奇特的物理、化学、力学 特性及其潜在的应用前景而成为世界范围内的研究热点之一。利用碳纳米管对电 极表面进行修饰时，除了可将材料本身的物化特性引入电极界面外，也会由于纳 米材料的大比表面积效应、粒子表面带有较多的功能基团而对某些物质的电化学 行为产生特有的催化效应，因而在电化学反应中可以作为优越的电子传递媒介 b 2 巧3 1 。近来，也有通过化学氧化法、静电沉积法和物理吸附法实现a u 、a g 和p t 在多壁碳纳米管表面的沉积，并用于生物传感器研究的报道【5 4 ，5 5 1 。 1 3 - 3 标记型纳米材料用于生物传感器 为提高电化学生物传感器的灵敏度，纳米粒子标记法是最常用的一种解决方 案。作为一种新兴的标记物，纳米粒子易于制备、表面积大、吸附每高、稳定性 好且具有较好的生物相容性，能大幅度提高检测过程中信号物质的灵敏度。常见 的用于标记的纳米粒子主要有下述几种类型： 1 ) 金属纳米颗粒在单一金属纳米颗粒中，纳米金和纳米银| 大i 其良好的电化学 性能和良好的生物相容性，在电化学d n a 生物传感器的研究中受到人们广泛的关 渖【5 6 5 8 】 1 lo 2 ) 复合金属纳米颗粒，利用含有多种金属核壳结构的复合纳米颗粒也叫进一 9 基于纤维紊酶系功能幕闷生物传感器的研究 步提高d n a 检测的灵敏度。f a n g 【5 9 】等研究的金银复合纳米颗粒在d n a 检测中使灵 敏度较一般的单个纳米颗粒标记的有关金和铁复合纳米颗粒，d n a 探针提高了两 个数量级，检出限可达5 0p m