（环境科学专业论文）重金属汞多克隆抗体的制备及间接竞争elisa方法的研究.pdf

重金属汞多克隆抗体的制备及间接竞争e l i s a 方法的研究 a b s i r a c t t h ea i mo ft h es t u d yi st op r o d u c et h ep o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tm e r c u r y i n0 1 1 1 s t u d y , m e r c u r i ci o n sw a sc o u p l e dt ob o v i ns e r u ma l b u r m i n ( b s a ) a n do v a l b u m i n ( o v a )v i a g l u t a t h i o n ea n dp e n i c i l l i ngs o d i u mt og a i nt h ec o m p l e t ea n t i g e nh g ( i i ) - g s h - b s aa n d h g ( i i ) - p e n i c i l l i n o v ar e s p e c t i v e l y t w on e wz e a l a n dw h i t er a b b i t sw e r ei m m u n i z e dw i t h h g ( i i ) - g s h b s a ，s e v e r a li m m u n i z a t i o nl a t e r , a n t i - a e r u mw a sc o l l e c t e df r o mt h ee a rv e i no f o n eo ft h er a b b i tw h i c hw a ss t i l la l i v ew h e nt h ei m m u n i z a t i o ne x p e r i m e n tw a so v e r t h et i t e r a n di d e n t i f i c a t i o no ft h ea n t i s e r u mw e r ed e t e r m i n e db yi n d i r e c te l i s a u s i n gt h ea n t i g e no f h g - p e n i c i l l i n o v aa st h eo r i g i n a lc o a t i n g 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea n t i s e r u mw h i c hw e r e o b t a i n e dc o n t a i n e dt h ea n t i b o d i e sa g a i n s tm e r c u r y , t h es e r u mt i t e rw a s1 ：2 0 48 0 0 t h ea n t i s e r u mw a su s e df o rf u r t h e rs t u d y , ap r e l i m i n a r ye x p l o r a t i o no ni n d i r e c t c o m p e t i t i v ee l i s au s i n gt h es e r u mw a sd o n e b yt h es t u d yo ft h ef i v ef a c t o r s ，w ep r i m a r i l y d e t e r m i n e dt h eb e s td e t e c t i o nc o n d i t i o n sf o rt h ee l i s aa s s a yc o n d i t i o n s ：t h ec o a t i n ga n t i g e n h g ( i i ) - g s h - b s aw a sd i l u t e d5 0 0m u l t i p l e ，a n t i - s e r u m120 0 0m u l t i p l ed i l u t e d ，t h eb l o c k w a s3 s k i m m e dm i l kp o w d e r , h o r s er a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) l a b e l e dg o a ta n t i r a b b i ti g g d i l u t e d3 , 0 0 0t i m e s ，0 5 m m o l le d t aa sac h e l a t i n ga g e n t a na s s a yc u r s ei sf o r m e db yt h e i n h i b i t i o nr a t e ( i ) a n dt h el o g a r i t h mo ft h em e r c u r i cc o n c e n t r a t i o n ( n g m 1 ) a st h et w o i n f l u e n c i n gf a c t o r s ，t h el i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o ni sa sf o l l o w s ：y = o 18 7 4 x 0 0 4 9 9 ，t h er 2i s o 9 7 3 9 ( yf o rt h ei n h i b i t i o nr a t e ，xf o r t h el o g a r i t h mo ft h eh 8 2 + c o n c e n t r a t i o no naf e w ( 1 9 c ) ， t h ed e t e c t i o nl i m i ti s0 0 0 6 5m g l 1 1 1 es u c c e s so ft h i ss t u d yw e r ep r e p a r e dt h ep o l y c l o n a l a n t i b o d ya g a i n s tm e r c u r y , t h ep r e l i m i n a r ys t u d yo ne l i s a d e t e c t i o nm e t h o d sf o rt h em e r c u r y h a dl a i daf o u n d a t i o nf o rf u r t h e re x p e r i m e n t a lr e s e a r c hw o r k k e y w o r d s ：h e a v ym e t a l ，m e r c u r y , p o l y c l o n a la n t i b o d y , e l i s a i l 重金属汞多克隆抗体的制备及间接竞争e l i s a 方法的研究 缩略语 a b a g b s a d 泓 e d c e l i s a t e m e d 嘶s t m b p b s g s h o d f c a f i a 术语和缩略语表 英文全称 a n t i b o d y a n t u g e n b o v i ns e r u ma l b u r m i n o v a l b u m i n 1 一( 3 一d i m e t h y la m i n o p r o p y l ) 一3 - e t h y l c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b a n ta s s a y s n ，n ，n ”，n ”- t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o e t h a n e 3 ，3 ，5 ，5 - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e p h o s p h a t eb u f f e rs a l t g l u t a t h i o n e o p t i c a ld e n s i t y f r e u n d sa d j u v a n tc o m p l e t e f r e u n d sa d j u v a n ti n c o m p l e t e 中文全称 抗体 抗原 小牛血清白蛋白 卵黄原蛋白 1 乙基( 3 二甲基氨基 丙基) 碳二亚胺盐酸盐 酶联免疫吸附分析 n ，n ，n ，n - 四甲基二乙胺 三羟甲基氨基甲烷 四甲基联苯胺 磷酸盐缓冲液 谷胱甘肽 吸光度 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 重金属汞多克降抗体的制备及间接竞争e l i s a 方法的研究 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中 除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究 成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确 的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子 文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：指导教师签名： 獬嗍。可“月加 3 7 重金属汞多克隆抗体的制各及间接竞争e l i s a 方法的研究 第一章绪论 1 1 引言 随着人们对于自身健康意识的加强及对生活质量要求的提高，食品安全与环境保护 已成为全社会关注的焦点之一，其中重金属污染已成为食品、环境、卫生监测的重要内 容【l 】。现已知至少有2 0 种左右的重金属具有很大的毒性，由于工农业废弃物和城市生活 垃圾的剧增以及化肥的大量使用，人类赖以生存的环境遭到了严重的重金属污染，人类 的生存和健康受到了严重的影响。在所有的重金属污染中，尤以汞、镉、铅、铬对人体 健康的危害最大，由于它们都是蓄积性毒物，被生物吸收后，只能通过一些有限的生化 途径进行转化，而不能像碳源污染物那样能被完全降解为无毒的物质，长期积累在生物 体内会对机体造成严重的伤害。曾经发生的水俣病等都是由重金属污染造成的比较典型 的病例【2 】。因此，尽可能地降低重会属污染造成的危害，对农产品及环境中重金属含量 的监控显得尤为重要。 目前，常用的重金属检测方法有原子吸收光谱法、电感耦合等离子发射光谱法 ( i c p a e s ) 、x 射线荧光光谱法等，运用这些化学仪器进行检测的方法虽然能精确测定 样品中单种金属离子的含量，但这些方法大多需要对样品进行复杂的预处理如高温、强 酸消化等，并且样品的检测需在具有大型分析仪器的室内进行，无法满足现场检测的需 求，存在检测仪器设备昂贵，检测费时、费力，成本高等缺陷。重金属免疫学检测方法 具有检测速度快、费用低廉、简单易携、灵敏度高等特点【3 】，为重金属污染物的检测提 供了一种新的途径。 本章就重金属汞污染与危害及免疫检测方法进行综述。 1 2 汞污染与危害 汞，俗称水银，是一种毒性较大，常温下唯一呈液态的金属，以微量广泛分布于岩 石、土壤、大气、水和生物中。一般情况下，分布在自然界中微量的汞不会对人体及生 态系统造成危害，但随着人类各种活动的同益频繁，造成了汞在自然界中的大量积累， 使汞成为当今污染最为严重、最为普遍的重金属之一【4 】。汞在工农业、医药卫生、电子、 颜料、国防军事等方面都有广泛的应用，目前，世界上约有8 0 多种需要以汞为原料的 工业生产，在生产和使用这些含汞产品的过程中，人类每年向大气中排放的汞的量大约 在1 9 0 0 - 2 2 0 0 0t 之间，给环境造成了严重污染。位于贵州高原中部的红枫湖，由于其沿 湖分布有纺织、冶金化工、电力交通、食品等行业，湖泊在不同程度上受到人类活动的 影响，其沉积物中的汞含量为环境背景值的2 3 1 2 1 3 倍【5 】，我国已成为全球范围内汞 污染最为严重的地区之一【6 】。生产汞的厂矿、有色金属冶炼厂及使用汞的生产部门是汞 污染的主要污染源，其中大气中的汞主要来源于以煤和石油的燃烧、含汞金属矿物的冶 炼和以汞为原料的工业生产所排放的废气；土壤中的汞主要来源于含汞农药和含汞污泥 肥料的施用；水体中的汞主要来源于氯碱工业、塑料工业、电池工业等排放的废水。国 l 重金属汞多克隆抗体的制备及间接竞争e l i s a 方法的研究 内外都曾发生过不同程度的汞污染问题，由于汞具有挥发性、易迁移转化性，汞污染已 成为了一个全球性的环境问题 7 - 1 4 】。 汞在环境中的积累量达到一定限度时，会对生物体造成不同程度的毒害。由于植物 有吸收、积累汞的能力，当土壤中的汞被机体吸收并在体内积累后，会诱发植物体产生 高活性的自由基，导致植物细胞膜过氧化水平上升，细胞膜透性增加，抗氧化酶系统发 生变化，植物生理生化过程出现紊乱，从而抑制植物的生长发育。例如：h 孑十胁迫对辣 椒和小麦种子萌发、胚生长的抑制作用随h f + 浓度的增加而增强，同时叶绿素、丙二醛 和游离脯氨酸含量也明显增多，过氧化物酶( p o d ) 活性亦受到影响【1 5 , 1 6 】，小麦幼苗受 到h 孑+ 胁迫后，地上部和根系中超氧化物歧化酶( s o d ) 活性显著增加，过氧化氢酶 ( c a t ) 的活性也有所增强【l7 1 。同时汞毒害亦会导致植物细胞中的主要细胞器如叶绿体、 线粒体、细胞核裂解，使细胞有丝分裂受到抑制【4 】。水体受h 孑+ 污染后，水生植物受 h 9 2 + 的影响与陆生植物相似，表现为细胞内活性氧代谢失常，膜脂过氧化程度加剧，膜 结构损伤等【l 引。 生长于汞污染水域中的鱼虾类，其早期发育阶段的胚胎期和仔鱼期会在不同程度上 受汞毒害影响，如出现鱼苗畸形、生长发育受到抑制等现象，与其他重金属相比，汞对 鱼虾类所造成的毒害更大【l9 1 。作为人体非必需元素的汞，它可以通过职业性暴露、呼吸、 饮食和皮肤接触等途径进入人体，对人体的键康危害因摄入体内的汞量、种类、侵入的 途径和方式有关。微量汞可经过人体排泄系统排出体外，不会引起危害，但若存在于体 内的数量过多便可导致人体健康受损。汞可分为元素汞、无机汞和有机汞三类，在一定 条件可以相互转化。元素汞毒性不大，通过饮食摄入的汞一般不会引起中毒，但会属汞 蒸汽侵入呼吸道后可被肺泡吸收并经血液循环至全身，通过血脑屏障进入脑组织和转移 到肾中蓄积起来，从而导致组织损伤；无机汞有毒性，主要蓄积在肾脏，常见的氯化汞 的致死剂量为l g ；有机汞的毒性大于无机汞r 7 1 ，尤其是甲基汞，对人体的毒性最大，存 在于环境中的任何汞化合物均可转化为剧毒的甲基汞。甲基汞易被人体吸收，但不易被 降解，特别容易在脑中积累。震惊世界的水俣病就是由甲基汞而引起的，患者表现为手 足协调失常、运动障碍、弱智、听力及言语障碍、感觉障碍、视野缩小等症状【2 0 - 2 3 1 。 重金属汞是一种很危险的污染物，可长期积累在生物体内且不可降解，在极微量的 情况下也会对机体造成不良后果，重金属汞可通过食物链积累到人体中，引起多种疾病 甚至导致死亡，而且危害还可遗传给下一代。由于重金属污染具有富集性，对动植物、 人类和环境具有潜在的危险性，因此，开展重金属汞的定性、定量分析在食品和环境检 测等方面都是非常重要且必要的。 1 3 重金属免疫检测方法 重金属的检测方法常采用化学仪器检测，检测所用仪器昂贵且前处理较为繁琐，难 2 重会属汞多克隆抗体的制备及间接竞争e l i s a 方法的研究 以适应市场产品的现场抽样，进出口快速通关等的要求。所以，研究出快速、简便、成 本低廉的重金属检测方法是十分必要的。近年来，重金属检测技术有了改进和发展，其 快速检测技术主要有：生物化学传感器方法、免疫学方法。由于免疫分析方法价格便宜、 灵敏度高、前处理简便，符合大批量、现场检测的要求，在环境激素、农药、工业污染 物、重金属等检测方面都有广泛的应用阱、2 5 1 。以下重点介绍重金属免疫检测方法。 1 3 1 免疫检测技术 免疫学检测是根据抗原和抗体之间相互作用的原理，以已知的抗原或抗体对待测抗 体或抗原进行定量或定性分析的一种生化测试方法【2 6 1 。所谓抗原是指能刺激机体产生抗 体和致敏淋巴细胞并能与之结合，从而发生特异性免疫反应的物质，它同时具有免疫原 性和反应原性。有些小分子物质可与相应抗体结合，但不能刺激机体产生抗体，即仅有 反应原性而无免疫原性，称这些小分子物质为半抗原。将半抗原与大分子物质偶联形成 完全抗原后便能刺激机体产生抗体，称此大分子物质为载体。抗体是指在抗原和免疫系 统相互作用下由b 细胞产生的能与相应抗原发生特异结合的免疫球蛋白( i g ) ，一般抗 体仅与大分子抗原的一部分反应，与相应抗体结合的部位称为抗原决定簇。抗原和抗体 反应的实质是抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间形成抗原抗体复合物的过程，两 者之间是非共价可逆的结合，而不是起化学反应。 目前，常用的免疫检测技术主要有酶联免疫吸附实验( e l i s a ) 、荧光免疫技术 ( f n ) 、凝集试验、免疫沉淀等。随着样品检测项目的增多，又出现了新的免疫检测， 如：分子印迹技术、流动注射免疫检测、脂质体免疫检测、免疫传感器和多组分免疫检 测【2 7 】，其中酶联免疫枪测( e l i s a ) 是目前应用最广泛的免疫榆测方法。 e l i s a 的原理是将部分抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性， 使另一部分抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，并保留其免疫原性和酶活性。 测定时，把待测抗体或抗原和酶标抗体或抗原，按照不同步骤与固相载体表面的抗原或 抗体发生反应。通过洗涤的方法将其它未发生结合反应的物质从体系中去除，最终结合 在固相载体上的酶量与样品中待测物的量成一定的比例。加入酶反应的底物反应一段时 间后，底物在酶的催化作用下转变成有颜色的产物，而产物的量与样品中待测物的量直 接相关，最终可根据颜色的深浅进行定性或定量分析。由于酶具有很高的催化效率，可 极大地放大反应效果，从而使此方法具有很高的检测灵敏度，此检测方法中包含3 种必 要的试剂，即：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物。 e l i s a 检测有多种不同类型的测定方式： ( 1 ) 双抗体夹心法：是检测抗原最常用的方法，将特异性抗体与固相载体连接， 形成固相抗体，洗涤后再加入受检样品，使之与固相抗体接触反应一段时间，使样品中 的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物，再次洗涤后加酶标抗体，使固相免 疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，彻底洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有 重金属汞多克隆抗体的制备及问接竞争e l i s a 方法的研究 的酶量与样品中需检测的物质的含量正相关，最后加底物溶液，夹心式复合物中的酶催 化底物为有色产物。根据颜色反应的程度对该抗原进行定性或定量的检测，同理，将大 分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗 体。 ( 2 ) 双位点一步法：在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不 同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可同时加入样品 和酶标抗体，这种方法不但简化了操作，而且缩短了反应时间，若采用的是高亲和力的 单克隆抗体，则会显著地提高检测的敏感性和特异性。 ( 3 ) 间接法测抗体：原理是利用酶标抗抗体来检测与固相载体结合的待检抗体， 它是检测抗体最常用的方法，检测时先将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原， 洗涤后加稀释的待检血清，使其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物， 再次洗涤后，加酶标抗抗体，与固相复合物中的抗体结合，使该抗体间接地标记上酶， 洗涤去除未连接上的二抗，最后加底物显色，根据颜色深浅表征样品中待检抗体的量。 ( 4 ) 竞争法：可用于测定抗原，也可用于测定抗体。具体方法是将特异抗体或抗 原与固相载体连接，形成固相抗体或抗原，洗涤，待测管中加待检样品和一定量酶标抗 原或抗体的混合溶液，使其与固相抗体或抗原反应。若待检样品中无抗原或抗体，则酶 标抗原或抗体可与固相抗体或抗原顺利地结合，若待检样品中含有抗原或抗体，则与酶 标抗原或抗体有相同的机率和固相抗体或抗原结合，竞争性地占去了酶标抗原或抗体与 固相载体的结合机会，减少了酶标抗原或抗体与固相载体的结合量。对照管中只加酶标 抗原或抗体，温育后，可充分地与固相抗体或抗原结合，洗涤，加底物显色：对照管中 因结合的酶标抗原或抗体最多，故颜色最深。对照管与待测管颜色深度之差，表征待检 样品抗原或抗体的量。待测管颜色越淡，表明样品中抗原或抗体含量越多。 免疫检测方法可用于定性或定量检测，定性检测是用己知的抗体或抗原和待检样品 混合，反应一段时间后，通过观察是否有免疫复合物形成的现象来推断待检样品中相应 的抗原或抗体的存在与否；定量检测是根据反应中抗原和抗体的浓度与所形成的复合物 浓度之间存在一定的函数关系为依据，绘制实验性标准曲线以推算待测样品中抗原或抗 体的浓度。 免疫检测的常用形式可分为均相和非均相免疫分析。非均相免疫分析是在除去与固 相载体连接物对应的、未反应的抗原或抗体后再加入测定结果的试剂，此法的检测灵敏 度和检测限均优于匀相免疫分析。此外，免疫检测亦可分为夹心法和竞争法。竞争法是 利用未标记的待测抗原和已知数量的标记抗原竞争的抗体结合位点，根据检出的标记抗 原的量推出待测物的浓度，可用于测定小分子物质【2 引。 1 3 2 重金属免疫检测程序 重金属同其他的小分子污染物一样，其免疫检测的程序包括5 个主要步骤：确定 4 重金属汞多克隆抗体的制备及间接竞争e l i s a 方法的研究 目标分析物；半抗原设计、合成与鉴定；半抗原和载体蛋白连接，合成完全抗原； 免疫动物制备抗体；建立目标分析物的免疫检测方法。 1 3 2 1 重金属螯合剂的筛选及半抗原的合成 制备重金属完全抗原是免疫检测技术研究中的关键问题。由于重金属离子带有电 荷，可与生物分子发生强烈的不可逆反应，导致动物中毒，所以，它不能单独的成为有 效的抗体识别目标。但是，可利用螫合剂的螫合功能，将其与重金属离子反应，形成重 金属螯合剂复合物。由于重金属离子与螯合物之间的螯合，其与生物分子的反应能力 被大大地减弱，而形成的金属螯合剂复合物亦可提供一个能被免疫系统识别的有机物 外壳【2 9 1 。但因此复合物分子量低、免疫原性弱，而不足以引起动物发生免疫反应。故选 用结构较复杂的大分子双功能鳌合剂，一方面鳌合重金属，另一方面连接到载体( 蛋白 质类、大分子聚合物、多肽聚合物等) 上，制备出完全抗原【3 0 。3 2 】。而双功能螫合剂的筛 选是制备重金属完全抗原的关键所在。目前，制备重金属抗体常用的双功能螫合剂主要 是在乙二胺四乙酸( e d t a ) 和二乙烯三胺五乙酸( d t p a ) 等已知分子基础上，用硝基 苯、苯磺酸、丁基苯等衍生后形成的高选择性螯合剂( 常用的螯合剂结构如图1 1 所示) 3 3 - 3 5 】，亦有报道选用还原型谷胱甘肽作为双功能螯合剂【3 6 1 。此外，植物螯合肽和金属硫 蛋白也可一方面络合金属离子，一方面与载体蛋白偶联，制备出完全抗原【3 7 , 3 8 】。 辱一k e 帆 垂cc 一芒c 簟 c y c l o h e x y l - e d r a n i t r o b e n z y l - d t p a c y c l o h e x y l d t p a 图1 1 常用重金属选择性螯合剂 f i g 1 - 1c o m m o nu s e dh e a v ym e t a ls e l e c t i v ec h e l a t e s 1 3 2 2 半抗原和载体蛋白连接，合成完全抗原 完全抗原是由半抗原和载体蛋白以共价键偶联而成的。常用的载体蛋白有牛血清白 蛋白( b s a ) 、卵清蛋白( o v a ) 和钥孔血蓝蛋白( k l h ) 等。载体蛋白上可结合半抗 原的功能基团有羧基、氨基、酪氨酸的羟基和半胱氨酸的巯基等。 根据重金属螯合剂复合物所含基团的不同，常采用以下几种方法将其与载体蛋白 5 莺金属汞多克隆抗体的制各及间接竞争e l i s a 方法的研究 偶联合成人工完全抗原： ( 1 ) 含氨基或可还原硝基：常用的有重氮化法、碳二亚胺( e d c ) 法、戊二醛法、 二异氰酸盐法等。 ( 2 ) 含有羧基或可羧化基团：常用的有羟琥珀亚胺( n h s ) 酯法、碳二亚胺( e d c ) 法 和混合酸酐法等。 ( 3 ) 含羟基：必须经一定的转化后方可与蛋白质结合。醇类可选择在分子中引入 羧基，如转变为半琉珀酸酯后按含羧基半抗原方法与偶联到载体蛋白质分子上。 ， ( 4 ) 含巯基：采用马莱酰亚胺法或在p h 4 0 的醋酸缓冲液中，利用过氧化氢的作 用形成二硫键，将半抗原和载体蛋白质分子偶联。 ( 5 ) 含醛基或酮基：根据其易与o ( 羧甲基) 羟胺反应，生成带有羧基的半抗原衍 生物( o 一羧甲基肟) 的性质在分子中导入羧基，亦可在对肼苯甲酸作用下，将酮基半 抗原衍变成羧基半抗原衍生物，最终参考含羧基半抗原方法与载体蛋白偶联。 i 3 2 3 重金属抗体的制备 根据抗体获得方式的不同，可将抗体分为多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体 等。 多克隆抗体是环境免疫检测方法中最常用的一类抗体。用合成的完全抗原免疫动物 后，可以引起动物的免疫反应，由于完全抗原有多个抗原决定簇，免疫系统将会产生具 有不同特异性的多种抗体，称为多克隆抗体。在制备多克隆抗体时，免疫动物的半抗原 载体复合物纯度应尽可能高。多克隆抗体生产成本低、耗时短，所以是免疫检测中常 用的试剂。 由一种抗原决定簇刺激机体，由一个b 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体，称之为 单克隆抗体。此抗体与抗原的亲和性能稳定，特异性强。在成功制备重金属抗原之后， 免疫小鼠，利用聚乙二醇( p e g ) 作为细胞融合剂，将免疫过且能分泌相应抗体的b 细 胞小鼠脾细胞与能在体外不断繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合为一体，在选择培养基的作用 下，筛选出融合成功的杂交瘤细胞，经过反复多次的克隆化培养，可获得能不断繁殖的 所需抗体的纯杂交瘤细胞系。再将此细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔或体外旋转瓶培养， 从而制备出高效价的单克隆抗体【3 9 1 。由于免疫检测的质量控制，需要大量性质均的抗 体，所以单克隆抗体在环境分析方面的运用越来越受到重视。 基因工程抗体是利用d n a 重组技术，将从生物体分离出的编码抗体的基因纯化后导 入另一种生物体内，这种带有完整抗体结合性能的抗体片段，能在e s c h e r i c h i ac o l i 这样 生长容易的生物体内表达并且大量生产，同时可借助分子生物学的工具，对抗体的结合 位点进行调控，提高其特异性与亲和性。基因工程抗体具有生产成本低、检测性能好、 周期短等优点，但目前还不能满足实际生产的需要。 6 重金属汞多克隆抗体的制各及问接竞争e l i s a 方法的研究 1 3 2 4 建立目标分析物的免疫检测方法 目前重金属的免疫检测均采用抗原抑制的方法，包括以下几种免疫检测模式： 荧光偏振免疫检测( f p 从) ：其方法是将样品中的重金属离子与过量螯合剂反应， 形成重金属螯合剂复合物，此复合物再与固定浓度的重金属螯合剂一荧光复合物竞争对 应的检测用多克隆抗体上的结合位点，然后利用荧光偏振分析仪进行分析，最终参考标 准曲线计算得出重金属离子的浓度【4 0 1 。此方法中用到的是多克隆抗体，无需制备单克 隆抗体，因而用于检测样品中重金属离子含量的成本较低，e l b a u m 等人用酶间接荧光 偏振法检测z n 2 + 离子，并指出在现场测试时用此方法非常有效【4 。 间接竞争性e l i s a 检测：方法是首先使样品中的重金属离子与过量螯合剂形成可溶 性的重金属螯合剂复合物，再与已包被在酶标板上的重金属螯合剂蛋白质复合物竞争 单克隆抗体的抗原结合位点，通过添加酶标二抗和底物显色，测定吸光度的值，然后通 过标准曲线计算得出样品中所含重金属离子的浓度。该方法是重金属免疫检测技术发展 过程中最初使用的方法，与其他方法相比，此方法易受多种因素的干扰，造成检测结果 出现假阳性或假阴性。t a w a r a d a 等人利用竞争e l i s a 检测了1 8 8 p p b 2 8 p p m 的 c d ( i i ) 1 4 2 1 。 直接竞争e l i s a 检测：其方法是将检测抗体包被在酶标板内，待测样品中的金属离 子先与过量螯合剂反应形成金属离子螯合剂复合物，然后与已知浓度的金属离子一螯合 剂酶复合物混合，二者在包被有抗体的微孔中竞争抗体的抗原结合位点，洗涤后加底 物显色，测定吸光度，然后通过标准曲线计算得出待测样品中所含金属离子的浓度。该 方法不必添加二抗，从而降低了成本，并且检测的特异性好、灵敏度高，检测下限在lp p b 以下。d a r w i s h 等人采用一步竞争性免疫检测法对人血清中的c d ( i i ) 进行检测，结果表 明此方法检测的特异性很高【4 ”。 k i n e x a 免疫检测：k i n e x a 是一种计算机控制的流式荧光计，可用于快速分离和定 量检测自由抗体、自由抗原和抗原抗体复合物 删。k i n e x a 由毛细管流观察单元组成并 配有多个微孔筛，利用微孔筛将表面固定有蛋白质一螯合剂金属复合物的硬质小珠放入 观测单元内，然后使抗体、可溶性金属螯合剂复合物、抗体抗原复合物三者混和溶液 快速流经小珠，其中部分带有空白抗原结合位点的抗体分子被固定在小珠上，而结合了 可溶性金属螯合物的抗体和可溶性金属螯合物都会被缓冲液冲洗掉，再通过添加荧光 标记的二抗，检测结合在小珠上的抗体分子，通过p c 界面来检测和记录荧光信号，与 标准曲线对照可得出重金属离子的浓度。k i n e x a 免疫检测的灵敏度比间接e l i s a 微板 法高1 0 - - 1 0 0 0 倍f 3 4 1 。 免疫胶体金快速诊断：其原理是将特异性单克隆抗体包被在微孔滤膜载体上，然后 加入待检样品，经滤膜的毛细管作用或渗透作用使待测样品中的抗原与膜上包被的单抗 结合，再加入标记物胶体金结合物达到检测的目的，运用此方法能做到定性或半定量的 7 重金属汞多克隆抗体的制备及间接竞争e l i s a 方法的研究 检测重金属离子【4 5 1 。 1 3 3 重金属汞的免疫检测 目前，我国j 下处在工业化和城市化的飞速发展阶段，城市生活垃圾产量和能源消耗 量与同俱增，由此引发的汞污染危机同趋严峻。因此，研究并开展快速、简便、成本低 廉的重金属汞的免疫检测法是十分必要的。 建立汞免疫检测法的首要步骤是合成汞的完全抗原，而抗原合成过程中起关键作用 的是选择合适的双功能螯合剂。然而，目前国内外有关汞免疫检测方面的报道非常有限。 1 9 9 2 年w y l i e 等人【3 7 】利用还原型谷胱甘肽作为双功能螯合剂螯合h 甙i i ) ，其合成路线 如图1 2 。首先用e d c 法将g s h 偶联到载体蛋白k l h 或b s a 上，再将透析后的偶联 物滴加到h g c l 2 溶液中，通过g s h 将h 颤i i ) 与蛋白连接形成免疫原k l h g s h h g 和包 被原b s a g s h h g ，经透析去除未反应的小分子，达到纯化的目的。再通过原子吸收法 检测复合物中h g ( i i ) 的含量，然后通过免疫b a l b e 小鼠最终获得2 个对h g ( i i ) 有特 异性的单克隆抗体4 a 1 0 和1 f 1 0 ，但未建立其相应的分析方法。2 0 0 7 年杨凤丽脚】等利 用异硫氰基苯甲基乙二胺四乙酸( i t c b e ) 作为双功能鳌合剂螯合h g ( i i ) ，再与蛋白偶 联，获得免疫原k l h i t c b e h g ，以该抗原免疫b a l b c 小鼠，应用杂交瘤技术，经克 隆化获得了5 株可稳定分泌抗重金属汞的杂交瘤细胞株( e h 9 、e b 2 、1 f l l 、1 h 7 和 b b 1 1 ) ，且b b l i 具有较高的特异性，选取此杂交瘤细胞所分泌的抗体，研究建立了e l i s a 检测体系。 卜一g l u t a t h i o n e 1 h 图1 - 2k l h - g s h h g 完全抗原的合成 f i g 1 - 2p r e p a r a t i o no ft h ea n t i g e nk l h g s h - h g 2 0 0 8 年黄桂俊等人【4 7 】以异硫氰酸苄基7 - - 胺四乙酸( i t c b e ) 为双功能螯合剂，成 功合成了半抗原，并将半抗原与钥孔戚血蓝素或牛血清白蛋白偶联制备了抗原，且通过 紫外分光光度计扫描，s d s p a g e 电泳，石墨炉原子分光吸收法和三硝基苯磺酸法等对 半抗原和抗原进行了鉴定，证实抗原合成成功，为制备重金属螯合物单克隆奠定了基础。 1 4 本文的研究目的和意义 随着经济的飞速发展，环境的重金属污染问题日益严重，人类的健康和生活受到严 重金属汞多克隆抗体的制备及间接竞争e l i s a 方法的研究 重威胁，因此人们对环境检测质量要求的呼声越来越高。传统的化学仪器设备检测重金 属的方法虽灵敏度高但存在仪器设备昂贵、前处理复杂等缺点，难以满足现场快速检测 的需要。生物测定技术以其简单、快速、灵敏、特异性强、样品量少等优势而得到迅速 发展，免疫分析技术的发展为重金属检测开辟了一条崭新的途径。 国内外有关重金属汞离子免疫检测的研究报道较少。本文结合我国汞残留较为严重 的国情，在参考国内外相关研究的基础上，研究了汞抗原的合成与多克隆抗体的制备， 并运用所得抗血清，对建立汞间接竞争e l i s a 检测的方法进行了初步探索，为后期制 备汞单克隆抗体提供实验依据和参考，为快速检测试剂盒的研制打下了基础。 1 5 本文的主要研究内容 ( 1 ) 设计合成重金属汞的完全抗原，并进行鉴定； ( 2 ) 免疫新西兰大白兔，制备抗重金属汞的多克隆抗血清； ( 3 ) 探索建立重金属汞的间接竞争e l i s a 的检测方法。 9 重金属汞多克隆抗体的制备及间接竞争e l i s a 方法的研究 第二章重金属汞人工抗原、抗体的制备与鉴定 利用谷胱甘肽和青霉素g 钠盐作为螯合剂，将n g + 间接与载体蛋白( b s a ，o v a ) 偶联，制备完全抗原，i c p a e s 检测偶联物中h 孑+ 含量，考马斯亮蓝法测定蛋白含量， 并计算其结合比。用免疫原免疫动物制备抗体，通过e l i s a 方法测定其效价，并对抗 血清进行鉴定。 2 1 材料与仪器 2 1 1 试剂、材料和用具 氯化汞( h g c l 2 ) 、水合磷酸氢二钠( n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ) 、磷酸二氢钾( k h 2 p 0 4 ) 、氯 化钾( k c l ) 、氢氧化钠( n a o h ) 、盐酸( h c l ) 、硼酸、还原谷胱甘肽( g s h ) 、牛血清 白蛋白( a l b u m i nf r o mb o v i n es e r u m ，b s a ) 、卵清白蛋白( a l b u m i nf r o mc h i c k e ne g gw h i t e ， o v a ) 、考马斯亮蓝g 2 5 0 均为分析纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司；青霉素 g 钠盐( p e n i c i l i ngs o d i u ms a l t ) ，购于上海创赛科学仪器有限公司；1 乙基。( 3 二甲基 氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐( e d c h c l ) 为s i g m a 公司产品；三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) ， 4 羟乙基哌嗪乙磺酸钠( h e p e s ，s o d i u ms a l t ) 生工生物工程( 上海) 有限公司；咪唑购 于上海西唐生物科技有限公司；醋酐购于上海豪登化工有限公司；乙腈购于上海试一化 学试剂有限公司；标准蛋白m a r k e r 购于上海星汉生物科技有限公司；汞标准溶液( m e r c k ) 购于上海恒奇仪器公司；脱脂奶粉由蒙牛乳液集团生产。 弗氏完全佐剂( f r e u n d sa d j u v a n tc o m p l e t e ，f c a ) 、弗氏不完全佐剂( f r e u n d s a d j u v a n ti n c o m p l e t e ，f i a ) 为s i g m a 公司产品；辣根酶标记羊抗抗兔i g g ( g o a ta n t i r b i g g h r p ) 购于上海朗顿生物科技有限公司；吐温2 0 ( t w e e n 2 0 ) 、3 0 过氧化氢溶液 ( h y d r o g e n p e r o x i d e ) 、3 ，37 ，5 , 5 - 四甲基联苯胺( t m b ) 购于国药集团化学试剂有限公司。 超滤离心管m i c r o c o ny m 3 0 ，购于上海晶睿生物科技有限公司；各种规格的离心 管均购于海门市其林贝尔仪器制造有限公司；一次性注射器购于国药集团上海医疗器械 有限公司。 实验动物：新西兰大白兔购于上海生旺实验动物养殖有限公司。 2 1 2 仪器 所需仪器设备如表2 1 。 l o 重金属汞多克隆抗体的制备及间接竞争e l i s a 方法的研究 表2 - 1 本试验用仪器设备 t a b l e 2 - 1t h et e s te q u i p m e n t 2 实验方法 2 2 1 主要试剂的配制 ( 1 ) 考马斯亮蓝g 2 5 0 试剂： 称取1 0 m g 考马斯亮蓝g 2 5 0 ，溶解于5 m l9 5 乙醇中，加入1 0 m l8 5 ( w v ) 磷 酸，用水定容至1 0 0 m l ，过滤，常温保存。 ( 2 ) e l i s a 试剂： 包被液：o 0 5m o l l p h 9 6 碳酸盐缓冲液。 称取1 5 9 9n a 2 c 0 3 ，2 9 3 9 n a h c 0 3 ，加双蒸水至1 l ，调p h 至9 6 。 洗涤液：o 1 5m o l lp h 7 4p b s t 。 n a c l 8 9 、n a z h p 0 4 1 2 h 2 0 2 9 9 、k h 2 p 0 4 0 2 9 、k c l 0 2 9 、t w e e n 一2 0o 5 m l ，加双蒸 水至l l ，调p h 至7 4 。加双蒸水至l l ，调p h 至7 4 。 封闭液：5 脱脂奶粉。 称取5 9 脱脂奶粉，加洗涤液至l o o m l ，保存于冰箱中。 反应稀释液：o 0 1m o l lp h 7 0 磷酸盐缓冲液。 n a c l 8 9 、n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 3 6 3 9 、k h 2 p 0 4 0 2 4 9 、k c l 0 2 9 ，加双蒸水至1 l ，调p h 至7 0 。 重金属汞多克隆抗体的制备及间接竞争e l i s a 方法的研究 底物缓冲液i ：称取7 1 6 3 9n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，加蒸馏水溶解后定容至1 0 0 m l ， 灭菌后保存。 底物缓冲液i i ：称取2 1 9 柠檬酸，加蒸馏水溶解后定容至1 0 0 m l ，灭菌后保存。 t m b 储液：称取1 0 m gt m b ，溶解于5 m l 无水乙醇中。 t m b 使用液：t m b 储液0 2 5 m l 、底物缓冲液i1 2 8 5 m l 、底物缓冲液i i1 2 1 5m l 、 蒸馏水2 5m l 和3 0 h 2 0 2 1 0 p l 。 终止液：2 m o l lh 2 s 0 4 溶液。 准确量取2 1 7 m l9 8 的浓硫酸，缓慢加入到1 7 8 3 m l 蒸馏水中，边加边搅拌。 2 2 2 完全抗原的制备 2 2 2 1 免疫抗原h g g s h - b s a 的制备 称取g s h 和b s a 各1 0 m g ，分别溶于5 m l 的h e p e s ( 0 0 1 m ，p n 7 4 ) 中，将g s h 溶 液逐滴滴加到b s a 溶液中，然后加入1 0 m l2 m g m l 的e d c 溶液，置于摇床上，室温反 应3 h 后取出反应液，用m i c r o c o n y m 3 0 超滤离心管对其进行分离纯化，去除未反应的 小分子物质。然后将一部分超滤后的溶液逐滴加入1 0 m l2 m m o l l 的h 9 2 + 溶液中，摇床 上室温避光反应过夜，次日取出反应物，同前法超滤，以达到分离纯化的目的，分装后 2 0 。c 保存备用。m i c r o c o ny m 3 0 超滤离心管在使用前，用1 0 0 m m o l le d t a 和p h 7 4 的h e p e s 对其进行预处理【4 8 1 。 2 2 2 2 包被抗原h g - 青霉素- 0 v a 的制备 参考王焕等人的方法【4 9 】合成半抗原h g 青霉素，然后向反应液中加适量的h 2 s 溶液 以沉淀未参加反应的h 9 2 + ，过滤除去沉淀。再取1 0 m ll m g m l 的o v a 溶液逐滴加入过 滤后的半抗原反应