（环境工程专业论文）快速、简便测定有机磷农药方法的研究.pdf

快速、简便测定有机磷农药方法的研究 摘要 本文目的是研究一种能够快速、简便测定有机磷农药的方法并对该方法效 果进行测试。根据有机磷农药对酯酶的抑制机理，采用酶法分析捡测有机磷农 药。选择面粉作为酶源，提取了植物酯酶，制成了植物酯酶片；合成了相应的 底物( 2 ，6 二氯靛酚乙醑) ；优选出最佳实验条件；在实验室试制出产品并对该产 品的性能进行了一系列测试；用产品对蔬菜上的有机磷农药进行实际检测。实 验结果表明：所制产品性能稳定，酶片保质期在1 4 个月以上；常用的几种有 机磷农药的检出限在00 4 1 0o m g l 之间；测定快速，一般人员测一次样只 需5 1 0 分钟。 关键词：有机磷农药植物酯酶，底物，酶抑制剂，快速测定 ar e s e a r c h0 1 1t h em e t h o df o rr a p i da n dc o n v e n i e n t d e t e r m i n a t i o no f o r g a n o p h o s p h o r o u s p e s t i c i d e s a b s t r a c t t h ep u r p o s eo ft h i sp a p e ri st os t u d yam e t h o df o rr a p i da n dc o n v e n i e n td e t e r m i n a t i o no fo r g a n o p h o s p h o f o u sp e s t i c i d e s a c c o r d i n g t ot h em e c h a n i s m o f p e s t i c i d e si n h i b i t i o no fe s t e r a s e ，t h ee n z y m e a n a l y s i sm e t h o dw a su s e d f l o u rw a sc h o s e n a st h er e s o u r c eo fe n z y m e t h ep l a n t e s t e r a s ew a se x t r a c t e d ，a n dt h ep l a n t e s t e r a s e t a b l e tw a sm a d et h es u b s t r a t e ，2 ，6 一d i c h l o r o - b e n z e n n o n e i n d o p h e n y i a c e t a t e ，w a s s y n t h e s i z e d t h e o p t i m a lo p e r a t i n g c o n d i t i o no f t h ee x p e r i m e n t sw a sc h o s e n t h e p r o d u c t w a sm a d ea n di t sp r o p e r t i e sw e r et e s t e dt h e p r o d u c t w a sa l s ou s e dt od e t e c to r g a n o p h o s p h o r o u 8p e s t i c i d e so nv e g e t a b l e s 、t h er e s u k ss h o wt h a tt h ep r o d u c t i ss t a b l e t h ee n z y m et a b l e ts h a l lb ev a l i df o ra b o v e1 4m o n t h s t h ed e t e c t i o nl i m i t sr a n g ef r o mo0 4t o10m e g lf o rp e s t i c i d e si nc o m m o nu s e - o n et e s tc a nb ed o n e w i t h i n5 l 0m i n u t e sw i t h o u t a n yi n s t r u m e n t a t i o n k e y w o r do 。g a n o p h o s p h o r o u sp e s t i c i d e s ，p l a n t e s t e r a s e ， s u b s t r a t e e n z y m a t i ci n h i b i t o r ，r a p i dd e t e c t i o n 硕士学位论文 1引言 自从1 9 4 4 年德国化学家施拉德尔( gs c h r a d e r ) 首次发现对硫磷具有强 烈的杀虫性能后，推动了有机磷杀虫剂的合成和它们的生理活性的研究工 乍。 在全世界合成数以万计的有机磷化合物中约有数十种有较好的杀虫效导有 的有机磷化合物还可作为杀菌剂，除草剂。 有机磷杀虫剂的特点是：杀虫力强、残留性低、易被生物体代谢为无害成 分( 磷酸盐) 。它的缺点是对哺乳动物的毒性大，易造成人畜急性中毒【1 】 有关人们因误食含磷农药中毒的事件时有报导。因此，自有机磷农药问世以来 各国在对其检弼、防护、急救上进行了大量的工作。 目前，用于检测有机磷农多芎的方珐很多，大致分为四类气相色谱法、分 光光度法和化学发光法、簿层色谱法、酶分析法。下面简要介绍这几种方法。 1 1 气相色谱法 2 j 气相色谱法在有机磷农药分析中得到广泛应用，关于这方面研究论文非常 多。下面简要介绍这种分析方法： 方法原理：采用极性有机溶剂分三次萃取用带火焰光度检铡器( f p d ) 的气相色谱测定有机磷农药含量。火焰光度检测器对含硫、磷的物质有较高的 选择性当含硫、磷的化合物进入燃烧的火焰中时，将发出一定波长的光，用 适当的滤光片，滤去其它波长的光，然后由光电倍增管将光转变为电信号放大 后记录之。 干扰及消除：当水体中有机物质含量较多萃取时激烈振荡，会产生严重 的乳化现象，影响预处理操作，造成农药损失。添痂适量氯化钠可以避免产生 严重乳化现象，以消除干扰。 适用范围：本方法适用于有机磷农药厂排放的废水和地表水、地下水中乐 果、甲基对硫磷、马拉硫磷和乙基对硫磷等有机磷农药的测定。 碰士学位论文 方法的最小检出浓度( r a g l ) 为：乐果，00 2 ：甲基对硫磷，00 1 ；马拉硫 磷，00 2 ；乙基对硫磷，00 l 。 气相色谱法虽能同时定性定量检出多种有机磷农药，但常用的气相色谱仪 属固定式设备不便于搬动，且样品预处理繁琐，测试时间长。因此，不便于 在野外进行快速应急监测。 近年来，由于商品化分析仪器的迅速发展，小型化、便携式的气桕色谱仪 已研制生产。如p e 公司生产的i o s p l u sp o r t a b l ec - c 型便携式气相色 谱仪，其重量约3 0 磅，大小如一个小提箱。该色谱仪采用p i d 作检测器，检 出限低，操作简单，用户可自己建立分析程序，有外接电源或电池两种供电方 式，适于野外应急监测，但这类仪器价格不菲。 1 2 分光光度法和化学发光法 1 2 1 钼兰比色法6 3 这是最早的检测有机磷化合物的方法之一。有机磷化合物被硫酸或高氯酸 等氧化为正磷酸盐，磷酸根离子和钳酸铵在硫酸溶液中反应生成微红色的磷钼 酸，然后转化为兰色化合物。反应如下： r 、扩骂，0 3 p x 一哪 p o i 一+ ( n n 4 ) d v _ i 。7 0 2 4 _ h 3 p ( m 0 3 u 1 0 0 ) 4j 鸳蓝色 由于这种方法有许多干扰，w e s t 等通过在最后一步加入邻联( 二) 茴香 胺来改进它，从而提高了该方法的灵敏度和选择性。 i 2 2 4 - 4 硝基苄) 吡啶法t 7 “】 b e r c k ，b e n 等人利用该方法在田间快速估铡叶面上和尘中残余有机磷 农药。一个非化学工作人员在3 0 、s o 和9 0 分钟可分别做6 、1 2 、2 4 次试 验，具体操作方法如下： 硕士学位论文 将叶面洗液和尘土用乙烷摹取，置于预先准备好的试管内，试管盛有1 0 0 徽升丙酮，内含l o 4 一( 4 硝基苄) 吡啶和04 草酸。试管在2 5 0 下加热3 分钟，添加25 毫升溶液( 2 0 - o 三乙醇胺的丙酮溶液) 和10 毫升n a ：c o ，溶液 ( 1 2 n a 2 c 0 3 和l5 n a c i 水溶液) ，显色，然后在5 6 0 n m 测定溶液的吸光度。 1 2 3 盐酸邻联茴香胺法【9 】 该法基于敌敌畏、磷胺、久效磷等磷酸烯酯类有机磷农药在过硼酸钠存在 下，可将盐酸邻联茴香胺氧化成有色或有荧光的产物。实验结果表明，该方法 的吸光度与浓度间有很好的线性关系，线性范围宽。敌敌畏的检出灵敏度高于 01 “m l 。但该法缺点是不能检出饱和磷酸酯类有机磷农药。 1 2 4 鲁米谱化学发光法o 】 该方法原理是：在碱性条件下，过硼酸钠将含烯酯类有机磷农药氧化成过 氧磷酸，生成的过氧磷酸在碱性条件下，氧化鲁米诺而发出蓝色化学冷光。在 暗房里，极微量的农药所造成的发光已十分清晰，采用发光测定仪测定，敌敌 畏的灵敏度可达o0 2 g m l 。 该方法具有灵敏度高、重现性好、检测线性范围宽等优点，但只能测定含 有p ( o ) c = c 官能团的有机磷农药或水解后能转化为不饱和烯醑类有机磷农 药如敌百虫。 综上所述，分光光度法和化学发光法检测有机磷过程中必须使用分光光度 计或发光测定仪。且所加试剂较多，有些方法只能测定某一类有机磷农药。这 些缺点使这类方法在野外快速检铡有机磷农药应用中受到限制。 1 - 3 簿层色谱法 簿层色谱法有分离能力强、分析速度快、效果明显等特点，已被广泛地应 用于农药残留量的定性、定最分析。有报道在1 6 分钟内能准确检出甲胺磷农 药“】。 簿层色谱法基本原理是：将有机磷农药样品经萃取浓缩。然后在簿层板上 展开、显色，再将样品斑点的r f 值与标准样的r t 值比较定性分析，并根据斑 点颜色深浅进行定量分析。簿层色谱法一般用的是硅胶板，但不同方法使用的 硕士学位论文 展开剂和显色剂不一样。下面简要介绍几种簿层色谱的展开剂和显色剂。 ( 1 )以正已烷一丙酮( 4 ：1 ) 为展开剂，t o l l e n s 试剂( 1 0 的氨性硝酸银溶 液) 为显色剂，所有的有机磷农药对t o l l e n s 试剂均立即显黑色斑点。该法可 检出低至2 1 - t g 农药 1 “。 ( 2 ) 用已烷一丙酮( 4 。1 ) 作展开剂，用k i 溶液( 2 克碘和4 克k i 在5 0 7 , 醇一浓h c i ( 11 ) 水溶液中) 作显色剂。喷淋风干的簿层板，久效磷在r j = 06 时 呈现明显的紫桃红斑，可检出1 0 p g 久效磷 1 “。 ( 3 )以苯一甲醇( 91 ) 作展开剂， o2 氯化钯溶液作显色剂显色，农药立 即出现黄褐色斑点 1 ”。 ( 4 ) 用氯仿一丙酮( 1 + 1 ) 作展开剂展开样品，再喷0l 溴酚兰一05 硝酸 银溶液使簿层板呈兰色，置室温5 分钟，再喷5 柠檬酸溶液，甲胺磷呈蓝色 斑点背景呈黄色。最低检出量o0 4 l a g 【“】。 ( 5 ) 用乙烷一丙酮一氯n ( 1 5 ：41 ) 作展开剂，四乙撑五胺4 ( 4 硝基苄) 吡啶 或3 , 5 二氯对苯醌氯代亚胺使斑点显色 1 “。 簿层色谱法虽然不需要仪器、操作简单、价格较低，但其必须使用层析缸、 展开剂、显色剂且样品预处理较繁，因此在野外侠速检测有机磷农药中这类 方法的应用受到限制。 l4 酶分析法 由于酶具有高选择性及在低浓度时仍能催化底物反应的能力，所以酶法分 析是目前研究测定有机磷农药最重要的方法之一。其原理基于有机磷农药能强 烈地、迅速地抑制胆碱酯葡致c 髓) ，阻碍胆碱酯酶对底物的正常酶促水解。通 过将正常酶活力与抑制酶活力进行对比就能知道有机磷农药是否存在。目前利 用酶法分析有机磷农药主要有三类方法：生色法、荧光法和电极法。 1 4 1 生色法 生色法是利用底物或底物反应后的产物在可见光范围有吸光性进行分析 的一种方法。它是目前酶法分析有机磷农药中采用最多的方法。在可见光范围 有吸收就意味着可以用目视观察颜色变化而不必借助仪器。有色物质的获得有 4 硕士学位论文 两种途径一直接法和间接法。直接法就是反应前后底物本身有颜色变化，观察 其颜色变化，可知酶是否被抑制。利用直接法，已有报道制威了酶片和底物片 用来分析水中和蔬菜水果中农药残留量6 ”。间接法就是反应前后底 物本身没有颜色变化。但是底物本身或其水解产物却能与第三种物质作用生 色，通过观察颜色变化得知底物是否已被催化水解，从而间接知道酶是否被抑 制。 f 1 ) 靛酚酯( i p a ) 法 ”1 “。“1 这是一种直接法，利用靛酚酯类物质( 包括一系列的取代靛酚酯) 经胆碱 酯酶催化水解、颜色由原来的橙到棕色变为相应的酚阴离子蓝到绿色，若水样 中含有机磷农药，u 酶受到抑制从而颜色变化小或不变色。通过和未受抑制 的酶进行对比，可知是否含有机磷农药。 r 2 ) 硫代乙酰胆碱法 硫代乙酰胆碱( 或硫代丁酰胆碱) 是胆碱酯酶一个极好的底物，被广泛地 应用在胆碱酯酶活性的测定上。该系统具有很高的灵敏度和快速反应的特点 这两个特点使它适于在田间或野外条件下快速测定有机磷农药。 硫代乙酰胆碱法的原理是硫代乙酰胆碱被酶促水解生成硫胆碱，然后用 试剂( 如e l l m a n 试剂或2 , 6 二氯靛酚) 检测硫胆碱中的s h ，从而测得酶的活 性。以2 , 6 二氯靛酚为例，其反应如下： 隅精c 峨s 惫o ：艘p h 70 永蛐c 2 ( c h 3 ) 3 n c l - 1 2 c h 2 s h + 26 二氯靛酚( 蓝色)元色 。 膨 渗a h 声 础叫 州 叫+阡o 务 硕士学位论文 若样品中无有机磷农药则溶液为无色；若样品中有有机磷农药，则酶受到 抑制溶液呈蓝色。根据类似原理，已有报道制成酶片和酶纸条。 1 4 2 荧光法”2 ”2 7 】 利用荧光法测有机磷农药的原理有两种：一是发光细菌在正常生活状态 下体内的荧光素在有氧参与时经荧光酶的作用会产生荧光，当受到有机磷 毒害时，发光减弱减弱程度与毒物的浓度呈线性关系。二是底物水解后产生 荧光性产物。利用第二种原理测试农药的底物大部分是酯类，对于这类酯类有 ( 1 ) 有荧光变化的酯类本身应无荧光，催化水解后生成易于测量的荧光性 产物，其荧光强度可用动力学方法测得并换算成酶活性( 相应为农药i 农度) 。 ( 2 1 有荧光变化的酯类自然水解应当极慢酶促水解快。 一下0 邺谢。 ( 无荧光) ( 强荧光) 对旷p + 岿町d 一些萘酚酯也可以作胆碱酯酶( o - m ) 催化水解的荧光底物，但灵敏度不如 1 4 3 电极法【2 “3 0 1 近年来，随着生命科学和环境科学诸领域的迅速发展，以生物材料为基础 的各种生物传感器的开发应用愈来愈受到关注，酶传感器便是其中之一。目前 利用酶电极法测定有机磷农药的研究开展的较多。下面以丁酰胆碱酯酶为例介 6 硕士学位论文 绍该方法的原理仪器及特点， ( 1 ) 基本原理底物硫代丁酰胆碱碘化物在丁酰胆碱酯酶( b u c h e ) 催化作 用下水解，生成丁酸和硫碱 b u c h e ， c 3 h 7 c o s c h 2 c h 2 n ( c h 3 ) ) i 一+ h 2 0 + c 3 i i 一( ) h + h s c t l 2 c h 2 n ( c h 3 ) 3 硫碱分子中含有电化学活性的巯基一s h ，含一s h 基团化合物在银基汞膜电 极上与金属汞结合生成的硫醇汞盐还原后在硼砂缓冲溶液介质中于05 5 v 电 位处形成可逆还原峰，峰高( 即还原电流大小) 不仅取决于基质溶液和酶的有 效活性，而且与酶反应体系中是否存在酶抑制剂有关，当向酶反应体系中加入 一定浓度的有机磷农药时，峰离降低即还原电流减小，且加入浓度越高还原电 流减小的程度越大。 ( 2 ) 仪器设备主要有示波极谱仪，银基汞膜电极和b u c h e 固定化酶膜， 其中固定化酶膜的制备是关键的一步。 ( 3 ) 该方法特点灵敏度高，可达p p b 级。被测农药摩尔浓度的对数值l g c 在1 0 。3 至1 0 - 6 m o l l 广大范围内具有良好的线性关系，酶膜机械强度大，保存 时阃较长，可达4 5 个月，但其选择性方面还不尽人意。 随着科技的进步，有机磷农药的监测将进一步向自动化，设备小型化方向 发展。以便适应野外快速、简便监测。 本课题的目的是研究一种简便、快速、廉价、不需要任何仪器设备的检测 有机磷农药的方法。该方法除了要能进行野外现场快速检测有机磷农药，还要 适用于家庭日常对蔬菜水果上残留的有机磷农药进行检测，以避免人们因误食 农药而造成中毒。上述四类检测方法，前三类显然不能满足本课题要求因此 本文选用酶分析方法。目前使用的酶法绝大多数应用胆碱酯酶进行分析，但胆 碱酯酶需从动物体中提取，价格较高，提取困难。因此，本文将通过实验选择 合适酶源和底物，达到分析的简便、快速和廉价；试制出成品，使之能尽快服 务社会；同时，通过对产品一系列性能的测定来检验产品的可行性和实用性。 通过大量实验，不仅选择了合适的酶源，合成了相应的底物，优选了实验 硕士学位论文 条件，还在实验室试制出产品，并用该产品对蔬菜进行实际检测，取得较好结 果。 正文共分四部分 第一部分为原理部分。详细论述了酶法分析有机磷农药的原理以及影响酶 法测定的因素。 第二部分为实验部分。通过对酶源的选择和底物的合成确定一种新的检 测有机磷农药的方法。优选了实验条件，试制出产品，并通过对蔬菜表面残留 有机磷农药的实际检测，论证了该方法的实用性。 第三部分为结果与讨论。总结实验结果，讨论方法的可行性和可靠性。 第四部分为结论。对全文作最终总结。 2 原理部分 2 1 有机磷农药的结构与分类 有机磷农药自问世以来就因其杀虫效力高，杀虫范围广而得到广泛应用和 发展。目前，有机磷农药的品种繁多，从结构上来看绝大多数属于磷酸酯和 硫代磷酸酯，少数属于瞵酸酯和磷酰胺酯其结构图如下： ，? 5r o p 圹sr p 譬 磷酸酯 硫代磷酸酯二硫代磷酸砖膦酸酯 磷酰胺酯 目前，我国在蔬菜水果上常用的有机磷农药有敌百虫( 化学名称0 o 一二甲 基一( 2 ，2 ，2 - 三氯- 1 - 羟基) 乙基膦酸酯) 、敌敌畏( 0 ，0 一二甲基0 一( 2 ，2 一二氯) 乙烯 基磷酸酯) 、甲基一1 6 0 5 ( 0 ，0 一二甲基一0 ( 4 一硝基苯基) 硫代磷酸酯) 、乐果 硕士学位论文 ( 0 ，o 一二甲基一s 一科甲基氨基甲酰甲基) 二硫代磷酸酯) 和氧乐果( o ，o 二甲 基s ( n 一甲基氨基甲酰甲基) 硫赶磷酸酯) 。它们的结构式如下： o f f ( c h 3 0 ) 2p o c h = cc h 敌敌畏 oo h l c h 3 0 h p c h cc b 。c h ； o - c o h p - - o - - 【e i ) 】) ， 反应可按假一级动力学处理，农药浓度可视为基本不变，则式( 235 ) 简化为： p 面2 3 0 3 ，g 揣 式中k 。一抑制反应速度常数 f 236 ) 由于所用的酶常常未经精制，所以很难知道它的绝对浓度，但根据酶量与 酶活性成比例关系，式( 236 ) 中的 e 0 】可用正常无农药时的催化水解的酶活性 硕士学位论文 ( a o ) 来表示；( 【e o 】 x ) ，则认为是经抑制后剩余酶的活性( a ) ，故式 ( 236 ) 可写成 盱篙g 等 ”， 在用分光光度法来测定酶的活性时，a o 与a 都可用吸光度值来表示。a ， 为无农药时，酶与底物作用t 时间后，测得的底物水解产物的吸光度值，a 为 酶与农药( 浓度 1 0 】) 共孵温t 时间后，再与底物作用t 时间后而铡得的底物水 解产物的吸光度值。 由于k i 为常数，所以当将t 定为常数时，n i l o 与l g ( a o a ) 成正比。配制一 系列浓度的农药，测其l g ( a o h ) t 以l g ( a o a ) 对( i o 】作图，可得一直线。 酶法定量铡定有机磷农药就是基于上述原理。 2 3 3 影响酶反应的因素 2 331 p h 对酶反应的影响 酶分子有许多酸性、碱性氨基酸的侧链基团，这些基团随着p h 变化处于 不同的解离状态，归纳起来，p h 对酶活性的影响有以下几个方面： ( 1 ) 酸或碱可破坏酶分子空间结构，导致酶活性丧失。这种失活可能是 可逆的，也可能是不可逆的。可逆矢活是当p h 适当改变后，酶的话性可以恢 复。 ( 2 ) 酸或碱可以影响酶活性部位的催化基团的离解状态，使底物不能分 解成产物。 ( 3 ) 酸或碱可以影响酶活性部位的结合基团的离解状态，使底物不能与 之结合。 ( 4 ) 酸或碱可以影响底物的离解状态，使底物不能与酶结合，或结合后 不能得到应有的产物。 ( 5 ) 酸或碱可以影响酶的非活性部位的离解状态，导致酶分子内构象的 变化，影响酶活性部位的三维结构，使酶不能与底物结合。这种影响也有可逆 与不可逆之分。 从上可知酶的作用有一个最合适的p h 范围。如果用酶活力对p h 作图， 硕士学位论文 往往是一种钟罩形的曲线。这里所说的最合适的p h 范围，是综合考虑整个酶 反应，包括酶纯度、底物浓度、种类、缓冲剂种类及抑制剂等。用于酶法分析 含磷农药的乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱水解的最佳p h 值为74 。实际工作中， 采用p h 74 75 之间。 2332 温度对酶促反应的影响 酶活性与温度的关系通常也出现一钟罩形的曲线，有一最佳温度。最佳温 度不是酶的特性常数因为酶反应同化学反应一样，在一定范围内温度升高 反应速度加快。如果温度继续升高。酶将失活，反应速度反而变慢。所以温度 对酶反应的影响，实际上包含了对反应速度的影响及对酶热失活影响。酶热失 活还与p h 、底物浓度等有关。 2333 底物浓度和酶浓度的影响 当底物浓度很高时，常观察到酶反应速度的下降。这种底物抑制，原因是 多样的其中之一是由于弼个或更多的底物分子与酶的一个活性中心结合生 成无效复合物。 至于酶浓度，从理论上说，反应速度应当随酶浓度增加而增加，但酶浓度 很高时，往往不能保持线性关系这不是因为酶活性下降，而是测定上的困难。 3 实验部分 3 1 仪器与药品 仪器：( 1 ) 7 4 0 0 型红外分光光度计上海分析仪器厂 ( 2 ) j a 一2 0 0 3 电子天平( 感度o0 0 1 9 )上海天平仪器厂 ( 3 ) 7 5 l g 分光光度计上海分析仪器厂 ( 4 ) u v v i s 分光光度计东德蔡氏公司 ( 5 ) 7 2 2 光栅分光光度计上海第三分析仪器厂 ( 6 ) 电光分析天平( 分度值0l m g )上海天平仪器厂 ( 7 ) p h s j 一4 型p h 计 上海雷磁仪器厂 4 硕士学位论文 ( 8 ) 电热恒温水浴锅国产 ( 9 ) 7 0 1 1 型电热干燥箱大连干燥箱厂制造 ( 1 0 ) 离心机国产 ( 1 1 ) 振荡器国产 ( 1 2 ) 玻璃仪器若干 药品：( 1 ) 二氧六环( 分析纯)上海试剂三厂 ( 2 ) 氯化钾( 分析纯)西陇化工厂 ( 3 ) 醋酸1 3 一萘酯( 化学纯)上海试剂一厂 ( 4 ) 固兰b 盐( 进口)上海化学试剂站分装厂 ( 5 ) 2 , 6 二氯靛酚钠盐德国 ( 6 ) 乙酸酐( 分析纯)南京化学试剂厂 ( 7 ) 磷酸氢二钠( 分析纯)江苏省连云港市化学试剂厂 ( 8 ) 磷酸二氢钾( 分析纯)南京化学试剂厂 ( 9 ) 面粉( 食用)市售 ( 1 0 ) 五种农药：甲基一1 6 0 5 ( 5 0 )市售 敌百虫( 9 0 )南京农业大学提供 敌敌畏( 9 0 )南京农业大学提供 乐果( 8 5 )南京农业大学提供 氧乐果( 7 0 )南京农业大学提供 3 。2 酶的选择 3 2 1 酶选择原则 适合测定有机磷农药的酶必须具备两个基本条件：a 必须能被有机磷农 药强烈抑制。b 来源广，易提取，价格低。 通过查阅大量文献，目前用于测定有机磷农药的酶有两类：胆碱酯酶和植 物酯酶。胆碱醑酶使用的最多，有马血清酶，鸭血酶等多种。但须从动物体中 提取，取材不便，保存困难，价格较高。为此，本文选用植物酯酶作为酶源。 硕士学位论文 根据文献 3 3 ，植物酯酶中面粉酶的灵敏度最高。因此，选用面粉酶。 3 2 2 酶液的制备 取面粉按l ：5 ( w v ) 比例加蒸馏水在振荡机上振荡3 0 r a i n ，以2 0 0 0 3 0 0 0 转分离心1 0 m i n 。上清液经滤纸过滤后，即为面粉酶贮备液，置冰箱( 4 ) 保存。用前加磷酸盐缓冲液( 1 l5 m 磷酸二氢钾与l 1 5 m 磷酸氢二钠，按 1 4 混台，p h 为74 ) 稀释3 倍，即为面粉酶工作液。 3 2 3 可行性实验 为验证所制酶液是否能被有机磷农药抑制。采用文献 3 3 1 中的显色底物溶 液进行实验。 3231 有关溶液的配制 ( 1 ) 醋酸一1 3 萘酯溶液称取2 5 m g 醋酸b 萘酯溶于2 0 m l 无水乙醇中。 ( 2 ) 固兰b 盐溶液称取1 2 5 m g 固兰b 盐溶于8 0 m l 蒸馏水中。 用前将( 1 ) 和( 2 ) 混合，即为显色底物溶液，颜色为黄色。 ( 3 ) 农药的配制用自来水将敌敌畏、敌百虫、甲基一1 6 0 5 、乐果、 氧乐果稀释成2 0 m g l 的溶液。 3 232 酶受农药抑制实验 实验原理：植物醑酶可以使醋酸8 一萘酯水解成醋酸和萘酚，萘酚与显色剂 固兰b 盐作用形成紫红色的偶氮化合物，从而完成显色反应。反应过程如下： 鼢卜。- - c h 3 + h 2 0 里鼢c h 厂r 乙酸一p 一萘酯 p 一萘酚 乙酸 6 硕士学位论文 管一n 毋n n 】2z n 0 4 2 - 当样品中有农药时若酶不受农药抑制，则溶液颜色应为紫红色：若酶受 农药抑制则醋酸b 萘酯水解将受到影响，水解速度变慢或不水解，故溶液颜 色变成浅红色或仍为黄色。根据这个原理，可用实验证明植物酯酶是否能被有 机磷农药抑制。 实验步骤：取两支试管，一支加l m l 自来水作对照管，另一支加l m l 敌敌 畏溶液作样品管。分别在两管中加入l m l 面粉酶工作液。3 分钟后，各加o5 m l 显色底韧溶液。酶和底物作用3 分钟，对比两臀颜色。 结果判断方法：对照管呈紫红色。若样品管呈黄色或浅红色，与对照管颜 色区别明显，则农药对酶具有抑制作用；若样品管呈紫红色，与对照管颜色无 明显区别，则农药对酶没有抑制作用。 实验现象：对照管呈深红色，样品管呈浅红色，两管颜色区别明显，敌敌 畏对酶具有抑制作用。 用敌百虫，甲基一1 6 0 5 、氧乐果和乐果重复上述实验，现象相同。 由上可知有机磷农药对面粉酶有抑制作用，且面粉酶来源丰富，取材方 便。因此，用面粉作酶源是可行的。 3 3 底物的选择 3 3 1 底物选择原则 所选底彻应具备以下条件a 底彻的自然水解必须十分缓慢，而酶促水 7 慧 硕士学位论文 解却十分迅速。旦酶被农药所抑制，底物的水解慢到几乎观察不到，这最有 利于识别农药的存在。b底物与分解后的产物颜色变化明显，这样有利于用 目视法测有机磷农药。c底物必须具有一定的稳定性，这有利于存贮。 文献 3 3 中植物酯酶的底物为醋酸一b 一萘酯，但该底物分解前后，无 颜色变化，需加呈色剂固兰b 盐制成显色底物溶液，但显色底物溶液很不稳定。 实验证明：显色底物溶液放在室温( 2 5 。c ) 下一天，颜色变红，失效。为此， 选用2 , 6 一二氯靛酚乙酯作底物。但从所查文献看，2 , 6 一二氯靛酚乙酯一酉： 作为胆碱酯酶的底物，其是否能作为植物酯酶的底物，需用实验证明。 3 3 2 2 , 6 一二氯靛酚乙醒的合成 3 321 合成原理 酚上的羟基与醇相似，可与酸酐或酰氯反应生成酯“。2 , 6 一二氯靛酚 钠盐为酚盐它能与酸酐反应生成酯。为此本文用乙酸酐与其反应合成2 , 6 二氯靛酚乙酯。反应如下： 3 32 2 合成步骤 称取21 6 5 克乙酸酐于梨形瓶中，加入5 毫升乙醚和l3 0 4 克2 , 6 一二氯靛 酚钠盐，在3 5 。c 下，水浴加热3 0 分钟。冷却盾，将反应混合物倒进装有2 0 0 克碎冰的烧杯中，充分搅拌15 小时a 过滤，用水冲洗滤物数次，再将滤物倒 进装有5 0 0 毫升水的烧杯中，置于冰箱( 4 。c ) 中1 2 小时后再过滤。所得产 物在空气中干燥，产物为红黑色。 3323 产物的红外光谱分析 分别作2 , 6 一二氯靛酚钠盐和合成产物的红外光谱图，见图331 和图 332 。 呱 卜 心 + 呱吗 。-0 叫 一 蛔 势 硕士学位论文 鬣米( u j 丌) 渍数( c m ) 图33i 2 ，6 一二氯靛酚钠盐红外光谱图 演技( m ) 图332 合成物红外光谱图 硕士学位论文 分析图33l 和图332 ，发现图3 32 比图331 在1 7 6 1 c m 。和1 18 9 c m 1 处多出两个强吸收峰。它们分鄹是乙酰氧基上c = o 伸缩振动和c o c 上 的c o 伸缩振动。这表明反应中，乙酸酐的c ( o ) 一c h 、接到了2 , 6 一 二氯靛酚钠盐上，且合成物的三个主要吸收峰1 7 6 1 c m 1 ( 乙醮氧基上c - o 伸缩振动) ，1 6 7 4 c m 。1 ( 醌上的c = o 伸缩振动) 和1 i8 9 c m 。( c o c 上 的伸缩振动) 和文献 3 5 上合成的2 , 6 一二氯靛酚乙酯的吸收峰基本一致。 因此可以认定，该合成物为2 , 6 一二氯靛酚乙酯。 3 3 3 可行性实验 3331 溶剂的选择 由于2 , 6 一二氯靛酚乙酯几乎不溶于水，因此需要选择一种既能溶解底物 又与水互溶，而且对酶又无显著性抑制作用的有机溶剂。根据文献 2 0 ， 我们选用1 , 4 一二氧六环，配成的底物溶液浓度为l m g m l 。 333 2 酶促底物分解实验 底物的自然分解实验：取2 支试管，一支加2 m l 自来水，另一支加2 m l 磷 酸缓冲液( p h 2 4 ) 。然后各滴2 滴底物溶液，摇匀，溶液呈橙色。此溶液在 室温( 2 8 。c ) 下放置8 小时仍为橙色。重复实验3 次，现象相同。由此可见， 底物的自然分解很慢。 底物的酶促分解实验：取1 支试管，先加入2 m l 酶工作液，再加2 滴底物 溶液。1 分钟后，溶液颜色变为绿色，2 分钟后为浅蓝，3 分钟后为天蓝色。 由此可见，底物的酶促分解很快。 由上可知，本底物在水中自然分解很慢，但其酶促分解很快。 3333底物及其分解产物的最大吸收波长 实验步骤1 ：配制适当浓度的底物溶液，以二氧六环作参比，用u v v i s 分光光度计进行扫描，其可见光区谱图见图333 。另取4 m t 酶工作液，加3 滴底物溶液，5 分钟后，以水作参比，用分光光度计将其光谱图扫描在同一张 图e 。 硕士学位论文 ，一! 三三 图333 底物及其分解产物可见光光谱图 i 一底物分解产物i i 一麻物 一 _ 一 一 一 、， 、u 硕士学位论文 谱图分析：从图333 看，底物的最大吸收波长在4 6 0 n m 左右，底物分解 产物的最大吸收波长在5 9 0 n m 左右，此波长处底物几乎没有吸收。 实验步骤2 ：用7 2 2 光栅分光光度计在不同波长处测底物及其分解产物的 吸光度值。结果见表33l 和表332 表33l 底物最大吸收波长 从表331 和表332 可看出，底物的最大吸收波长为4 5 0 n m ，底物分解产 物最大吸收波长为5 9 0 n m 。 通过上述实验可得出：2 , 6 一二氯靛酚乙酯在自然状态下分解很慢而酶促 反应却很快；分解前后颜色变化很大，由橙- 蓝，其九一之差达1 4 0 n m ，用目 视很容易辨别；和文献【3 3 】中的显色底物溶液相比，不需要再加显色剂，且性 能稳定。因此，用该物质作为面粉酶的底物来测定有机磷农药是可行的。 3 4 实验条件的确定 3 - 4 1 最佳p h 值的选择 3 411 有关溶液的配制 ( 1 ) 磷酸盐缓冲溶液的配制。 按表3 , 41 配制一系列不同p h 值的磷酸盐缓冲溶液。 硕士学位论文 表341 磷酸盐缓冲溶液m p h 1 1 5 mk h 2 p 0 41 1 5m n a 2 h p 0 4 p h 1 15 mk h 2 p 0 41 15m n a 2 h p 0 4 ( m i )( m 1 )( m i )( m i ) 608 80 1 2o741 928 08 6 47 382 627 61 308 70 685 005 0078859 l5 703 906 l08o559 45 ( 2 ) 不同p h 值面粉酶工作液的配制 将面粉酶贮备液按l ：2 的比例用不同p h 磷酸盐缓冲溶液稀释，得到不同 p h 值面粉酶工作液。 ( 3 ) 终止剂的配制 配制终止剂的原因：在酶促反应体系内，只要条件合适，酶促反应总是进 行着。因此，实验操作除了要严格控制加入的酶量，还要控制酶与底物反应时 间。为此，当到达指定反应时间时必须加入终止剂，使酶反应停止，这样底 物分解产物的吸光度值能保持一定值。否则，当反应到达指定时间时，由于酶 反应未停止，底物分解产物仍在增加，其吸光度值也在增加这将给实验测定 带来困难和误差。本文采用的方法是加入高浓度酶抑制剂，将酶全部“杀死” 使酶促反应终止。选用的终止剂为4 克升的敌敌畏。 效果验证：取六支试管加入2 m l 酶工作液( p h 74 ) 和0l m l10 t r i m l 的 底物溶液，摇匀。3 分钟后，各加2 m l 终止剂，摇勾。2 分钟后，每隔5 分钟 取一支试管，在6 0 0 n m 处测其吸光度值。结果见表3 , 42 。 表3 42 加入终止剂后溶液吸光度值随时间的变化 从表34 2 可看出，加入终止剂后，溶液吸光度值在3 0 分钟内基本不变。 硕士学位论文 因此，用高浓度敌敌畏作终止剂是可行的。 3 4l 2 酶的活性与p h 关系 实验步骤：取八支试管t 分别加2 m t 不同p h 值的酶工作液和0l m l 底物 溶液。3 分钟后，各加2 m l 终止剂，摇匀。2 分钟后，在6 0 0 n m 处测吸光度值。 结果见表343 和图3 4i 。 垂! ! ! 堕堕适焦皇巡堕羞墨 巳丝鱼q垒墨鱼璺! 旦z !z 鱼 ! ：!璺：q 吸光度o0 3 1o0 4 2o0 9 801 4 801 9 501 9 301 6 701 4 5 6 u6 ，d758 0 p h 图3 41 酶活力与p h 值关系 通过上述实验，本文选择的最佳p h 值为74 。p h 值通过磷酸盐缓冲液调 节。 磷酸盐缓冲液的配制：1 1 5 mk h 2 p 0 4 和1 1 5m n a 2 i - i p o 。溶液按l ：4 混 合，其口h 值为7 4 。 3 4 2 最佳温度的选择 实验步骤：取3 支试管作平行样。先加2 m l 酶工作液，放在水浴锅中水浴 i o 分钟( 温度3 0 ) ，再各加0l m l 底物溶液( 10 m g m 1 ) ，作用3 分钟后， 加2 m l 终止剂。2 分钟后在6 0 0 r i m 处测吸光度值。改变水浴温度分别在2 0 硕士学位论文 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 。c 、5 0 下，按相同操作步骤，测溶液吸光 度值a 另取一批样放在冰箱( 1 2 ) 中冷却，然后铡其吸光度值。 结果见表344 和图342 表3 44 酶的活性与温度的关系 0 复 o 2 0 0 1 8 捌o ” 篓”一 馨0 1 2 o 图342 酶活力与温度关系 从表3 44 和囹3 , 4 + 2 可看出，酶的活性在3 0 时最大，温度的升高或降 低都会使酶的活性降低。在正常室温( 2 0 3 0 ) 下傲实验，不用水浴加热 也行。 3 4 3 晦和底物作用时间的确定 酶和底物作用时间对实验影响较大。由于酶促反应总是进行，所以作用时 间过长，则未受抑制的酶和受抑制的酶都能将底物分解完，从而无法进行比较 分析；若作用时间过短，则酶只能分解极少数底物，溶液颜色变化不明显，从 硕士学位论文 而影响测定。因此，必须选择一最佳作用时间。 实验步骤取5 支试管分男加入2 m l 酶工作液和0l m l 底物溶液。在室温 3 0 。c 下作用时间分别为1 分钟、2 分钟、3 分钟、5 分钟、i o 分钟后，依次 加入2 m l 终止剂，2 分钟后在6 0 0 n m 处测其吸光度值。 实验现象：1 分钟后溶液仍带橙色；2 分钟后，变为绿色；3 分钟后， 变为天蓝色；5 分钟后，蓝色更深；l o 分钟后，颜色仍为深蓝色。 所测吸光度值见表345 。 表3 45 酶和底物作用时间实验 从表3 45 可看出，酶和底物作用5 分钟后，基本能将底物分解完。因此， 选择酶和底物作用时间为3 分钟左右此时溶液颜色已经变蓝，而底物又未完 全分解。 3 4 4 农药和葺孽作用时间的确定 农药和酶作用时间对实验有一定影响。作用时间短则农药未能有效抑制 酶，从而降低了检测灵敏度：著作用时间过长，又延长了分析时间。因此，必 须选择一最佳作用时间。 实验步骤：取六支试管各吸3o m l 的酶工作液和lo m ll o m g l 敌百虫溶 液，作用不同时间后，依次分别加入0 2m l1o m g m l 底物液，3 分钟后加2o m l 终止剂，2 分钟后在6 0 0 n m 测其吸光度。 结果见表34 6 表3 46 农药和酶作用时间实验 硕士学位论文 从表3 46 可看出农药和酶作用l o 分钟后，对酶抑制比较彻底，但考虑 到实验时间，我们将作用时间定为3 分钟。 通过上述实验，我们将实验条件定为： ( 1 ) p h 值为74 通过1 1 5 m k h 2 p 0 4 和1 1 5 m n a 2 h p 0 4 ( 14 ) 的缓冲溶 液调节。 ( 2 ) 温度为2 0 一3 5 。c ，一般在室温下即可。 ( 3 ) 酶和底物作用时间为3 分钟左右。 ( 4 ) 农药和酶作用时间为3 分钟。 3 5 酶片的制备 3 5 1 酶的固定化 由于酶溶液保存时间短( 酶储备液在冰箱中只能保存l o 天左右) ，不便 储存和运输。为此，须将其固定化，制成酶片。这样既延长了酶的寿命，又便 于储存运输。固定化方法拟采用：滤纸吸附和纸浆片吸附。 3511 滤纸吸附 ( 1 ) 酶片的制作 将中速定量滤纸剪成2 l c m 的纸片，作为酶的吸附物。用面粉酶贮备液 与磷酸盐缓冲液按1 ：l 配成面粉酶液。 将剪好的滤纸片浸泡在酶液中1 0 分钟，取出放在培养皿中自然晾干，即 为滤纸酶片。 ( 2 ) 有效性检验 用试管取2 m l 自来水，放一片滤纸酶片，浸泡3 分钟后取出滤纸酶片。 滴加2 滴底物液2 0 分钟不变色，2 小时后为浅蓝色。 用2 片滤纸酶片，重复实验。2 0 分钟仍不变色，1 小时后开始变色但 不明显。 由此可知，用滤纸吸附酶作酶片，虽能促使底物分解，但由于吸附的酶太 少，催化能力差，底物分解时间长，没有实用价值。 硕士学位论文 3512 纸浆片吸附 ( 1 ) 酶片制作 用纸浆压成厚2 3 m m ，致密的纸片。将纸片浸泡在酶液( 酶的贮备液 磷酸盐缓冲液= 1 ：1 ) 中15 分钟左右，取出放在培养皿上自然晾干，即为纸浆 片酶片。 ( 2 ) 有效1 生检验 用试管取2 m l 自来水，放片纸浆片酶片( o5 o5 c m ) ，浸泡3 分钟， 中间振荡数次，然后加2 滴底物液，5 分钟后溶液为浅蓝色。 由此可知，用纸浆片吸附酶作酶片吸附量增大，催化底物能力较强，效 果较好。 采用滤纸固定酶的方法，由于酶的吸附量小，催化能力差，故没有实用价 值。而采用纸浆片吸附酶作酶片，由于酶的吸附量增大，催化底物能力增强， 效果较好。故本文采用纸浆片吸附面粉酶作酶片，下文中将纸浆片酶片简称为 酶片。 3 5 2 酶片量的选取 实验步骤按上节制备纸浆片酶片的方法制成一块大的酶片，然后将酶片 剪成边长分别为o3 c m ，o4 c m ，o5 c m 06 c m ，07 c m 和lo c m 大小不一 的正方形酶片。将这6 个酶片分别加到6 支装有2 m l 自来水的试管中，浸泡3 分钟，中间振荡数次。滴加2 滴底物溶液，观察颜色变化。现象见表351 表351 不同面积酶片催化能力实验 颈士学位论文 从表351 可看出，1 ，2 ，3 ，4 号吸附的酶量较小，变色慢；5 号量 适中，3 分钟时能将溶液变为蓝色；6 号量较大变色太快，且纸片面积大 使用不方便。因此，5 号酶片较合适。 3 5 3 酶片的稳定性 3531酶片失活的动力学方程推导 3 7 - 3 9 1 ( 1 ) 实验原理 通过研究酶片的失活率和时间的关系，从而推导出酶片失活的动力学方 程。但由于酶片在常温下非常稳定，其失活程度难以测定。因此，需在较高温 度下加快其失活速度，缩短测定时间。本文所选温度为8 0 。 酶片的活性用在一定时间内酶片促底物水解产物的吸光度值来表示。设未 失活的酶片活性为10 0 ，烘过一段时间后酶的活性为e ，则： e ：尘1 0 0 ( 351 ) a i j a 一失活的酶片测得的吸光度值。 一未失活的酶片铡得的吸光度值。 ( 2 ) 实验步骤与结果 a 取一批酶片放在烘箱中在8 0 _ + 1 下，连续烘9 5 小时，期间每隔2 4 小 时取四片酶片测其活性。 b 酶片活性的测定：吸2 m l 水加到试管中