（分析化学专业论文）毛细管电泳高效分离、高灵敏度检测方法的研究.pdf

苏州大学学位论文使用授权声明 l i l t ll ll l l lll lllli iiil y 17 3 18 9 6 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所( 含万方数据电子出版社) 、 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属在年- 月解密后适用本规定。 非涉密论文口 论文作者签名； 导师签名： 期：丛! ! ：竺：坌 e l 期：丝 ! ：! 兰 中文摘要 要 通过毛细管的过程中可实现分离，基 物质，包括无机物和生物大分子。毛 细管电泳已日益成为一个强大和通用的分析分离技术，它具有很多诱人的特征， 譬如高效、快速、微量、经济、应用面广等。现今，毛细管电泳作为高效液相色 谱的有益补充广泛地应用于日常分析，并在化学、药学和生命科学等领域均得到 了广泛深入的发展。本文旨在构建“高分离柱效、高灵敏度 的分析策略，建立 基于高效快速分离、高灵敏度检测的毛细管电泳优化方法，并将其应用到实际生 物样品的分析中。本论文分为四个部分。 第一部分简要回顾了毛细管电泳( c e ) 的发展历史，对毛细管电泳技术的基 本理论、分离模式、应用特点以及联用检测技术等进行了介绍。着重讨论了毛细 管电泳的发展热点。最后，以方法的建立、完善、优化为出发点，提出了本论文 的研究内容。 第二部分报道了自建毛细管电泳电化学检测系统分离测定柚( 苷) 配基、芦 丁、槲皮素三种黄酮类化合物以及抗坏血酸含量的方法。对影响分离分析的实验 参数如缓冲液种类、浓度、p h 值，检测电位，分离电压等进行了详细考察，得到 最佳实验条件：以2 4m m o l l 硼酸盐缓冲溶液为运行介质，1 8k v 电压下，5m i l l 内实现基线分离，自制石墨碳圆盘电极于+ 0 9v 电位下实现检测。柚( 苷) 配基、 芦丁、槲皮素和抗坏血酸的检测限分别为1 0 州，8 0 州，0 5 州和2 0 州。方 法成功应用于s d 大鼠血清和粪便样品的分析测定，回收率均在9 0 9 1 0 8 6 之 间。该方法为黄酮类化合物在生物体内的代谢研究提供了一种新方法的借鉴。 第三部分建立了一种修饰毛细管电泳紫外吸收快速分离测定柚苷、芦丁、槲 皮素和抗坏血酸的方法。采用动态修饰和层层组装修饰涂层技术，将纳米二氧化 硅( s i n p s ) 、聚离子电解质( p d d a 、p s s ) 用于毛细管修饰改性。实验发现， p d d a s i n p s p s s 层层组装涂层c e 能显著改善柚苷、芦丁、槲皮素和抗坏血酸的 峰型，提高柱效和分离度。毛细管经p d d a s i p s s 组装修饰后，四种分析物在1 4 r a i n 内实现了基线分离。本方法用于尿样中痕量柚苷、芦丁、槲皮素和抗坏血酸的 分析测定，四个分析物分别在5 - 1 5 0 “m ，5 1 5 0g m ，5 1 7 5 m 和0 1 2 3 6m m 中文摘要毛细管电泳高效分离、高灵敏度检测方法的研究 的浓度范围内呈良好线性，检出限为1 4g m ，1 3 m ，0 8 斗m ，1 71 t m 。该方法的 提出为修饰毛细管电泳在实际生物样品分析中的应用提供了理论与实践基础。 第四部分基于电化学发光检测灵敏度高、选择性好的优点，进行了毛细管电 泳流动注射电化学发光检测方法的初步研究。利用实验室现有的资源，自行搭建 了一套c e - f i a e c l 分析仪。重点考察了电泳高压对发光检测的影响，工作电极、 毛细管出口端以及光纤的相对位置等因素，设计了一种高效、稳定、一体化的微 型c e f i a e c l 检测池，为随后将要开展的相关工作提供了硬件准备。 关键词：毛细管电泳电化学检测修饰毛细管电化学发光流动注射 l i 作者：钱晓敏 指导教师：屠一锋教授 英文摘要 a b s t r a c t e p a r a t i o na n dh i g h a r ye l e c t r o p h o r e s i s c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) ，b a s e do nt h es e p a r a t i o no fc h a r g e dm o l e c u l e s t h r o u g has m a l lc a p i l l a r yu n d e rt h ei n f l u e n c eo fa l le l e c t r i cf i e l d ，h a se m e r g e d 邪a p o w e r f u la n a l y t i c a ls e p a r a t i o nt e c h n i q u ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fn u m e r o u sa n a l y t e s f r o mo r g a n i cm o l e c u l e st om a c r o m o l e c u l e s 、) l ，i ma t t r a c t i v e f e a t u r e s ，s u c ha sh i 曲 r e s o l v i n gp o w e ra n ds m a l ls a m p l ev o l u m e n o w a d a y s ，i ti su t i l i z e df o rt h ed a i l ya s s a y s a sa ne x c e l l e n tc o m p l e m e n tt oh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o 聊h y t h ea i mo ft h e t h e s i si st oe s t a b l i s ht h ee f f i c i e n t ，s e n s i t i v ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sm e t h o d sa n da p p l y t ot h es e p a r a t i o no ff l a v o n o i d sa n da s c o r b i ca c i di nr e a ls a m p l e s t h et h e s i si sc o m p o s e d o ff o u rp a r t s i nt h ef i r s t p a r t ，t h eh i s t o r y o fc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i st e c h n o l o g y w a s r e v i e w e d ，a n dt h ef u n d a m e n t a lt h e o r y , b a s i cs e p a r a t i o nm o d e l s ，c h a r a c t e r i s t i c sa n d d e t e c t o r so fc ew e r ei n t r o d u c e d a tt h es a m et i m e ，w en a r r a t e dt h ep r e s e n td e v e l o p m e n t h o t s p o t so fc e i nd e t a i l ，a sw e l la st h eg o a la n ds i g n i f i c a n c eo ft h i sp a p e r i nt h es e c o n dp a r t ，al a b o r a t o r y b u i l tc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t he l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o nw a sd e v e l o p e df o rt h es i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no ft h r e ef l a v o n o i d s ( n a r i n g e m n ，m t i n , q u e r c e t i n ) a n da s c o r b i ca c i d t oo b t a i nt h eb e s ts e p a r a t i o ne f f i c i e n c y , t h ee x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r ss u c ha sb u f f e rt y p e ，c o n c e n t r a t i o n , p h ，d e t e c t i o np o t e n t i a l ， s e p a r a t i o nv o l t a g e ，e t c w e r ec a r r i e do u tad e t a i l e di n v e s t i g a t i o n i tw a sf o u n dt h a t n a r i n g e n i n ，r u t i n ，q u e r c e t i na n da s c o r b i ca c i dw e r ew e l ls e p a r a t e dw i t h i n5m i ni nb o r a t e b u f f e rs o l u t i o n ( p h8 6 ，2 4m m ) t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s1 0 “mf o rn a r i n g e n i n ，8 0p m f o rr u t i n ，2 0p mf o ra s c o r b i c a c i da n d0 5 州f o rq u e r c e t i n t h ep r o t o c o lw a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h ea n a l y t e si nr a ts e r u ma n de x c r e m e n t r e c o v e r yr e s u l t sr a n g e df r o m9 0 9 t o10 8 6 i nt h et h i r dp a r t ，t h es t u d yf o rt h es e p a r a t i o no ft h r e ef l a v o n o i d s ( n a r i n g e n i n ，r u t i n a n dq u e r c e t i n ) a n da s c o r b i ca c i db ym o d i f i e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) w i t hu v i l i 英文摘要 毛细管电泳高效分离、高灵敏度检测方法的研究 d e t e c t i o nw a sd e s c r i b e d t h ec a p i l l a r y m o d i f i e db y p o l y e l e c t r o l y t e s a n ds i l i c a n a n o p a r t i c l e s ( s i n p s ) u s i n gd y n a m i cc o a t i n go rl a y e r - b y - l a y e rt e c h n i q u ew a su s e dt o i n c r e a s et h er e s o l u t i o na n ds e n s i t i v i t yo ft h es e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o n t h e m o d i f i c a t i o no f ( d i a l l y l d i m e t h y l a m m o n i u mc h l o r i d e ) ( p d d a ) - - s i l i c an a n o p a r t i c l e s - p o l y ( s t y r e n e s u l f o n a t e ) ( p s s ) w a st h em o s te 毹c t i v ec a p i l l a r y t h ef o u ra n a l y t e sc o u l d b ew e l ls e p a r a t e du s i n gas e p a r a t i o nv o l t a g eo f18k vi n2 4m m o l lb o r a t eb u f f e r s o l u t i o n0 h8 3 ) t h et h e o r e t i c a lp l a t en u m b e r so b t a i n e dw e r ea l la b o v e6 5 1 0 j t h e o r e t i c a lp l a t e sp e rm e t e r , w h i c hw e r ei m p r o v e do b v i o u s l yc o m p a r e dw i mt h en a t i v e c a p i l l a r i e s t h ep r o p o s e d m e t h o dw a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e d f o r t h e r a p i d c e d e t e r m i n a t i o no ft r a c en a r i n g e n i n , m t i n ，q u e r c e t i na n da s c o r b i ca c i di nh u m a n 噎i 地 w i t hs a t i s t i e dr e s u l t s i nt h ef o u r t h p a r t , t h e c o n n e c t i o no f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s w i n l e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c ew a sp r e l i m i n a r ys t u d i e d an o v e lf t - e c lc e l lb a s e do nf l o w i n j e c t i o nw h i c hc a nw e l lc o u p l ew i t hc et e c h n o l o g yw a sd e s i g n e da n df a b r i c a t e d t h e k e yf a c t o r ss u c ha st h ee f f e c to fh i g hv o l t a g eo nl u m i n e s c e n c ed e t e c t i o nw e r es t u d i e d t h ec e l lh a ds o l v e dt h e s ep r o b l o m sw e l la n dp r o v i d e dh a r d w a r ef o rf u r t h e rs t u d y i tw i l l h a v eaw i d ea p p l i c a t i o ni nt h er e a lr e s e a r c ha n da n a l y s i s k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t o p h o r e s i s e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nm o d i f i e d c a p i l l a r y e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c ef l o wi n j e c t i o n w r i t t e nb yq i a nx i a o m i n s u p e r v i s e db yp r o f y i f e n gt u i v 目录 1 1 1 理论1 模式3 1 2 3 毛细管电泳的应用特点4 1 3 毛细管电泳的发展热点6 1 3 1 高柱效分离分析6 1 3 2 高灵敏度检测方法”1 0 1 4 本论文的立题依据与研究内容”1 9 第二章毛细管电泳电化学检测s d 大鼠血清和粪便样品中的黄酮和抗坏血酸2 1 2 1 引言2 l 2 2 实验部分2 2 2 2 1 试剂与仪器2 2 2 2 2 毛细管活化处理”：”2 3 2 2 3 样品预处理2 3 2 3 结果与讨论2 4 2 3 1 电极位置的优化2 4 2 3 2 检测电位的选择”2 4 2 3 3 缓冲溶液的影响2 5 2 3 4 分离电压的影响2 6 2 3 5 线性范围、检测限及重复性2 7 2 3 6 实际样品测定及回收率实验2 8 2 4 结论2 9 第三章纳米s 1 0 2 一聚电解质修饰毛细管电泳用于尿样中黄酮类化合物的分离分 析3 0 3 1 引言3 0 3 2 实验部分- 31 3 2 1 试剂与仪器3 1 3 2 2c e 分离条件3 2 3 2 3s i n p s 的制备3 2 3 2 4 毛细管修饰柱的制备3 2 3 3 结果与讨论”3 3 3 3 1 未修饰毛细管中的c e 分离3 3 3 3 2 修饰毛细管中的c e 分离3 4 3 3 3 样品分析3 8 3 4 结论3 9 第四章毛细管电泳与流动注射电化学发光检测联用的初步研究4 1 4 1 引言“4 1 4 2 实验部分4 3 4 2 1 实验装置与试剂4 3 4 2 2 实验方法4 3 4 3 结果与讨论4 3 4 3 1 电泳高电场效应的避免4 4 4 3 2e c l 效率”4 6 4 3 3 流动注射流速的控制4 7 4 4 结论4 7 参考文献4 8 作者部分相关论文题录5 6 致j 射5 7 第一章 效毛细管电泳( h i g h 电场为驱动力，在毛 种新型液相分离分析 技术。电泳作为一种技术出现，已有近百年的历史，1 9 6 7 年瑞典科学家h j e r t e n 1 】 最先提出在直径为3m l l 的毛细管中做自由溶液的区带电泳( c a p i l l a r yz o n e e l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 。虽然他没有完全克服传统电泳的弊端，却是对高效毛细管 电泳最有启发性的工作。1 9 7 9 年m i k k e r s 等人【2 】在内径为2 0 0 岬的聚四氟乙烯管 中进行研究，获得了小于1 0i x m 板高的空前高效率，这是c z e 发展史上的第一个 重大突破。现在所说的毛细管电泳技术是由j o r g e n s o n 和l u k a c s 3 4 】在1 9 8 1 年首先 提出，他们使用了7 5 咖的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离，同 时他们还就分离的机理、高电场和小内径对高效的决定性影响等问题进行了讨论。 正是由于j o r g e n s o n 等人十分成功的实验和异常出色的理论工作，轰动了分离科学 界，激起了人们的巨大反响，成为高效毛细管电泳划时代的里程碑。近年来，分 离科学家又将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，发展出毛细管电色谱，扩大 了电泳的应用范围。目前，它已成为可以与气相色谱( g c ) 以及高效液相色谱 ( h p l c ) 相媲美的一种分离技术，并被认为是当代分析科学最具活力的前沿研究 课题。 1 2 毛细管电泳的发展现状 1 2 1 毛细管电泳的基本理论 1 2 1 1 毛细管电泳的分离原理 毛细管电泳( c e ) 是一类以毛细管作为分离的通道，以高压直流电场为驱动 力，依据被测物在溶液中带电粒子的淌度和分配行为上的差异而实现分离的检测 技术。图1 1 为一普通毛细管电泳系统的示意刚5 1 ，其基本组成包括进样系统、分 离系统、检测系统和数据处理系统。 图1 1 ：毛细管电泳仪示意图 由界面化学可知，固体与液体接触时，固体表面分子离解或和表面吸附溶液 中离子，在固液界面上形成双电层。在水溶液中，多数固体表面带负电荷。按照 近代双电层模型，在双电层溶液一侧由两层组成。第一层为吸附层，称为s t e m 层 或紧密层【6 ，7 】。在s t e r n 层中与固体表面接触的特性吸附离子是部分脱水的，它可以 是异号离子，亦可以是同号离子，其外面主要是由静电力吸附的水化对离子。第 二层为扩散层，由s t e m 面外的剩余对离子构成，其电荷密度随着远离表面而逐渐 与体相溶液的接近。对于熔融二氧化硅石英( 简称熔硅) 毛细管，在碱性和微酸 性( p h 2 5 ) 溶液中，熔硅表面的硅羟基( s i o h ) 电离成s i o 。，使表面带负电荷。 负电荷表面在溶液中积聚相反电荷的对离子，形成双电层。 在s t e m 层和双电层的扩散部分的起点之间的边界层上的势称之为管壁的z e t a 势，典型值约在0 到1 0 0m v 之间，z e t a 势的值随距离增大按指数衰减。毛细管壁 上的z e t a 电势是毛细管电泳中的一个重要参数，对控制电渗流、优化c e 分离条 件有实际指导意义。 在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体朝负极方向移动，这 一现象叫做电渗。电渗是毛细管电泳的一个重要特征，受到毛细管材料、电场强 度、缓冲溶液p h 值、缓冲溶液浓度与成分、添加剂和温度等影响。正负离子在直 流电场作用下于一定介质( 溶剂) 中所发生的定向运动就是电泳。 2 毛细管电泳高效分离、高灵敏度检测方法的研究第一章 由于电渗流的速度比电泳速度快5 7 倍，因此毛细管电泳利用电渗流可将正、 负离子和中性分子一起朝一个方向移动，而正、负离子实际迁移速度矿是电泳速 度和电渗流速度的矢量和。即： v = + 圪。 因此，带正电荷粒子最先流出；中性粒子的电泳速度为“零 ，故其迁移速度 相当于电渗流e o f 速度；带负电荷粒子运动方向与e o f 方向相反，故它将在中性 粒子之后流出。由于样品各组分间迁移速度的不同，经过一定时间，各组分按其 速度大小依次流出毛细管到达检测端进行检测，得到按时间分布的电泳谱图。用 谱峰的迁移时间作定性分析，按其谱峰的高度或峰面积进行定量分析。这就是毛 细管电泳的分离分析原理。 1 2 1 2 分离效率与分离度 根据色谱理论，c e 中的分离效率用理论塔板数( t h en u m b e ro f t h e o r e t i c a lp l a t e s ， ) 表示，对具有高斯型的电泳峰，按下式求出： _ 5 5 4 r 土、1 2 l ，2 ，为迁移时间，扔为半峰宽。 分离度( r e s o l u t i o n ，r s ) ，亦称分辨率，是指将淌度相近的组分分开的能力。通 常，在电泳图上读出两相邻峰的迁移时间和它们的峰宽，按下式计算匙【羽。 r 。= 堑三二 5 + 下标1 和2 分别代表相邻两个物质，形为以时间表示的基线峰宽。因此上式 分子代表两种物质迁移时间之差，分母则表示这一时间间隔组分展宽对分离的影 响。 1 2 2 毛细管电泳的分离模式 按毛细管内分离介质和分离原理的不同，c e 已有六种分离模式，包括： ( 1 ) 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) ： ( 2 ) 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) ； ( 3 ) 毛细管胶束电动色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y , m e k c 是1 9 8 4 年t e r a b e 等人1 9 发展的基于组分疏水性差异而实现分离的一种 c e 分离模式，是把一些离子型表面活性剂( 如十二烷基磺酸钠，简称s d s ) 加到缓 冲液中，形成有一疏水内核的胶束，以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳 技术和色谱技术的巧妙结合。在m e k c 中，中性粒子的分离机理只是它与胶束间 的相互作用，而对于带电离子则同时有电泳迁移、静电作用、两相分配等多种分 离机理。近年来，各种各样的表面活性剂得到了研究如环糊精、聚乙烯吡啶等， 并在许多样品测试中得到了应用【1 0 d 3 1 。m e k c 拓宽了c e 的应用范围，适用于中性 化合物的分离，亦可区别手性化合物，可用于氨基酸、肤类、小分子物质、手性 物质、药物样品及体液样品的分析。m e k c 是以电渗流为驱动力的一种电动色谱， 如分别用环糊精及其衍生物、高聚物离子、微乳胶代替胶柬作为假固定相，则分 别为环糊精电动色谱、离子交换电动色谱和微乳胶电动色谱。m e k c 是目前研究 较多、应用较广泛的一种毛细管电泳模式。 此外，还有在以上六种c e 基本分离模式基础上利用各种技术建立起来的新型 的分离模式：亲和毛细管电泳、毛细管矩阵电泳、芯片毛细管电泳、毛细管阵列 电泳( c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ，c a e ) 、非水毛细管电泳( n a c e ) 等，这些新 型分离模式的显著优越性，必将会得到科学工作者的重视。 1 2 3 毛细管电泳的应用特点 毛细管电泳作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离技 4 毛细管电泳高效分离、高灵敏度检测方法的研究 第一章 术，近年来发展迅猛并得到广泛应用。表将毛细管电泳与传统的h p l c 分离方 法进行了比较。基于毛细管电泳的基本原理和仪器特点，其应用特点可以用“多、 快、好、省”四个字来概括： “多 分离模式多。毛细管电泳商品仪器在1 9 8 8 年首先推出，2 0 年的时 间，在世界范围内就已推出十几种型号的毛细管电泳仪，至此，毛细管电泳仪得 到不断改进和完善。可根据需要选用不同的分离模式且仅需一台仪器。以离子状 态存在的样品，一般选择毛细管区带电泳( c z e ) 分离模式，而非离子状态的样品 则选择m e k c 分离模式。c z e 和m e k c 两种分离模式都难以达到满意结果时，就 有必要考虑在运行电解液中加入一些能与样品产生相互作用的添加剂，如环糊精 或有机溶剂，目的是样品通过与修饰剂的相互作用，改善分离效果，提高c e 分析 速度。 “快 分析速度快。由于毛细管具有良好的散热效能，允许在毛细管两 端加上高至3 0k v 的高电压，分离毛细管的纵向电场强度可达到4 0 0v c m 以上， 因而分离操作可以在很短的时间内完成，几十秒至十几分钟即可完成分离。 “好”分离效能好。如图1 - 2 a 所示，由于液体流动由电场驱动，e o f 的 流型属扁平流型( f l a tf l o w ) ，而h p l c 的流型( 图1 - 2 b ) 则是抛物线状的层流 ( 1 a m i n a r f l o w ) 。扁平流型不会引起样品区带的增宽，这是c e 获得高分离度的重 要原因之一。另外由于毛细管极细的内径，焦耳热得到有效的克服，因此具有很 高的柱效( 1 0 51 0 6n m ) 。c g e 柱效可达1 0 6n m 以上，可以识别相差一个碱基 d n a 片段，因而被广泛的用来进行基因测序盼1 6 1 。 a 一 、 l d 图1 2 ：c e 电渗流( a ) 和h p l c ( b ) 的流型( 上) 及相应的溶质区带( 下) 第章毛细管电泳高效分离、高灵敏度检测方法的研究 “省 分析费用省。一方面，因为毛细管内径很小( 般小于1 0 0m n ) ， 对内径5 0 岬，长度为5 0c m 的毛细管，其容积不足1 灿，进样体积在l l l 级；实 验消耗不过几毫升缓冲溶液，仅为h p l c 的几百分之一；另一方面，多种分离模 式为c e 提供了很大的选择性，可以根据分子的性质( 如大小，电荷数，手性，疏 水性等) 对极广泛的对象进行有效分离，而h p l c 则要用价格昂贵的柱子和溶剂 才能达到相似的目的。 此外，h p c e 还有容易自动化、操作简便、溶剂消耗少和环境污染小等优点。 正因为h p c e 技术具有如此诱人的优点，使它在短短的几十年中，特别是在最近 几年，受到分离分析科学家的极大关注。广泛应用于分离多种化合物，如氨基酸、 糖类、维生素、杀虫剂、有机酸、无机离子、染料、表面活性剂、药物、多肽和 蛋白质、低聚核普酸( r n a ) 和d n a 片段等【1 7 也o 】。毛细管电泳己经成为一种分析 从小分子酸到生物大分子的适应性极强的分离方法。 1 3 毛细管电泳的发展热点 虽然毛细管电泳在2 0 世纪后期取得了许多进展，但相对于高效液相色谱技术 而言，毛细管电泳还不完全成熟，理论的发展和分离的应用尚不完善。毛细管电 泳还存在着不能完全有效控制电渗流、由于光程短而导致浓度检测限高等不足。 因此，获得更高的分离柱效和检测灵敏度，成为当今c e 发展的热门课题。 本文将从毛细管电泳高柱效分离分析和高灵敏度检测两方面着手，分别就各 自技术应用过程中的影响因素、发展现状及存在问题进行相关介绍，并在此基础 上构建“高效快速、高灵敏度 的分析策略，将其应用到实际生物样品的分离分 析中去。 1 3 1 高柱效分离分析 1 3 1 1 影响毛细管电泳分离的主要操作因素【5 , 2 1 - 2 2 1 为了保证分离效率，需要对c e 的操作参数进行优化。毛细管电泳中需要控制 的变量主要有：缓冲溶液及其p h 值和浓度、分离电压、进样方式和时间等等。下 面做一简要介绍。 一、缓冲溶液及其p h 值和浓度 缓冲溶液类型、浓度( 离子强度) 和p h 不仅影响e o f ，亦影响样品溶质的电 泳行为，决定着c z e 分离效率、选择性和分离度的好坏，以及分析时间的长短， 在c z e 分离条件优化中具有重要意义。背景电解质的选择目前还尚无严格规则可 6 毛细管电泳高效分离、高灵敏度检测方法的研究第一章 循，但有如下几个基本要求必须满足。 ( 1 ) 要求有一定的p h 调节范围，并在该p h 范围有足够的缓冲容量。因为z e t a 电势对p h 很敏感，在分离过程中要求保持恒定的p h 值。 ( 2 ) 尽可能选择浓度高而产生电流小的缓冲溶液。因为浓度高可以提高r s ， 电流小可允许使用较高的外加电压。 ( 3 ) 缓冲溶液的表观淌度接近样品溶质的淌度，否则引起区带发散。 缓冲体系的p h 值对e o f 的影响是通过改变表面特性，即改变z e t a 电势来实 现的。以融硅毛细管为例，在高p h 值下，毛细管内表面s i o h 电离并趋于饱和， 负电荷密度大，z e t a 电势高，e o f 达到最大且变化平缓。随着p h 值降低，s i o h 电离受到抑制，负电荷密度减小，e o f 接近零。因此，缓冲溶液p h 成为影响泳出 时间重现性的关键参数。离子的电泳淌度直接正比于它的有效电荷，离子的有效 电荷受操作缓冲溶液p h 的影响，因此，缓冲溶液p h 的调节与控制是优化分离的 重要对策，在蛋白质和多肤分离上更是如此。 缓冲溶液浓度的影响比较复杂。现在已确认，在恒定p h 下，淌度随浓度增加 而减小，但有关数学模型仍存在混乱现象。e o f 速度随浓度增大而减小，不管电 泳迁移如何变化，电渗总比电泳大，所以在恒电压下，任何溶质的泳出时间都随 缓冲溶液浓度增加而加长，分离因子得到改善。但另一方面，缓冲溶液的浓度决 定了毛细管内溶液的电导，这一电导会对电泳分辨和毛细管内产生的热量有影响。 当样品的电导接近或者超过缓冲溶液中电解质的电导时，c e 分辨率会降低。而增 加电解质的电导时，焦耳热增加，电泳区带随之变宽。同时，为避免背景信号， 缓冲溶液纯度要足够高。此外，缓冲溶液在使用前应当过滤和脱气，以免毛细管 堵塞和气泡形成。 二、分离电压 电压是影响毛细管分离的另一重要因素。毛细管长度固定时，电压增加，e o f 增大，从而改善方法的灵敏度并缩短分析时间。但是，外加电压过高时，毛细管 不能有效散失产生的焦耳热，导致温度升高，介质粘度变小，扩散层厚度增大， e o f 偏离线性。在一定范围内柱效随电压的增大而增大，过了极点后，随着电压 的升高，焦耳热的影响加剧，柱效反而下降，而极点的具体位置视系统和组分而 异【2 3 】。 三、进样方式和时间 7 第一章毛细管电泳高效分离、高灵敏度检测方法的研究 进样方式和进样时间是影响c e 的分离效果和重现性的重要因素。流体动力学 进样和电动进样是c e 常用的两种进样方式。 流体力学进样时，依靠毛细管两端压力差将样品导入毛细管，常通过虹吸、 在进样端加压或在检测端抽空等方法来实现，进样量通过调节进样压力和时间进 行控制，但是进样量的选择与分析物的性质( 淌度) 无关。 电动方式是通过电场的作用，依靠样品离子的电迁移和电渗流将样品注入。 电动进样可以对分析物进行富集。但是，电动进样存在两个不足，即电歧视和进 样时高电压产生的电渗流使分析区带随进样量增加而变宽【2 4 j 。为解决电动力进样 的歧视问题，l i n h a r e s 等人【2 5 】综合流体力学进样和电动力进样两种方式的优点，提 出了断口电渗进样。目前市场上已经有解决进样歧视的商品化的仪器出现。 与电动进样相比，流体力学迸样应用更为广泛。对于大体积样品，电动进样 在整个过程中试样连续的被分离，其分辨要比流体动力学进样要好。近年来， 流动注射技术得到广泛应用，使分析结果获得了更高的精度【2 引。为适应低浓度 样品分析的要求，发展了在柱浓缩进样以及预浓缩进样等技术，大大提高了检 测灵敏度。 1 3 1 2 毛细管电泳的柱技术 毛细管电泳的分离过程在毛细管内完成。因此，作为毛细管电泳分离的核心 部件，毛细管的制备始终是人们关心的重点。所谓的毛细管制备，是指用动态吸 着、物理吸附或化学键合的方法对内壁表面进行修饰或改性。给毛细管内壁修饰 上某种材料，可以达到抑制样品吸附、改善分离、改变分离机制、控制电渗流等 目的，所以修饰技术是毛细管制备中的关键技术。 用毛细管作电泳分离时，会遇到两种现象，一是电渗，二是吸附。一般电渗 必须予以适当的控制，而对吸附则要尽可能消除。有效地控制e o f 和消除内壁对 样品溶质的吸附一直是分离条件优化的重要方面，曾做了大量的研究工作。围绕 这个问题，开展了内容丰富的柱化学研究。它涉及柱内壁表面化学以柱壁涂渍或 改性为主，通过表面s i o h 基团衍生( 内壁涂层) 或加改性剂到缓冲溶液中( 动 态去活，d y n a m i cd e a c t i v a t i o n ) 的方法对柱内壁进行改性。动态去活的方法很多， 如采用极端p h 、高离子强度缓冲溶液、添加表面活性剂等。表1 1 列举了毛细管 的不同修饰方法。 8 毛细管电泳高效分离、高灵敏度检测方法的研究第一章 表1 1 ：毛细管电泳柱修饰技术 方法类型试剂种类作用机理备注 p h 法 h + 或o h 改变硅羟基解离度 影响电渗，改变分离 金属离子 改变管内壁电荷量 影响电渗，改善分离 静电电渗大小与方囱控 吸引：胺或有机铵盐等改变电荷量与符号制，抑制碱性样品吸 动态 附 吸着 纤维索，葡萄耱，聚掩盖电荷，增加表面抑制电渗，抑制样品 分子同力 丙烯酰胺等黏度 吸附 表面活性剂，如s d s ，电渗大小及方向控 表露张力改变电荷童与符号 c r a b 等制。改善分离 健合类蕉为 s i o - s i - r ，制备比较 容易，在p h = 4 7 ( 某 桥连过渡 聚丙烯酰胺，五氟芳 些为9 ) 之网稳定， 改变电荷量与符号或 化学基，p 董盼，p e o 等琉水涂层会增加蛋白 改变管壁其他物化性 键合质的吸附水平 质 键合类型为s i - c r ， 直接键合 p h 稳定范围宽 涂层稳定，可耐极端 溶胶凝胶多种硅烷化试剂 p h 适合碱性物质分离， 物理吸附聚乙烯亚胺，环氧树改变电荷符号，掩盖 减小吸附，p h 稳定范 化学交联 鹰电荷 围较宽 掩盖或改变电荷量或稳定性较差，能改善 物理涂布 吸附纤维素及其衍生物 符号分离 9 第一章 毛细管电泳高效分离、高灵敏度检测方法的研究 除上表中所列的毛细管柱修饰方法之外，近年来纳米材料在毛细管电泳方面 的应用也已有成功的例子，例如，早在1 9 8 9 年w m l i n g f o r d 等【2 7 】就用聚合物纳米分 离了5 种胺类化合物。虽然当时的分离效率并不高，但是引起了人们极大的关注。 随后，关于纳米修饰的毛细管电泳的应用越来越多。二氧化硅和聚合物纳米颗粒 在毛细管修饰中已经用到 2 8 - 3 0 。n e i m a n 等【3 1 】合成了一种中性和两种带正电荷的纳 米粒子来分离芳香族胺和其异构体。相比较于未修饰的毛细管，迁移时间增加了， 但是分离度和峰形却随着纳米的修饰有所改进。当用带正电荷的纳米修饰时，电 渗流的方向发生了变化，朝向正极。l u o n g 等【3 2 】用碳纳米修饰的毛细管电泳，在 1 0m i n 内分离了7 种苯胺类衍生物。后来又有报导将烷基修饰的金纳米颗粒用在 开管毛细管电色谱中【3 3 ，3 4 1 。h s i e h 等【3 5 1 通过二氧化肽纳米颗粒( t i 0 2 n p s ) 与石英 毛细管中的硅烷醇基进行浓缩反应制得一种新型的修饰纳米柱。单层保护的纳米 颗粒( m p n s ) 特别重要，因为单层表面能够稳定住它们而相对聚合，它们的性质 受单层分子结构的影响。l i n g 等【3 6 】用钛纳米修饰的开管毛细管电色谱成功分离了 蛋白质，g w e n 等唧用十二烷基保护的金纳米颗粒作为气相色谱的固定相。 1 3 2 高灵敏度检测方法 如前文所述，所有的毛细管电泳形式都不同程度受检测器，检测光程和进样 量的限制，浓度响应灵敏度不是很高，使得该技术在应用于痕量分析时受到一定 限制。如何提高毛细管电泳的检测灵敏度或降低其检测限成为一项具有挑战性的 工作。就毛细管电泳而言，极细的毛细管内径带