（环境工程专业论文）手性除草剂异丙甲草胺对斜生栅藻的毒理机制研究.pdf

浙江工商大学硕士学位论文 手性除草剂异丙甲草胺对斜生栅藻的毒理机制研究 摘要 手性农药的使用与环境安全已成为一个新的研究热点。本文从对 映体水平上研究了酰胺类除草剂r a c 和孓异丙甲草胺对斜生栅藻的 急性毒性和斜生栅藻的氧化应激反应来说明两者毒性的立体选择性 差异，并通过叶绿素含量和藻细胞膜的通透性的影响以及细胞超微结 构的观察进一步探讨了r a c 和口异丙甲草胺对斜生栅藻的立体选择 性毒性作用机制，为手性农药的生产和合理使用、手性农药的生态风 险性评估提供理论依据。 异丙甲草胺对斜生栅藻的急性毒性影响研究结果表明：从整体而 言，异丙甲草胺对斜生栅藻的急性毒性与除草剂的暴露浓度与时间呈 正相关；处理初期，低浓度( k d ( s - 异丙甲草胺p 环糊精) k d ( 孓异丙甲草胺0 l 环糊精) ，说明r a c 异丙甲草胺易被包合，p 环糊精较q 环糊精包合能力强，同时解释了 环糊精对r a c 异丙甲草胺的毒性影响较大的原因；包合反应的热力学 常数a h ，a s 和a g 均为负值，说明包合反应过程均为放热的、自发 的过程，且包合反应过程中的主要驱动力为焓变。 关键词：r a c 异丙甲草胺；孓异丙甲草胺；立体选择性；斜生栅藻； r o s ；激光共聚焦显微镜( l s c m ) ；透射电子显微镜( t e m ) ；环 糊精 浙江工商大学硕士学位论文 t h et o x i c 卫征c h a n i s m s0 f 卫皿t o l a c h l o r a bs t r a c t r a t i o n a lu s ea n de n v i r o n m e n t a ls e c u r i t yo fc h i r a lp e s t i c i d e s h a v e g a i n e d t h ei n t e r e s to fm a n yr e s e a r c h e r s i nt h i s p a p e r , t h e e n a n t i o s e l e c t i v ee f f e c to na c u t e t o x i c i t y a n do x i d a t i v es t r e s so f s c e n e d e s m u so b l i q u u sb ym e t o l a c h l o rw e r ed e t e r m i n e d t h ec h l o r o p h y l l c o n t e n t ，c e l l u l a rm e m b r a n ep e r m e a b i l i t ya n dc e l lu l t r a s t r u c t u r e so f & o b l i q u u sc a u s e db ym e t o l a c h l o rw e r ei n v e s t i g a t e da sw e l lt os t u d ya n d a n a l y s i st h em e c h a n i s mo fe n a n t i o s e l e c t i v et o x i c i t yb ym e t o l a c h l o r i ti s t oo f f e rt h et h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rt h ep r o d u c t i o na n dr a t i o n a lu s eo f c h i r a lp e s t i c i d e s ，a sw e l la st h ee c o l o g i c a lr i s k s i no u rs t u d y , ap o s i t i v e c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ea c u t et o x i c i t ya n dc o n c e n t r a t i o n e x p o s u r et i m eo f m e t o l a c h l o rw a so b s e r v e d ；f o rt h ee a r l yt r e a t m e n tt i m e ，l o wg r o w t h i n h i b i t i o na n de v e ns t i m u l a t i o no na l g a eg r o w t hw a ss h o w e da tt h el o w c o n c e n t r a t i o nt r e a t m e n t ( 1 ，f r o m2 4 ht o 9 6 h ，s u g g e s t i n g t h e s t r o n g e rt o x i c i t y o fs - m e t o l a c h l o r a n dt h e e n a n t i o s e l e c t i v et o x i c i t yo fm e t o l a c h l o rw a sr e l a t i v e s t a b l ew i t ht h e i n c r e a s i n gt i m e f u r t h e rs t u d yo nt h eo x i d a t i v es t r e s sa n dd a m a g eb y m e t o l a c h l o r , s h o w e dt h a tas i g n i f i c a n ti n c r e a s eo fr o sc o n t e n ti n h e r b i c i d et r e a t m e n tc o m p a r e dt ot h ec o n t r o l ，e s p e c i a l l ya ts - m e t o l a c h l o r t r e a t m e n t i tw a so 7 4t i m e s ( 0 0 5 m g l ) ，1 9 2t i m e s ( o 1 m g l ) ，8 31t i m e s ( 0 2 m g l ) a n d1 0 8t i m e s ( 0 3 m g l ) o f s - m e t o l a c h l o rt or a c - m e t o l a c h l o r s o da n dc a ta tt h er e l a t i v el o wc o n c e n t r a t i o nw e r es t i m u l a t e da t v a r y i n gd e g r e e s s o da c t i v i t yo fo 2 m g lr a c - a n ds - m e t o l a c h l o rw a s 1 58a n d3 18t i m e so ft h ec o n t r o l ，c o r r e s p o n d i n g l y , c a ta c t i v i t yo ft h a t w a s2 14a n d3 10t i m e so ft h ec o n t r o l ，i n d i c a t i n gt h ee n a n t i o s e l e c t i v e o x i d a t i v es t r e s s b yr a c a n ds - m e t o l a c h l o r w i t ht h ei n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o no fh e r b i c i d e ，ad e c r e a s et r e n do fa n t i o x i d a n te n z y m e a c t i v i t yw a so b s e r v e d ，w h i l eac o n t i n u o u s l yg o i n gu pt r e n di nr o s p r o d u c t i o nw a ss h o w e d ，s u g g e s t i n gt h eb a l a n c eo fr o sp r o d u c t i o ni n a l g a ec e l l sm i g h tb ed i s t u r b e d ，r e s u l t i n gi no v e r p r o d u c t i o no fr o s i n a d d i t i o n ，s i g n i f i c a n te f f e c t so nc h l o r o p h y l lc o n t e n t ，c e l l u l a rm e m b r a n e p e r m e a b i l i t y a n dc e l lu l t r a s t r u c t u r e so fs o b l i q u u s b yh e r b i c i d e ， e s p e c i a l l ys - m e t o l a c h l o rt r e a t m e n t ，w e r eo b s e r v e di no u rs t u d y c h laa n d v 浙江工商大学硕士学位论文 c h lbc o n t e n ta t0 3 m g lr a c m e t o l a c h l o rw e r e6 9 4 a n d7 9 5 o ft h e c o n t r o l ，r e s p e c t i v e l y f o rs - m e t o l a c h l o r , t h e yw e r e9 4 1 a n d9 4 5 o f t h ec o n t r o l ，i n d i c a t i n gt h es t r o n g e re f f e c to nt h ep h o t o s y n t h e s i so f a l g a e s a c c o r d i n g l y , t h ec e l l u l a rm e m b r a n ep e r m e a b i l i t yo fa l g a e se x p o s e dt o 0 3 m g lr a c a n ds - m e t o l a c h l o rw e r e6 19a n d4 2 5t i m e so ft h ec o n t r 0 1 a n ds t r o n gr o sc o m e ma n dc h l o r o p h y l lc o n t e n t c e l l u l a rm e m b r a n e p e r m e a b i l i t y g r o w t hi n h i b i t i o nw e r eo b s e r v e d m o r e o v e r , d a m a g e so n t h e c h l o r o p l a s ta n dc e l l m e m b r a n eo fs o b l i q i g u sw e r eo b s e r v e d b y t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p y t h ec e l l w a l lo ft r e a t e d a l g a e s s e p a r a t i n gf r o mt h ec e l lm e m b r a n e ，o b s c u r ec h l o r o p l a s tg r a n al a m e l l a e ， d e c l i n e ds t a r c hg r a n u l e si nt h ec h l o r o p l a s ta n da ni n c r e a s ei nt h en u m b e r o fv a c u o l e sw i t hc e r t a i nb l a c kd e p o s i t so fs o b l i q u u se x p o s e dt ot h e h e r b i c i d ew e r e o b s e r v e d ，e s p e c i a l l y i nt h ec e l l so fs - m e t o l a c h l o r 仃e a t m e m t w ot y p e so fc y c l o d e x t r i n s ，e t - c y c l o d e x t r i n ( 0 【- c d ) a n d 1 3 - c y c l o d e x t r i n ( 1 3 - c d ) ，w e r e s e l e c t e dt oe v a l u a t et h ee f f e c t so ft h e e n a n t i o s e l e c t i v ee c o t o x i c i t yo fr a c a n ds - m e t o l a c h l o ro n & o b l i q u u s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et o x i c i t yo fs - m e t o l a c h l o rw a sh i g h e rt h a n r a c - m e t o l a c h l o ra n dt h a tc d se n h a n c e dt h et o x i c i t yo fm e t o l a c h l o r e n a n t i o s e l e c t i v e l yb yi n c r e a s i n gt h et o x i c i t yo fr a c m e t o l a c h l o rr a t h e r t h a nt h a to fs - m e t o l a c h l o rt o & o b l i q u u s 6 4 5 a n d4 0 9 i n c r e a s eo f t h e9 6 h - a c u t et o x i c i t yo fr a c a n ds - m e t o l a c h l o rw e r eo b s e r v e d ， 浙江工商大学硕士学位论文 r e s p e c t i v e l y , b y 仅一c d ；a n df o r 3 - c d ，t h e yw e r e6 8 o a n d41 8 t h e e q u i l i b r i u m c o n s t a n t ： k d ( r a c m e t o l a c h l o r - 1 3 一c d ) k d ( n a c - m e t o l a c h l o r - a - c d ) k d ( s - m e t o l a c h l o r - 3 c d ) k d ( s - m e t o l a c h l o r - a c d ) ，w h i c hw a gr e s p o n s i b l ef o rt h eg r e a t e rt o x i c i t ys h i f t e f f e c to fr a c m e t o l a c h l o r t h e r m o d y n a m i cs t u d i e s o fc y c l o d e x t r i n c o m p l e x e s ，w i t ha h 0 ，a s 0a n da g - - - j 惯等生物因素影响；w i b e r g 掣1 5 】研究发现滴滴滴( e pj j l 页氯 3 浙江工商大学硕士学位论文 丹) 和叶六六六( 即反氯丹) 间的e r s 在环斑海豹和灰色海豹间的变化相反， 也表明物种差异性是e r s 变化的重要因素。进一步研究发现植物可以立体选择性 富集土壤中存在多年的有机氯农药氯丹，m a t t i n a 等【1 6 1 和w h i t e 等【1 刀证实农药不 仅在各组织中残留量差异较大，而且异构体比例变化也较大，如反式氯丹e r 值 在果实中为o 7 ，而在根部则为1 2 。l e e 等【1 8 】也证实了手性对映体顺式氯乒j - ( t c ) 、 反式氯丹( c c ) g 及非对映体物质反式九氯比率在南瓜( c u c u r b i t a p e p ol 、l 的根、 茎、叶和果实等部位中的表现不同，并且差异很大。b u s e r 掣1 9 】研究表明有机氯 杀虫剂七氯优先代谢产物为( + ) 环氧七氯，并且( + ) 环氧七氯能在鲑鱼、企鹅、灰 海豹甚至人体脂肪体中大量富集【2 0 1 ，另外也有研究报道( 斗环氧七氯被青鱼和 灰海豹立体选择性富集。l i u 等f f 报道美国南加州的农田中检测到拟除虫菊酯类 农药，研究表明联苯菊酯和合成除虫菊脂其( 0 对映体被微生物优先降解，( + ) 对映体则相对较多地被残留富集于环境中。 综上所述，e r 值偏离程度的一个总趋势【2 l 】是：低营养级生物 高营养级生 物 ( ) 地 虫磷 ( 士) 地虫磷 ( ) 顺式联苯菊酯 ( + ) 地虫磷，表明不同手性农药对 映体对同种生物的毒性立体选择性不同。另外，l i u 等【7 】研究结果表明同种手性 农药的立体选择性毒性也因受试生物而异，比较两种水蚤对顺式联苯菊酯和地虫 磷的急性毒性敏感性，网纹水蚤较大型水蚤敏感。随着时间的变化，手性农药的 立体选择性毒性不同。斑马鱼暴露于三氯杀虫酯不同对映体9 6 h 后，间隔2 4 h 观 察其致死率，结果表明：( + ) 对映体的毒性最为稳定，( 士) 和( ) 对映体 的毒性随时间而增大f 3 3 】。 s 浙江工商大学硕士学位论文 手性农药不同对映体对靶标生物的作用不同，包括底物与酶、抗体、受体、 介导物质、d n a 和转运蛋白等各类生物大分子之间的反应。因此，手性农药的 立体选择性毒性差异往往体现在多方面，除致死率外，还包括酶活性抑制、内分 泌干扰、三致效应等。y a o 等【3 9 1 研究甲霜灵外消旋及其天对映体对成熟期斑马鱼 的n a + 和k ，a t p 酶活性存在差异：暴露4 8 9 6 h 期间，1 0 m g lr 对映体逐渐刺 激酶活性，7 0 m g l 处理9 6 h 则产生1 0 抑制；外消旋体处理2 4 7 2 h 期间，n a + 和k + - a t p 酶活性相比对照几乎没有变化，说明酶活性影响对有毒物质更为敏感。 刘和熊【4 0 】报道手性除草剂异丙甲草胺在浓度较低时( o 0 1 m g l ) 能刺激蛋白核小 球藻的过氧化氢酶活性，其中外消旋明显于对映体；高浓度时则明显抑制酶活 性( o 3 0 5 m g l ) ，其中孓对映体明显于外消旋。l i u 和熊对过氧化氢酶活性研 究结果与小球藻在异丙甲草胺低浓度时毒性较小甚至刺激生长，随除草剂浓度增 大而增大的趋势一致。 类似地，l i l l 等【4 l 】研究了甲胺磷不同对映体对2 种分别提取自牛血红球和电 鳗的乙酰胆碱酯酶的活性影响，结果均表明( ) 对映体试验组酶活性高于( + ) 一对映体8 o 1 2 4 倍；进一步的体内毒性实验发现( + ) 一对映体对大型水蚤的4 8 h 毒性是( ) 对映体的7 倍，与酶活性研究结果一致。j i n 等【4 2 】研究合成除虫菊 酯对胚胎幼虫生长期的斑马鱼体内雌激素反应基因表达的影响，结果表明 1 0 0 0 n g l 合成除虫菊酯不同对映体对v t g l 、e s l l x 和e y p l 9 b 三个基因的表达存在 显著性差异( p 。，飞峰鬣nis 皿屿n 出飞脚一咯 函 心譬m寸嚣1t心r芷ttaq 乜譬警-客寸嚣盖s毽m旨譬q叶譬a阿，rq 爱n l u dt毒aot奄o 9夕蕊再式 q唼琴。$冀弘 餐甚鼋韶擦镊堀船垛将岱佰譬 箍钗帮瓢 毯蛏 蜷茸丰掣艚 堆崔茛 雾删蝠瞰 霉蚂 糯掣仆 g一爵磬o。一瓮j哥宴qpiuhsoa iibjlq。j0鲁uixo_3；盆oai芍。一qo一=口i_q一声舀 掣储掣娟掣鞲则堆悄g霉划州*靛糯掣脚i-i僻 议秘掣扑书器扑长慢h目菸 + 制+。制+制+制+蓬砖 q 【9 立 一n 一 蛊罨h寸1暑g乜_n、h暑旨nn0，i暑n01暑g【o ，罱g卜均。、寄基n01暑基h均。 1s昌ii 、茜昌no、h岛暑心0 1sgii 、譬gn0 ，茜g”nh 蛊tfcn0，】蕊”冀n 参。一6q_t18，一6nqh妻j吣囊一ons交jq泰iosu_ 蚕一象qh舞h一。”u_霉一。ns霉ioss蠡善占，itl连。nsti连。”u_焉一on呈娄10gq1196一。ns a葭心tl罄一譬tqa一 tl罾蠢az 嘁蜒船斟帐骣 议袋迫扑书匿扑k栏h婷嶷 【8 f 已 毫g一寸”i_暑_工i卜卜n_、h暑旨。ni 、茜g寸co、茜昌弋。 、茜g西冀1暑暑”oi 、茜iilnt。1s暑。hn卜 1暑暑s_ 1嚣g_9_ 巷盆u幽t196一。占田量一袅u阉t196。”斌_196一。nu阉1196一。占嘲t196一雾u阉囊一。nu田囊一。占嘲趸一。nu豳趸一。”o国 警窘葛oq码so譬a_墨q警，l由。 船甾区建点n嘁褂帐营韵孵 钗秘逍扑书匿扑k慢h目嶷 浙江工商大学硕士学位论文 1 3 异丙甲草胺的作用机理及使用现状 目前，在我国登记生产的除草剂按化学结构可分为苯氧羧酸类、酰胺类、磺 酰脲类、三嗪类等共计1 2 类，约1 1 4 个品种。其中酰胺类除草剂销量最大的依 次为乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺和丁草胺，据报道【4 9 】由于异丙甲草胺杀草谱广， 适用作物多和高效等优点，其在国内需求不断增长，近年来进口国甚至有将异丙 甲草胺替代乙草胺除草的趋势。异丙甲草胺在全球的销售额也一直较为稳定，为 3 7 亿美元。目前市场上的异丙甲草胺产品主要有两种，一种是外消旋异丙甲草 胺( r a c - m e t o l a c h l o r , r a c m t ) ，又称都尔、稻乐思，即r 和孓以相同的摩尔比例存 在，其除草活性主要来自s - 对映体，r 对映体能致突变；另一种是富集了孓对映 体的产品，称异丙甲草胺( s - m e t o l a c h l o r , s m t ) ，又称精异丙甲草胺或金都尔( 图 1 - 2 ) 。 训 & n 蛩删3 a 峨 切 嘭n 首唧地 ，石f c i h 【2 q 切 奄霉”3 a _ 、力f r c h 3 h 邸喝 a r , s r - m e t o l a e h l o ra s ，5 r - m e t o l a c h l o r 图1 - 2 异丙甲草胺的对映体结构图 f i g 1 - 2i s o m e r i cf o r m so f m e t o l a c h l o r 异丙甲草胺最初以外消旋的形式进入市场，直至1 9 8 2 年被发现它的活性 9 5 来自于其两个非对映异构体【5 0 l ，含有9 0 s - 对映体的除草剂就可以产生 相同的生物效应，用量仅相当于6 5 的外消旋的年生产剂量。目前，异丙甲草 胺( 孓对映体) 己实现商品化生产，一些国家陆续用异丙甲草胺取代外消旋形式 异丙甲草胺的生产使用，如瑞士1 9 9 7 年，美国1 9 9 7 年，加拿大1 9 9 8 年，南非 1 9 9 8 年，澳大利亚1 9 9 9 年 5 1 , 5 2 】，也包括我国。异丙甲草胺主要用于控制田间杂 草，对单子叶杂草具有很好的除草效果，已经注册用于世界7 0 多种作物上，另 外有报道异丙甲草胺经常会与其他除草剂( 如莠去净、乙草胺、阿特拉津) 被混合 浙江工商大学硕士学位论文 使用，以扩大其除草范围【5 3 1 。 关于异丙甲草胺的作用机理还不是很清楚。目前学术界比较公认的是异丙甲 草胺抑制植物细胞的分裂。它不仅可以抑制幼苗的伸长生长，还会影响植物其它 生理过程( 如干扰脂质，蛋白质和类黄酮的合成等) ，从而破坏植物细胞的正常 分裂和生长【5 4 1 。异丙甲草胺还会参与植物细胞内延长c 1 6 和c 1 8 ，形成c 2 0 、 c 2 4 脂肪酸的f a e l 合成酶紧紧的结合，导致长链脂肪酸的合成受阻，打破植物 细胞壁和细胞膜中的脂肪酸平衡，从而破坏植物细胞的渗透性和细胞结构的稳定 性5 卯。除此外，异丙甲草胺通过破坏叶绿体片层结构来抑制植物光合作用【4 0 1 的 作用机理也不乏报道。 1 4 异丙甲草胺及其孓对映体的研究进展 1 4 1 异丙甲草胺的迁移及残留 农药施用后会以各种途径如径流、大气沉降等进入到水生生态系统，在水体 中存在不同程度的农药残留。2 0 世纪9 0 年代以来除草剂在中国的市场份额在逐 年增加，到2 0 0 4 年除草剂的市场份额已达到2 6 4 t s 6 1 。市场前景极为看好的除 草剂异丙甲草胺已经注册用于世界7 0 多种作物上，但同时时异丙甲草胺也是地 表水或者地下水中被检出率最高的除草剂之一【5 刀。据报道在北美和欧洲一些国家 中，尽管已经停止使用r a c - 异丙甲草胺但是仍然能够在地面水中检测到残留的 r 对映体1 5 1 1 。且水体中异丙甲草胺的浓度随季节变化【5 羽，在美国的安大略湖区 农田中中异丙甲草胺的年平均浓度是5 r t g l ，但在春夏季的暴雨后，河水中的浓 度可以达到8 0 嵋l 【5 引。对于这些以外消旋形式使用的手性农药，将会有成千上 万吨成为环境中污染物，并可能对非靶标甚至是人类产生毒性效应1 5 1 。 此外，文献报道水体中能检测到异丙甲草胺代谢产物，并且浓度都比母体浓 度高，h l a n d i k 等【5 9 】发现在美国切萨皮克海湾中异丙甲草胺的代谢产物的浓度是 其母体的2 0 3 0 倍，v a r g o 等【6 0 j 对美国爱荷华州8 8 个城市水井和1 2 个河流采样 点的水样进行研究，发现7 5 的地下水样中都能够检测到e t h a n e s u l f o n i ca c i d ( e s a ) 和o x a n i l i ca c i d ( o x a ) ，浓度是其母体的3 - 4 5 倍，而e s a 被认为是异丙甲 草胺与植物包括藻类，及微生物体内的g s h 发生结合反应后生成的磺酸化物【6 l 】。 这些代谢产物在土壤中的迁移性要比异丙甲草胺来得好，因此在环境中的半衰期 l l 浙江工商大学硕士学位论文 要比异丙甲草胺长【6 2 1 。c a r l s o n 等1 6 1 1 研究报道相比之下，异丙甲草胺代谢产物其 细胞毒性减小，但其更容易导致致畸可能性。由此可见，异丙甲草胺的立体选择 性环境行为以及毒性研究显得极为重要。然而目前对于r a c 和孓异丙甲草胺施 用后产生的生态安全差异的研究少有涉及。 1 4 2 异丙甲草胺的立体选择性 手性污染物的生物效应大都具有对映体选择性，某一对映体具有生物活性， 而其他对映体的生物活性会很低、无效甚至有副作用，异丙甲草胺其除草活性主 要来自s - 对映体，r 对映体能致突变。已有研究表明，孓异丙甲草胺和其外消旋 体( r a c ) 异丙甲草胺在药效、毒理学等方面存在差异1 6 3 , 6 4 l 。表1 - 2 罗列了现有关 于异丙甲草胺对水生生物的急性毒性研究结果。 表1 2 说明了异丙甲草胺的毒性因受试生物种类、暴露时间而异。相比之下， 水生藻类比水生动物类对异丙甲草胺的毒性来得敏感，且毒性随着暴露时间而增 大，同时其立体选择性毒性也不同。此外，异丙甲草胺的生物立体选择性不仅体 现在急性毒性方面，研究报道异丙甲草胺在土壤和污泥中的降解具有弱对映体选 择性【6 9 】。 徐冬梅等 7 0 l 研究了异丙甲草胺及其孓对映体对赤子爱胜蚂l ( e i s e n i af e t i d a ) 体 内纤维素酶和过氧化氢酶活性的影响，结果表明短期内( 2 d ，7 d ) s - 异丙甲革胺 影响较大，而长期( 1 4 d ，2 8 d ) r a c - 异丙甲草胺有较大的毒性作用。l i u 等 4 0 l 研 究发现异丙甲草胺与蛋白核小球藻叶绿素含量存在剂量效应，并且叶绿素含量变 化趋势与小球藻生长抑制，说明异丙甲草胺对藻类的光合作用产生一定影响；此 外，l i u 等m 】还发现蛋白核小球藻细胞体内过氧化氢酶活性受一定浓度范围内异 丙甲草胺的刺激，说明小球藻的氧化应激水平，即自由基含量与抗氧化酶系活性 之间的动态平衡受毒性影响。 综上所述，手性污染物的不同对映体在生物体内存在不同的活性，它们对人 类健康和生态安全所构成的威胁也有很大的差别【7 1 1 。因此，对映体水平上研究异 丙甲草胺的生态安全性已迫在眉睫。 浙江工商大学硕士学位论文 s e l e n a s t r u mc a p r i c o r n u t u m r a p h i d o e e l i ss u b c a p i t a t a c h l o r e l l av u l g a r i s r a c m t r a c m t r a c m t s m t r a c m t e c j o 2 4 h e c s o t s h e c s o , 2 4 h e c 轴饿 e c s o , z 4 h e c s o 4 s h e c j o , z 2 h e c s o 9 e h e c s o , z 4 h e c s o 4 s h e c j o z z h e c 5 0 , 9 酗 e c s o , 7 2 h e c j o 9 嘲 e c 5 0 9 酗 i c s o 。2 4 i i 【6 5 】 【5 2 】 【4 0 【6 6 【6 7 】 【6 8 】 【6 3 】 1 5 环糊精在手性农药中的研究及应用 环糊精( c y c l o d e x t r i n s ，c d s ) 也称环聚葡萄糖，由淀粉通过环糊精葡萄糖基转 移酶( c o t ) 降解而成，是一种水溶性、非还原性、不易被酸水解的白色结晶或无 定型粉末，无毒，具有多孔性。最常见的为洳环糊精( a c d ) ，3 - 环糊精( p c d ) 和y 。环糊精( y - c d ) ，分别由6 、7 、8 个葡萄糖单元，彼此间通过a 1 ，4 糖苷键 连接形成一个呈锥形的圆环( 图1 3 ) 。 环糊精具有一个环外亲水，环内疏水且有一定尺寸的立体手性空腔，可以和 许多客体( 或称为底物) 分子包结形成包合物，可以起到保护、稳定、增溶客体分 2 6 l 7 2 6 6 l 8 6 8 力 ， 5 3 侈 抖 ：2 仆 m ： 卯 溅 眩 h 蚴 躬 蚴 吣 洲 吣 嘶 呱 锄 则 m 刚 浙江工商大学硕士学位论文 子和选择定向分子等作用f 诩。环糊精的包合作用还受环糊精分子空腔大小和包合 反应热力学过程影响p ”，a c d ，p - c d 和y - c d 三种环糊精的主要理化性质见表 1 - 3 。利用环糊精的包合性能，将农药分子用环糊精包合起来形成的环糊精农药 包合物，可改变农药分子的理化性质，如提高农药的溶解度等已见报道【7 4 1 。z h a n g 等1 7 5 1 报道p c d 及其两种衍生物( 羟丙基p 环糊精和部分甲基化p 环糊精) 能有 效改变精恶唑禾草灵的水溶性并同时改变其生物可利用性。c a i 等【7 6 1 报道p - c d 及其衍生物对2 硝基联苯的水溶性影响与其生物降解影响呈正相关。f a i 等册和 d ea z e v e d o 等【7 8 1 的研究表明环糊精与药物的包合作用还能影响农药的生物毒 性。 h 蛾钠单h 曲l c 呐量自d 0 图1 3 环糊精分子结构及立体结构( 当n = 6 ，为洳环糊精； n - 7 为争环糊精；n = 8 ，为t 环糊精) f i g 1 3t h es c h e m eo f t h es t e r e o - c o n f i g u r a t i o no f c d s ( m e a nn = 6f o ra - c d ；m e a nn = 7f o rp - c d ； m e a nn = 8f o ry o c d ) a n ds c h e m a t i c3 dr e p r e s e n t a t i o no f t h eh y d r o p h o b i c a n dh y d r o p h i l i cr e g i o n so f c d s 同样地，环糊精因具有立体选择性的疏水空腔，能够提供与对映体结合的空 间【7 9 1 ，环糊精衍生物能与手性分子形成包合物的事实已由x - r a y 及1 h n m r 证实。 因此，环糊精尤其是j 3 - c d 及其衍生物常被用作手性选择剂，在毛细管电泳手性 拆分中应用最为广泛 8 0 i ，其分离机理即基于被分离的物质和环糊精形成包合物的 作用力不同1 8 1 】。进一步的研究表明环糊精因与手性农药不同对映体间形成的包合 作用力不同，而能不同程度改变手性农药对映体的理化性质【8 2 1 。环糊精通过手性 识别手性药物不同对映体【3 2 】，立体选择性地改变手性药物的释放【8 3 】、转移洲。 z h a n g 等【4 7 】研究报道环糊精改变手性农药的立体选择性毒性还与环糊精种类及 浓度相关。 浙江工商大学硕士学位论文 n u m b e ro f g l u c o p y r a n o s eu n i t s m o l e c u l a rw e i g h t ( g m 0 1 ) s o l u b i l i t yi nw a t e ra t2 5 0 c ( ，w v ) o u t e rd i a m e t e r ( a ) c a v i t yd i a m e t e r ( a ) h e i g h to f t o r u s ( a ) c a v i t yv o l u m e ( a 3 ) 1 6 本课题立题意义及主要内容 鉴于手性农药在国内外的广泛应用且呈上升趋势的市场前景，以及较为严重 的农药残留问题，更重要的是手性农药在生态环境中潜在的立体选择性生物效 应，包括转移、富集、代谢、降解和毒性等，在对映体水平上研究和评价手性农 药的生态环境效应和安全性问题已然成为必要趋势。异丙甲草胺广泛应用于世界 各地多种农作物上，且市场前景良好，是目前手性农药中研究较为成功的一例。 水藻是水生生态系统中最常见的生物，由于其对毒物敏感、易获得、个体小、繁 殖快，在较短时问内即可得到有毒物质对藻类多个世代及种群水平的影响评价， 因此是一个很好的测试生物，也常被用来监测和评价水体环境质量变化和水体污 染状况。已有研究表明异丙甲草胺不同对映体间存在立体选择性生物毒性 4 0 , 8 5 , 8 6 l 的事实，但多局限于对毒性差异的评价，很少能从对映体水平上解析手性农药产 生立体选择性毒性差异的作用机制。 本文拟选择对有毒物质较为敏感的斜生栅藻为毒性指示生物，从对映体水平 上研究了r a c 和孓异丙甲草胺对斜生栅藻的急性毒性、氧化损伤以及斜生栅藻 的氧化应激反应来说明两者毒性的立体选择性差异，并通过叶绿素含量和藻细胞 膜的通透性的影响以及细胞超微结构的观察进一步探讨分析了r a c 和异丙甲 草胺对斜生栅藻的立体选择性毒性的作用机制；最后本文还研究了具有手性结构 的a 和p 环糊精分别对r a c 和墨异丙甲草胺生物毒性的影响，以及从化学角度 卯 2 5 汹 ， 7 聊 勉 ” 列 9 8 1 2 l 7 7 4 m 粥 钳 眦 9 配 7 l l 1 6 7 2 2 5 石 l ， 4 6 ! ；全 晰 似 浙江工商大学硕士学位论文 研究了环糊精对异丙甲草胺包合反应的物理化学过程，意在探究环境中手性化合 物间可能的相互作用影响异丙甲草胺立体选择性毒性的作用机制。本文的技术路 线图见图1 - 4 。 图l - 4 技术路线图 f i g 1 - 4t e c h n o l o g yr o a d m a p 浙江工商大学硕士学位论文 第2 章异丙甲草胺的急性毒性 2 1 引言 藻类是水生生态系统中的初级生产者、氧气提供者，在大型水生植物、浮游 动物、鱼类之间起着非常重要的营养链接作用，对群落初级生产及富养水体的净 化起着重要作用。在水生生态毒理研究中，藻类因生长周期短、对毒物敏感、易 获得、个体小、繁殖快等特点，在较短时间内可得到化学物质对其许多世代及种 群水平影响的评价，而被广泛的应用于评价农药和一些有机化合物毒性 8 7 , 8 8 l 。许 多国家在化学品风险测试中选用藻类进行生物测试，并建立了多个藻类生物测试 标准方法【的】。大量研究表明，手性除草剂不仅会直接对水生动植物产生毒害即l ， 且呈现立体选择性【4 6 ，9 1 1 ，对水生藻类的生长也有明显的抑制作用h 3 ，9 2 1 ，使藻类的 多样性指数下降，进而影响藻类和浮游动物种群结构和功能，对水生生态系统产 生危害。 本章研究了异丙甲草胺对斜生栅藻的急性毒性，测定了除草剂不同暴露时间 段斜生栅藻生长抑制率，同时考察了异丙甲草胺暴露时间对斜生栅藻的e c s o 的 影响。 2 2 实验方法 2 2 1 试剂与仪器 表2 - 1 试剂及仪器来源 t a b l e2 - 1t h es o u r c eo fc h e m i c a l sa n de q u i p m e n t s 实验材料厂家 r a c - 异丙甲草胺( 9 6 纯度) 孓异丙甲草胺( 9 6 纯度) 硫酸铵( 分析纯) 过磷酸钙( 化学纯) 硫酸镁( 分析纯) 碳酸氢钠( 分析纯) 氯化钾( 分析纯) 杭州庆丰农药厂 先正达( 瑞士) 公司 湖州湖试化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海试四赫维化工有限公司 温州市化学用料厂 成都市科龙化工试剂厂 1 7 浙江工商大学硕士学位论文 氯化高铁( 分析纯) 智能型可编程光照培养箱 可见光分光光度计( 7 2 l e ) 立式压力蒸汽灭菌锅( y x q - l s 3 0 s i i ) 高速冷冻离心机( c f l 5 r x l l ) 净化台控制器( s w c j 1f d ) 国药集团化学试