（分析化学专业论文）食品中某些有害物质的gcms和高效毛细管电泳检测新方法.pdf

摘要 i 摘要 随着色谱技术的不断发展，色谱在食品分析中的应用越来越广泛。本文首先对色谱 在食品分析中的应用进行了介绍， 主要包括gc/ms和高效毛细管电色谱在食品安全分析 中的应用。 第二章建立了高效毛细管电泳(hpce)浊度法检测牛奶和奶粉中三聚氰胺的方法。 样 品中加入三氯乙酸水溶液，加热样品至沸腾后自然冷却，使蛋白质充分凝聚、沉降，并 提取三聚氰胺。添加回收率在83% - 98%之间，相对标准偏差为1.8% - 3.4%(n=5)。定量 限为1 mg/kg。样品的前处理步骤简单、过程易于控制，浊度法特异性强、重现性好， 灵敏度与高效液相色谱法相近。方法经济环保，可用于大量牛奶和奶粉样品中三聚氰胺 的快速检测。 第三章建立了气相色谱-串联质谱法(gc-ms/ms)测定果蔬中苯醚甲环唑残留量分 析方法。试样中残留的苯醚甲环唑用乙腈提取，提取液经固相萃取柱净化后，以 gc-ms/ms在多反应监测模式测定。方法回收率在78.82% - 94.64%之间，测定低限为:10 g/kg， 苯醚甲环唑在0.01 mg/l- 2.5 mg/l(10 g/kg - 250 g/kg)范围内符合线性关系， 相 关系数大于0.99。 第四章采用气相色谱-串联质谱法(gc-ms/ms)同时测定蜂蜜中的杀虫脒和双甲脒 的含量。用丙酮和正己烷的混合液提取样品中的杀虫脒和双甲脒，净化后检测，在0.010 mg/l - 0.2 mg/l(10g/kg - 200 g/kg)范围内，杀虫脒、双甲脒及其代谢物2，4-二甲基苯 胺均符合线性关系，线性相关系数r0.99，平均回收率在76.83%-91.35%之间。 关键词气相色谱-串联质谱高效毛细管电泳三聚氰胺苯醚甲环唑杀虫脒双 甲脒2，4-二甲基苯胺 abstract ii abstract in recent years the chromatography develops rapidly, and it has been used widely. in the paper, the application of chromatography in food safety analysis has been reviewed, including application of gc/ms and hpce in food analysis. in chapter 2, a novel method of high performance capillary electrophoresis (hpce) has been established for the separation of melamine in milk and milk powder. trichloroacetic acid solution was used to precipitate proteins and to dissociate the melamine from the sample matrix. in order to dissociate the proteins clean and simply, the sample was heated to boil, then cooled naturally. the average recoveries ranged from 83.2% to 97.5% in the spiked range of the determination of melamine in milk and milk powder. the limit of quantification (loqs) of milk and milk powder was 1.0 mg/kg, and the relative standard deviations were between 2.1% and 3.9% (n = 5). the sensitivity of the method is similar to the high-performance liquid chromatography, and the sample pre-treatment is more simple, specific, reproducible, economic, environment. so it can be used for a large number of samples of milk and milk powders melamine rapid detection. in chapter 3, a new method of the determination of difenoconazole in vegetable by gc-ms/ms was developed. the difenoconazole in sample was extracted with acetonitrile. the extract was purified and concentrated with solid phase extraction column, then detected by gc-ms/ms in the multiple reaction monitoring mode. the average recoveries ranged from78.82% to 94.64%,the limit of quantification (loqs) was 10 g/kg, the calibration curve was linear between 0.01 mg/l and 0.25 mg/l(10 g/kg - 250 g/kg), and the correlation coefficient was more than 0.99. in chapter 4, a novel method of simultaneous differmination ofamitrazand chlordimeform in honey by gc-ms/ms was investigated. the amitraz and chlordimeform in sample were extracted with mixture of acetone and n-hexane, the extract was purified and concentrated, then detected by gc-ms/ms. the calibration curve was linear of amitraz,chlordimeform and 2,4 - xylidine between 0.01 mg/l and 0.2 mg/l(10 g/kg - 200 g/kg), and the correlation coefficient was more than 0.990. the average recovery was ranged from 76.83%-91.35%. key wordsgc/mshpcemelaminedifenoconazoleamitrazchlordimeform 2,4-dimethylaniline 第 1 章 综述 1 第 1 章 绪论 色谱在食品分析中的应用 中国是食品生产和贸易大国， 食品安全问题是关系到我国的国民经济和人民生活的 重大问题。从2005年的苏丹红事件到近年来的三聚氰胺等事件不断发生，这使得国家对 食品安全及快速检测的要求不断提高， 提出并制定了很多针对检测食品中有毒有害物质 的方法、技术及手段。在这些方法中，色谱法的应用最为广泛。 当前食品中的不安全因素主要表现在以下几个方面:微生物、 寄生虫等生物污染； 环 境污染；农用、兽用化学物质的残留；自然界存在的天然毒素；营养素不平衡；食品加 工和贮藏过程中产生的毒素；食品添加剂的使用；食品掺伪；新开发的食品资源及新工 艺产品；包装材料。食品中最常见的有毒有害物质是有机合成农药、兽药残留物及污染 物和致病菌。其中的有机合成农药、兽药残留物及污染物均是通过色谱方法分析，故本 文就色谱法在食品分析中的应用做一综述。 1.1 气相色谱在食品分析中的应用 气相色谱法是一种以气体为流动相，采用冲洗法的柱色谱分离技术l。气相色谱分 析是一种高效能、选择性好、灵敏度高、检出限低、分析速度快、样品用量少、应用广 泛的分析、分离方法。它可以应用于分析气体试样，也可分析易挥发或可转化为易挥发 的液体或固体，不仅可分析有机物，也可分析部分无机物。气相色谱法相对高效液相色 谱法简单易于操作，分析成本低。一般地说，只要沸点在 500以下，热稳定性良好， 相对分子质量在 400 以下的物质，原则上都可采用气相色谱法2。另外，gc 和 ms 联 用是集分离和鉴定、定性与定量于一体的方法，是 gc 的高分离能力与 ms 的高灵敏度 和极强的专属性的分离检测的结合，从而提高了气相色谱法定性、定量的能力。 1.1.1 常规气相色谱法 气相色谱仪在食品安全卫生检测中的应用由于气相色谱法可以对卤素、硫、磷化物 等进行分析，所以气相色谱仪在食品安全卫生检测中被广泛应用。赵辉3建立了能同时 测定番茄、苹果中氯硝胺、六氯苯、百菌清、三唑酮、丁草胺、狄氏剂、op-ddt、异 狄氏剂、乙酯杀螨醇、胺菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯等 14 种有 机氯和拟除虫菊酯类农药的气相色谱多残留分析方法。结果表明，供试的 14 种农药在 河北大学理学硕士学位论文 2 番茄和苹果中的分离状况良好，能在 30 min 内出峰完毕，其添加回收率在 70% - 113% 之间，变异系数在 0.3% - 13%之间，最小检出限在 0.0011 - 0.0085 mg/kg 之间。吕芬等 4建立一种快速、准确测定蔬菜水果中拟除虫菊酯残留量的气相色谱法，并应用于广东 省食品化学污染物网络监测工作中。使用石油醚提取，浓缩后经 florisil 固相萃取柱净 化， 用气相色谱-电子捕获检测器测定， 色谱柱为 db-1 石英毛细管柱(30 m0.25 mm0.25 m)。在小白菜中的平均回收率为 86.2%-93.4%，相对标准差为 3.4%-8.6%；苹果中的回 收率为 87.3%-92.8%，相对标准差为 2.8%-8.1%。检测了 511 份蔬菜水果样品中 5 种拟 除虫菊酯的残留量，检出率为 17.4%，超标率为 0.59%。郭新道，杨仁斌等5选择气相 色谱氮磷检测器法检测大米、面粉中 22 种有机磷和有机氮农药多残留.大米、面粉样品 用丙酮/二氯甲烷(1:1，v/v)提取，二氯甲烷萃取，丙酮定容，gc-npd 检测.结果表明， 该方法分离度较好，灵敏度高，方法的最小检出量在 5.18010-12- 8.54110-11g 之间.当 添加浓度在 0.02 - 2.00 mg/kg 范围时，大米平均添加回收率为 71.71% - 109.16%，变异 系数为 1.16% - 12.89%；面粉平均添加回收率为 73.87% - 113.48%，变异系数为 1.75% - 15.17%.王文芳，董春洲6研究一个新的气相色谱法测定山梨酸和苯甲酸。此方法采用不 分流/分流进样模式，ffap 毛细管作色谱分离柱、丙酮作溶解提取物溶剂，对饮料中山 梨酸和苯甲酸进行测定。线性范围为 25-300 g/ml，相关系数都大于 0.999；山梨酸和苯 甲酸的检出限分别为 0.813 g/ml 和 0.606 g/ml；样品 3 次平行测定的相对标准偏差均 小于 6.42%；回收率均在 87.0%-97.8%范围内。赵文亚等7建立了水产品中氯霉素残留 量测定的气相色谱法。样品中的氯霉素用乙酸乙酯提取，正己烷去脂肪，过 sep-c18柱 进行净化，用 bstfa-tmcs 衍生后进带有微电子俘获器的气相色谱仪检测。该方法的 线性范围为 0.5 - 500 g/l，相关系数 r=0.999，最低检测限为 0.1 g/kg，相对标准偏差 为 4.3% - 11.0%， 向样品中分别添加 1g/kg、 10g/kg 和 20g/kg 3 个浓度水平的氯霉素， 回收率分别为 62.0%、88.2%和 96.4%。方法灵敏度高，准确可靠，适合水产品中氯霉素 残留量的检测。 1.1.2 顶空气相色谱法 顶空气相色谱法(hs-gc)又称液上气相色谱分析，它采用气体进样，可专一性 收集样品中的易挥发性成分，与液-液萃取和固相萃取相比既可避免在除去溶剂时 引起挥发物的损失，又可降低共提物引起的噪音，具更高灵敏度和分析速度，对 第 1 章 综述 3 分析人员和环境危害小，操作简便，是一种符合“绿色分析化学”要求的分析手段。 顶空分析方法主要分为静态顶空分析、动态顶空分析、顶空-固相微萃取三类，其 在食品检测方面也主要是用于一些易挥发性成分的检测。如王海峰等8对食用油中 c5-c8 烃类残留溶剂的高温项空气相色谱分离与测定进行方法学考察。 样品在 90进行 顶空平衡以提高样品残留溶剂组分在顶空气相中的分配， 并采用 25%角鲨烷填充色谱柱 对溶剂组分进行分离和定量分析。结果表明，30 min 内的高温平衡对组分测定无干扰； 不同组分保留时间的 rsd 均不超过 0.2%、峰面积的 rsd 也均小于 5%，方法的回收率 为 99.2%，最低定量限均低于 0.5 mg/kg；项空分析的相平衡条件、色谱分离模式不导致 此方法与国家标准方法的测定结果间存在显著差异； 国家标准方法中六号溶剂标准溶液 的配制对定量分析结果影响显著。 此方法可用于监控油脂加工中溶剂残留的变化以及精 炼油的质量检测。 甜蜜素，化学名称为环己基氨基磺酸钠，是一种人工合成的非营养型食品甜味剂。 目前国标分析甜蜜素的方法采用气相色谱法。样品进行衍生化反应后，低沸点的衍生物 必须稳定在冰浴中用正己烷提取再注入色谱仪分析，样品预处理较繁琐。也有文献报道 采用高效液相色谱法测定甜蜜素， 是在其结构中引入芳香基团再用紫外进行检测。 栾燕， 赵晶9利用顶空毛细管色谱技术建立一个简便、快速、低成本、高效率的测定甜蜜素方 法。 1.1.3 气相色谱-质谱联用 气相色谱-质谱联用技术是食品研究强有力的工具。质谱分析可以确定待测物的分 子量、分子式。方法的灵敏度和准确度高，可以获得物质大量的内涵信息。但是，质谱 只能对纯物质定性，对混合组分定性无能为力。气相色谱具有很强的分离能力，在一定 的色谱条件下，可以将混合物分离为纯物质。但是，气相色谱依靠保留值定性具有很大 程度的不可靠性。基于上述原因，将气相色谱与质谱采用适宜的接口相联结，综合各自 优点，诞生了气相色谱-质谱联用仪10。尤其以在食品农残及有毒有害物分析方面的研 究比较广泛。席艳丽，董慧茹11建立了一种有效分离富集并检测蔬菜中氨基甲酸酯类农 药残留的方法， 即采用溶剂浮选法(ss)对蔬菜中的氨基甲酸酯类农药残留进行分离富集， 然后用气相色谱/质谱(gc/ms)进行检测。考察了浮选溶剂、试液 ph、通气速度及浮选 时间等因素对浮选效果的影响，得到了优化浮选条件；对此条件下的浮选产物进行气相 河北大学理学硕士学位论文 4 色谱/质谱检测， 回收率为 81.6%-97.8%， rsd 为 1.39%-2.65%， 定量限(loq)为 0.39-6.17 g/kg。gorna12采用溶剂萃取及选择离子萃取模式测定等蔬菜、水果中的单环芳香烃， 进而对人类每天通过食用污染过的蔬菜水果而摄入单环芳香烃进行推算。 周昱等13用丙 酮提取水果中三唑酮， 经液-液分配净化，用气相色谱-电子捕获检测器测定，并用气相 色谱-质谱(选择离子监测)进行确证。以 hp-5 大口径毛细管拄和 hp-5ms 毛细管柱为分 离柱，选择出合适的色谱条件，三唑酮的分离效果良好。该方法对苹果样品的测定下限 为 510-5g/kg；添加浓度为 510-5- 1.010-3g/kg 的三唑酮；回收率为 96%以上；相对 标准偏差小于 4.0%。在三唑酮的测定方面取得了良好的效果。rivera 14采用固相萃取 分离净化，gc/ms 技术同时测定了木炭烤肉中多环芳烃和杂环芳胺等 12 种致突变物。 song 等15采用超临界流体萃取和固相萃取等浓缩净化手段，gc/ms 技术测定了香烟中 亚硝胺。赵琼晖等16利用气相色谱-质谱(gcms)联用技术建立了茶叶中 25 种有机氯 农药残留同时测定的方法。茶叶样品中有机氯农药残留通过正己烷-丙酮(体积比2:1) 溶液提取，浓缩后过弗罗里硅土柱净化，采用正己烷.乙酸乙酯(体积比为 9:1)溶液淋洗， gc-ms 选择离子监测模式(sim)检测。方法的线性范围为 0.0100.500 mg/l。在茶叶样 品中 0.010.20 mg/kg 加标水平下有机氯混标的加标回收率为 70.8% - 105.5%，相对标 准偏差为 1.6%-12.7%。除硫丹和硫丹的定量限为 0.02 mg/kg 以外，其余 23 种有机 氯农药的定量限均为 0.01 mg/kg。此法大大提高了对茶叶中有机氯农药的多残留检测能 力。牟峻17等应用气相色谱和气相色谱质谱法测定及确证粮谷和油籽(糙米、玉米、大 豆、花生)中丰索磷的残留含量，试样采用水-丙酮提取，提取液经液-液分配后，再以硅 土柱净化，气相色谱-火焰光度检测器(gc-fpd)测定，外标法定量，并用气相色谱-质谱 (gc/ms)(sim)针对丰索磷的选择监测离子的种类(m/z293、295、308)和丰度比(约为 100:11:34)进行阳性确证。方法检出限为 0.01 mg/kg。 1.2 高效液相色谱法在食品分析中的应用 高效液相色谱法是上世纪 60 年代末 70 年代初发展起来的一种新型分析分离技术。 它结合了现代高压技术与传统的液相色谱方法的优点， 具有高选择性、 高灵敏度等特点， 已成为食品检测的有力工具，随其分离检测技术的日益完善，已被广泛应用于各个学科 中。高效液相色谱法对于气相色谱法的优势在于:不需要气化，只要求样品能制成溶液， 因此无论对于是挥发性的物质还是挥发性低，热稳定性差，分子量大的高分子化合物以 第 1 章 综述 5 及离子型化合物均可检测，如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、脂类、维生素、 抗生素等分子量较大，沸点较高的合成药物以及无机盐类。高效液相色谱法的适用范围 更广、分离效率更高、速度更快，而且流动相的可选择范围宽、灵敏度高、色谱柱可反 复使用、流出组分容易收集、安全等优点。世界上约有 80%的有机化合物可以用 hplc 来分析测定18。近年来液相色谱-质谱联用技术在食品工业上的应用愈来愈广，液相色 谱-质谱(lc-ms)联用技术体现了色谱和质谱优势的互补， 将色谱的高分离性能和质谱的 鉴别力强的特点相结合，组成了较完美的现代分析技术。本文还介绍近年来液-质联用 技术在食品分析研究领域的应用，随着液相色谱-质谱质联用技术的不断完善、发展， 必将在药物分析中占据越来越重要的地位。 1.2.1 高效液相色谱法 由于在使用气相色谱检测沸点高、热稳定性差的物质时需要衍生化，这样就加大了 实验的难度， 使得实验变得复杂。 对于这些物质我们就可以使用高效液相色谱进行分析。 由于高效液相色谱法自身的优势，所以在食品分析中被广泛用于兽药残留、食品添加剂 和农药残留等方面的研究。 高效液相色谱法对食品中的兽药残留进行检测是该方法的一项主要应用。 主要用于 动物源食品中的盐酸克仑特罗、磺胺类药物、四环素类抗生素等物质的检测。陈金枝， 柳光斌19采用高效液相色谱法测定猪眼、 猪肝、 猪肺中微量盐酸克仑特罗(俗称瘦肉精)。 该法线性范围 0.5-8.0 g/ml，r=0.9997，添加回收率为 76.0%-88.0%，rsd(n=6)为 1.4% - 3.6%，最小检测量为 0.20 ng。吴银良，赵莉20建立了同时测定牛奶中残留的 9 种磺胺 类药物的固相萃取-高效液相色谱分析方法。奶样经磷酸盐缓冲液稀释后高速离心去除 脂肪，过 c18柱后，用水淋洗，甲醇洗脱，洗脱液经氮气吹干后用乙酸乙酯溶解，并过 氨基固相萃取小柱净化， 用正己烷及水淋洗， 以甲醇-乙腈-水(含1%乙酸)(体积比为1:1:8) 洗脱，洗脱液用于高效液相色谱分析。采用 inertsilods-3c18柱分离，以水-乙酸和甲醇- 乙腈为流动相进行梯度洗脱，二极管阵列检测器检测，外标法定量。9 种磺胺类药物标 准曲线的线性回归系数均在 0.9999 以上，线性范围为 25 - 5000 g/l，检出限为 1.7 - 2.8 g/l，定量限为 5.7 - 9.2 g/l。在 10，20，40 g/l 添加水平下的添加回收率为 72.1% - 88.3%，相对标准偏差为 2.3% - 5.0%。薄海波等21采用柱切换直接进样高效液相色谱法 测定蜂蜜中 3 种四环素类抗生素(土霉素 otc、四环素 tc、金霉素 ctc)的残留量，先 河北大学理学硕士学位论文 6 用缓冲溶液溶解样品后，直接进样，以二次蒸馏水作流动相在 c18预柱上在线富集和净 化，然后用柱切换阀将预柱与一个 c18分析柱接通，以草酸溶液-乙腈-甲醇作流动相， 紫外检测器在 350 nm 处检测。结果各组分回收率大于 86%，相对标准偏差小于 8.0%， 最低检出浓度为 0.005 mg/kg，满足了日本等国对进口蜂王浆中土霉素、四环素、金霉 素残留量(0.05 mg/kg)要求。 孔雀石绿曾长期作为水产养殖业的杀菌剂，可用于鱼类高发的水霉病、原虫病的控 制，但研究证实，进入人体后，通过生物转化可产生致癌、致畸、致突变等副作用，上 世纪 90 年代以来许多国家都将其列为水产养殖的禁用药物。桂英爱等22，建立淡水中 孔雀石绿含量的高效液相色谱法测定分析方法。方法采用 zorbaxsb-c18(250 mm4.6 mm，5 m)色谱柱，二氧化铅柱后氧化柱，流动相为 0.1 mol/l(ph=4.5)的乙酸铵溶液 乙腈(体积比为，流速为 1.5 ml/min，紫外检测器波长为 588 nm。该法的线性范 围为 0.1 - 4.0 g/ml， r = 0.9997，最低检测限为 0.02 g/l，平均回收率分别为 98.5%， 97.8%，rsd 分别为 11.2%，8.0%。罗晓燕等23，建立了固相萃取高效液相色谱法同时 测定禽畜组织中已烯雌酚(des)、 丙酸睾酮(tes)的残留量。 该法使用 alltech extract-clean columns c18固相萃取柱净化样品，甲醇洗脱；使用甲醇:水=85:15(v/v)做流动相，流速为 1.0 ml/min，经 supelco discovery c18柱分离，二极管阵列检测器，检测波长为 245 nm。该方法的线性范围为:0.5 - 10.0 g/ml； r 分别为已烯雌酚 r=0.99999；丙酸睾酮: r=0.99994 。 最低检出限分别为:已烯雌酚 9.5 g/kg； 丙酸睾酮 8.4 g/kg； 回收率在 92% - 103% 之间，相对标准偏差小于 1.3%。 高效液相色谱也常用于对食品添加剂及农药残留的测定。苏丹(sudan)色素是应用于 诸如油彩、蜡、地板蜡和香皂等化工产品中的一种红色或橙红色的偶氮类合成着色剂。 有研究表明苏丹(一号)对人类肝细胞也显现出可能致癌的特征，欧盟已明令禁止在食品 中添加苏丹色素，我国也禁止其在食品中使用。刘昱等24采用高效液相色谱法快速测定 辣椒制品中的苏丹色素含量。用乙腈提取样品中的苏丹着色剂，再经浓缩过滤，直接用 反相液相色谱测定。 该方法具有良好的稳定性、 重现性和准确性。 检测低限为 0.5 mg/kg ， 线性范围为0.5 mg/l- 5.0 mg/l ， 标准曲线相关系数0 .9999 ， 回收率为80 .3% - 10 1% ， 相对标准差(rs)小于 9.8%。 刘晓颖，吴飞25应用高效液相色谱法测定蔬菜中甲 1605 和久效磷两种常用有机磷 农药农药残留量。采用高效液相色谱法，c18色谱柱、流动相为甲醇:水(v:v)=70:30，用 第 1 章 综述 7 紫外检测器检测。该法相关性好，线性范围广，精密度高，准确度好。 1.2.2 液相色谱-质谱质联用技术 高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)是基于高效液相色谱的高分离能力与质谱的高 灵敏度和极强的专属性的分离检测技术，该技术在植物化学、分析化学、药学、生物化 学、临床医学、环境化学等领域有极为广泛的应用。尤其在食品分析中可以对食品中的 蛋白质和肽、低聚糖、皂苷、核苷、黄酮、维生素、甾醇等功能成分及有害残留物等进 行分析检测以及确证工作。祝伟霞等26建立了高效液相色谱串联质谱(hplc-msms)同 时检测肌肉、肝脏、肠衣、蜂蜜中氯霉素残留的确证方法。采用乙酸乙酯提取样品中氯 霉素，以乙腈甲酸铵为流动相，zor-bax sb c18柱(150 mm2.1 mm i.d 5 m)进 行分离， 质谱采用电喷雾电离(esi)多反应监测(mrm)负离子模式进行检测， 外标法定量， 定量下限 0.05g/kg， 检测限为 0.01g/kg(s/n 3)。 该方法的平均回收率为 72.0% - 90.0%， 相对标准偏差为 2.10% - 9.65%。徐锦忠等27建立了鸡肉和鸡蛋中合成类固醇类激素(睾 酮、甲基睾酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯 丙酸诺龙)和糖皮质类激素(泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、氟氢可的松、甲基泼尼松、 倍氯米松及氢化可的松)多残留的液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)检测方法。样品经 乙腈超声提取，正己烷脱脂净化，以甲醇-甲酸水溶液为流动相，经 c18柱分离后在 hplc-ms/ms 上进行选择反应监测模式下的定性及定量分析。合成类固醇类激素采用 正离子模式检测，糖皮质激素则采用负离子模式检测，正、负离子化模式一次进样同时 检测。类固醇类和糖皮质类激素的定量检出限为 0.5 g/kg。在 0.5、 1.0 和 5.0 g/kg 3 种浓度添加水平，上述激素的平均回收率为 73.4% - 108.9%；相对标准偏差为 3.4% - 13.4%。可实现样本灵敏、准确地定性定量分析。 1.3 高效毛细管电色谱法在食品分析中的应用 毛细管电色谱法是近十年来蓬勃发展的一种检测方法，是以高压电场为驱动力，以 毛细管为分离通道的液相分离技术，是经典电泳技术和现代微柱技术的结合产物，具有 分离效率高且经济环保的特点，已广泛应用于医疗和食品安全检测领域。毛细管色谱法 在食品分析中主要应用于对包括糖类、蛋白质、维生素、矿物质、有机酸、食品添加剂、 农药残留量和抗生素残留量等物质的测定。 糖类物质是毛细管色谱法在食品分析中应用很广泛的一类。ban等28使用毛细管电 河北大学理学硕士学位论文 8 色谱法分析分子量高达20万的高分子聚氨基葡糖， 测定条件为:使用50 m内径， 27 cm(有 效长度=20 cm)的未涂敷毛细管，施加电压15 kv，100 mmol ph为2的三乙基胺-磷酸盐 作运行缓冲液，检测波长195 nm，线性浓度范围为1.25-20 mol/l，方法被用于测定血 浆和食物样品。翁梅倩，宋金芳29使用毛细管电泳法(ce)对兔乳中乳糖和中性低聚糖进 行测定，为感染性腹泻患儿用生物活性物治疗寻找更为广泛的物质来源。使用2-氨基吖 啶天酮盐酸盐(2-amac)胺化还原兔乳中乳糖和中性低聚糖，然后用ce分离和定量分析 这些糖-amac衍生物。结果从兔乳中共分离出5个峰，分别为乳糖、3 -岩藻乳糖、乳糖 -乙酰化-辛糖、乳糖-乙酰化-岩藻五糖i和2 -岩藻乳糖i。兔乳中含量最丰富的碳水化合物 是乳，4种人乳低聚糖亦存在于兔乳中，其中含量最丰富的是乳糖-乙酰化-岩藻五糖i， 其次是3 -岩藻乳糖、2 -岩藻乳糖i和乳糖-乙酰化-辛糖。从而得出ce可用于生物样品中 糖-amac衍生物的分离和定量分析，而且人乳和兔乳中存在共同的低聚糖，其对新生 儿(仔)肠道的正常发育可能具有重要作用。兔乳中的这些低聚糖可以作为感染性腹泻患 儿治疗的生物活性物来源。 毛细管电色谱法对带电且分子扩散小的大分子化合物如蛋白质等有很高的灵敏度。 brehmer30等报道了免疫电泳法测定食物中的乳蛋白。将10 g肉样品匀浆后与20 ml的 tm-尿素混匀，在冷置15 h，然后在加热30 min，混合物离心并在-放置20 min。 水提取液于固化了的脂肪分离，过滤，以1:12稀释。2.5 g面包样也类似地处理，并按1:12 稀释；取2.5 g冰淇淋也同样处理，以1:8稀释。使用含1.5%琼脂糖、5.66% -酪蛋白抗血 清(小狗中产生)的ph8.6的巴比妥缓冲液，被涂在板上成长20 cm、宽6 cm、厚0.2 cm的 薄层。于距阴极1 cm处打4 mm的圈，加入15微升样品。在，300v(40ma)条件下电泳 6 h。此板在1%nacl为15 h，用酰胺黑染色，测区带的长度。由所绘校正曲线测得二种 冰淇淋， 均含70%全乳， 面包样含26.8%全乳， 肉样含2%乳蛋白， 检测限分别是5%、 0.2% 和0.05%，变异系数为6.8%、5.3%、8.2%。 毛细管电色谱法还应用在对多种食品中的有机酸、食品添加剂、农药残留量和抗生 素残留量等物质的检测。kenney 等31用等用毛细管区带电泳测定了苹果汁、番茄汁、 葡萄汁及其它果酒中的柠檬酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、醋酸和乳酸。thompson 等32 利用高效毛细管电泳同时分离和测定了无糖软饮料和番茄酱中的山梨酸、苯甲酸、咖啡 因、阿斯巴甜和甜蜜素。该研究表明，在高效毛细管电泳法中使用脱氧胆酸钠等运行缓 冲液添加剂可有效改善上述防腐剂和甜味剂的分离效，回收率高，重现性好，测定结果 第 1 章 综述 9 与高效液相色谱在同一水平。王玲等33采用加压毛细管电色谱-紫外检测法，建立了速 灭威、克百威和残杀威三种氨基甲酸酯类农药的同时分离检测方法。采用反相 c18毛细 管电色谱柱(3 m， 200 mm 75 m i.d.) ， 以乙腈： pbs(5 mmol/l， ph 6.50 ) =30:70 (v/v) 为流动相， 检测波长 220 nm， 流速 100 l/min， 柱压 6.9 mpa， 在电色谱柱末端施加 10.0 kv 负电，三种物质在 10 min 内基线分离。该法用于蔬菜中速灭威、克百威和残杀威的 残留分析研究，分离快、灵敏度高，效果令人满意。刘波静34用毛细管电泳法检测牛奶 中的 4 种抗生素残留，即四环素、土霉素、金霉素和氯霉素，其牛奶中检测限为氯霉素 为 10 ug/l，四环素、土霉素为 15 ug/l，金霉素为 20 ug/l，为残留研究提供了既灵敏又 可靠的测定方法。 1.4 食品中三聚氰胺的分析研究 三聚氰胺(melamine)简称三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物35，其主要用于 生产三聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、皮革、医药等行业。由于 经典的凯氏定氮法无法测定氮的来源，不法商人便将其加入饲料，甚至奶粉中，冒充蛋 白质，提高产品的表观蛋白质含量，从中谋取暴利。自2007年在美国爆发宠物食品受三 聚氰胺污染事件及2008年爆发了婴幼儿因食用了含三聚氰胺的奶粉而致肾结石甚至死 亡的恶性事件后，才引起广泛的重视。目前三聚氰胺的检测方法主要包括液相色谱法 (lc)36-42、气相色谱-质谱法(gc-ms)43-46和液相色谱-质谱法(lc-ms)47-53及免疫学法。 1.4.1 高效液相色谱法检测食品中的三聚氰胺 高效液相色谱法是目前最常用的测定方法，但由于三聚氰胺属于强极性化合物，其 在普通的c18色谱柱上几乎无保留，因此需在流动相中添加庚烷磺酸钠或者辛烷磺酸钠 等离子对试剂以得到较好的保留。汪辉等36建立用高效液相色谱-二极管阵列法测定高 蛋白食品中的三聚氰胺的检测方法。对不同样品采用不同的前处理方法，然后用 agilenttc-c184.6250 mm色谱柱，柱温为，流动相为0.02 mol/l硫酸铵甲醇 =94，流速0.8 ml/min，二极管阵列检测器于235 nm波长下进行检测，并以保 留时间和三维光谱图相似性系数进行定性， 外标法定量。 不同样品的加标回收率为98.8% - 101.5%，rsd小于1.2%。方法线性范围为0.1 - 150 g/ml，检测限为0.01 g/ml，相关 系数r=0.9999。宫小明38建立了高效液相色谱法检测植物性原料中三聚氰胺的方法。样 品由水涡旋混匀超声提取，通过加入亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白进行净化。色谱柱 河北大学理学硕士学位论文 10 sunfirec18 (4.6250 mm，5 m)，流动相为水-氨水-高氯酸缓冲液，检测波长240 nm， 检测限0.5 mg/kg。在添加浓度为1.0 - 4.0 mg/kg范围内，回收率在70.2% - 80.2%，相对标 准偏差小于10%。张美金等40建立高效液相色谱法测定饲料和宠物食品中三聚氰胺含量 的方法。 该法将样品经盐酸溶液提取， 离心后取5 ml上清液于预平衡的waters oasismcx 固相萃取柱净化，进行hplc分析。其校准曲线在0.05-1.0 mg/l的范围内，相关系数 r=0.999。饲料和宠物食品中三聚氰胺的定量检测限(loq)是1.0 mg/kg；添加水平为1.0 mg/kg时，样品加标回收率为81% - 105%，rsd为10%。该法简便可行，净化效果好， 检测灵敏度、准确度及精密度均满足检测要求。赵永彪等41建立了测定宠物食品中三聚 氰胺的高效液相色谱分析方法。采用ods分离柱，以10.0 mmol/l的庚烷磺酸钠(用hcl 调节ph 3.0)-乙腈为流动相，在236 nm波长下检测三聚氰胺含量，测定结果的平 均回收率为96.5%，平均相对标准偏差为1.39%。最低定量检出浓度为2 mg/kg。该方法 也可应用于其它类型动物食品中三聚氰胺的含量分析。 陆艳霞等42建立了浊点萃取法(cpe)对牛奶样品进行净化和浓缩后用高效液相色谱 (hplc)检测的方法.采用三氯乙酸(ccl3cooh)结合非离子型表面活性剂triton x-100对 牛奶进行破乳，以非离子表面活性剂聚乙二醇600(peg 600)为萃取剂，研究牛奶中三聚 氰胺的萃取行为.破乳的最佳条件:triton x-100的质量浓度为20 g/l， ccl3cooh的质量浓 度为20 g/l，水浴加热10 min； cpe方法的最佳条件:peg 600的质量浓度为130 g/l， na2co3和na2so4的质量浓度分别为5 g/l和260 g/l，平衡温度，平衡时间30 min.在 优化的实验条件下，牛奶样品的加标回收率为80% - 98%，相对标准偏差为1.2% - 5.7%， 检出限为0.9 mg/kg.该方法简便、快速、灵敏度高、污染少. 1.4.2 气相色谱质谱联用法及液相色谱质谱联用法检测食品中的三聚氰胺 gc-ms和lc-ms均可作为三聚氰胺的确证方法，具有灵敏度高，选择性好，能有效 消除复杂基体干扰等特点，但由于其价格昂贵，运行成本高，所以不易普及。 王征43建立了一种用于动物食品中三聚氰胺含量的气相色谱一质谱联用检测方法。 通过甲醇/水/三乙胺混合液提取动物食品中的三聚氰胺，氮气吹干、硅烷化衍生，再由 气相色谱一质谱联用仪检测，苯代三聚氰胺内标法定量。该方法在饲料和动物食品中三 聚氰胺的加标回收率在82.0% - 105.6%之间， 相对标准偏差(rsd)不大于5.8% ， 在0.1 mg - 50.0 mg/l范围内呈现良好的线性关系，灵敏度高，最低检测限达到0.1 g/kg；选择性 第 1 章 综述 11 好，能有效消除复杂基体干扰。可作为常见样品中三聚氰胺类有机物含量检测的确证方 法。 李锋格等45建立了气相色谱-质谱法测定牛奶中三聚氰胺和三聚氰酸含量的分析方 法。样品经二乙胺-乙腈-水溶液超声提取，离心，滤液用氮气吹干后加入硅烷化衍生试 剂衍生，气相色谱-质谱测定，选择离子模式监测，外标法定量。在0.025 - 2 mg/kg范围 内，目标物的峰面积与其质量浓度的线性关系良好(r0.98)；在0.5，1.0和2.5 mg/kg的添 加水平，三聚氰胺和三聚氰酸的平均回收率分别为84% - 87%和75% - 102%，相对标准 偏差(rsd)分别为5.7% - 11.7%和4.9% - 7.8%；三聚氰胺和三聚氰酸的检出限(lod)分别 为0.05 mg/kg和0.10 mg/kg。该方法简便、快速、灵敏、准确，适合牛奶中三聚氰胺和三 聚氰酸的确证和定量测定。 李爱军等51建立了液相色谱-串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留的方法。试样用 v(乙腈 2 溶液，提取，高速离心后，供液相色谱-串联质谱仪定性定量分 析。流动相为v(乙腈 2 混合溶液。采用电喷雾离子源，定性离子对为 127.2/85.2和127.2/68.2；定量离子对为127.2/85.2。在添加了0.5 - 10.0 mg/kg的三聚氰胺 标准品时的回收率为92.6% - 103.2%；相对标准偏差(rsd)在0.8% - 2.0%；检出限为0.2 mg/kg。 孙志文等53建立了牛奶中三聚氰胺残留的高效液相色谱-串联质谱检测方法 (uplc-ms/ms)。 采用20%乙腈-1%三氯乙酸(2:8， v/v)沉淀蛋白后， 离心， 上清液过mcx 固相萃取柱净化后，5%氨化甲醇洗脱，蒸干，流动相溶解后，采用电喷雾离子源，在 多反应监测(mrm)模式下进行分析，外标法定量，三对定性离子对分别为：m/z 126.784.8、126.768.1和126.743.0，定量离子对为126.784.8。在1 - 500 ng/ml浓度范 围内，呈良好的线性，相关系数为0.9996。在10、50、100 g/kg三个添加水平，平均回 收率58.2% - 83.6%，变异系数范围在4.1% - 13.2%之间，方法检测限2 g/kg。 丁涛等52建立了高效液相色谱-二极管阵列检测器(hplc-dad)及hplc-电喷雾串 联质谱(esi-ms/ms)测定植物源性蛋白中残留的三聚氰胺的方法。利用hplc-dad进行 样品中三聚氰胺的初筛，利用hplc-ms/ms进行确证。采用三氯乙酸溶液沉淀样品中的 蛋白，同时提取目标分析物，质谱检测时样品再经强阳离子固相萃取柱富集净化。 hplc-dad的检测低限为10 mg/kg，hplc-ms/ms的检测低限为0.5 mg/kg；hplc-da 的添加回收率为76% - 88%，hplc-ms/ms的添加回收率为72% - 82%(基质匹配曲线校 河北大学理学硕士学位论文 12 正)，两种方法的添加回收率的相对标准偏差(rsd)为3.4% - 6.4%。 1.4.3 高效毛细管电泳法检测食品中的三聚氰胺 毛细管电泳是近十年来蓬勃发展的一种检测方法， 因其具有分离效率高且经济环 保的特点，已广泛应用于医疗和食品安全检测领域。 饶钦雄等54建立了牛奶和奶粉中三聚氰胺的高效毛细管电泳-二极管阵列检测器 (hpce-dad)检测方法。使用长度58.5 cm、内径75 m的毛细管柱，分离电压25kv，进 样量3.5 kpa(35 mbar)8 s，分离温度，缓冲溶液20 mmol/l柠檬酸-40 mmol/l磷酸 氢二钠(ph 2.6)，检测波长232 nm。分析物在1 - 100 mg/l范围内线性良好，相关系数为 0.997；牛奶和奶粉的定量限分别为0.5 mg/kg和1.0 mg/kg。在添加水平为定量限浓度至 50 mg/kg时的回收率为72.2% - 97.3%，相对标准偏差为2.1% - 3.9%。 第 2 章 高效毛细管电泳浊度法检测牛奶和奶粉中的三聚氰胺 13 第 2 章 高效毛细管电泳浊度法检测牛奶和奶粉中的三聚氰胺 2.1 前言 三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物35，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂， 广泛用于木材加工、塑料、涂料、皮革、医药等行业。由于经典的凯氏定氮法无法测定 氮的来源，不法商人便将其加入饲料，甚至奶粉中，冒充蛋白质，提高产品的表观蛋白 质含量，从中谋取暴利。自2007年在美国爆发宠物食品受三聚氰胺污染事件及2008年爆 发了婴幼儿因食用了含三聚氰胺的奶粉而致肾结石甚至死亡的恶性事件后， 才引起广泛 的重视。 毛细管电泳是近十年来蓬勃发展的一种检测方法， 因其具有分离效率高且经济环保 的特点，已广泛应用于医疗和食品安全检测领域。目前毛细管电泳检测三聚氰胺方法的 报道较少，主要原因是国家规定的三聚氰胺限量严格，如婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的 限量值为1 mg/kg， 液态奶(包括原料乳) 奶粉及其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg，而毛细管电泳对三聚氰胺的检测灵敏度低，一般情况下无法直接检测，需要复 杂的柱前富集过程。饶钦雄等55采用三氯乙酸沉淀牛奶中蛋白质，高速离心分离，经 mcx柱净化富集，毛细管电泳分离检测牛奶中三聚氰胺，方法的检出限为0.5 mg/kg； tsai等54同样采用了高速离心和mcx柱净化富集， 在线富集毛细管电泳分离检测奶中三 聚氰胺，方法的检出限为0.5 mg/kg。本文着重研究了样品前处理方法和高效毛细管电泳 浊度法，从而避免了复杂的柱前富集过程和繁琐的实验操作步骤，旨在建立简便、低成 本、准确灵敏的牛奶和奶粉中三聚氰胺的高效毛细管电泳直接测定方法，使之成为企业 和检测部门的普适检测方法。 2.2 实验部分 2.2.1 主要仪器与试剂 高效毛细管电泳仪:th-3000型， 配紫外检测器， 河北省保定市天惠分离科学研究所； 80-2b离心机:80-2b型，上海安亭科学仪器厂；ph酸度计:phs-3c型，上海伟业仪器厂； 超声波清洗器:kh3200b型，昆山禾创超声仪器有限公司；三氯乙酸、nah2po4、氢氧化 钠:分析纯；十二烷基硫酸钠(sds):纯度大于99%(补充规格)；三氯乙酸溶液:将1 g三氯乙 酸固体溶于水中定容至100 ml；氢氧化钠溶液:将1.9 g氢氧化钠溶于水中并定容至50 河北大学理学硕士学位论文 14 ml； 磷酸盐缓冲溶液缓:准确称取40 mg磷酸二氢钠溶于25 ml水中，加入300 l浓磷酸， 750 l三氯乙酸水溶液，用氢氧化钠溶液调节ph 2.05 - 2.