（化学工艺专业论文）纳米管纳米粒子杂化海藻酸凝胶固定化醇脱氢酶.pdf

摘要 海藻酸( a l g ) 钙凝胶具有生物相容性好、价格低廉、材料易得、制备简便等 优点，已成为使用最为广泛的酶固定化载体之一。但其突出缺点是结构松散、孔 径大，酶泄漏严重，且易发生溶胀。这些缺点严重限制了海藻酸凝胶固定化酶的 使用寿命和进一步的应用。 为克服上述缺点，本研究根据酶固定化载体设计中“亲疏平衡”和“刚柔相 济”的思想，在海藻酸凝胶中添加不同亲疏水性、结构形态的纳米管( 碳纳米管， c n t s ；二氧化硅纳米管，s i n t s ) 和纳米粒子( 二氧化硅胶体，s g ；石墨) 制备 出新型的无机有机杂化凝胶：海藻酸碳纳米管杂化凝胶( a l g - c n t sg e l ) ，海 藻酸一二氧化硅纳米管杂化凝胶( a l g s i n t sg e l ) ，海藻酸硅胶颗粒杂化凝胶 ( a l g s gg e l ) 和海藻酸石墨杂化凝胶( a l g g r a p h i t eg e l ) ，并通过s e m ，e d x ， f t i r 、s e m ，d m a 和b e t 等多种表征手段对空白及杂化海藻酸凝胶的结构形 态、物化性质进行了研究。并通过非稳态扩散模型研究底物n a d h 在空白及杂 化海藻酸凝胶的扩散行为。研究结果表明，杂化后，凝胶的机械强度显著增强， 底物在凝胶中的有效扩散系数也大大提高。 首先采用先吸附、后包埋的方法将模型蛋白( 牛血清白蛋白，b s a ) 包埋于 空白及杂化海藻酸凝胶中，通过对各种凝胶在固定化过程中b s a 泄漏率的研究 发现，由于杂化介质对b s a 分子和水分子的吸附，杂化海藻酸凝胶中的b s a 泄 漏率显著下降，且凝胶中b s a 泄漏率从高到低依次为：a l g a l g g r a p h i t e a l g s g a l g c n l b a l g s i n t 。 采用筛选出的a l g s i n t s 和a l g s g 杂化海藻酸凝胶进一步包埋酵母醇脱 氢酶，并对空白及杂化海藻酸凝胶中酶泄漏率、酶促反应最适温度和p h 值、酶 催化活性、动力学性质、循环使用和储存稳定性进行了研究。研究结果显示，与 空白海藻酸凝胶相比，a l g s i n t s 杂化凝胶中的酶泄漏率降低了5 0 。此外， a l g s i n t s 杂化凝胶固定化酶与底物的亲和力、酶活保持率、贮存和循环使用稳 定性均显著高于空白海藻酸凝胶和a l g s g 杂化凝胶两种载体。 关键词：海藻酸杂化凝胶二氧化硅纳米管牛血清白蛋白醇脱氢酶包埋 a b s t r a c t c a l c i u ma l g i n a t e ( a l g 、g e li so n eo ft h em o s tc o m m o n l yu s e dc a r d e r si nt h e e n t r a p m e n ti m m o b i l i z a t i o no fa l l z y m eo w i n g t ot h e i rs i g n i f i c a n ta d v a n t a g e ss u c ha s g o o db i o c o m p a t i b i l i t y , l o wc o s t , e a s ya v a i l a b i l i t y , a n ds i m p l i c i t yo fp r e p a r a t i o m h o w e v e r , s o m ed i s a d v a n t a g e sa r eo f t e na s s o c i a t e dw i m t h i sc a r r i e r , i n c l u d i n gh i 曲 e n z y m el e a k a g e ，l o wm e c h a n i c a ls t r e n g t h , a n ds e r i o u ss w e l l i n gd u et 0t h e i ro p e n s t r u c t u r e ，l a r g ep o r es i z e t h e s ed i s a d v a n t a g e ss i g n i f i c a n t l yr e s t r i c tt h el i f e t i m eo f t h e s ee n z y m e si m m o b i l i z e di na l g i n a t eg e l sa n dl i m i ti t sf u r t h e ra p p l i c a t i o n t oo v e r c o m et h e s e d i s a d v a n t a g e s ，i n t h i s p a p e r , n o v e l a n de f f i c i e n t o r g a n i c i n o r g a n i ch y b r i dg e l sc o n s i s t i n go fa l g i n a t e g e l sd o p e dw i ln a n o t u b o so r n a n o p a r t i c l e sw e r ep r e p a r e db yi n c o r p o r a t i n gn a n o t u b e s ( c a r b o nn a n o t u b c s ，c n t s ； s i l i c an a n o t u b e s ，s i n t s ) a n dn a n o p a r t i c l e s ( s i l i c ag e l ，s o ；g r a p h i t e ) i n t oa l g i n a t eg e l s t h eh y b r i da l g i n a t eg e lp r e p a r e di nt h ep r e s e n ts t u d yi n c l u d e da l g - c n t s g e l ， a l g s i n t sg e l ，a l g s gg e la n da l g g r a p h i t eg e l t h es t r u c t u r e sa n dm o r p h o l o g i e s ， c h e m i c a la n dp h y s i c a lp r o p e r t i e so fp u r ea n dh y b r i da l g i n a t eg e l sw e r ee v a l u a t e db y s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( s e m ) e q u i p p e dw i t he n e r g yd i s p e r s i v ex - r a y s p e c 血o s c o p y ( e d x ) ，f o u r i e rt r a n s f o r mi rs p e c t r o p h o t o m e t e r 口t i r ) ，d y n a m i c m e c h a n i c a la n a l y s i s0 ) m a ) a n db e tn i t r o g e na d s o r p t i o n d e s o r p t i o nm e t h o d i n a d d i t i o n , t h ed i f f u s i o nc h a r a e t e r i s i t i c so f n a d hi np u r ea n dh y b r i da l g i n a t eg e l sw e r e d e t e r m i n e da c c o r d i n ga l lu n s t e a d y - s t a t em o d e l a n dc h a r a c t e r i z a t i o nr e s u l t ss h o w e d t h a tt h em e c h a n i c a lp r o p e r t i e so ft h e s eh y b r i dg e l sw e r er e m a r k a b l yr e i n f o r c e da n d e f f e c t i v ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n tf o rs u b s t r a t e sw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d t od e e p l yu n d e r s t a n dt h ee f f e c to fd o p i n go nt h ee f i z y m el e a k a g e ，p u r ea n d h y b r i da l g i n a t eg e l sw e r ef i r s t l ye m p l o y e dt oe n c a p s u l a t eb o v i n es e r u m a l b u m i n s a ) d u r i n gt h ee n c a p s u l a t i o n , f i r s tb s a w a sa d s o r b e do nt h ed o p a n t sa n dt h e n b s aa n dd o p a n t sw e r es u s p e n d e di na l g s o l u t i o n , f o l l o w e db yc a 什c r o s s - l i n k i n gt o f o r mb i o c o m p o s i t e s i tw a sf o u n dt h a tb s al e a k a g ed e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya f t e r i m m o b i l i z e di nt h e s eh y b r i da l g i n a t eg e l sc o m p a r e dt ot h a tf r o ma l g g e l , w h i c hw a s m a i n l yd u et o ，f i r s t l y , t h ep r o t e i nm o l e c u l ew a sa d s o r b e do i lt h ed o p a n t sw h i c hc o u l d n o tb ew a s h e do u te a s i l y , s e c o n d l y , d u r i n gt h eg e lf o r m a t i o n , w a t e rl o s si nh y b r i d a l g i n a t eg e l sb e c a m el e s st h a nt h a ti np u r ea l g i n a t eg e l a n dt h eb s al e a k a g e si n t h e s eg e l so c c u r r e di nl h ef o l l o w i n go r d e r ：a l g a l g g r a p h i t e a l g s g a l g - c n t s a l 0 一s i n t s t h e nt h ea l g - s i n t sa n da l g - s gh y b r i dg dw a sc h o s e nf o re n c a p s u l a t i n g y e a s ta l c o h o ld c h y d r o g e n a s e ( y a d h ) t h ee n z y m el e a k a g e ，o p t i m u mr e a c t i o n c o n d i t i o n , c a t a l y t i ca c t i v i t ya n dk i n e t i cp a r a m e t e r s ，o f i m m o b i l i z e dy a d hi na l g 毗 a l g - s i n t sa n da l g s gh y b r i dg e lw e r es t u d i e d n er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e e n z y m el e a k a g ef r o ma l g s i n t sh y b r i dg e lw a sr e m a r k a b l yr e d u c e db ya b o u t5 0 c o m p a r e dt ot h a tf r o ma l gg e l m e a n w h i l e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts t r o n g e ra f f i n i t y b e t w e e ns u b s t r a t e sa n de n z y m e ，h i g h e ra c t i v i t yr e t e n t i o n , i m p r o v e ds t o r a g ea n d o p e r a t i o n a ls t a b i l i t yw l e r ea c h i e v e dw h e ny a d hw a si m m o b i l i z e di na l g - s i n t s h y b r i dg e li n s t e a do f a l gg e la n da l g s gh y b r i dg e l k e y w o r d s ：a l g i n a t e ，h y b r i dg e l ，s i l i c a , n a n o t u b e ，b o v i n es e r u ma l b u m i n ， a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e s ，e n c a p s u l a t i o n 前言 刖舌 固定化酶是2 0 世纪5 0 年代开始发展起来的一项新技术，固定化酶以其稳定 性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物、医学及临 床诊断、资源环境、能源开发等领域发挥了重要作用。常用的酶固定化方法包括 物理吸附法，共价键合法和包埋法等。其中包埋法具有条件温和、操作简便、使 用范围广、酶负载量大等特点，成为应用最为广泛的酶固定化方法之一。 海藻酸( a l g i n a t e ，a l g ) 是从褐藻或菌体中提取的一种酸性多糖类天然高分 子，能在在二价金属离子的引发下迅速反应形成凝胶，形成的海藻酸凝胶具有制 备条件温和、含水率高、生物相容性好等优点，已成为最常用的酶包埋固定化的 载体和药物缓释载体之一。但其突出缺点是结构松散、孔径大，易造成酶的严重 泄漏，且易溶胀或降解。 一 为了克服以上缺点，将无机载体掺杂到海藻酸凝胶中，制备有机一无机杂化 凝胶。该杂化凝胶能把无机载体的机械强度高、稳定性好的优点与海藻酸良好的 生物相容性相结合，一方面改善无机载体与酶相容性差的缺点，另一方面能抑制 海藻酸中酶泄漏和溶胀，提高机械强度。 本研究根据载体设计中“亲疏平衡”和“刚柔相济”的思想，在海藻酸凝胶 中添加不同亲疏水性、结构形态的纳米管和纳米粒子制备无机有机杂化凝胶。 首先采用先吸附、后包埋的方法将牛血清白蛋白( b s a ) 作为模型蛋白包埋于空 白及杂化海藻酸凝胶中，通过对各种凝胶在固定化过程中水泄漏和b s a 泄漏率 的研究，确定出理想的杂化海藻酸凝胶配方和制备条件。然后，对酵母醇脱氢酶 ( y a d h ) 用杂化凝胶进行包埋，通过研究杂化海藻酸凝胶的酶泄漏率，催化特 性及其稳定性、扩散特性、机械强度等，揭示酶一无机介质一高分子三者相互作 用，指导酶固定化载体的设计与合成，建立高效的酶固定化方法，达到酶负载量 大且泄漏率低、酶催化活性高且稳定性强、载体扩散特性好( 底物有效扩散系数 大) 、机械强度大等理想的固定化效果。 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨盗盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：7 盘杨 签字日期：文。p # 年吱月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解基生盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 了玉杨 导师签名： 貉一 签字吼泐6 年2 月2 7 日签字蹶缈石年荔月7 日 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1酶固定化技术 第一章文献综述 酶是由细胞产生的具有催化能力的蛋白质，是生物体内进行新陈代谢不可缺 少的生物催化剂。酶促反应条件温和，专一性强，催化效率高，但酶稳定性很差， 在受热，酸碱和有机溶剂等条件下易变性失活。在存放过程中也易发生构象变 化而导致酶活下降。此外，酶促反应一般在液相中迸行，反应结束后由于酶与反 应液分离困难而导致操作费用增加。这些因素都严重制约着酶在生物工程和技术 领域中的应用。酶的固定化是解决上述问题的主要方法之一。酶固定化技术具有 酶易于循环使用、产物易于分离纯化、过程易于连续化等优点，因而吸引了大量 的研究兴趣，成为酶催化领域的研究热点和前沿1 1 2 1 。酶固定化技术主要包括固 定化方法的研究和和固定化载体的研制两方面。 1 1 1 固定化方法 传统的酶固定化方法主要包括物理吸附，共价键合和包埋法等。物理吸附法 操作简便，且酶活损失很少，但酶容易发生泄露或脱落，选择性差【3 】；共价键合 法虽使酶与载体结合牢固，但条件苛刻，酶与载体作用强烈，易破坏酶的活性中 心，活性回收率低，如以戊二醛交联酸性磷酸酶，酶活回收率仅为2 0 0 1 。且这 两种固定化方法专一性强，通用性差。相比之下，包埋法具有条件温和、操作简 便、适用范围广，酶负载量大等特点，且包埋法固定化酶与生物体细胞膜上的酶 的存在状态也最为接近，因此得到了越来越多的应用【5 】。但包埋法的主要局限是 包埋过程必须在与酶活性相宜的温度、p h 值、有机溶剂等条件下完成，载体选 择范围窄、扩散阻力较大。 1 1 2 固定化载体 在包埋法固定化酶过程中，固定化载体的选择和设计是提高酶活保持率和增 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 强稳定性的关键因素。 1 1 2 1 固定化载体分类 用于包埋酶的载体主要分为无机载体和高分子载体两大类。其中，无机载体 以硅胶、碳材料为主，其优点是结构有序、机械强度高、物理化学稳定性好，主 要缺点是与酶的相容性较差，底物和产物在其中的有效扩散系数较小。而高分子 载体生物上相容相好，制备方便、成本低廉、固定化酶的载体由高分子载体和无 机载体，其中高分子载体生物相容性好、制备方便、成本低廉、固定化酶的初始 活性较高、底物和产物在其中的有效扩散系数较大，因而应用较多。目前，典型 的高分子载体包括多糖类、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯等，随着高分子材料科学的发 展，载体种类选择余地越来越大。但高分子载体包埋酶也存在下述方面的缺陷： ( 1 ) 载体多为水溶性分子，水分子在高分子网络中传递速度快而容易将溶于其 中的酶冲走造成酶的泄漏。( 2 ) 载体易发生溶胀，加剧了酶分子的泄漏，同时降 低了凝胶的机械强度。 1 1 2 2 固定化载体设计 设计理想的酶固定化载体需要考虑两个重要的因素：载体的亲疏水性和结构 性态。载体的这些性质直接影响酶在载体中的构象保持及运动性、酶的可及性及 活性和稳定性。 目前研究中所包埋的酶大多为水溶性蛋白酶，酶固定化载体中必须保持有足 够的水分才能保持酶的构象稳定性，从而保证酶的活性和稳定性。l i u 和c h e n 等通过紫外光谱检测发现，在湿凝胶载体中的酶能够保持其构象稳定性，而在干 凝胶中的酶构象发生较大变化【6 】。因此，亲水性的固定化载体有利于固定化酶活 性保持。此外，材料的亲水环境能对主体溶液苛刻的p h 和温度条件具有很好的 缓冲作用【7 ，8 】。载体的亲疏水性主要受材料本身的极性、荷电性、以及氢键结合 能的影响。常用的亲水性载体主要包括二氧化硅凝胶，以及水溶性高分子凝胶包 括海藻酸、壳聚糖、聚乙烯醇等都为亲水性载体。二氧化硅胶体具有许多能形成 氢键的氧原子和羟基，所以具有较强的亲水性；而多糖类高分子如海藻酸中含羟 基和羧基数目较多，也具有较强的亲水性。 载体的结构形态决定了底物和产物在载体中的扩散以及固定化酶分子的可 及性，同时也影响着固定化酶促反应的活性。许多固定化酶酶促反速率降低的主 要原因是底物在凝胶中扩散受到限制，或者底物分子难以到达酶的活性位点。底 物在凝胶中的扩散性质受到载体孔径影响较大，如果孔径大，则底物在载体中的 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 扩散为自由扩散，扩散速率快；如果载体孔径小，载体在凝胶中的扩散为受阻扩 散，则扩散速率降低。f e r r e i r a 报道载体的孔径增加一倍，则底物的扩散速率有 较大程度增加，酶的催化活性也增加了一倍f 9 】。 1 2 海藻酸凝胶固定化酶研究 根据以上两个载体设计的重要因素，我们选择海藻酸作为固定化载体。海藻 酸是一种多糖类天然水溶性高分子，具有凝胶制备过程操作简便、条件温和、含 水率高、生物相容性好，来源广泛等特点，已成为最常用的酶固定化载体之一。 下面就海藻酸性质、海藻酸凝胶制备以及海藻酸凝胶固定化酶过程作以介绍。 1 2 。1 海藻酸凝胶固定化酶 海藻酸( a l g i n a t e ，a l g ) 是从褐藻或菌体中提取的一种酸性阴离子多糖，是由 古洛糖醛酸( g u l u r o n i c a c i d ，g 段) 与其立体异构体甘露糖醛酸( m a n n u r o n i ca c i d ， m 段) 由毡( 1 4 ) 糖苷键连接而成的线形嵌段共聚物( 图i - 1 ) ，两种结构单元 以m m 段、g g 段和m g 段三种方式链接成为线性直链多糖。 ( g )( 0 ) o v d g g g g g g g m m n i m m m g m g g g g g g g g m g m g m g m l _ jl _ j l _ jl 。_ j g - b l o c km b l o c kg - b l o c k m g - b l o e k 图1 - 1 海藻酸分子链状结构 f i g 1 1l i n e rs t r u c t u r eo f a l g i h a t em o l e c u l e 海藻酸钠在c a 2 + 、s ，、b a 2 + 等二价金属离子的引发下即能形成凝胶“0 1 。单 价阳离子和镁离子无法引发凝胶化反应。其余的二价阳离子如p b 2 + 、c u 2 + 、c d 2 + ， c 0 2 + ，n i 2 + ，z n 2 + 和m n 2 + 等也能与海藻酸交联形成凝胶，但由于它们的毒性而限 制了其应用。形成的海藻酸凝胶通常用作药物缓释载体以及包埋的载体。 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 其中海藻酸钙凝胶的应用最为广泛，ca ：2 + 引发海藻酸形成凝胶的机理研究也 相对较为深入。海藻酸钠在c a + 的引发下凝胶化的过程主要是c a j + 从g 段( 古洛 糖醛酸1 中交换一价钠离子的过程。海藻酸盐中均聚的g 嵌段的分子链结构扣得 很紧，不易弯曲。两个均聚的g 段通过协同作用相结合，中间形成一个亲水空 间，c a 2 + j 差入该空间并且与g 段上的多个o 原子发生螯合作用，从而加强了g 段之间的这种协同作用。这种加强的分子链之间的相互作用最终导致了三维网络 结构的形成，即海藻酸钙凝胶的形成。在这个三维网络结构中，c a 2 + 象一个鸡蛋 一样位于海藻酸盐分子形成的蛋盒中心，形成所谓的“蛋盒结构”( e g g - b o x ) 。图 1 2 给出了海藻酸与钙离子形成凝胶的蛋盒结构。而均聚的m 嵌段由于其韧性较 大，易弯曲，不能与c a 2 + 形成类似的“蛋盒”结构。因此c a 2 + 优先和g 嵌段反 应，而m 嵌段只有在ca _ ”浓度非常高时才能够凝聚。 图1 - 2 海藻酸凝胶化过程的蛋盒机理 f i g 1 - 2e g g - b o xm e c h a n i s mo f a l g i n a t eg e l a t i o n 海藻酸盐的凝胶化通常有两种方法，外源法和内源法。外源法为一神常规方 法，该方法是把海藻酸盐溶胶呈球形分散在c a 2 + 溶液中，溶胶球由外而内进行凝 胶化反应，从而在小球表面快速形成一层致密的海藻酸钙，阻碍了c a 2 十向小球内 部的扩散，因此所得到的一般为非均相凝胶球。内源法是由p e l a e z 与k a r e l 于1 9 8 2 年开发出来的，其制备过程为将不溶性的钙盐( 如碳酸钙、柠檬酸钙和草酸钙等) 的超细粒子分散在海藻酸盐溶胶中，然后将该溶胶滴入溶有醋酸的低芥酸菜籽油 o 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 中，在醋酸的作用下，不溶性的钙盐释放出游离的c a 2 + ，引发一价的海藻酸盐溶 胶形成海藻酸凝胶。 。 外源法是c a 2 + 由外至内扩散到溶胶内部，受c e + 扩散速率影响，且形成的 海藻酸钙阻碍了c a 寸的扩散，因此凝胶化时间较长；而内源法是质子由外至内的 扩散，速度较快，所以凝胶化时间较短。从凝胶结构来看，外源法所得到的凝胶 内外不均匀，凝胶表面比内部更加致密；内源法制得的凝胶更加均一，并且内部 比外表面致密。 1 2 2 海藻酸凝胶的优势和现存问题 海藻酸凝胶法固定化酶具有如下优点：海藻酸从生物中提取，具有极好的 生物相容性；海藻酸凝胶具有很强的亲水性，凝胶中有足够的水分，为酶分子 提供了适宜的微环境，使固定化酶呈现出与游离酶相似的行为：海藻酸凝胶制 备过程操作简便，凝胶化过程不需要加入影响酶结构及活性的助剂( 多为醇) 和 催化剂( 酸或碱) ，只需要金属离子引发，海藻酸即可凝胶化，凝胶化条件更加 温和，使酶活得以更好保持：海藻酸凝胶不直接与酶形成化学键，避免了因为 键合作用造成酶空间结构的改变和活性丧失；海藻酸凝胶具有较大的凝胶孔 径，可以减少酶促反应底物和产物的扩散阻力；可从微观和介观水平上控制凝 胶化过程，根据酶结构和特性设计出具有特殊组装方式和多级结构特点的生物矿 化凝胶，并且根据需要，可以将含酶海藻酸制成薄膜状、块状、粒状或涂覆于其 它载体的表面；海藻酸钠价格便宜，材料易得。 然而，目前海藻酸凝胶固定化酶存在的主要问题是：海藻酸凝胶结构松散， 并且网络孔径大、分布范围广，在5 2 0 0 n m 之间1 1 2 , 1 3 1 。孔径是固定化酶载体的 重要参数之一，较大的孔径虽然有利于底物和产物在载体中的扩散，但同样导致 了酶分子的泄漏。在海藻酸的凝胶化过程中，水分子在海藻酸网络中快速传递， 容易将海藻酸网络中的酶带走，从而造成酶泄漏。其次，海藻酸易发生溶胀，加 剧了酶分子的泄漏，同时也降低了凝胶的机械强度，不利于固定化酶的重复使用。 研究表明，分子量小于或等于3 0 00 0 0 的酶分子都能从海藻酸凝胶球体中泄漏出 来【1 4 1 。许多研究者都研究了酶和细胞在海藻酸凝胶的泄漏问题，例如d a s h e v s k y 采用海藻酸凝胶包埋l 乳酸脱氢酶，泄漏量达到3 6 t “。而r o 和k i m 用海藻 酸凝胶包埋蔗糖酶( m w = 2 7 0o o o ) 的泄漏率超过8 0 i 。c h e e t a me ta 1 测定了失 活细胞在1 o ( w t ) 的海藻酸凝胶的泄漏速率为2 2 9 9 h - i g - 1 干固定化细胞1 1 7 1 。 此外，海藻酸凝胶在老化过程中或在n 矿、k + 溶液中易降解，尤其在一些溶液如 柠檬酸盐、乳酸盐、磷酸盐中稳定性差，易发生溶胀，这也导致酶大量流失，酶 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 活降低。 1 2 3 抑制海藻酸凝胶酶泄漏的途径 由于海藻酸凝胶固定化酶存在以上这些问题，人们不断寻求克服海藻酸自身 缺陷，提高酶包埋率和酶活保持率的方法，目前常用的方法包括： ( 1 ) 采用有机高分子如壳聚糖和聚丙烯酸等交联海藻酸凝胶。t a n r i s e v e n 等采用戊二醛交联海藻酸钙凝胶用于包埋转化酵素，酶的包埋率提高到8 7 【l 剐。 a t e s 等包埋牛乳糖时，同样采用戊二醛与海藻酸钙交联，提高酶的包埋率和稳定 性【1 9 1 。但是由于戊二醛通常也能够与酶结合使酶活性丧失，因此在应用上也受到 了限制。 ( 2 ) 采用高分子涂覆海藻酸颗粒表面形成微胶囊的方法来降低酶泄漏。这 种高分子通常为阳离子聚电解质，通过静电作用吸附在海藻酸颗粒表面。用于海 藻酸凝胶颗粒表面涂覆的高分子包括聚赖氨酸、壳聚糖、聚乙胺、聚丙烯酸、聚 乙醚( p e i ) 、聚乙胺( p n 、後) 、羧甲基纤维素和聚亚甲基共聚胍( p m c g ) 等。 例如，r i l l i n g 在海藻酸钙表面涂覆羧甲基纤维素后，所包埋的细胞色素c 的泄漏 率由原来的几乎1 0 0 降低为3 0 左右【2 0 l 。h e r a n 等采用聚亚甲基共聚胍涂覆海 藻酸钙凝胶，所包埋脲酶的包埋率也达到7 0 t 2 ”。但以上两种方法也有着明显 的缺点：常常使用挥发性有机溶剂，容易对环境造成污染；一些有机溶剂的使用 可能改变蛋白质的结构和功能。减少酶在介质中损失的同时提高固定化酶反应活 性就显得尤其重要。 1 2 4 杂化海藻酸凝胶固定化酶 将无机介质掺杂到海藻酸凝胶中，制备有机一无机杂化凝胶，是一种新的海 藻酸改性方法。这种杂化凝胶能把无机载体的机械强度高、稳定性好的优点与海 藻酸良好的生物相容性相结合，期望一方面改善无机载体与酶相容性差的缺点， 另一方面能抑制海藻酸中酶泄漏和溶胀，提高机械强度。许多研究者已经尝试制 备无杌载体一高分子材料来作为固定化酶载体。 l i v a g e 等把中孔硅胶粒子浸渍于含有b 一半乳糖苷酶的海藻酸钠溶液中然后 通过c a 2 + 引发聚合制备出中孔硅胶海藻酸多孔生物复合物。与空白海藻酸凝胶 相比，该复合载体中酶的泄漏显著降低，稳定性也大大提高，但载体仍以硅胶为 主要组分，载体的传递特性较空白海藻酸凝胶差【2 2 】。s h c h i p u n o v 等通过溶胶凝 胶过程制备出多糖( 包扩海藻酸) 一硅胶纳米复合凝胶，固定化了l 一3 b d 一葡 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 聚糖酶l 和e t - d 牛乳糖，固定化后酶的使用寿命显著提高。他们还研究了多 糖的类型、荷电性、浓度等对凝胶特性的影响，发现多糖与硅胶具有良好的相容 性，多糖上的羟基加速了硅溶胶的凝胶化过程【2 3 川。 1 2 4 1 无机掺杂介质的选择 制备杂化海藻酸凝胶，无机掺杂介质的选择至为重要。近年来，纳米管以其 特有的结构特性、理化特性以及机械性能在生物技术领域中开始有所应用。纳米 管的类别包括碳纳米管( c a r b o nn a n o t u b e ，c n t s ) ，二氧化硅纳米管( s i l i c a n a n o t u b e s ，s i n t s ) ，多肽纳米管等【2 5 1 。其中又以碳纳米管和二氧化硅纳米管的 在生物技术领域的应用最为广泛，如生物催化和生物分离。为实现纳米管在生物 技术中的应用，首先要将生物分子固定化在纳米管上。目前利用碳纳米管和二氧 化硅纳米管固定化生物分子的方法主要包括交联法和吸附法。 碳纳米管中的每个碳原子和相邻的三个碳原子相连，形成六角形网格结构， 如图1 3 所示。碳纳米管端部有五元环的缺陷以及由缺陷引起的维度弯曲，使其 端部碳原子反应活性增加。管壁碳原子形成的化学键同时具有s p 2 和妒混合杂 化特征，但以s 矿为主，管壁上因此形成高度离域化的兀电子复合体系。 碳纳米管交联法固定化生物分子通常利用含有兀电子的有机交联剂与碳纳 米管侧壁上的高度离域化冗电子通过霄芤非共价键作用相结合，再将蛋白质或酶 与这种有机交联剂结合，从而固定化生物分子在碳纳米管的外表面上 2 0 ；或在有 机交联剂的作用下，利用蛋白质或酶分子中氨基酸残基所含的氨基与碳纳米管表 面的羧基发生酰胺化反应，使生物分子通过共价键合作用固定化在碳纳米管外表 面或顶端上【2 。”。k a w i l l i a m 等通过对单壁碳纳米管的表面能量进行m o n t o c a r l o 模拟发现，单壁碳纳米管( s w n t s ) 表面能分布主要集中在6 8 1 1 1 k j m o l ，有 相当_ 部分表面的表面能大于理想石墨的表面能( 9 k j m 0 1 ) 2 s j 。因此碳纳米管 具有很高的表面能，能够通过对蛋白质的物理吸附将生物分子固定在纳米管上 【2 9 - 3 l 】。 二氧化硅纳米管是由平面六元环组成的，每个环由六个硅原子和六个氧原子 组成( 图1 - 4 a ) ，环与环之间通过六个氧桥连接形成网络，在该网络中每个硅原子 连接四个氧原子，每个氧原子连接两个硅原子，因此硅原子与氧原子的比例为 1 ：2 ，即其化学式为s i 0 2 。为了维持这种化学结构，纳米管两端的六元环的外侧 均只有三个氧原子，形成了三配位的硅原子与四配位的硅原子交替的结构。这三 个氧原子都有一个悬空键，只能和一个硅原子键合。当二氧化硅纳米管形成封闭 结构时，三个氧原子同时与三配位的硅原子形成氧桥，所以在纳米管的两端也形 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 成硅原子与氧原子的比例为l ：2 的结构，并且硅原子之间是单氧桥与双氧桥交替 的结构( 图1 - 5 ”。所以整个二氧化硅纳米管结构中，其主体结构为四配位的硅原 子与二配位的氧原子形成的网络，而两端为硅原子之间单双氧桥交替的结构( 图 1 5 c ) 。二氧化硅纳米管表面能很大，计算可知吸附时其分子间势能为5 6 9 k j m o l ， 脱附时其分子间势能为2 1 3 7k j m o l t 3 2 1 。d a v i d 等利用s e h i f f 碱性形成途径把葡 萄糖氧化酶固定到硅纳米管的内外表面，酶的活性达到o 5 0 2 单位m g 纳米管， 且无脱落现象产生，但过程比较复杂【3 3 1 。d i n g 等利用二氧化硅纳米管作为固定 化载体吸附脂肪酶，固定化效率以及固定化后活性都显著增加，但在长期使用中 会发生酶的脱附而引起酶泄漏网。 图1 - 3 碳纳米管结构示意图 f i g 1 - 3t h es c h e m a t i cs t r u c t u r eo f c a r b o nn a n o t u b e 图1 - 4 二氧化硅纳米管的的结构示意图( 大球为硅原子，小球为氧原子) a ) 内层六元环；b ) 两端六元环；c ) 二氧化硅纳米管 f i g 1 - 4 t h es c h e m a t i cs t r u c t u r e o f s i l i c a n a n o t u l ) e ( b i gs p h e r e ：s i ；s m a l ls p h e r e ：o ) a ) i n s i d es i x m e m b e r e dr i n g ；b ) o u t s i d es i x - m e m b e r e dr i n g ；c ) s i l i c an a n o m b e - 8 - 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 虽然碳纳米管和二氧化硅纳米管能够通过交联法和吸附法单独用于酶的固 定化，但还存在一定的困难，主要体现在：纳米管特别是常用的碳纳米管在水 溶液中分散性差；共价修饰易造成纳米管的结构缺陷；碳纳米管化学稳定性 很强，若采用交联法和化学键合法固定化酶，一般需要先对碳纳米管进行共价衍 生，纳米管和酶的结构均容易遭到严重破环；尽管纳米管对酶分子有一定的吸 附容量，但由于吸附非特异性，且酶易脱落，而限制了吸附法的应用。 而将纳米管与聚合物掺杂制备纳米管一聚合物复合材料来包埋酶，能有效减 少酶泄漏并有利于酶促反应。已经有研究表明这种含酶聚合物一纳米管复合材料 系统能作为一种独特的生物催化材料，如生物催化膜等。r e g e 等通过将单壁碳 纳米管和a 一胰蛋白酶直接悬浮在聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 的甲苯溶液中制 备生物催化复合膜。得到的胰蛋白酶一单臂碳纳米管一聚甲基丙烯酸甲酯复合体 薄膜，在1 h 和4 8 h 后的催化活性均高于石墨掺杂的复合膜。结果显示，加入纳 米管后，酶的泄漏量显著下降，固定化酶的活性和稳定性显著增强1 3 甜。此外，无 机纳米材料( 纳米粒子、纳米管) 高分子复合和杂化材料的试验和分子模拟研 究已有大量报道【3 6 挪】，纳米粒子和纳米管的强度在一定程度上增强了高分子的力 学性能，高分子的包裹效应也改善了纳米粒子和纳米管的分散性，但这些复合或 杂化材料中均不含有酶或其他生物分子。 1 2 4 2 纳米管纳米粒子杂化海藻酸凝胶 本研究尝试将酶预吸附于纳米管或纳米粒子后加入到海藻酸钠溶液中，利用 c e + 引发海藻酸交联聚合，形成纳米管纳米粒子杂化海藻酸凝胶，将酶包埋固 定化。纳米管包括亲水性的二氧化硅纳米管和疏水性的碳纳米管，纳米粒子包括 亲水性的二氧化硅胶体( 以下简称硅胶，s i l i c ag e l ，s g ) 和疏水性的石墨。这样 一方面可以考察无机介质的亲疏水性对酶的吸附、酶固定化微环境等的影响，另 一方面，也可考察无机介质的性状( 片状，管状、粒状) 对海藻酸凝胶多孔结构、 扩散性能、机械强度等的影响。 这种纳米管纳米粒子杂化海藻酸凝胶具有以下特点：( 1 ) 添加纳米管和纳 米粒子可以有效改善海藻酸凝胶松散的结构，抑制其溶胀，在保持良好生物相容 性的同时理化稳定性及机械强度也得到提高；( 2 ) 纳米管、纳米粒子对酶和水分 子产生非特异性吸附，可有效减少酶的泄漏。此外，纳米管或纳米粒子与海藻酸 载体界面处的相互作用也可具有减少酶泄漏的作用；( 3 ) 高分子的包裹效应也在 一定程度上阻止了纳米管、纳米粒子的团聚；( 4 ) 酶、纳米管或纳米粒子、海藻 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 酸三者之间温和的相互作用所创造出的适宣为环境可使酶分子的三维结构得以 很好地维持，提高了海藻酸凝胶固定化酶的活性和稳定性；( 5 ) 纳米管或纳米粒 子对于海藻酸凝胶高分子链的排列和网络结构形成的影响可能会有利于底物和 产物在凝胶中的有效扩散；( 6 ) 生物体内蛋白质纳米通道以及生物矿化过程的存 在为纳米管、纳米粒子的应用提供了很好的原型。例如，二氧化硅在很多植物细 胞内矿化，具有极好的生物相容性，二氧化硅纳米管的加入，更利于酶保持生物 活性。 1 2 4 3 酶和反应体系的选择 c 0 2 是温室气体的主要成分，其高效的利用和转化方法近年来一直是全球范 围内的极具挑战性的战略性研究课题。通过化学和生物学途径，c 0 2 可以转化为 多种无机和有机化合物如低碳醇、低碳烃、有机酸、氧气等。其中，c 0 2 转化为 甲醇已经被公认为是具有重要理论和应用研究价值的途径。因为它不但可以有效 地解决c 0 2 的循环利用问题，同时还可以获得重要的化工原料和洁净燃料一 甲醇。为实现c 0 2 向甲酵的转化，国内外的研究人员己尝试了多种方法，其中 非均相催化法( h e t e r o g e n e o u sc a t a l y s i s ) 、电催化法( e l e c l x o c a t a l y s i s ) 和光催化 法( p h o t o c a t a l y s i s ) 三种方法研究最多【3 8 删。各种方法中所用催化剂绝大多数是 氧化物基催化剂，这些化学催化剂普遍存在选择性差和转化率低等突出缺点，且 反应需要在高温高压下进行。而相比之下，酶法转化c 0 2 为甲醇则具有高效专 一、反应条件温和( 常温常压) 、无污染等优点【4 l ，4 2 】。例如采用甲酸脱氢酶( f o r m a t e d e h y d r o g e n a s e ，d h ) 、甲醛脱氢酶( f o r m a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，f a l d d h ) 和 醇脱氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，a d h ) 三种脱氢酶作为催化剂，以还原型二 磷酸吡啶核苷酸( 1 3 - - n i c o t i n a m i d e a d e n i n ed i n u c l e o t i d e ，n a d h ) 作为电子供体， 经三步连串反应将c 0 2 转化为甲醇，如图1 5 所示【4 3 】。该法的一个突出优点是可 以在常温下直接将c 0 2 高效和专一地转化为甲醇。 c 0 2f 耐a