（环境工程专业论文）生物传感与实时荧光定量技术检测堆肥微生物酶编码基因的研究.pdf

m a s t e ro fe n g i n e e r i n g e n v i r o n m e n t a le n g e e r i n g i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a n u n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rz e n g g u a n g m i n g m a y , 2 0 1 1 ； 本 果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表 或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 写污 ， 日期：2 0 1 1 年石月2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖 南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 篡戮多 导师签名：嚏别帜 日期：2 0 1 1 年6 月2 日 日期： 2 0 1 1 年6 月ze 1 生物传感与实时荧光定量技术检测堆肥微生物酶编码基因的研究 摘要 随着社会发展，农业废物的无害化、减量化和资源化处理，越来越受到人们的重视。 通过合理的堆肥可以实现这一目标。木质素、纤维素是农业废物堆肥化过程中的主要限 速有机物，其降解被认为是快速堆肥的关键。黄孢原毛平革菌在降解木质素方面有着重 要意义，本研究以黄孢原毛平革菌的基因组d n a 为模板，根据木素过氧化物酶的基因 序列设计引物，比较了此菌基因组d n a 的提取方法，并通过聚合酶链式反应和酶切反 应得到3 3 9 b p 及2 6 5 b p 的待测特异性d n a 片段，制作d n a 传感器以检测所得d n a 片 段。利用自组装单分子膜法，将巯基修饰的探针固定在金电极表面，并研究了夹心式和 竞争式两种杂交机制，采用辣根过氧化物酶作为标记物。在电化学分析中采用了循环伏 安法、交流阻抗法、方波伏安法、微分脉冲伏安法等一系列电化学分析方法。研究表明： s d s c r a b 法提取黄孢原毛平革菌基因组d n a 效果较好。电化学分析中，电流响应值 与d n a 检测浓度成线性关系。夹心式杂交机制中，线性回归方程为y = 8 x 1 0 1 0 x + 0 2 8 0 ， 线性相关系数为0 9 8 1 ，回收率为9 7 9 3 , - - , 1 1 3 5 3 。竞争式杂交机制中，作出生物传 感器检测黄孢原毛平革菌d n a 低浓度段曲线，回归方程为v _ - 4 x 1 0 1 0 x + o 3 6 6 ，线性相 关系数为0 , 9 9 3 。其中y 为电流跃迁值( 从) ；x 为d n a 检测链浓度( m o l m l ) 。此外， 对传感器进行再生，实验结果表明再生性能较好。 纤维素的降解是堆肥中很重要的一个过程，产纤维素酶能力最强的常用的微生物是 木霉属的里氏木霉。本研究采用d n a 生物传感技术以及实时荧光定量p c r 技术对其能 产生纤维二糖水解酶的编码基因进行检测，达到检测堆肥进程的目的。d n a 初始浓度 的对数值与循环阈值成良好的线性关系，回归方程为y = 2 7 5 6 3 x + 3 8 2 8 4 ，r 2 - o 9 9 0 3 ，达 到了较好的效果。 关键词：黄孢原毛平革菌；里氏木霉；d n a 传感器；实时荧光定量p c r i l 硕士学位论文 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to ft h es o c i e t y , m o r ea n dm o r ea t t e n t i o nh a sb e e np a i dt or e a l i z i n g t h ed e c o n t a m i n a t i o n ，r e d u c ea n dr e c y c l eo ft h ea g r i c u l t u r a lw a s t e ，a n dc o m p o s t i n gi sa w i d e l ya c c e p t e dw a y i j 印i na n dc e l l u l o s ea so r g a n i cm a t t e rh a r d l yt ob ed e g r a d e di n c o m p o s ta r cc o n s i d e r e da st h ek e yp o i n to ff a s tc o m p o s t p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mi so f g r e a ts i g n i f i c a n c ei n t h ed e g r a d a t i o no fl i g n i n t h eg e n o m ed n ao fp h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u mw a ss t u d i e da sat e m p l a t ea n dt h ep r i m e r sw e 托d e s i g n e da c c o r d i n gt ot h e l i g n i np e r o x i d a s eg e n es e q u e n c e w eh a v ec o m p a r e dt h em e t h o d so fd n a e x t r a c t i o na n dg o t 3 3 9b pa n d2 6 5b ps p e c i f i cd n af r a g m e n t sw h i c hw e r ea m p l i c a t e db yp o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o na n dr e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o n t h ed n as e n s o rw a sm a d et od e t e c tt h ed n a f r a g m e n t s t h em e r c a p t o - m o d i f i e dp r o b ew a si m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo fg o l de l e c t r o d e w i t ht h em e t h o do fs e l f - a s s e m b l i n gs i n g l e - m o l e c u l a rf i l l t h eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ew a s a d o p t e da sam a r k e ri nt h et w oh y b r i d i z a t i o nm e c h a n i s mo fs a n d w i c ha n dc o m p e t i t i o n e l e c t r o c h e m i c a l a n a l y s i s s u c ha s c y c l i cv o l t a m m e t r y , e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c e s p e c t r o s c o p y , s q u a r e w a v ev o l t a m m e t r ya n dd i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r yw e r eu s e d r e s e a r c hs h o w e dt h a tt h em e t h o do fs d s c 1 ：a bt oe x t r a c tt h ed n ao fp h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u mi st h eb e s t t h ed n a s e n s o rd i s p l a y e da ne x c e l l e n te l e c t r i c a lr e s p o n s el i n e a r t ot h er e d u c t i o no fd n ac o n c e n t r a t i o n a sf o rt h es a n d w i c hh y b r i d i z a t i o no fd n a s e n s o r , t h el i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o ni sy = 8 x 1 0 1 0 x + 0 2 8 0 ，w i t hac o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 8 1 ， a n dt h er e c o v e r i e sa r ei nt h er a n g eo f9 7 9 3 - 1 1 3 5 3 a n dt h el i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o n o fh y b r i d - c o m p e t i t i o nm e c h a n i s mi sy - 4 x 1 0 1 0 x + 0 3 6 6 ，i nt h er a n g eo fl o wd n a c o n c e n t i o n ， w i t hac o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 9 3 ，w h e r eyi sc u r r e n tt r a n s i t i o nv a l u e ，肛八a n dxi sd n a c o n c e n t r a t i o n ，m o l m l i ts h o w st h a tt h er e g e n e r a t i o no ft h es e n s o rh a sag o o dp e r f o r m a n c e t h ed e g r a d a t i o no fc e l l u l o s ei so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ts t e p si nt h e p r o c e s so fc o m p o s t t r i c h o d e r m ar e e s e ii nt h et r i c h o d e r m ah a sh i g ha b i l i t yt op r o d u c ec e l l u l a s e t h i sr e s e a r c h d e t e c t e dt h ed n ao fc e l l o b i o h y d r o l a s ew h i c hi sp r o d u c e db yt r i c h o d e r m ar e e s e id e p e n d i n g o nt h et e c h n o l o g yo fd n ab i o s e n s o ra n dr e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep e r , a n di ta c h i e v e dt h ea i mo f d e t e c t i n gt h ep r o c e s so fc o m p o s t t h es t a n d a r dc a l v ei n d i c a t e dt h el i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e n c y c l et h r e s h o l dt e m p l a t ec o n c e n t r a t i o na n ds h o w e dh i g l lc o r r e l a t i o n s ( 一= 0 9 9 0 3 ) ，a n dt h e l i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o no fi sy = 2 7 5 6 3 x + 3 8 2 8 4 k e yw o r d s ：p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ；t r i c h o d e r m ar e e s e i ；d n ab i o s e n s o r ； r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep c r 1 1 1 1 3 1 核酸杂交技术的历史背景2 1 3 2 核酸杂交的基本原理3 1 3 3 核酸杂交技术的方法5 1 3 4 核酸杂交技术的特点5 1 3 5 核酸杂交技术的应用。5 1 4 生物传感器。6 1 4 1 生物传感器的工作原理6 1 4 2 生物传感器的应用研究6 1 5d n a 生物传感器。7 1 5 1d n a 传感器原理7 1 5 2d n a 传感器的分类7 1 5 3d n a 传感器检测微生物功能基因方面的研究现状8 1 6d n a 电化学传感器8 1 6 1电化学d n a 传感器的原理9 1 6 2d n a 电化学传感器电极修饰方法9 1 7 黄孢原毛平革菌1 1 1 7 1 理化性质1 1 1 7 2 黄孢原毛平革菌在环境中的研究现状1 2 i v 硕士学位论文 1 7 3 黄孢原毛平革菌的应用1 2 1 8 木素过氧化物酶1 2 1 8 1 理化性质。1 2 1 8 2 过氧化物酶催化氧化特点和机理1 3 1 8 3 l i p 同工酶基因分析1 4 1 9 传感技术检测黄孢原毛平革菌木素过氧化物酶编码基因的展望1 4 1 1 0 里氏木霉1 5 1 1 1 实时荧光定量p c r 技术1 5 1 1 1 1 实时荧光定量p c r 定义1 5 1 1 1 2 实时荧光定量p c r 定量原理及检测方法1 6 1 1 2 本论文研究目的及意义1 7 1 1 3 本论文研究的主要内容1 7 第2 章夹心式杂交d n a 传感器检测木素过氧化物酶编码基因1 9 2 1 前言1 9 2 2 实验部分1 9 2 2 1 实验仪器1 9 2 2 2 试剂和溶液2 0 2 2 3 实验方法2 0 2 3 实验结果与分析2 4 2 3 1d n a 提取方法的比较与总结2 4 2 3 2 电泳检测分析。2 5 2 3 3p c r 电泳检查结果2 6 2 3 4 酶切反应电泳检查结果2 6 2 3 5 裸金电极预处理结果2 7 2 3 6 核酸捕获探针固定结果2 7 2 3 7d n a 检测结果与分析2 8 2 3 8 传感器的寿命2 9 2 3 9 传感器再生结果分析2 9 2 4 结论3 0 第3 章竞争式杂交d n a 传感器检测木素过氧化物酶编码基因3 2 3 1 前言3 2 3 2 实验部分3 2 3 2 1 实验仪器3 2 3 2 2 试剂和溶液：3 2 v 生物传感与实时荧光定量技术检测堆肥微生物酶编码基因的研究 3 2 3 实验方法3 2 3 3 实验结果与分析3 4 3 3 1p c r 扩增结果3 5 3 3 2 裸金电极预处理效果。3 5 3 3 3 捕获探针固定情况3 6 3 3 4d n a 检测分析j 。3 7 3 3 5 传感器再生分析。4 0 3 4 结论z 幻 第4 章竞争式杂交d n a 传感器检测纤维二糖水解酶编码基因4 1 4 1 前言4 1 4 2 实验部分4 1 4 2 1 实验仪器4 1 4 2 2 试剂和溶液4 1 4 2 3 实验方法4 2 4 3 实验结果分析。4 2 4 3 1 自组装条件的选择4 2 4 3 2 杂交条件的优化4 3 4 3 3d n a 杂交的循环伏安检测。4 3 4 3 4d n a 杂交的交流阻抗检测。4 4 4 3 5 循环伏安法与交流阻抗法检测结果对比4 6 4 4 结论4 6 第5 章实时荧光定量p c r 检测纤维二糖水解酶编码基因4 8 5 1 前言。4 8 5 2 实验部分。4 8 5 2 1 实验仪器4 8 5 2 2 试剂和溶液。4 8 5 2 3 实验方法4 8 5 3 实验结果与分析。5 0 5 3 1d n a 提取电泳检测分析5 0 5 3 2p c r 电泳检查结果5 0 5 3 3 荧光定量p c r 反应结果5 1 5 4 结论5 1 第6 章结论5 2 参考文献5 4 v l v l l 图2 8 电流跃迁值随d n a 浓度变化的线性图2 9 图2 9 方波伏安法扫描电极3 0 图2 1 0 微分脉冲伏安法扫描电极。3 0 图3 1d n a 竞争式杂交原理。3 4 图3 2p c r 扩增电泳图。3 5 图3 30 5 mh 2 s 0 4 为底液的裸金电极c v 扫描图。3 5 图3 45 m m 铁氰化钾溶液为底液的裸金e i s 图3 6 图3 5 捕获探针固定前后金电极上电阻对比图。3 7 图3 6 不同d n a 检测浓度所得电流时间曲线。3 8 图3 7 电流跃迁值与d n a 检测链浓度线性关系二3 8 图3 8h s d s d n a a u 与捕获探针固定前后电极交流阻抗扫描图。3 9 图3 9d n a 检测浓度对数与阻值线性关系图。3 9 图3 1 0 传感器再生前后及探针固定前后电阻对比图4 0 图4 1 不同杂交时间的电流响应4 3 图4 2 裸金电极( a ) 、s s d n a a u 电极( ”、d s d n a a u 电极( c ) 的循环伏安图。4 4 图4 3 目标d n a 浓度常用对数值和s s d n a a u 电极与d s d n a a u 电极峰电流差值线性 关系4 5 图4 4 裸金电极( a ) 、s s d n a a u 电极( b ) 、d s d n a a u 电极( c ) 的交流阻抗图4 5 图4 5 目标d n a 浓度的常用对数值和电阻值的线性关系4 6 图4 6 循环伏安法与交流阻抗法检测结果对比4 6 图5 1 总d n a 提取琼脂凝胶电泳图5 0 图5 2p c r 电泳图5 1 图5 3c t 值与d n a 初始浓度对数值的线性关系图5 1 v i l l 图图图图图图图图图 硕士学位论文 附表索引 表1 1 黄孢原毛平革菌能够降解的物质1 3 表2 1 捕获探针与响应探针链2 2 表2 2 夹心式杂交机制p c r 引物。2 6 表2 3 传感器回收率3 0 表3 1 竞争式杂交机制p c r 引物设计。3 3 表4 1 用于传感检测的核酸序列4 2 表5 1 荧光定量p c r 反应体系上下游引物4 9 表5 2 荧光定量p c r 反应体系4 9 表5 3 荧光定量p c r 反应条件5 0 i x 硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 真菌基因组d n a 提取的研究现状 由于丝状真菌的细胞壁中含有复杂的多糖物质，所制备的d n a 样品经常会有不同 数量的色素、多糖以及成分不明的胞壁物质，这些物质的存在会直接影响到d n a 样品 的p c r 反应以及限制性酶切等【1 1 。在细胞d n a 提取过程中，真菌较细菌或其他组织细 胞d n a 提取的不同在于其破壁的过程，只有使细胞壁有一定程度的破坏，核酸才能有 效释放。目前存在和使用的丝状真菌染色体d n a 提取方法步骤大体相似，常用的破壁 方法包括氯化苄、液氮冷冻研磨和酶裂解等化学裂解法。核酸分离方法包括酚、氯仿抽 提，以及纯化柱、纯化膜分离法等。 冻融破壁是采用液氮冷冻与室温融化交替处理菌丝体，可使细胞内的d n a 复合物 释放出来，有利于进一步采用萃取、沉淀等手段分离纯化满足实验要求的高质量d n a l 2 1 。 g e n et l e t m 抽提法对真菌细胞壁裂解，提取d n a 完整性好，纯度高，操作步骤简单， 缩短了检验时间，整个过程仅需要约1h 【3 1 。可用试剂盒裂解液进一步裂解，最后通过去 除杂质的d n a 纯化步骤，完成真菌d n a 提取【4 】。 1 2p c r 技术 1 2 1p c r 技术的简介 p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 展o 聚合酶链式反应，又称无细胞分子克隆或特异性 d n a 序列体外引物定向酶促扩增技术【5 1 ，它能把痕量的遗传物质迅速扩增百万倍，并且 无需通过繁琐费时的基因克隆程序，便可以获得足够数量的精确的d n a 拷贝，使原本 无法进行的各种分析检测项目得以实施【6 】，是基因扩增技术的一次重大飞跃。p c r 技术 以其特异性强，灵敏度高和快速准确的优点，被世界各国广泛应用于医学、农业、考古 学等各个领域的基因研究和分析，并形成了巨大的市场同。 1 2 2p c r 技术的原理 p c r 技术的基本原理类似于d n a 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端 互补的寡核苷酸引物1 8 l 。根据己知的待扩增的d n a 片段序列，采用人工的方式合成与 此d n a 两条链末端碱基互补的寡核苷酸引物，在酶促作用下，在体外将待检测的d n a 序列进行扩增。p c r 由双链d n a 的高温变性、引物与模板的退火和适温延伸三个基本 步骤作为一个周期，反复循环，每一循环合成的新链都可作为下一循环中的模板，从而 生物传感与实时荧光定量技术检测堆肥微生物酶编码基因的研究 可迅速扩增特异性d n a 9 1 。高温变性是模板双链d n a 经加热处理一段时间后，d n a 双 链解离成单链模板，以便与引物结合；引物与模板的退火是指引物与模板特异结合的最 佳温度，模板d n a 经加热变性成单链后，体系反应温度降低，使人工合成的寡聚核苷 酸引物与目的d n a 互补配对结合，此温度取决于引物的长度、碱基组成及其在反应成 分中的浓度【1 0 1 ；适温延伸在t a q 酶的最适温度下，以引物3 端为合成的起点，以单核苷 酸为原料，沿模板延伸，合成d n a 新链，新链又可以作为下一次反应的模板，如此反 复进行，每一次循环都使两条人工合成的引物间的d n a 特异区拷贝数扩增一倍，p c r 产物数量得以呈几何级数迅速扩增【1 1 】。 1 2 3p c r 在环境领域的应用 p c r 技术用于定期检测土壤、水和大气环境中的致病菌的种类、数量及变化趋势等， 克服了传统分离培养法费时长的缺陷，而且可以检测难以人工培养的病原菌【1 2 l 。p c r 技术同样应用于检测以及知道基因组结构和功能的基因工程菌，c h a u d r y 等将一工程菌 株接种于经过过滤灭菌的湖水及污水中，定期取样并对提取的样品d n a 进行p c r 扩增， 特异性地扩增其0 3 k bd n a 片段，然后用0 3 k bd n a 方法检测，结果表明接种1 0 d 一 1 4 d 后仍能用p c r 方法检测出该工程菌株。近年p c r 技术发展迅速，在环境微生物领域中 的应用将进一步扩大，特别是在检测水体、土壤中的致病细菌、病毒及指示菌等方面发 挥愈来愈大的作用【1 3 1 。 1 3 核酸杂交技术 1 3 1 核酸杂交技术的历史背景 核酸杂交技术是具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对 原则缔合成异质双链的过程1 1 4 】。核酸杂交技术是h a l l 等人在1 9 6 1 年开展的，探针与靶 序列在溶液中进行杂交，之后再通过平衡密度梯度来离心分离杂交体。此种方法费时而 且检测不够准确，但奠定了核酸杂交技术的基础。n y g a r d 等研究证明硝酸纤维素膜能对 d n a 序列产生特异性吸附，这个发现为将标记过的d n a 或者是r n a 探针固定在硝酸 纤维素膜上进行d n a 序列的检测奠定基础，如b r o w n 等应用这一技术评估了爪蟾r r n a 基因的拷贝数。t h o m a s 研究证明经过广泛意义的变性之后的r n a 也可以非常容易地转 移到硝酸纤维素膜上。在此之后，核酸杂交技术中的固相杂交法得到了深入的研究和应 用，并先后研究出了各种其它的固相载体，比如化学尼龙膜以及活性基团纸等。2 0 世纪 7 0 年代早期许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展，寻求新的探针来源是使分子杂 2 硕士学位论文 交技术进一步推广的基础。8 0 年代早期，d n a 连接酶和核酸内切限制酶的使用促进了 分子克隆技术的发展；不同载体系统相继发现，特别是噬菌体d n a 载体和质粒的构建， 极大地丰富了特异性d n a 探针的来源；c d n a 文库及基因组d n a 文库可使人们得到特 定基因克隆，人们从培养的细菌可提取大量d n a ，并将其用于制备探针；应用核酸自 动合成仪以及固相化学技术，可常规制备1 8 1 0 0 个碱基的d n a 探针，这使得核酸杂 交技术得到飞速的发展。g a l l 等人通过染色体原位杂交技术成功地定位了爪蟾中的多拷 贝顺序，它是以探针直接探测靶分子或靶序列在生物体内的分布状况，这标志着核酸原 位杂交技术的建立。到2 0 世纪9 0 年代，核酸杂交技术在p e r 技术广泛使用的基础上 得到新的突破。 1 3 2 核酸杂交的基本原理 核酸杂交技术是一种发展迅速而且应用很广的分子生物学方法。它是具有一定互补 序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程1 1 5 1 。其利 用核苷酸碱基互补配对形成氢键的原理，将特定的示踪物质标记在一段已知特异性的核 酸分子上，作为探针，在液相或固相中与待测标本中的特异性核酸进行反应，探针与标 本核酸的互补单链经氢键作用而形成双链，此后，通过一定的程序来检测杂交双链的大 小、数量或存在的状态，它具有简便快速、标本取材少、超强特异性、高敏感度及易于 运送等优势。， 核酸分子探针杂交检测技术是以核酸分子的杂交技术为核心的，利用探针分析d n a 序列及片段长度的多态性【1 6 1 。探针是能与特定d n a 序列通过形成氢键发生特异性结合 的已知碱基序列的核酸片段。它可以是短核苷酸片段，也可以是长探针，可以用人工合 成的寡核苷酸链亦或是p c r 的产物，也可以是从r n a 制备的互补d n a ( c d n a ) 探针。 探针既可用非放射性的分子进行标记，同样也可用放射性核苷酸进行标记。这些标记物 可以用末端标记、切刻转移、随机引物或p c r 等方法整合到核苷酸探针的序列中去【1 7 1 。 根据碱基互补配对的原则，被标记之后的核苷酸探针可以斑点印迹杂交以及s o u t h e r n 印 迹杂交等不同杂交方法，然后用其直接检测细胞组织内、固定于膜上或是在溶液中的同 源核酸序列【1 踟。 核酸分子杂交检测方法具有高度的灵敏性以及高度的特异性，使这项技术被广泛地 应用在检测环境中的各种工程菌及指示菌等微生物，并对它们的存在、分布、丰度和适 应性等进行定性和定量分析。核酸杂交技术主要的操作是核酸分子的选择性退火和d n a 链的变性。处于二级结构的r n a 分子或者是双链的d n a 通过变性之后，回复到线性及 3 生物传感与实时荧光定量技术检测堆肥微生物酶编码基因的研究 单链的状态，这种状态能使它们可以与互补的核苷酸链进行退火杂交。r n a 分子通常 是在甲酰胺存在的情况下，通过采用加热的方式使其变性。采用通过高温或碱则可以使 双链d n a 变性1 1 9 1 。外部加入的d n a 或r n a 链与母板d n a 互补或是与母板r n a 序 列互补。事先将外部加入的互补d n a 链标记之后可以将其作为探针，从核酸混合物中 检测到能与之杂交的特定目标核酸序列。杂交实验中所用到的核酸探针可以来自r n a 、 寡核苷酸、d n a 或c d n a 等，通常都是以待检测的核酸序列为基础 2 0 i 。核酸杂交主要 分为固相杂交和液相杂交，通常在溶液中杂交过程进行得比较快，所需要的探针分子的 量也比较少。固相杂交中目标核苷酸序列或探针分子被固定在硝酸纤维素膜或尼龙滤膜 上，其最大好处是可以分析各种不同纯度的核酸，并可以在同一时间处理多个样品，因 此在目前得到广泛应用【2 1 1 。而液相杂交是直接将标记的扩增产物与特殊标记的特异探针 之间呈液相混合，加热使其解链，复性时探针与解链的d n a 竞争结合。可以采用不同 的方法将目标核酸分子转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜等固相支持物上之后进行杂交。杂 交完毕，洗去未杂交的探针，“探针目标核酸”杂交分子便留在支持膜上。如果探针分子 是用非放射性方法标记的，则杂交分子可以通过生物发光、化学发光或显色等方法来进 行检测。如果使用的探针是用同位素来标记的，则杂交分子可以采用放射自显影的技术 来进行检测；核酸杂交实验并不要求探针与目标核酸序列之间完全互补。有限数目的非 互补碱基对的存在是能接受的。退火后，互补的单链核苷酸分子可以经过碱基作用重新 形成核酸双链分子【2 2 1 。因此，通过改变反应的化学和物理环境，从而增加核酸双链分子 生成的速度、程度及其稳定性是可行的。 对互补的核苷酸链进行杂交的过程产生影响的因素主要有：杂交和洗膜的温度、甲 酰胺浓度、杂交时间、碱基对之间非互补的程度、靶核酸序列和探针分子的浓度、长度 和复杂性以及离子强度等。利用r n a 和d n a 探针还可以跟踪、检测环境中特定基因或 d n a 序列及其宿主微生物，因此核酸杂交技术在微生物生态学研究领域具有广泛的应 用前景。杂交在精心控制的条件下进行，随后洗去未杂交的探针，就能得到与已杂交探 针同源的序列，而利用从某一有机体，克隆到的d n a 序列作为探针，可以通过杂交技 术从另外个有机体中，分离到与探针相似，但不完全相同的d n a 序列。从理论上讲， 不同的微生物种群都携带着不同的特殊遗传信息。既然从某个微生物的基因组中，检测 到特定基因是可行的，当然也就能够从众多微生物的基因组混合物中检测到同样的基 因，从而检测到携带有该特定基因的微生物。基于此原理，核酸探针技术已经被人们广 泛地应用在医学中病原微生物的鉴定与检测、环境微生物样品的分析以及释放到环境中 的基因工程微生物的跟踪和监测等。d n a 探针的检测是基于基因型的，因此可以直接 4 硕士学位论文 在环境中检测到重组d n a 或基因工程微生物的存在，而无需分析有关微生物的生长或 重组d n a 所表达的蛋白质。 1 3 3 核酸杂交技术的方法 按环境以及作用的不同，核酸杂交技术大致可分为固相杂交和液相杂交两种。液相 杂交指的是被检测的分子和核酸探针都在液相中发生杂交反应。液相杂交法反应快速、 出现最早以及方法简单，增加了其特异性和敏感性，但检测杂交体比较困难，因此应用 得相对比较少。根据分离与检测杂交体的方法不同可以分为复性速率液相分子杂交法、 羟基磷灰石液相分子杂交法以及s l 核酸酶液相分子杂交法。近些年来又出现一些新的液 相杂交法，比如磁珠液相杂交法、能量传递液相杂交法、链置换液相杂交法等。固相杂 交法则是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上，另一条参加反应的核酸链游 离在溶液中。该法虽杂交速度较慢，但因检测方便而被广泛使用。 1 3 4 核酸杂交技术的特点 核酸杂交技术具有敏感性高、反应速度快以及特异性强等优点，一次可对大批样品 进行检测，而且无需提取病毒d n a ，但其检测灵敏度较p c r 方法低，因为核酸杂交的 方法是直接检测被检对象体内相对较低拷贝数的病毒d n a ，而p c r 方法对病毒d n a 进行t g n 。但用常规p c r 方法检测病毒，易出现假阳性，而核酸杂交方法的阳性结果 与之相比更为可靠【矧。 1 3 5 核酸杂交技术的应用 ( 1 ) 对致病性微生物的检测。大气、水体以及土壤等环境中都存在一定种类和数量的 致病性微生物，某些传染性疾病的流行与这些致病性微生物存在着密切关系，而常规的 分离培养检测费时，且不适宜于检测无法人工培养的病原菌。核酸杂交技术则可克服传 统检测方法的不足。许多细菌的r r n a 基因含有多拷贝的高度保守性d n a 序列，可以 根据这些d n a 序列合成特异性的d n a 探针来检测病原细菌。 ( 2 ) 指示菌的监测。指示细菌的种群消长动态是土壤、水体等环境监测的重要依据之 一。传统的方法一般要花费几天时间，目前采用核酸杂交技术检测指示菌则可以在几小 时内完成。由于与物质分解代谢有关的基因已被克隆，携带有克隆基因的质粒d n a 可 以作为分子探针，用于监测土壤中上述指示菌的种群变化。 ( 3 ) 对遗传工程菌的监测。近年来，随着遗传工程研究的广泛开展出现了许多遗传工 程菌株，它们将不可避免地进入到自然环境中。研究这些遗传工程菌在自然环境中的种 5 生物传感与实时荧光定量技术检测堆肥微生物酶编码基因的研究 群动态及其对环境的影响在理论上和实践上均具有重要意义。由于工程菌株的基因组 d n a 至少是部份已知的，可以有的放矢地设计高度特异性的c d n a 探针进行杂交检测， 核酸杂交技术在这方面具有广阔的应用前景。 ( 4 ) 在特异性微生物分离及基因克隆的应用。土壤及水体等自然环境中含有丰富的微 生物资源，其中某些特异性的微生物具有重大应用价值，如固氮菌、抗重金属细菌及某 些有害物的降解菌等，核酸杂交技术为这些特异性微生物的分离及其基因克隆提供了有 力的手段。综上所述，核酸杂交技术近年来已广泛应用于环境微生物检测中，并展示了 广阔的应用前景。由于它具有特异性强、灵敏度高及快速简便等优点，随着核酸杂交技 术的不断发展与完善，预期在以后几年内其应用将日益广泛和深入，在环境微生物检测 中将发挥愈来愈大的作用【矧。 1 4 生物传感器 生物传感器是- f l 由生物、化学、电子技术等多种学科相互交叉渗透的高新技术， 它是以生物学组件作为其主要的功能性的元件，能够感应到规定的待测量，并且可以按 照一定的规律它其转换成可以识别的信号的装置或器件。已在医学、环境监测、食品等 领域显示出广阔的应用前景，其特点是检测速度快、灵敏度高、能进行在线分析甚至活 体分析、操作简单便捷且能够检测非常微量的污染物f 瑚。 1 4 1 生物传感器的工作原理 生物传感器是将生物识别元件和信号转换元件紧密结合，用于检测生物体内或体外 的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的装置。它以固定化的生物成分 ( 酶、d n a 、蛋白质、抗原、抗体等) 或生物体的本身( 微生物、组织、细胞等) 作为敏感 性的材料。采用各种化学及物理换能器捕捉敏感材料与目标物之间发生的反应，然后将 反应的程度转变为电信号，根据电信号情况可以推算出被测的量大小【2 蚴j 。 1 4 2 生物传感器的应用研究 ( 1 ) 在医学领域中的应用。在医学领域，生物传感器发挥着巨大作用。用生物传感器 进行与人体免疫缺陷病毒有关的短d n a 序列的测定研究，为临床爱滋病检测提供了一 种简便的方法。此外，使用碳糊电极制作的生物传感器采用差示脉冲伏安法检测了肝炎 b 病毒，生物传感器在医学的领域具有广阔的应用前景。 ( 2 ) 在发酵生产中的应用。近十年里有关发酵领域电化学生物传感器的研究极大部分 都是检测在葡萄糖、酒精、乳酸、苹果酸、甘油等在微生物发酵过程中常见反应物和产 6 硕士学位论文 物。采用微生物或酶等作为分子识别元件，利用对分析物的催化分解，可以达到对发酵 生产过程中葡萄糖、甘油等物质的浓度监测的目的。同时，由于发酵工业是大规模的生 产，微生物传感器成本低的特点使其在应用中具有更大的优势。 ( 3 ) 在食品工业中的应用。