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山东师范大学硕士学位论文 乙草胺对泥鳅生理功能影响的研究 摘要 乙草胺( a c e t o c h l o r ) 是酰胺类最具代表性的、我国使用最多的3 种除草剂中 的一种。乙草胺原药在我国的使用量已超过l 1 0 7 k g 。众所周知，农药自身通过 其在环境中的转化产物直接或间接地影响人类的身体健康。采取生物标志物来对 乙草胺这种具毒性、长期的污染物进行合理地评价是一值得探讨的问题。一般来 说，对乙草胺这种低毒、长期的污染，采用化学分析的方法往往很难评价它的潜 在毒性。本实验采用了利用指示生物的测试如急性毒性实验、致死浓度的测定和 生态毒理学领域研究的热点生物标志物，系统地研究了乙草胺污染液对水生 生物泥鳅生理功能的影响，为研究乙草胺的污染情况积累资料。 泥鳅( m i s g u r n u sa n g u i l l i c a d a t u s ) ，属鱼纲，鲤形目，鳅科，是一种抗污能力较 强的淡水鱼，作为实验对象和监测的指标种类都有显示意义。乙草胺对泥鳅的慢 性毒性实验证明，乙草胺污染液对泥鳅具有极强地毒害作用，其毒性与暴露时间 和污染液的浓度呈正相关关系，被毒害致死的泥鳅大致有：大部分鳃部出血；全 部肛门外翻；全部死亡个体均有体壁黄色黏液增多现象：部分体壁变透明，依稀 可见内脏；死亡前1 分钟左右，个体会出现剧烈的绕缸壁侧翻运动，继而死亡。 随浓度的增加，肝组织由正常的黄褐色变为红褐色，并由完整组织变为溃散组织。 肠部变得松软易断裂。个体皮肤出现全身出血点。 对乙草胺污染液中残存的泥鳅进行了遗传毒理学实验，采取断尾取血的方式 制作血涂片，在显微镜下观察其血红细胞的形态，发现其血红细胞的核异常及微 核率明显高于对照组，证实在亚致死状态下，乙草胺中的有毒物质已经对泥鳅的 遗传毒理学指标产生了重大影响。 山东师范人学硕：i ：学位论文 乙草胺污染液对泥鳅的分子生态毒理学指标的影响实验采用了三个时间段 一2 4 d , 时、4 8 小时年1 3 9 6 小时，检测了s o d 、g p t 、g o t 、g s t s 、a c h e 五种酶 活性随污染液浓度的变化趋势，探讨这些指标用于检测水域环境污染的可行性。 对实验结果进行分析可以看出，s o d 、g s t s 、g p t 、g o t 表现出明显的诱导效 应，a c h e 则表现为抑制效应。五种酶中s o d 是水域污染检测的良好生物标志物， 可指示水域污染。 本实验的创新之处在于：首次采用生物标志物系统地研究了乙草胺对水生生 物生理、生化的影响，为环境监测和鱼类健康养殖提供了一定的理论依据。 关键词：乙草胺；泥鳅；遗传毒理学；分子生态毒理；生物标志物；s o d ； g p t ；g o t ；g s t s ；a c h e 中图分类号：x 5 0 3 2 2 5 山东师范大学硕士学位论文 s t u d yo nt h ee f f e c to fa c e t o c h l o ro nf u n c t i o n so f l o a c h ( m i s g u r n u sa n g u i l l i c a d a t u s ) a b s t r a c t a c e t o c l l l o ri so n eo ft h em o s tt h r e e r e p r e s e n t a t i v e ，l a r g e s tk i n d so fh e r b i c i d e s u s e di nc h i n a i t so f i g i n a lm e d i c i n ei nc h i n ah a sb e e nt h eu s eo fm o r et h a n1 107 k g i ti sw e l l k n o w nt h a tt h ep e s t i c i d ed oh a r mt om a n k i n dt h r o u g hi t so w n p e s t i c i d ei nt h ee n v i r o n m e n ti n t ot h ep r o d u c td i r e c t l yo ri n d i r e c t l y i t i sw o r t h e x p l o r i n gi s s u et oe v a l u a t eaa c e t o c h l o rt o x i c i t y ，l o n g t e r mc o n t a m i n a n t sb yu s i n ga r e a s o n a b l eb i o m a r k e r g e n e r a l l ys p e a k i n g ，f o rs u c hl o wt o x i c i t y ，l o n g - t e r mp o l l u t i o n b ya c e t o c h l o r ，i ti so f t e nd i f f i c u l tt od e t e c tt h ep o t e n t i a lt o x i c i t yb yc h e m i c a l a n a l y s i s i nt h er e s e a r c h ，w es t u d ys y s t e m a t i c a l l yo nt h ee f f e c to fw a t e rp o l l u t e db y a c e t o c h l o ro nl o a c hp h y s i o l o g yb yt h eu s eo fi n s t r u c t i o n sb i o l o g i c a lt e s t i n gs u c ha s a c u t e t o x i c i t yt e s t ，t h ed e t e r m i n a t i o no ft h ec o n c e n t r a t i o no fd e a t ha n d b i o m a r k e r t h er e s e a r c hp r o v i d e sm u c hm a t e r i a l so np o l l u t i o nb ya c e t o c h l o r m i s g u r n u sa n g u i l l i c a d a t u s ，as p e c i e so ff r e s h w a t e rf i s h ，h a sf a i r l yc a p a c i t yo f a n t i - p o l l u t i o n h e n c e ，l o a c hw a sc h o s e na se x p e r i m e n ts u b j e c t i ts h o w e dt h a tw a t e r p o l l u t e db ya c e t o c h l o rh a dp o i s o n i n ge f f e c t so ni t ，t h e r ew e r ev e r ys i g n i f i c a n tp o s i t i v e c o r r e l a t i o n sb e t w e e n t o x i c i t ya n dd u r a t i o no fe x p o s u r e ，c o n c e n t r a t i o no fp o l l u t i o n w a t e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc h a r a c t e r so fa n i m a l sp o i s o n e dw e r ea sf o l l o w s ：c a n k e r o fm u s c l e so nb e l l y ，b a c k ，a n dm a n d i b l e ；b l o o ds p o ta p p e a r a n c eo ns k i n ，a n de y e s p o t w e r eh a r m e de t a 1 a f t e rc h r o n i ct o x i c i t yt e s t ，f u r t h e rt e s to fg e n e t i ct o x i c o l o g yo ns u r v i v i n gl o a c h w e r ec a r d e do u t b l o o db l a d e sw o r em a d et oo b s e r v et h ef o r mo fc e l l c o m p a r e dt o c o n t r o lg r o u p s ，t h er a t eo fn u c l e a ra n o m a l ya n dm i c r o n u c l e ia r eg r e a t l yh i g h e r t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt o x i nf r o ma c e t o c h l o rm a d et r e m e n d o u sm p a c t s o ni n d e x e so f g e n e t i ct o x i c o l o g y a c t i v i t i e so fe n z y m s ( s o d ，g p t ，g o t ，g s t s ，a c h e ) u n d e rd i f f e r e n tc o n c e n t r a - t i o no fl i q u o rp o l l u t e db ya c e t o c h l o rw e r ed e t e c t e dr e s p e c t i v e l yi n2 4 h 4 8 ha n d9 6 h o b v i o u si n d u c t i o ne f f e c t sw e r eo b s e r v e do ns o d ，g s t s ，g p ta n dg o t ，w h i l ea c h e l t t 山东师范人学硕十学位论文 s h o w e di n h i b i t o r ye f f e c t s o d ，s o d ，g s t s ，g p tc o u l db ea p p l i e da sr e a s o n a b l e b i o m a r k e r st od e t e c tw a t e rp o l l u t i o n i nt h et h e s i s ，t h ei n n o v a t i o ni nt h i se x p e r i m e n tw a st h a ti tw a st h ef i r s tt i m et h a t b i o m a r k e r sw e r es y s t e m a t i c a l l yu s e dt o s t u d yt h e e f f e c t so fa c e t o c h l o ro n p h y s i o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a lc h a n g e s ，w h i c hp r o v i d e dt h e o r i c a lf o u n d a t i o n f o r e n v i r o n m e n t sm o n i t o r i n ga n df i s hc u l t i v a t i o n k e yw o r d s ：a c e t o c h l o r , l o a c h ，g e n e t i ct o x i c o l o g y ，m o l e c u l a re c o l o g i c a l t o x i c o l o g y , b i o m a r k e r , s o d ，g p t ，g o t ，g s t s ，a c h e i v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注： 如没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者躲犹纠川聊擗厮移 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂控有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文 在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名莉川叫 签字日期：2 0 0 8 么月么日 銎 日狗形 话嘭 矿 字 吣 簦 加 d， 副 期科 山东师范大学顾十学位论文 综述 一- i - j l 1 刖吾 世界上的农业生产，由于病、虫、草害，每年使农作物的损失占总产量的1 3 左右，使用农药可以换回其中的3 0 以上。目前世界上生产使用的农药已达1 3 0 0 多种，其中大量使用的约2 5 0 多种，每年化学农药的产量约2 2 0 万吨【1 1 。随着社会 的发展，农业现代化和集约化生产的要求，对农药的需求仍在不断增加。我国自 1 9 5 8 年以来，总计生产了近6 0 个品种的除草剂，除草剂的年产量从1 9 8 6 年的0 7 7 万吨增加到1 9 9 9 年的6 9 万吨，占农药总产量的1 7 5 ，增加了9 倍岁羽。随着除草 剂的发展和农村劳动力的社会转移，除草剂的使用量还将逐渐增加。然而，大量 施用农药带来的水体污染等环境问题不容忽视，已成为环境安全性评价的重要内 容。 氨基酸类除草剂、磺酰脲类除草剂、酰胺类除草剂在除草剂系列中位列前三。 其中酰胺类除草剂因其药效低且持久，使用量而呈上升趋势，2 0 0 3 年的销售额为 1 2 o o 亿美元，占整个农药市场的4 5 ，占除草剂市场的9 0 t 3 1 。据报道，乙草 胺( a c e t o c h l o r ) 是酰胺类最具代表性的、我国使用最多的3 种除草剂中的一种 4 1 。 乙草胺原药在我国的使用量已超过1 1 0 7 k g t 5 1 。自从1 9 9 4 年，美国环保局e p a 批 准乙草胺有条件注册以来，乙草胺在美国的使用量也迅速增加，1 9 9 5 年，仅明尼 苏达州的乙草胺使用量就达1 6 1 1 0 6 k g ，2 7 的玉米地使用了乙草胺防除杂草。 根据1 0 个种植玉米州的调查结果显示，乙草胺的使用面积从1 9 9 4 年的7 上升到 1 9 9 5 年的2 0 【6 】。e p a 已将乙草胺列为b 2 类致癌物。酰胺类除草剂具有中等到较 高的水溶性，相对较低的土壤吸附常数，因而施用到农田的酰胺类除草剂，容易 通过渗透转移到浅层地下水或随雨水径流进入地表水。据报道，美国的浅层地下 山东师范大学硕士学位论文 水和塞纳河水中乙草胺的检出量为o 0 5 0 1 7 u g l 1 7 1 。随乙草胺在水中积蓄到一定 量后，将对水生生物产生影响，甚至通过间接地作用影响人类的健康。对这种低 毒、长期的污染，采用化学分析的方法往往很难评价它的潜在毒性，传统的利用 指示生物的测试如急性毒性实验、致死浓度的测定也很难有理想的结果。而这种 污染又是切切实实的存在的。因此，需要寻求更灵敏的毒理学评价指标对这种低 毒、长期的污染物进行合理的评价，就涉及到目前毒理学领域研究的热点生 物标志物。 2 生物标志物在监测环境污染中的应用 现有的化学分析方法虽然能对环境或生物体内污染物含量进行定量描述，但 仅凭含量无法反映污染物对生物的效应，要了解这些生物效应，就要从分子水平 研究在不同污染物作用下生物体内各种指标的变化【8 】。因而，发展快速、灵敏的 生物分析方法，并利用生物标志物( b i o m a r k e r ) 作为环境样品毒性评价方法的研 究受到国际上同益广泛的重视，也是当前的研究热点【9 1 0 】。生物标志物是研究污 染物与不同层次生物组织的反应，并用所产生的影响来反映污染物的作用。生物 标志联系污染物与生物效应之间的纽带，既可以揭示环境样品和生物体内污染物 的浓度，还可反映污染物的毒性，可以提供污染物的暴露与效应最灵敏的检测。 另外它可以用于环境污染的探查和快速筛选，还可用于环境健康的风险性评价， 作为污染物长期毒性效应的早期预报系统【l l 】。 2 1 生物标志物的定义 生物标志物是：通过测量体液、组织或整个生物体，能够表征对一种或多种 化学污染物的暴露或其效应的生化、细胞、生理、行为或能量上的变化。简单地 讲，生物标志物就是可衡量环境污染物的暴露以及效应的生物反应【1 2 1 。一个理想 2 山东师范大学硕士学位论文 生物标志物应具备化学特异性，能够微量鉴定、试验费用低廉、检验快速，与环 境样品中污染物有量的相关性等【13 1 。 2 2 生物标志物的分类 从功能上看，生物标志物一般可分为接触标志物、效应标志物和敏感标志物 3 ：k 类。接触标志物指示生物对污染物的暴露，即污染物引发生物体的反应，如 指示对重金属暴露的键联金属的蛋白质( 金属硫蛋白，m e t a l l o t h i o n e i n s ，m t s ) ， 此类标志物不能指示污染物的毒性效应，但有助于研究生物对化学分析方法很难 检测到的环境中的不稳定化合物的暴露。效应标志物指示污染物对生物体健康状、 况的损害效应，如指示d n a 损伤的d n a j ，h 合物( d n a a d d u c t s ) ，它可能是生物 机体中某一内源性成分或测定机体功能容量，产生疾病或障碍的改变等。在环境 毒理学研究中，这类生物标志物具有更重要作用，它可解释污染物毒性效应的分 子反应机理，从而能够确定环境样品中各污染物对生物体作用的相互影响1 2 1 。敏 感性标志物指示生物个体对污染物的敏感性。在污染物与生物体相互作用过程 中，机体因素是很重要的，性质与剂量相同的污染物对不同的个体可能出现迥然 不同的反应，这取决于受作用个体的敏感性【1 4 1 。 一般地各个层次的生物组织，小到微观分子，大到生态系统，在污染物的作 用下，都有各自相对应的污染效应以及相应的生物标志物，如水藻的种类、数量、 结构等可以指示水体污染程度。但生物标志物的研究多集中于分子或细胞水平， 种群、群落和生态系统层次上的生物标志物正处于研究的初始阶段【1 5 】。 2 3 生物标志物的特点 2 3 1 特异性：分子水平的生物标志物能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反 应终点，特异性强，反应灵敏。如有机磷农药对乙酰胆碱酯酶活性有特异性抑制 山东师范人学硕上学位论文 作用1 6 1 。 2 3 2 预警性：污染物与生物体之间所有的相互作用都始于分子水平，生物标志 物的产生是对污染物暴露的早期反应，因此这类标志物成了污染物暴露和毒性效 应早期警报的指示物。 2 3 3 广泛性：从微观分子到宏观生态系统，生物标志物在各个不同层次的生物 组织上体现着污染物和生物效应之间的因果关系。一般来说，生物体之间的共性 在分子水平上最大，所以许多分子生物标志物，如d n a 加合物，可广泛应用于 各类生物。 2 4 可用于监测环境污染的生物标志物 2 4 1 组织结构和亚显微结构 组织和亚显微结构的变化作为环境相关的化合物的生物标志物，能有效评 价化合物毒性。 2 4 1 1 红细胞 红细胞微核及核异常测定是一种简便、迅速、灵敏的遗传毒理学测定方法。 h o o f t m a n 最早将微核测定法应用于鱼类，证明化学诱变剂加基磺酸乙酯( e m s ) 能诱发泥荫鱼( u m b r a p y g m a c a ) 外周血红细胞微核的形成【17 1 。近年来，水生 生物的微核实验得到了广泛深入得研究，国内外得学者以泥鳅、黄鳝、蝌蚪、黑 斑蛙等为实验材料，监测具有诱变活性得污水、氟化物、农药、除草剂等1 8 】【1 9 2 0 1 对水生生物遗传物质的损害及毒理效应。为环境污染的监测提供了一种行之有效 的生物学方法。 2 4 1 2 肝胰腺细胞、粘液细胞 主要用于监测陆生腹足类的生存环境。当陆生腹足类暴露于杀软体动物剂颌 4 山东师范人学硕士学位论文 重金属( c d 、h g 、z n ) 之后，肝胰腺中重吸收细胞和嗜碱性细胞表现出最明显 的剂量一反应关系，被认为是环境污染的监测细胞【2 l 】，而在蜗牛的皮肤和肠中， 粘液细胞则对杀软体动物剂有较灵敏的反应2 2 1 。 2 4 1 3 线粒体、内质网和溶酶体 在亚细胞水平上，亚显微结构的研究显示，细胞器对污染物有不同的易感性 并做出不同的反应。线粒体对多种刺激都较敏感，并能迅速做出反应，如肿胀、 收缩，嵴膜解体或形成线粒体内结晶【2 3 】；内质网在中毒之后也能迅速做出反应， 包括肿胀、脱粒、囊泡化等；溶酶体在细胞中起着分解细胞器和高分子物质的作 用，稳定的溶酶体中，完整的溶酶体膜可以防止水解酶与底物发生反应。当受到 刺激时，膜的渗透性增高，稳定性降低。对于很多生物来说，溶酶体的生理变化 对于鉴别外来物的负效应十分有效。例如采用中性红分析法将蚯蚓暴露于无机或 有机污染物后，溶酶体膜渗透性增大，溶酶体吸收的中性红会逐渐渗出溶酶体膜 进入体液中；而健康的溶酶体则具有较长的中性红保留时间【2 4 】。 2 4 2 蛋白质 蛋白质是生物体的重要构成成分，当暴露于污染环境之中，蛋白质的结构、 性能必然发生相应的变化。目前研究最多的蛋白质生物标志物是应激蛋白、金属 硫蛋白和各种酶类。 2 4 2 1 应激蛋白 应激蛋白作为生物标志物的研究多集中在脊椎动物，对于无脊椎动物只是在 过去几年才得到重视，并且是集中在对水生环境的研究上。应激蛋白包括一系列 具有不同分子质量的蛋白质家族，长期以来被称为“热休克蛋白”( h s p ) ，暴 露于多种化合物之后，都能发现应激蛋白的诱导。此类蛋白还对温度升高、损伤、 山东师范人学硕一i 二学位论文 病毒感染及组织损害有反应。它作为生物标志物的主要优势在于它们能将所有的 负效应综合并体现在蛋白的完整性上，即“蛋白毒性”【2 5 1 。另一方面，应激蛋白 水平的普遍提高能指示应激物的存在，并不能提供应激物化学性质方面的信息。 尽管如此，应激蛋白家族成员中的许多种以应激物特异性的方式被调控，至少使 区分应激物的类型成为可能2 6 1 。 2 4 2 2 金属硫蛋白 金属硫蛋白( m t ) 是一种低分子量的蛋白质，富含半胱氨酸，与特定金属 离子如锌、铜及镉等有高度亲和力。研究表明，脊椎动物的m t 合成可被金属、 有机化合物或其它应激因素诱导。例如对鱼类来说，正常情况下，体内m t 含量 很低，当受到重金属污染时，体内解毒系统就会诱导合成这类蛋白质，进入鱼体 内的重金属就会结合到这些新合成的m t 上。由于m t 的结构和功能存在着种间 特异性，目前使用较多的是已经进行了充分研究的蜗牛物种的m t 作为生物标志 物来评价镉的污染。 2 4 3 酶 一 酶活性的改变是反应生物体生理变化的一项灵敏指标。暴露于污染的环境 中，生物体在致死甚至半致死效应之前，生理生化反应就已经发生了明显的变化， 有些酶的活性被抑制，有些则被诱导。 2 4 3 1 乙酰胆碱酯酶 目前研究最广泛和成熟的是有机磷农药对乙酰胆碱酯酶有特异性抑制作用， 乙酰胆碱酯酶在传导过程中主要分解神经递质乙酰胆碱，一旦乙酰胆碱酯酶受到 抑制，神经节突触部位会积累大量乙酰胆碱，突触后膜的一些胆碱受体不断被激 活，神经纤维长时间处于兴奋状态，而突触部位f 常的神经冲动受阻，中毒的动 6 山东师范大学硕十学位论文 物出现兴奋、痉挛，最后瘫痪、死亡。乙酰胆碱酯酶受抑制的动态变化，可以用 来监测有机磷农药污染的情况。 2 4 3 2 超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶 生物体在长期的进化过程中，形成了一套抗氧化防御系统，用以保证体内正 常的生理生化和代谢反应的进行。目前，研究最广泛的抗氧化酶是超氧化物歧化 酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 和谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 。其q bs o d 被认为 是发挥关键性作用的抗氧化物，同时又是高度诱导酶【2 7 】。污染物进入生物体内进 行生物转化，可形成多种中间产物，其中许多中间产物可进入氧化还原循环，产 生大量的活性氧物质；同时，脂质过氧化可产生丙二醛，进而引发机体的氧化应 激。s o d 可有效清除生物体内的超氧阴离子自由基( 0 2 一) ，保护细胞免受损伤； 这一过程产生的大量过氧化氢，可i 扫c a t 和g s h p x 清除：c a t 可促使过氧化 氢分解为氧气和水；g s h p x 可以促进过氧化氢和还原型谷胱甘肽( g s h ) 反应 生成水及氧化型谷胱甘肽( g s s g ) ，阻断了产生活性极高的羟自由基的可能， 使机体免受氧化伤害。所以当受到污染胁迫时，抗氧化防御系统的酶活性或含量 会发生改变，其改变可间接反应环境中污染物的变化，进而可作为环境污染胁迫 的分子生态毒理学指标，对环境污染的监测起到早期预警的作用。 2 4 3 3 谷胱甘肽硫转移酶 谷胱甘肽硫转移酶( g s t s ) 是生物体内重要的解毒酶，g s t s 可催化g s h 的毓基与一些亲电子化学物结合，保护d n a 及一些蛋白质免受损伤；同时g s t s 还可以与一些难溶于水的物质如血红素、胆酸、染料、激素和气体一些疏水性强 或内源的代谢产物结合，使之极性增强，易溶于水，成为水溶性化合物排出体外 2 8 1 。和生物体内的抗氧化酶相似，g s t s 的活性可因为化学污染物、脂质代谢和 7 山东师范人学硕卜学位论文 某些病理情况下被诱导而发生变化，其变化可以作为监测环境污染的一项灵敏指 标。 2 4 3 4 谷草转氨酶和谷丙转氨酶 谷草转氨酶( g o t ) 和谷丙转氨酶( g p t ) 是广泛存在于动物线粒体中的重要 的氨基酸转氨酶，在机体蛋白质代谢中起重要作用指标。其活性变化亦是反映肝 细胞受损伤的主要敏感指标。 2 5 生物标志物的优势及存在的不足 生物标志物是从分子水平研究在污染物作用下生物体内各种指标的变化，作 为联系污染物与生物效应之间的纽带，它既可以揭示环境样品和生物体内污染物 的浓度，还可以反应污染物的毒性，成为污染物的暴露与效应最灵敏的监测指标， 对于环境污染的探查和快速筛选、环境健康的风险评价及污染物长期毒性效应的 早期预报具有重要意义f l l 】。尽管生物标志物监测环境污染具有化学分析方法所不 可比拟的优点，但其本身也有缺陷和不足。首先，生物标志物具有种间差异性， 例如脊椎动物肝脏细胞色素p 4 5 0 与污染物之间的剂量效应关系良好，而对无脊 椎动物，研究结果就不慎理想，因此，作为污染监测和毒性评价的手段，一定要 选择合适的生物标志物，并进行多指标生物毒性检测，才能对环境样品毒性进行 合理评价；其次，目前使用的生物标志物多为个体效应生物标志物，这些生物标 志物与更高层次上( 种群、群落、甚至生态系统) 的生物健康状况尚缺乏直接的 联系。因此，探求个体生理生化上的受损与种群数量或整个生态系统的健康状况 之间的联系，或者选择可代表区域环境物种健康状况的非个体水平的生物标志物 用于生态风险评价，也是需要加强的领域【2 9 1 。 山东师范大学硕上学位论文 正文 1 乙草胺对泥鳅的毒性效应 泥鳅( m i s g u m u sa n g u i l l i c a d a t u s ) 属鱼纲，鲤形目，鳅科，广泛分布于同本、 朝鲜、东南亚和我国，生活在江河、湖泊、池塘等水域，是深受人们喜爱的优 质鱼类，并且还是我国淡水鱼类出口创汇的品种之一。泥鳅是一种抗污能力较 强的淡水鱼，作为实验对象和监测环境指标种类具有显示意义。乙草胺作为环 境中的一种致癌物已经是不争的事实。但是有关乙草胺对水生生物的毒害作用 仅限于对其遗传毒理学红细胞的形态研究，乙草胺对水生生物的生物标志 物系统的影响还无学者开展研究。本研究采用乙草胺药物对泥鳅进行毒性试验， 以期为安全合理地使用这类药物，保护环境资源，维护生态平衡，保障人体健 康，预防疾病的发生提供参考。 1 1 实验材料和方法 1 1 1 实验材料 实验所用泥鳅购自滨州市六街水产市场，每条体重5 6 1 0 。8 9 ，平均重量 7 8 9 。鱼缸3 0 个，规格为5 0c r u x 2 5c r u x 2 5e n l ，充气泵1 5 个，中型塑料水桶6 个。乙草胺为江苏昆山化工厂生产。 1 1 2 实验鱼养殖 实验用水为阳光曝气7 d 的自来水，水温为2 2 - t - l o c 、p h 7 4 左右。在消毒好 的水桶中暂养泥鳅若干尾，以供整个试验所需。鱼缸中水量为5 0c m x 2 5c r u x 2 0 锄。每个鱼缸中投放3 0 尾鱼暂养，每天上午1 0 ：0 0 换一次水。发现死亡的要 及时捞出。 1 1 3 方法 9 山东师范大学硕：j 二学位论文 1 1 3 1 样本的挑选 泥鳅暂养一周后，在每个鱼缸中挑选健康活泼，体表无损、个头均等的个 体1 0 尾继续试验，其余的去除。 1 1 3 2 半数致死浓度和安全浓度的测定 通过预试验，设计3 4 u l l 、3 6 u l l 、3 8 u l l 、4 u l l 、4 2 u l l 、4 6 u l l 、 4 8 u l l 、5 0 u l l 的药液共8 个浓度组，每个浓度设3 个平行试验。每个鱼缸 中按设计浓度加入药液，外设一个鱼缸用曝气自来水做对照。分别记录2 4 h 、 4 8 h 各浓度的泥鳅死亡数目。根据加权概率法计算半数致死浓度t l m ，并根掘 以下公式计算安全浓度。 安全浓度2 西云z z i m 4 而8 x0 3 1 2 实验结果 1 2 1 泥鳅在乙草胺中的染毒试验反应 泥鳅在放入染毒液后呈现不安游动和上窜的现象，几分钟后趋于平静。浓 度越高，不安现象越长。5 h 后泥鳅个体丌始出现上颌溃烂、有的出现大量出血 点、肛f - j p b 翻、体壁变薄等体表变化。死前l m i n 左右围绕缸壁做剧烈运动，继 而死亡。死后体表出现粘液，但全身未见充血现象( 见图1 ) 。染毒2 4 h 泥鳅死亡 数见表1 。 l o 黛翳灞纛 出血点腮部充血 山东师范人学硕十学位论文 体壁变薄 止常泥鳅内脏 毒性泥鳅内脏 肛门外翻 正常泥鳅肝胰脏 毒性泥鳅肝胰脏 图1 泥鳅染毒体壁变化图 表1 染毒试验泥鳅死亡数据表 4 8 h 死亡0 1 数 678 采用加权概率单位法，计算2 4 h 急性中毒试验的半数致死量为4 7u l l ； 9 5 置信区间为( 4 5u l l ，4 9u l l ) 。4 8 h 中毒试验的半数致死量为4 4u l l ； 羞 一 雕壁 一 山东师范大学硕j j 学位论文 9 5 置信区间为( 4 1u l l ，4 6u l l ) 。 1 2 2 安全浓度 安全浓度2 石云r z ：m 4 万gx 云0 ：3f 2 ( 4 4 。3 ) ( 4 7 4 4 ) 2 = 1 4 l ( u l 几) 2 乙草胺污染液对泥鳅红细胞核异常的诱导 2 1 仪器设备及试剂 2 1 1 仪器设备 鱼缸、充气泵、解剖盘、解剖器、生物显微镜 2 1 2 试剂 姬姆萨染液购自南京建成生物工程研究所，其试剂组成与配制： 试剂一：姬姆萨贮备液5 m l 一瓶。 试剂二：姬姆萨稀释液5 0 m l 一瓶。 配制：临用时将试剂一倒入试剂二中混匀即可染色。 2 2 试验方法 以2 4 h 内泥鳅不出现死亡和明显异常( 如形态、行为异常等) 为标准，确 定最高染毒浓度为4 0 u l l 。以4 0 u l l 为标准，依次以1 2 浓度梯度递减，确 定5 个试验组。由此，将乙草胺用曝晒好的自来水配制成2 o u l l 、1 o u l l 、 0 5 u l l 、0 2 5 u l l 、0 1 2 5 u l l 5 个浓度组( 5 、4 、3 、2 、l 组) ，分别为农田最 高使用浓度的1 1 0 0 0 、1 2 0 0 0 、1 4 0 0 0 、1 8 0 0 0 、1 1 6 0 0 0 。另设一不加乙草胺 的对照组( 0 组) 。对照组和每一试验组均投放2 0 尾泥鳅，每2 4 h 更换一次处理 液。5 个鱼缸中按设计浓度加入药液，毒性实验时分别在2 4 h 、4 8 h 、9 6 h 时从 各浓度的处理液中随机去两条泥鳅断尾取血，制作血涂片，每组制作两张。涂 片先用无水乙醇固定2 3 分钟，再浸入新鲜配制的染色液中染色3 0 分钟，用 山东师范人学硕士学位论文 水冲洗后在空气中晾干。对照组按同样步骤制作血涂片两张。将血涂片置于油 镜下观察血红细胞形态有无畸变，记录异常数。红细胞异常的判断按照娄允东 等【3 0 1 人的标准，包括微核、核空泡、核凸出、核内凹、双核等。每张片子观察 3 0 0 0 个左右。统计微核及核异常细胞率，结果以千分率( ) 表示。选取红细 胞微核和核异常的经显微摄影拍照。微核及核异常鉴别见薛开先等【3 。采用二 项分布的单样本检验对统计结果进行分析。 微核细胞率= 带有微核的细胞数观察的细胞总数1 0 0 o 核异常细胞率= 具有核异常( 除微核外) 的细胞总数观察的细胞总数1 0 0 总核异常细胞率= 微核细胞率+ 核异常细胞率 2 3 试验结果 泥鳅正常的红细胞一般为圆形或椭圆形，大小相似，分布均匀，具有细胞 核。与对照组相比，残存泥鳅的红细胞多出现粘连现象，细胞核有双核、外凸、 内凹等现象( 见图2 ) 。 核外凸 山东师范人学硕二i ：学位论文 试验结果见表2 。 空泡双核 图2 红细胞异常结果图( 1 0 x 4 0 ) 表2 乙草胺诱发泥鳅红细胞的总核异常细胞率 从表2 可以看出，经乙草胺处理后，泥鳅总核异常细胞率均比对照组( 1 0 4 ) 有一定程度的提高。试验组总核异常细胞率最大值为( 9 7 2 ) ，为对照组 的9 3 5 倍。 试验组中各个浓度均有一定的总和异常细胞率出现高峰值的时间，并在高 峰以后都有下降趋势。这与刘爱华等1 9 1 的报道一致。 表3 不同浓度乙草胺诱发泥鳅红细胞总核异常细胞率的方差分析 1 4 山东师范大学硕士学位论文 方差分析表明，乙草胺诱发泥鳅红细胞总核异常细胞率不仅与浓度和时间 有关，而且与两者的交互作用有关，说明不同浓度下乙草胺诱发泥鳅红细胞总 核异常细胞率是不同的。在控制时间因素条件下，进行两两比较，结果表明： 在处理因素2 4 h 条件下，除处理浓度0 1 2 5u l l 与0 2 5u l l 、o 1 2 5u l l 与2 0 u l 几、0 2 5u l l 与1 0u l 几差异不显著外，均差异显著；在处理因素4 8 h 条件 下，除处理浓度0 2 5u l l 与1 0u l l 差异不显著外，均差异显著；在处理因素 9 6 h 条件下，除处理浓度0 1 2 5u l 几与o 2 5u l l 、o 1 2 5 刖l 与2 ou l l 差异 不显著外，均差异显著。 从以上方差分析结果可以看出，在时间相同条件下，泥鳅红细胞总核异常 细胞率在一定浓度下达到最高，以后随处理浓度升高，红细胞总核异常细胞率 变化不明显。这可能与微核率高低不仅取决于诱变剂的活性浓度，而且与细胞 有丝分裂的速率有关。较高浓度组的毒力较大从而抑制了红细胞的有丝分裂【3 2 】， 因此其总核异常细胞率较之对照组差异并不显著。 2 4 讨论 对环境污染的监测，仅用化学分析方法难以评估化合物的潜在毒性，而利 用指示生物的测试也主要集中于对污染物的急性毒性、生物可利用性、生物积 累和保持性的分析等，这些数据对预测污染物的致死浓度是不可缺少的。但是， 自然环境中的污染物常常是低毒长期存在的，因此，急性效应发生的频率远远 不及亚致死效应。如何利用和发展亚致死效应的生物标志物来更准确的评估和 预测污染物对生物的危害是目前毒理学领域研究的热点。其中水生生物的微核 山东师范人学硕i ：学位论文 实验已经得到了广泛深入地研究。微核主要是由染色体断裂产生的无着丝粒断 片形成，或是由于纺锤丝断裂造成的一条或一组染色体滞后形成。有学者认为 微核可直接由问期形成【3 3 】；另有一些学者认为微核可能是由于核质向外突出并 延伸而形成的1 3 4 1 ，当主核向外突出时，便可形成核质外凸，影响严重时便产生 核碎裂。 现已证明，铅、镉、铬、铜和各种化学物质被鱼体组织吸收，一部分随血 液循环到达各组织器官，引起组织细胞的机能变化；重金属离子还能与带负电 的核酸结合，引起核酸裂解，使正在进行细胞分裂的细胞染色体被阻断而产生 微核和各种形式的核异常【3 5 】【3 6 】 3 7 1 3 8 】。本实验残存的泥鳅红细胞的核异常率明 显高于对照组，证实在亚致死的情况下，乙草胺中的有毒物质已经对生物体造 成了危害。鱼类的微核实验方法简便，易于操作，且灵敏度高，可以用来监测 水体污染。 3 乙草胺对泥鳅转氨酶的影响 3 1 乙草胺对泥鳅谷丙转氨酶( g p t ) 活性的影响 3 1 1 仪器设备及试剂： 3 1 1 1 实验设备 t g l 1 6 高速台式离心机 f a l 0 0 4 n 电子天平 x w - 一8 0 a 旋涡混合器 t u 19 0 1 双光束紫外可见分光光度计 h h s 数显恒温水浴锅 x b 7 0 制冰机 1 6 山东师范大学硕士学位论文 d z g 3 0 3 a 超纯水器 b c d 2 7 2 w b c s 海尔冰箱 移液枪5 2 0 u l ，1 0 2 0 0 u l ，1 0 0 1 0 0 0 u l 手工匀浆器 l m o 立式全自动高压灭菌锅 3 1 1 2 试剂 本实验所用药品试剂为南京建成生物工程研究所所提供的谷丙转氨酶活力 测试试剂盒，试剂配制按试剂盒说明书中配制方法配制，见附录2 。 3 1 2 实验材料与方法 3 1 2 1 实验材料 将乙草胺用曝晒好的自来水配制成2 0 u l l 、1 0 u l l 、0 5 u l l 、0 2 5 u l l 、 o 1 2 5 u l l 5 个浓度组，另设一不加乙草胺的对照组。 实验所用泥鳅购自滨州市六街水产市场，于曝气七天的清水中饲养备用。 3 1 2 2 实验方法： 3 1 2 2 1 实验样品的处理 把暂养一周的泥鳅，挑选大小均匀的投入到各浓度组的处理液和对照组中， 每组投放2 0 条。 、 3 1 2 2 2 酶匀浆的制备 于2 4 h 、4 8 h 、9 6 h 从每处理组中任意取3 、4 条泥鳅，取其肝胰脏，在冰冷 的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称取0 1 5 9 。用移液器从盛有0 8 6 的1 3 5 9 冷生理盐水的小烧杯中取总量的2 3 作为匀浆介质倒入匀浆器中。用眼 科小剪尽快剪碎肝胰脏，此操作在冰水浴中进行。将剪碎的组织倒入手工匀浆 山东师范人学硕十学位论文 器中，再将剩余的1 3 冷生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀 浆器中进行匀浆，左手持匀浆器将下端插入盛有冰水的器皿中，右手将捣杆垂 直插入套管中，上下转动研磨6 - - - 8 m i n ，充分研碎，使肝胰脏组织匀浆化。即 得到l o 膨h 织匀浆。匀浆好的样品倒入1 5 m l 的e p p e n d o r f 管中在4 。c 冰箱中 暂存，待全部样品匀浆完毕后置于高速冷冻离心机中，3 5 0 0 转分离心l o m i n ， 取上清液，然后取匀浆上清液再用生理盐水按1 ：9 稀释成1 的组织匀浆，待 测。 3 1 3 酶活力的测定 酶活力的测定操作步骤按表4 进行。 表4 谷丙转氨酶活力测定表 混匀，室温放置5 m i n ，5 0 5 n m 波长，蒸馏水调零，测各管的吸光度，测定 管吸光度减去对照管吸光度之差值，查标准曲线，求得相应的组织匀浆活力。 山东师范大学硕士学位论文 根据公式：组织中g p t 活力= 查表得匀浆活力组织匀浆蛋白含量( m g p r o t m 1 ) 3 1 4 组织匀浆蛋白含量的测定 组织匀浆蛋白的含量采用考马斯亮兰染色法进行( 见附录1 ) 。蛋白测定试 剂盒购自南京建成生物工程研究所。 3 1 4 1 样品前处理 样品取自酶的匀浆制备中的1 的组织匀浆。 3 1 4 2 组织匀浆蛋白含量的测定操作步骤按表5 进行。 表5 组织匀浆蛋白含量的测定表 混匀，静置1 0 m i n ，于5 9 5 n m 处，l c m 光径，蒸馏水调零，测各管o d 值。 3 1 4 3 计算公式 蛋白质含量( g l ) = 蒹器臻嚣器标准管浓度( 蛐 3 1 4 4 蛋白质含量表 计算结果见表6 。 表6 肝脏组织蛋白质含量 1 9 山东师范人学硕士学位论文 1 组0 9 2 3 7 0 1 0 6 0 2 8 5 0 14 - 0 1 3 9 33 1 5 8 2 4 - 0 3 1 3 8 2 组 3 组