（环境工程专业论文）微生物絮凝剂产生菌的选育及絮凝性能研究.pdf

摘要 本实验从活性污泥中分离、纯化絮凝剂产生菌，经初筛，得 9 株絮凝率达7 2 以上的细菌菌株，复筛得2 株稳定性较好且絮 凝率达9 0 以上的菌株，分别命名为e - 9 、a 一1 。通过菌落形态 观察、显微镜观察及革兰氏染色等一系列生理生化实验，初步确 定菌株e 9 为大肠杆菌。 通过单因素实验，确定了菌e 一9 产生絮凝剂的最佳培养条件， 并在此基础上，找到了理想的替代性培养基，即以乙醇为碳源， 大豆粉为氮源，且乙醇和大豆粉的最佳浓度分别为1 5 m l l 、 1 2 5 9 l 。以乙醇为碳源时，可以免去灭菌的操作；以大豆粉为氮 源所产絮凝剂处理4 e l l 高岭土悬浊液时，絮凝剂的投加量仅为 通用发酵培养基的1 1 5 ( 1 m l l ) ，絮凝率高达9 7 9 9 5 ：乙醇和 大豆粉复合使用时，絮凝率可达9 8 ，成本仅为通用发酵培养基 的5 2 。 生长曲线表明，菌e 9 产絮凝剂的时间与菌生长相比，稍有 些滞后，而对菌a 1 而言，其絮凝剂的时间与菌生长成正相关性。 对菌e 9 、a 一1 所产絮凝剂的絮凝活性分布进行了测定，两 株菌产絮凝剂的活性成分主要存在于上清液中，说明絮凝活性物 质是微生物在发酵过程中分泌的胞外代谢产物，而且菌e 9 产生 的絮凝剂具有较好的酸碱稳定性和热稳定性。 以高岭土悬浊液为模拟废水，对菌e 9 产生的絮凝剂进行了 絮凝条件实验，得出其最佳絮凝条件为：原水p h 值为5 0 8 0 ， 初始悬浮固体浓度为2 - 4 9 l ，c a 2 + 、m 9 2 + 等金属离子的加入有助 于絮凝，且当c a 2 + 浓度为0 2 0 5g l 时助凝效果最好。该絮凝剂 处理印染废水实验表明具有一定的脱色能力。 关键词：微生物絮凝剂絮凝剂产生菌筛选细菌培养条件 絮凝性能 a b s t r a c t 9f l o c c u l a n t p r o d u c i n gb a c t e r i ah a v eb e e ns e l e c t e df r o mt h e a c t i v a t e ds l u d g eb ys c r e e n i n g ，w i t haf l o c c u l a t i n gr a t eo v e r7 2 a f t e rr e s e l e c t i n g ，2o ft h e mw e r eo b t a i n e dw i t hh i 【g h e rf l o c c u l a t i n g a c t i v i t ya n d b e t t e rs t a b i l i t y , n a m e da se 一9 ，a l r e s p e c t i v e l y t h r o u g h t h eo b s e r v a t i o no ft h ec h a r a c t e ro fi n d i v i d u a lf o r r na n dt h ec o l o n y f o r m ，a sw e l l a st h eo x i d a s ea n das e r i e so fp h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a l e x p e r i m e n t s ，e 一9w a s i d e n t i f i e da se c o l i t h eb e s tc u l t u r ec o n d i t i o n so fs t r a i ne 一9w e r ef o u n db ys o l e f a c t o rt e s t ，t h e ya r e ：e t h a n o la st h eo p t i m u mc a r b o n s o u r c e ，s o y b e a n p o w d e r a st h eo p t i m u mn i t r o g e ns o u r c e ，w i t ht h eb e s tc o n c e n t r a t i o n 15 m l l ，1 2 5 9 lr e s p e c t i v e l y , i n i t i a lp h6 0 7 0 ，3 0 ，a n d 6 0 7 2 h o u r sf o rc u l t i v a t i o n w h i l ee 一9i saf a c u l t a t i v e a n a e r o b i c ，t h e v e n t i l a t i o nf l o wc a l lb ei g n o r e d f o ra - l ，i t sc u l t i v a t i o nt i m ew a s 4 8 6 0h o u r s e t h a n o la n ds o y b e a np o w d e ra r eh e l p f u li nf l o c c u l a t i o nt ot h e m i c r o b i a l f l o c c u l a n t s w h e nt h ef l o c c u l a n t sp r o d u c e db ye 。9w e r e u s e dt oc l a r i f y4 9 lk a o l i ns u s p e n s i o na tt h ed o s a g eo fl m l l ，t h e f l o c c u l a t i n gr a t ea m o u n t e dt o 9 7 - 9 9 5 w h i l ei t sd o s ew a sa b o u t 1 1 5o ft h ef e r m e n tm e d i a ，i t sp r i c e ，a b o u t5 2 h i g hf l o c c u l a t i o n e f f i c i e n c y c o u l db ea c h i e v e dw h e nt h e p hv a l u e sw e r ek e p t i n b e t w e e n5 0 - 8 。0 ，t h ec o n c e n 姗i o no fk a o l i nc l a y s u s p e n s i o nw a s 2 - 4 e e l m e t a li o ns u c ha sc a ”，m 9 2 + f a c i l i t a t e sf l o c c u l a t i o na c t i v i t y o f m i c r o b i a l - f l o c c u l a n t s ，a n d t h ea v a i l a b l e r a n g e o fc a 2 + i s 0 2 0 5 e g l t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef l o c c u l a n t sp r o d u c e d b y t w os t r a i n s m a i n l y e x i s ti nt h e s u p e m a t a n t a n d t h e y w e r e s y n t h e s i z e dd u r i n gt h e c e l l g r o w t h f o re 一9 ，t h eg r o w t hd y n a m i c c u r v e so ff l o c c u l a t i n gm i c r o b i a lw e r es l i g h t l yd i f f e r e n tf r o mt h e i i p r o d u c t i o nd y n a m i cc u r v e so fm i c r o b i a l f l o c c u l a n t s ，w h i c hm e a n s t h a tt h e p r o d u c t i o n t i m eo fm i c r o b i a l f l o c c u l a n t st e n d st ol a gb e h i n d 。 t h ef l o c c u l a n t sp r o d u c e db ye - 9c o u l db ek e p tw i t h o u tl o s i n g a c t i v i t y w h e nt h e t e m p e r a t u r ew a sb e t w e e n3 0 。c a n d6 0 。c ，p h v a l u e sw e r ei nb e t w e e n2 0 8 0 k e yw o r d s ：m i c r o b i a l - - f l o c c u l a n t ；f l o c c u l a n t - p r o d u c i n gs t r a i n ； s c r e e n i n g ；b a c t e r i u m ；c u l t u r ec o n d i t i o n ；f l o c c u l a b i l i t y 引言 随着科学技术的进步，在水处理领域中应用的无机和有机合成 高分子絮凝剂越来越广泛，它们的生产技术和应用取得了长足的进 步，但随着人们生活水平的提高，对于它们使用中的不安全性和给 环境造成的二次污染已引起了人们的重视和担忧。因而一种安全 的、可生物降解的、对环境和人类健康无害的新型水处理剂一微生 物絮凝剂正引起人们的关注。 目前，微生物絮凝剂的研制和开发应用方兴未艾，其特性和优 势为水处理技术的发展展示了一个广阔的前景，其作为一个新兴课 题，尚有大量的基础工作急需科学工作者去完成，如高效絮凝剂产 生菌的筛选及产生絮凝剂的条件优化；为降低生产成本而进行的原 料优选等等。 本课题属于湖南省计委资助项目“微生物絮凝剂的研制和应 用”工作的一部分，课题组成员已筛选得到了多株絮凝率较高的霉 菌菌株，并且正在进行工业化应用的探讨。本论文力图在拓宽产絮 凝剂优势菌种来源方面进行实验研究，包括选育高效絮凝剂产生菌 细菌，并对其产生的絮凝剂性能进行研究，望能为充实絮凝剂 产生茵菌库而积累经验，为微生物絮凝剂研究工作的进一步开展， 为实现工业化应用提供一定的基础数据，因而具有一定的理论意义 和实际价值。 第一章绪论 r 无机低分子絮凝荆 a 1 c i6 h 2 0 )r 无机阳离子絮凝荆( 如 3 p 燃剂t 一圳。聚黑警黧黧塞嚣 絮凝荆气广阿| 离子型( 如聚丙烯酰胺) l 徽酬，僻僦黼肝瓣剂t 黑霎季篓篙墒黻 li l 天然类高分子絮凝剂( 如纤维素、淀粉、环糊精) 图1 1 絮凝剂的分类 从目前的实际应用状况来看，无机高分子絮凝剂由于絮凝活性 高，价格低廉而得到广泛应用，尤其在我国，使用更加普遍。相比 之下，合成有机高分子絮凝剂则具有用量少、适应范围广、受盐类 及环境条件影响小、絮凝速度快、处理效果好等优良性能，因而在 市场上占有绝大优势。 随着工业和科学技术的发展，无机瓤有机合成高分子絮凝剂越 来越广泛地被应用于各种水及废水的处理。然而，无机和有机合成 高分子絮凝剂的生产和应用在取得长足进步的同时，其使用过程中 的不安全性和给环境造成的二次污染己越来越引起人们的重视。无 机低分子絮凝剂如a 1 3 + 的投入，与目前日益增多的老年痴呆症的引 发有直接关系；铁盐类絮凝剂不仅具有较强的腐蚀性，限制了所用 设备，而且容易残留铁离子，使被处理水带有颜色，影响水质心1 。 有机合成高分子絮凝剂聚丙烯酰胺是丙烯酰胺多聚体，虽然本身没 有任何毒性，但其难生物降解，易造成二次污染，而且聚合单体丙 烯酰胺的残留也是一个令人十分担忧的问题，它不仅具有强烈的神 经毒性，而且是致癌物质，现在许多国家和领域已禁止或限量使用 此类絮凝剂，如美国严格规定其最大投加剂量不得超过1 0 9 l ”1 。 天然高分子絮凝剂作为一种新的水处理剂，具有无毒、能安全 降解的特点，但由于其絮凝活性较弱，限制了其广泛的开发应用， 工业生产和实际应用不多。 因此，开发一种安全无毒、絮凝活性较高、无二次污染的新型 絮凝剂，对人类健康及环境保护都具有很重要的现实意义。 微生物絮凝剂( m i c r o b i a lf l o c c u l a n t ) 正是这样一类絮凝剂， 它是利用生物技术，从微生物或其分泌物中抽提、精制得到的新型 高分子絮凝剂。它具有可降解、高效安全、无毒，无二次污染等优 点，克服了常规的无机絮凝剂和有机絮凝剂对人体有害和产生二次 污染的缺点，因而越来越受到各国水处理工作者的重视o 。1 。 1 2 国内外研究现状 微生物絮凝作用首先是l o u i sp a s t e u r 在酵母中观察到的。这里 的“絮凝作用”是指细胞的聚集现象，但当时一直未对其产生重视 【8 0 1 9 7 6 年，j n a k a m u r a 等人酋先从霉菌、细菌、放线菌、酵母 菌中筛选出1 9 种具有絮凝能力的微生物，其中以酱油曲酶a j t 0 0 2 产生的絮凝剂效果最好阳1 。8 0 年代中期，k u r a n e 、仓根隆一郎等人 从旱田土壤中分离筛选到红平红球菌s 一1 ，并将菌株产生的微生物 絮凝剂( 主要成分为粘多糖) 命名为n o c l 。迄今为止，它仍然是 已发现的最好的生物絮凝剂，它具有强而广泛的絮凝活性，也是目 前研究最为深入的生物絮凝剂，包括对其产生菌的筛选、发酵条件 的优化、分离纯化、分子结构的剖析及应用条件的摸索等都进行了 较为系统的研究。在降低生产成本方面亦取得了一定的成果“3 。 1 9 8 5 年，h t a k a g i 等人研究了拟青霉素属微生物生产的絮凝 剂，采用乙醇沉淀和凝胶色谱法精制得到了称为p f l 0 1 的絮凝剂， 分子量约3 0 万，主要成分为半乳糖胺，对大肠杆菌、红血细胞、 活性污泥等均有良好的絮凝效果。1 9 9 1 年k t o e d a 等又从土壤中 分离了一株产碱杆菌，它在含有蔗糖的培养基中分泌絮凝剂 a l 2 0 “。y b a r 等发现一些海底蓝细菌能产生数量可观的胞外絮凝 剂1 。 美国、日本、英国、法国、德国、前苏联、葡萄牙、以色列、 韩国等对微生物絮凝剂都进行了大量的研究，取得了一些初步的研 究成果旧3 。目前，国外市场上已有几种牌号的微生物絮凝剂粉末和 活液制品销售。 我国对于微生物絮凝剂的研究起步较晚，只是在近几年才刚刚 涉足。目前，我国学者公开发表的有关生物絮凝剂的文章大多为综 述性报道，而且实验研究大多处在菌种筛选和菌株培养液对废水处 理的实验室小试阶段，成功的微生物絮凝剂制剂投入生产的报导较 少。 程树培等人从活性污泥中筛选培养了p m b f 和c s m b f ，对土壤 悬浊液、果珍悬浊液、碳素墨水、涂料废水、脱墨剂废水、豆制品 黄浆水有良好的絮凝效果n “。邓述波等人从土壤中分离了一株产生 絮凝剂的芽孢杆菌a 一9 ，絮凝黄浆废水效果好，药剂用量少且不需 助凝剂“。宫小燕等人从活性污泥中筛选培养了假单胞菌 p s e u d o m o n a ss p g x 4 1 ，对高岭土悬浊液絮凝效果好“。王镇等人 从土壤和污水处理场的活性污泥中分离出4 株絮凝剂产生菌， 3 0 m i n 内可使果汁悬液澄清“。另外张本兰从活性污泥中分离得到 的p a l c a l i g e n e s 8 7 2 4 菌株产生的絮凝剂对造纸黑液和氯霉素等有色 废水具有良好的絮凝脱色作用“。台湾邓德丰从废水中分离到 c 一6 2 细菌菌株并产生微生物絮凝剂，可用于处理猪粪尿废水和红 豆加工厂废水等“。柴晓利等人研制的氮单孢菌生产的絮凝剂处理 生活污水时效果较好，且对造纸、染料、皮革废水的脱色效果非常 明显“。黄民生等在污水处理厂的回流污泥及俞经浦底泥中分离 筛选出的3 株絮凝剂产生菌，该菌株培养液可使土壤悬浊液浊度去 除率达9 9 以上，使碱性染料废水c o d 去除率达7 0 左右，色度 去除率达9 2 左右“。 l - 3 微生物絮凝剂的种类及结构特征 微生物絮凝剂的来源可包括以下四类： ( 1 ) 直接利用微生物细胞的絮凝剂，他们大量存在于土壤活性 污泥和沉积物中，如某些细菌、酵母等。 ( 2 ) 利用微生物细胞提取物的絮凝剂，如酵母细胞壁的葡萄糖、 蛋白质等成分均可作为絮凝剂。 ( 3 ) 利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂。微生物分泌到壁外的 产物主要是细菌的荚膜和粘液质，其絮凝剂的有效成分主要有蛋白 质，脂类及其复合物，多糖在某种程度上可作为絮凝剂“。 ( 4 ) 克隆技术所获得的絮凝剂。目前从酿酒酵母中至少发现1 4 个絮凝基因，其中f l 0 1 和f l 0 5 絮凝基因在1 号染色体上，f l 0 8 絮凝基因在8 号染色体上，这3 个絮凝基因分子克隆已获成功“。 微生物絮凝剂的结构和性质各异，如r h o d o c o c u se r y t h r o p o l i s 产的絮凝剂n o c 1 是多糖蛋白，最大分子量为7 5 万“。絮凝剂 d p 一1 5 2 是一种新型的微生物絮凝剂，来自糖的混合物，包括葡萄 糖、甘露糖、半乳糖和岩澡糖，其质量比例约为8 ：4 ：2 ：1 ，分子量 大约为2 + 1 06 道尔顿心“。 1 4 微生物絮凝剂的絮凝机理 目前关于微生物絮凝剂较为普遍接受的是“架桥作用”机理皿“。 认为微生物絮凝剂是一类高分子化合物，其具有线性结构，具有能 与胶粒表面某些部分起作用的化学基团。当微生物絮凝剂与胶粒接 触时，基团能与胶粒表面产生特殊反应而互相吸附，而絮凝剂的其 余部分则伸展在溶液中，可以与另一个有空位的胶粒吸附，这样微 生物絮凝剂就起到了架桥连接的作用。如果加入m 9 2 + ，c a 2 + 等金 属阳离子，则可减少悬浮颗粒的负电荷，增加悬浮颗粒对大分子的 吸收量，促进架桥的形成。c a 2 + 不仅能够促进絮凝的形成，而且高 浓度的c a 针可以有效地保护絮凝剂不受降解酶的作用。 国外有一种说法是双层厚度理论心。 1 5 微生物絮凝剂的产生及絮凝条件 微生物絮凝剂的产生受其培养条件的影响，影响因素包括： ( 1 ) 培养基组成，包括碳源、氮源及生命所需的各种无机盐等。 不同的微生物需要不同的营养基质，如细菌中的自氧菌不能利用有 机化合物，而异氧菌则需要有机化合物作为碳源( 蔗糖、淀粉等) 和氮源( 牛肉膏、蛋白胨等) ，产荚膜细菌需要较高浓度的糖类作为 培养基乜“。 ( 2 ) 培养基初始p h 值，p h 值可影响絮凝剂产生菌的生长及絮 凝物的分泌，一般来说，细菌的最适p h 为中性到弱碱性，而霉菌 为酸性。如m b f a 9 培养基的最佳初始p h 为8 - 9 ，n o c 1 的为8 5 。 ( 3 ) 培养温度，不同种类的微生物有不同的适宜温度范围，一 般认为，最适宜的温度为2 5 3 5 之间。 ( 4 ) 培养时间，不同种类的微生物有不同的生长周期，因而产 生絮凝剂的周期也不一样。 ( 5 ) 通气情况( 水浴摇床的速度) ，直接影响絮凝荆产生菌的生 长及絮凝剂的分泌。 微生物絮凝剂的絮凝能力除受上述培养条件的影响外，同样也 受它所处理的水质条件的影响，如水质的p h 值、浓度等，即有其 特定的应用条件。 1 6 微生物絮凝剂的应用“5 。5 。1 与有机或无机合成高分子絮凝剂相比，微生物絮凝剂具有絮凝 范围广、活性高、安全无害、不污染环境等特点，因此可以广泛应 用于给水和污水处理。 ( 1 ) 畜产、屠宰废水的处理心“。畜产废水是b o d 较高难处理有 机废水，含有较高的t o c 和t n 。有研究表明，猪粪尿废水采用 微生物絮凝剂n o c l 处理1 0 m i n 后，废水的上清液变成几乎透明 的液体。废水的t o c 由处理前的1 4 2 0 m g l 降至4 2 5 m g l ，t n 从 4 2 5 m g l 降至2 1 5 m g l ，去除率分别达7 0 和4 0 。o d 6 ( 光密 度值) 由处理前的1 5 7 变成o 8 6 ，浊度去除率达9 4 5 。 ( 2 1 膨胀活性污泥的处理“。不少工业废水在采用活性污泥法 处理时，常因污泥的沉降性能变差而使处理效果变差，若添加生物 絮凝剂，能有效消除污泥的膨胀状态，使污泥的容积指数快速下降， 从而提高处理效果。如甘草制药废水生化处理过程中形成的膨胀活 性污泥，当添加n o c 1 后，污泥的s v i 从2 9 0 降至5 0 。 ( 3 ) 废水脱色“。目前，对有色废水的脱色，还没有极其有效 的处理方法。而采用微生物絮凝剂n o c 一1 ，可对含有可溶性着色 物质的黑墨水、面包酵母生产过程中排出的培养基糖蜜废水等有色 废水进行处理，发现处理后的上清液变为无色透明。 ( 4 ) 废水悬浮颗粒的去除“1 。微生物絮凝剂可用于高岭土、粉煤 灰、泥水浆等水样的处理。如向陶瓷厂废水中添加n o c 。1 后，坯 体废水的o d 值可从原来的1 4 降至o 0 4 3 ，釉药废水的o d 值从 i 7 2 降至0 3 5 ，浊度去除率分别为9 6 6 和9 7 9 ， ( 5 ) 乳化液油水分离。目前未见到无机或有机合成絮凝剂用于 处理油脂乳浊液的报道。而r k u r a n e 的研究表明，向棕榈油乳浊 液中加入a 1 a t u s 的絮凝剂粗制品后，可见油滴上浮到乳浊液的表 面，形成油层，下层清液的c o d 值明显下降。 ( 6 ) 发酵液后处理。从发酵液中收集或除去菌体是发酵工业后 处理中必不可少的工序，通常采用离心或过滤的方法，但因能耗较 大而导致成本过高，由于絮凝剂对细胞具有优良的沉降性能，因而 可大大减少能耗，降低成本。 ( 7 ) 物质的分离纯化“1 。利用生物絮凝剂的高选择性，可进行 物质的分离纯化。如s t e p a n e n k ov g 将b a c i l l u sc e r e u s 成功地用于 黄金、白钨矿等贵重稀有金属类化合物的富集提取。 1 7 本实验的研究目的及主要研究内容 综上所述，微生物絮凝剂具有高效、无毒、无二次污染和絮凝 广泛等特点，从根本上克服了无机和有机高分子絮凝剂的不足，是 絮凝剂研究发展的方向，而目前对微生物絮凝剂的研究大多限于实 验室阶段，因此，要使微生物絮凝剂尽快应用于工业生产，在未来 可能部分取代无机或有机絮凝剂，还需要作大量的、进一步的试验 和研究。 本课题属于湖南省计委资助项目“微生物絮凝剂的研制和应 用”工作的一部分，课题组成员已筛选得到了多株絮凝率较高的霉 菌菌株，并且正在进行工业化应用的探讨。本论文力图在拓宽产絮 凝剂优势菌种来源方面进行实验研究。 主要研究内容包括： ( 1 ) 絮凝剂产生菌的分离和纯化 采用平板划线法，对采集的菌种经过多次稀释、划线，实现纯 培养的单菌落微生物。采用烧杯实验检测微生物培养液对高岭土悬 浊液的絮凝效果。 ( 2 ) 絮凝剂产生菌的初步鉴定 经过鉴别染色、培养特征观察及系列生理生化实验确定微生物 所属的属、种。 ( 3 ) 菌产絮凝剂的最佳培养条件和替代性培养基的研究 进行单因素条件实验，考察培养条件对微生物产生絮凝剂的影 响，主要考察培养基的初始p h 值、培养温度、培养时间、培养基 的碳源、氮源等因素，并在此基础上进行替代性培养基的研究。 ( 4 ) 确定微生物絮凝剂应用的最佳条件 以高岭土悬浊液为模拟废水，研究絮凝剂的投加量、絮凝体系 的p h 值、高岭土悬浊液浓度以及金属离子的种类和浓度对微生物 絮凝剂絮凝效果的影响，优化絮凝剂的应用条件。 第二章微生物絮凝剂产生菌的分离、筛选及鉴定 分离和筛选的目的是为了获得稳定性较好、絮凝率较高的纯菌 株。 本章实验分为三大部分：一是微生物的分离，采用简便的平板 划线法；二是絮凝剂产生菌的筛选，是通过烧杯实验检测絮凝剂样 品对高岭土悬浊液( 模拟废水) 的絮凝效果来确定的；三是絮凝剂 产生菌的鉴定，是通过对细菌的菌落形态观察、显微镜观察及革兰 氏染色等一系列生理生化实验来初步确定细菌所属的属、种。 根据国内外有关微生物絮凝剂方面的研究报道，综合本实验的 具体情况，设计了以下的分离、筛选步骤：样品采集一稀释一富 集培养一平板划线一挑选菌落( 营养琼脂平板或斜面) 一纯化培养 一初筛一富集培养一复筛一高效絮凝剂产生菌。 2 1 絮凝剂产生菌的分离 2 1 1 实验材料 一、主要实验设备 实验所需主要设备见表2 - 1 ： 表2 - 1 所用设备一览表 设备名称设器型号 手提式高压灭菌锚 酸度计 分光光度计 冰箱 六连搅拌机 电子分析天平 高速冷冻离心机 数显式电热恒温干燥箱 水浴恒温振荡器 生化培养箱 水平层流洁净工作台 m 。 m 吨鹊o 嗽 一燃徘小一一一一一一 二、实验器具 吸管、试管、培养皿、酒精灯、接种环等 三、菌种来源 菌种的来源一般有三种。“： 1 来自天然土壤中的絮凝生物极为丰富，分离方法简单，而 且成本低； 2 水厂的活性污泥，成本低，而且从中分离、提取、制备的 微生物絮凝剂投入污水中，不会增加活性污泥系统的成分，能够保 持投加前后微生物系统的稳定性； 3 直接购买能产生絮凝剂的纯微生物菌株，免去实验的麻烦， 且针对性强，但成本高。 针对上述分析，本实验为满足所筛选的菌种为好氧菌，同时为 降低成本，采用长沙市某污水处理厂曝气池中活性污泥作备用菌 液。 四、分离所用培养基岱9 蚓 1 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c i5 9 ， h 2 01 0 0 0 m l ，p h 7 2 2 可溶性淀粉2 0 9 ，k h 2 p 0 45 9 ，n a n 0 3l g ，m g s 0 40 5 9 ，k c l 0 5 9 ，h 2 01 0 0 0 m l ，p h 7 5 8 5 3 酵母膏2 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c i2 9 ，h 2 01 0 0 0 m l ，p h 7 0 2 1 2 实验方法 一、倒平板 将洗净、晾干的培养皿用报纸包好，放入高压灭菌锅中，于 1 2 1 下灭菌1 5 2 0 m i n 后取出。量取以上三种培养基各2 0 0 m l ， 放入2 5 0 m l 三角瓶中，分别加入5 9 琼脂( 通常做固体培养基需加 入的琼脂量为1 5 3 0 ) 、i 2 m l 浓度为5 m g l 的抑菌剂( 该 剂能有效抑制真菌生长，一般占培养基质量的5 3 5 u g l ) 嘲1 ，然后 放入灭菌锅中于1 2 1 1 2 8 。c 高温下灭菌2 0 m i n ，取出后放进超 净工作台，待冷却至5 5 c 6 0 。c 时迅速倒入培养皿中( 只要盖满皿 1n 底一浅层即可1 ，自然冷却后置于生化培养箱中于3 7 。c 温度下培养 2 - 3 天，检查无菌落及皿盖无冷凝水后方可使用。 二、制备稀释液 用一支无菌吸管从备用菌液中吸取l m l 注入盛有9 m l 无菌水 的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支无菌吸管从此试 管中吸取l m l 溶液注入另一支盛有9 m l 无菌水的试管中，依此类 推，制成稀释倍数分别为1 0 1 、1 0 2 、1 0 3 、1 0 4 、1 0 5 、1 0 6 的稀释液。 三、划线 采用平板划线法，用在酒精灯上己灭菌的接种环分别挑取不同 倍数的稀释液，于超净工作台上在不同的培养基平板上进行划线。 方法为：揭开皿盖，将接种环头伸入培养皿内，在平板上轻轻划线。 划线方式见图2 1 ( 第一区一第二区一第三区) 。 第二区 图2 1 平板划线示意图 四、培养 划线后，将培养皿倒置于恒温生化培养箱中培养2 4 h ，温度设 定为3 7 。 五、挑菌 将培养皿中生长出的单个菌落挑取并再进行划线培养，用显微 镜观察，看是否为单一菌种，如果不纯，继续进行划线培养，直至 获得纯的菌种。 2 1 3 实验结果 稀泥水划线到三种培养基的平板上，经恒温生化培养箱内培养 1 l 2 4 h 后，观察发现：第一种培养基平板上的菌落相当的多：第二种 培养基平板上几乎没有菌落生成；第三种培养基平板上有少量的菌 落，菌种不很旺盛。这说明第一种培养基很适合所挑菌的生长，第 二种培养基不适合所挑菌的生长，可能是因为淀粉较难被利用的缘 故。所以本实验选择牛肉膏蛋白胨培养基来分离细菌。 同时也可以看到，从稀释成1 0 1 倍的稀泥水中挑菌划线生长的 菌种极多，不适于再次分离培养。稀释成1 0 5 倍的稀泥水中挑菌划 线生长菌落很少，1 0 6 倍的几乎没有菌落生长。1 0 3 倍、1 0 4 倍的生 长好且有大量菌落，菌落里的菌种种类也较少，容易划线纯化，因 此，实验中的初次挑菌均从稀释成1 0 3 倍或10 4 倍的稀释液中挑选。 经过反复划线、分离、纯化，最终通过镜检证实菌落中不再混 有杂菌，且为细菌，共4 8 株。 2 2 絮凝剂产生菌的筛选 2 2 1 实验材料 筛选用培养基为通用发酵培养基：葡萄糖2 0 9 ，k h 2 p o 。2 9 ， k 2 h p 0 45 9 ，心h 4 ) 2 s 0 4o 2 9 ，n a c l0 1 9 ，尿素0 5 9 ，酵母膏0 5 9 ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，h 2 01 0 0 0 m l ，p h 7 5 8 0 测絮凝率的模拟废水采用4 9 l 高岭土悬浊液：称取1 2 96 0 目 的高岭土于下口瓶中，加入3 l 蒸馏水搅匀。 2 2 2 实验方法 一、预发酵培养 用接种环将分离出的4 8 株纯菌株( 分别命名为a 、l 、a 2 a - 4 8 ) 适量接种到装有4 0 m l 发酵培养液的2 5 0 m l 三角瓶中进行培 养，温度设定为3 0 ，摇床转速为1 6 0 r r a i n 。 二、发酵培养 将经预发酵培养1 8 2 4h 的菌种按2 5 ( 体积比) 的接种量接 种到发酵培养基中培养( 温度和摇床转速与预发酵同) 。 三、絮凝剂样品的制各 将经7 2 h 发酵培养的发酵液于1 2 0 0 0r m i n 离- i i , 机上离心 l0 m i n ，取上清液作为絮凝剂样品。 四、初筛 以高岭土悬浊液为模拟废水，通过絮凝沉淀来测定各絮凝剂样 品的絮凝率，依絮凝剂样品是否对高岭土悬浊液具有较好的絮凝效 果来确定菌种是否为初筛菌种。 五、复筛 对初筛获得的菌种进行多次平行发酵培养，稳定性较好且絮凝 率较高的菌株即为复筛菌种。 六、絮凝沉淀 在1 0 0 m l 量筒中加入8 0 m l 蒸馏水，o 4 9 高岭土，5 m l 0 1 观 的c a c l 2 溶液，2 m l 絮凝剂样品，然后加蒸馏水至1 0 0 m l ，调节 p h 至7 0 ，然后倒入2 5 0 m l 烧杯中，放在磁力搅拌器上，先快搅 ( 2 0 0 r r a i n ) lm i n ，慢搅( 8 0 r m i n ) 3 m i n ，再静置沉降3r a i n 取同一层面上清液作为备用液。 七、絮凝率的测定 絮凝效果用絮凝率来表征。将絮凝沉淀后的备用液放在7 2 2 s 型分光光度计于波长为5 5 0 n m 处测其吸光度，以不加备用液的蒸 馏水作对照，絮凝率的计算公式如下： 絮凝率= ( a i b 、a x1 0 0 式中：a 对照液的吸光度； b 絮凝沉淀后备用液的吸光度。 2 2 3 实验结果 一、初筛实验结果 初筛的实验结果如表2 2 所示。 由表2 2 可以看出，初筛可得9 株絮凝率达7 2 以上的细菌菌 株，它们分别为a - 1 、a 3 、a ，6 、a 一9 、a 1 7 、a 2 8 、a 2 9 、a 4 1 、 a 一4 3 ，其菌落形态见表2 3 。 表2 - 2 初筛实验结果 一一 堕壁兰塑堡圭堕壁旦 鍪堡垩堕登曼塑堡圣 堕壁兰墨茎垩 a 18 8 1 4a 1 3 a 2 5 4 0 2 7a - 3 74 6 8 9 a 2 a 3 a 4 a 5 a 6 a 7 a - 8 a 一9 a 1 0 a 1 1 7 1 7 3 6 2 5 4 3 0 6 8 2 0 7 3 1 1 3 9 5 0 1 5 1 3 9 1 6 0 6 6 3 0 4 86 9 a 。1 4 a 1 5 a 1 6 a - 1 7 a 1 8 a - 1 9 a 2 0 a - 2 j a 2 2 a 2 3 5 5 7 9 4 1 1 4 8 79 3 5 0 6 2 7 i3 0 7 0 0 6 5 30 8 4 s 0 6 a 2 66 7 2 9 a 一3 85 3 4 0 a 2 a 2 8 a 2 9 a 3 0 a t 3 l a - 3 2 a ，3 3 a 。3 4 a 3 5 3 61 5 9 2 9 2 8 98 2 4 4 3 1 4 9 3 3 2 5 2 5 a 3 9 a 4 0 a 4 1 a 4 2 a 4 3 a 4 4 a - 4 5 a 4 6 a 4 7 ， 7 27 7 0 0 9 8 01 3 8 3 i ， 4 0 0 垒：! !竺：! ! 垒：! ! ! ：! !垒：! ! ! ：! ! 垒：! ! ! ：! 注：表中絮凝率为：“”代表其吸光度比对照液的还火。 表2 39 株絮凝剂产生菌的菌落形态 4 二、复筛实验结果 复筛的实验结果如表2 4 所示。 表2 4 复筛的实验结果 由表2 - 4 可以看出，经过多次发酵培养，只有2 株稳定性较好、 絮凝率达9 0 以上的菌株，分别为a 1 和a 一9 。 2 3 絮凝剂产生菌的初步鉴定 本实验仅鉴定了稳定性较好、絮凝率较高的菌株a 9 。 2 3 1 细菌的培养特征观察 将纯化的菌a 一9 划线于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，置于恒温 培养箱3 7 培养2 4 h ，待培养皿中有菌落后，先用肉眼观察培养皿 中菌落的生长情况，再将下述鉴别染色的标本用显微镜观察其大 小、形状等。 2 3 2 细菌的生理生化实验” 细菌个体较小，单纯用肉眼很难将其分辨出来，必须经过一系 列生理生化实验，才能够将其鉴别出来。 、细菌的鉴别染色口“。 实验器具：显微镜、恒温培养箱、盖玻片、载玻片、酒精灯、 接种环、滴管等 实验材料：草酸铵结晶紫、碘液、酒精( 9 5 、沙黄、生理 is 盐水 实验方法：将培养了2 4 h 的菌株a 9 涂片于载玻片上，干燥、 固定后，加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟后，水洗，滴加碘液冲去 残水，并覆盖约一分钟，水洗，用酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现 紫色时为止，约2 0 3 0 秒钟后，立目用水冲洗，再用沙黄染1 2 分 钟，水洗，干燥后置油镜观察。 二、苯丙氨酸脱氨酶试验 培养基：酵母膏3 9 、n a c l 5 9 、n a 2 p 0 4 l g 、琼脂1 2 9 、d l 一苯丙 氨酸2 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l 试剂：f e c l 3 1 0 ( w v ) 溶液 实验方法：调培养基p h 值为7 0 ，分装试管，于1 2 l 蒸汽灭 菌1 0 m i n ，制成斜面培养基，将菌种接种到培养基上，3 7 恒温 培养箱中培养8 h 后，滴加f e c l ，试剂4 - 5 滴，观察斜面及冷凝水的 颜色。 三、甲基红( m r ) 试验 培养基：蛋白胨5 9 、n a c l 5 9 、葡萄糖5 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l 试剂：甲基红0 。t g 、乙醇( 9 5 3 0 0m l 、蒸馏水2 0 0 m l 实验方法：调培养液p h 值为7 0 7 2 ，分装试管，于1 1 59 0 蒸 汽灭菌3 0 m i n ，将菌种接种到培养液中，3 7 恒温培养箱中培养 6 d 后，滴加甲基红试剂l 滴，观察培养液的颜色。 四、v p 试验 培养基：与甲基红同 试剂：肌酸0 3 、n a o h 4 0 实验方法：调培养液p h 值为7 0 7 2 ，分装试管，于1 1 5 蒸 汽灭菌3 0 m i n ，将菌种接种到培养液中，3 7 。c 恒温培养箱中培养 6 d 后，取培养液和4 0 的氢氧化钠等量相混，加少许肌酸，1 0 m i n 后观察培养液的颜色。 五、吲哚试验 培养基：1 胰胨水 试剂：对二氨基苯甲醛8 叠、乙醇7 6 0 m l 、浓t t c l1 6 0 m l 16 实验方法：调培养液p h 值为7 2 7 6 ，分装试管，于1 1 5 。c 蒸 汽灭菌3 0 m i n ，将菌种接种到培养液中，3 7 。c 恒温培养箱中培养 l ，2 ，4 ，7 d 后，沿管壁缓缓加入3 - 5 m m 高的试剂于培养液表面，观 察培养液的颜色。 六、明胶试验 培养基：蛋白胨5 9 、明胶1 0 0 一1 5 0 9 、水1 0 0 0 m l 实验方法：调培养液p h 值为7 2 7 4 ，分装试管( 4 5 c m ) ，于 1 1 5 。c 蒸汽灭菌1 5 - 2 0 m i n ，将菌种穿刺到1 8 - 2 4 h 斜面中，留两支 未接种的作为空白对照，2 0 恒温培养箱中培养2 ，3 ，1 0 ，1 4 d 后， 在2 0 以下的室温下观察其生长情况及明胶是否液化。 七、柠檬酸盐试验 培养基：n a c l 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 9 、c n h 4 ) h 2 p 0 4 1 0 9 、 k 2 h p 0 4 3 h 2 0 1 0 9 、柠檬酸钠2 0 9 、溴百里酚蓝1 水溶液1 0 m l 、 水洗琼脂12 o g 、蒸馏水9 9 0 m l 实验方法：将以上成分除指示剂外加热溶解，调p h 值为7 0 并加入指示剂。分装于试管中，于1 2 1 蒸汽灭菌1 5 m i n ，将菌种 接种到培养基中，3 7 恒温培养箱中培养3 7 d 后，观察培养基中 菌落的颜色。 八、伊红美兰乳糖( g m b ) 试验旧“ 培养基：蛋白胨1 0 9 、乳糖5 9 、蔗糖5 9 、k 2 h p 0 4 2 9 、伊红y 0 4g 、美兰0 0 6 5 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l 实验方法：调培养基p h 值为7 2 ，分装于培养皿中，于1 1 5 蒸汽灭菌1 5 - 2 0 m i n ，将菌种接种到培养基中，3 7 恒温培养箱 中培养卜2 d 后，观察培养基中菌落的颜色。 2 3 4 实验结果 一、细菌的培养特征观察结果 用肉眼观察，发现该菌在牛肉膏蛋白胨培养基上生长很好，菌 落米黄色，呈圆形，边缘整齐，较薄，中央略为凸起，表面光滑， 粘度大。显微镜观察，该菌呈短杆状，约1 3 p m 。4 0 l m 大小，具 体染色后的标本形状见附录。 二、细菌的生理生化实验结果 经过革兰氏染色，发现该菌呈现红色，因此可断定该菌为阴性 菌。 苯丙氨脱氨酶试验时，斜面上和冷凝水不变颜色，则表明为阴 性；吲哚试验时在液层界面颜色不明显，则为阳性；m r 试验时为 红色，为阳性；v - p 试验时混合液无色，则为阴性；明胶试验时， 菌已生长，但表面无凹陷且为稳定的凝块，则为阴性：柠檬酸盐时， 培养基未变色，说明其不可利用柠檬酸盐：伊红荚兰乳糖试验时， 能很好地利用乳糖，同时经培养卜2 d 后，菌落在透射光下呈紫色， 反射光下呈现绿色金属闪光，因而初步确定其为大肠杆菌。 2 4 本章小结 分离、纯化得到4 8 株纯的细菌菌株：经初筛，得9 株絮凝率 达7 2 以上的菌株；复筛，得2 株稳定性较好、絮凝率达9 0 以 上的菌株，分别为a 1 、a 一9 。 通过菌落形态观察、显微镜观察及革兰氏染色等一系列生理生 化实验，初步确定菌a 9 为大肠杆菌，暂命名为e 9 ，其最适合的 分离培养基是牛肉膏蛋白胨培养基。 第三章高效菌产絮凝剂的最佳培养条件和 替代性培养基的研究 环境对微生物的生长有很重要的影响。微生物在适宜的环境条 件下能充分地生长繁殖并产生絮凝剂，一旦超过了其适应的条件范 围，不但不能产生絮凝剂，其生命都会受到威胁。因此本章仍以高 岭土悬浊液为模拟废水，通过单因素实验，分别考察了通用发酵培 养基的初始p h 值、培养温度、培养时间、培养基中的碳源、氮源 等因素，以絮凝率的大小为指标，确定菌e - 9 产絮凝荆的最佳培养 条件，并在此基础上进行了替代性培养基的研究，以期为微生物絮 凝剂的工业化应用提供基础数据。 一、实验设备：如表2 1 所示 二、实验器具：接种环、酒精灯、三角瓶等 三、实验药剂：通用发酵培养基 3 1 高效菌产絮凝剂的最佳培养条件研究 3 1 1 培养液初始p h 值的试验研究 实验方法：发酵培养时，将发酵液的初始p h 值分别设定为5 0 、 6 0 、7 o 、8 0 、9 0 ，其他的预发酵培养、絮凝剂样品的制备、絮凝 沉淀及絮凝率的测定均与2 2 2 实验方法相同，所得实验结果见图 3 - l 。 9 5 童9 0 啪 * 8 5 癸 妊8 0 7 5 一 5678 9 p h 值 图3 - 1 培养基初始p h 值对絮凝率的影响 由图3 - 1 可见，该菌在p h 为5 0 8 o 较宽的范围内，絮凝率都 1 9 达到8 0 以上，在p h 为6 0 7 5 时，絮凝率达9 0 以p ，p h 为7 0 左右絮凝率达最大，9 4 2 7 。从实验现象来看，虽然在p h 为5 0 或 8