（环境工程专业论文）硫酸软骨素的提取和纯化方法的研究.pdf

江苏大学硕士毕业论文 摘要 硫酸软骨素是一种酸性粘多糖，通常以糖蛋白的形式存在于动物体内，是由氨基已 糖和葡萄糖醛酸为基本单元构成的聚合体。硫酸软骨素具有调节免疫和脂类代谢、预防 感染和心血管疾病等多种生理作用，在医药、食品、化妆品等领域应用前景广泛。 分子印迹是指一种可以合成对指定分子具有专一性识别位点的聚合物的技术。分子 印迹技术的基本原理是将需要印迹的模板分子与功能单体、交联剂溶于溶剂中，通过聚 合反应形成复合物，洗脱除去模板分子，得到记录模板分子构型空穴的刚性聚合物，且 功能基在立体空穴中的排布上与目标分子具有互补的结构，因此对模板分子有着选择性 和吸附能力被广泛应用于分离过程( 包括色谱分离、毛细管电色谱分离、膜分析与固相 萃取) 、生物传感器、人工模拟抗体、模拟酶催化等领域。 论文研究了采用微波萃取法提取复方硫酸软骨素片中的c h s - c ，以c h s - c 的提取率 为考察指标，在单因素试验基础上进行正交试验，确定微波萃取最佳条件。微波萃取最 佳条件为：萃取功率为5 9 5w ，浸提时间9 0s ，固液比为1 ：7 5 。在此条件下，提取率 可达4 1 。以高效液相色谱法为测定方法，在流动相为乙腈一0 5 磷酸一异丙醇，检测波 长2 0 9r i m ，柱温4 0 ，样品中c h s a 和c h s c 组分分离良好，峰型较为对称。 本文采用硫酸软骨素作为模板分子，以丙烯酰胺( a m ) 为功能单体，二甲基丙烯酸 乙二醇酯( e d g m a ) 为交联剂，其物质的量之比为1 n ：4 ：2 0 ( n = 6 0 ) ，以乙睛水( 8 5 ： 1 5 ) 为溶剂、偶氮二异丁睛( a i b n ) 为引发剂，采用6 0 加热聚合的方法，制备出吸附 性能良好的硫酸软骨素印迹分子聚合物m i p s 。通过红外和紫外光谱和透射电镜分析，表 征印迹聚合物结构和反应机理。 论文研究了乙醇沉淀法和分子印迹法纯化硫酸软骨素的效果。可知，乙醇沉淀法中 当硫酸软骨素粗体物溶液的固形物浓度为1 8 ( w v ) 、n a c l 浓度为3 ( w v ) 、p h 为 6 4 、醇沉体系的乙醇浓度为7 0 ( v v ) ，重复沉淀4 次时，纯化物的葡萄糖醛酸含量可 达4 4 3 ( w w ) ，硫酸软骨素得率为4 5 ( w w ) 。 分子印迹法对纯化硫酸软骨素具有很好的选择性和较高的吸附和解吸性能。通过对 其吸附等温线、吸附时间、溶液浓度曲线和s c a t c h a r d 方程评价分析得知：硫酸软骨素 溶液浓度2 5 m g m l ，4 0 。c 恒温反应时间7 8 h 时，吸附效果较好。表明在m 口中主要存 在着两类不同能量的结合位点。根据s c a t c h a r d 方程分别计算出来两类结合位点的离解 江苏大学硕士毕业论文 常数k d 和最大表观结合量q 衄。对于高能结合位点，l 【d 。和q 咖。分别为9 5 8 1 0 4 m o l l 和6 6 71 埘o l g ；对于低能结合位点，k 和q 邮。分别为5 3 8 x1 0 。3m o l l 和2 5 8 7g n o l g 。 与传统的乙醇沉淀法相比较，分子印迹法可以具有高度选择性和亲和性，聚合物制 备过程简单、配套、大大缩短了预处理时间，减少了溶剂的大量使用和暴露，符合绿色 化学的原则，易于与其他技术一起联用，实现自动化在线分析。 关键词：硫酸软骨素， 微波萃取，乙醇沉淀法，分子印迹技术 江苏大学硕士毕业论文 a b s t r a c t c h o n d r o i t i ns u l f a t e ，r e l a t i v em o l e c u l a rm a s sf r o m1 0 ，0 0 0 dt o5 0 ，0 0 0 d ，i sa l la c i d i c p o l y s a c c h a r i d ec o m p o s e do f d i s a c c h a r i d eu n i t so fg l u c u r o n i ca c i da n da m i n o h e x o s e c h o n d r o i t i ns u l f a t ed i s t r i b u t i n gi nv a r i o u sa n i m a lt i s s u e sh a sb e e np r o v e nt op o s s e sv a r i o u s b i o l o g i c a la c t i v i t i e ss u c h 弱a d j u s t i n gi m m u n i t ya n df a tm e t a b o l i s m ，p r e v e n t i n gi n f e c t i o n ， r e d u c i n gt h er i s ko fh e a r td i s e a s e s t h e r e f o r e ，e h o n d r o i t i ns u l f a t eh a sg r e a ta p p l i c a t i o n p o t e n t i a l si nf i e l d so ff o o d ，m e d i c i n ea n dc o s m e t i c m o l e c u l a ri m p r i n t i n gi san e wa n dp o t e n t i a ls e p a r a t i o nt e c h n i q u ef o rp r e p a r i n g s p e c i a l i z e dr e c o g n i t i o nc h r o m a t o g r a p h ym e d i a t h ep r o c e s so ft h ep r e p a r a t i o nc o n s i s t so f ：( 1 ) m i x i n gt h et e m p l a t em o l e c u l e sw i t hm o n o m e r sw i t ha p p r o p r i a t ef u n c t i o n a lg r o u p s ，( 2 ) l o w t e m p e r a t u r ea n dp h o t op o l y m e r i z a t i o n ，a n d ( 3 ) e x t r a c t i n gt h et e m p l a t em o l e c u l e sf r o mt h e p o l y m e r ，w h i c hl e a v e sc a v i t i e si n s i d et h ep o l y m e r st h a ta r ec o m p l e m e n t a r yi nt e r m s o fs i z e ， s h a p e ，a n df u n c t i o n a lg r o u po r i e n t a t i o nt ot h o s eo ft h et e m p l a t em o l e c u l e s t h et e c h n i q u eh a s b e e na p p l i e dw i d e l yi ne n a n t i o s e l e c t i v es e p a r a t i o nf o rav a r i e t yo fm o l e c u l e s ，s u c ha sa m i n o a c i d sa n dt h e i rd e r i v a t i v e s ，f r e es u g a r s ，a n dr a c e m i cd r u g s i nt h i st h e s i s ，c h i r a ls e p a r a t i o no f d r u g sa n dp r e p a r a t i o no fp u e r a r i au s i n gm o l e c u l a ri m p r i n t i n ga n di m p r i n t i n go fp r o t e i nw e r e s t u d i e d m o l e c u l a ri m p r i n t i n ga f f m i t ym o d e lw a se s t a b l i s h e d ，a n du t i l i z e dt od e s c r i p t q u a n t i f i c a t i o n a l l yi m p r i n t e ds e p a r a t i o n am i c r o w a v e i - i p l cm e t h o dw a se s t a b l i s h e df o re x t r a c ta n dd e t e r m i n a t i o nt l l ec h s ci n c o m p o u n dc h o n d r o i t i ns u l f a t et a b l e t s ，t a k e nt h ec h s - ce x t r a c t i o nr a t e 觞t h ei n s p e c t i o nt a r g e t c a r r i e do nt h eo r t h o g o n a lt e s tb a s e do ns i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ，a n dd e f m i t e de x t r a c t i o n o p t i m u m c o n d i t i o n t h e o p t i m a l e x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e ：m i c r o w a v e p o w e r 5 9 5 w , e x t r a c t i n gt i m e6 0 s ，t h er a t i oo fs o l i da n dl i q u i d1 ：7 5 i nt h i sc o n d i t i o nt h ee x t r a c t i o n r a t eo fc h o n d r o i t i ns u l f a t ecw a s4 1 ac 1 8c o l u m nw a su s e d , w i t ht h em o b i l ep h a s eo f ， a c e t o n i t r i l e 一0 5 p h o s p h o r i ca c i d - i s o p r o p y la l c o h o l ( 1 5 ：8 5 ：1 ) ，a tt h ed e t e r m i n a t i o nw a v e l e n g t ho f2 1 0 n m ，a n dc o l u m nt e m p e r a t u r e4 0 0 c m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u ea n de t h a n o lp r e c i p i t a t i o nw e r ea p p l i e dt o p u r i f y c h o n d r o i n t i ns u l f a t e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h em e t h o dh a dh i g h e re x t r a c t i o nr a t ea tp h6 4 ， t h en a c id e n s i t yw a s3 ( w v ) ，s o l i dc o n t e n td e n s i t yw a s l 8 ( w v ) w i t h7 0 ( v v ) e t h a n o l s o l u t i o n t h er e s u l t ss h o w dt h a tt h ey i e l do fc h o n d r o i t i ns u l f a t ew a s4 5 ( w w ) a n dt h e 江苏大学硕士毕业论文 g l u c u r o n i ca c i dc o n t e n ti nt h ee x t r a c tw a s4 4 3 ( w w ) t h e i m p r i n t e dp o l y m e rw a sp r e p a r e db yb u l kp o l y m e r i z a t i o nu s i n gc h s a st e m p l a t e ，a m a st h ef u n c t i o n a lm o n o m e r t h em o l a rr a t i oo ft e m p l a t e ，f u n c t i o n a lm o n o m e ra n dc r o s s - l i n k e r w a g1 n ：4 ：2 0 ( n = 6 0 ) e g d m aw a st h ec r o s s l i n k i n gm o n o m e ra n da i b nw a st h ei n i t i a t o r t h e p r e p o l y m e r i z a t i o nm i x t u r ew a sd i s s o l v e di na c e t o n i t r i l e w a t e r ( 8 5 ：1 5 ) t h em i x t u r ew a sp u t i n t oaw a t e rb a t ha t6 0 。cf o r2 4ha n df m a l l yt u r n e di n t ob u l km mb u l km 口w e r eg r o u n d a n ds i e v e dt h r o u g h1 0 0 u ms i e v e s ，a n dw a s h e dw i t hm e t h a n o l w a t e r ( 1 ：4 ) t or e m o v et e m p l a t e m o l e c u l a rc o m p l e t e l ya n dd r i e da t6 0 c _ a c c o r d i n gt ot h ei ra n du vs p e c t r u m ，t h eb e s t m o l a rr a t i oo ft e m p l a t ea n df u n c t i o n a lm o n o m e rw a s1 n ：4 ( n = 6 0 ) d i f f e r e n ts o l v e n t sw e r e e x a m i n e d ，w h i c hs h o w e dt h a tm e c h a n i s mc a p a b i l i t yo fm 口p r e p a r e db ya c e t o n i t r i l e w a t e r ( 8 5 ：1 5 ) w a sb e t t e rt h a nt h a tp r e p a r e db ym e t h a n o l w a t e r t h er e c o g n i t i o no fm 口w a se s t i m a t e db ys c a t c h a r de q u a t i o n ，w h i c hw a su s u a l l yu s e d s h o w e dt h a tm i ph a dt w ok i n d so fd i f f e r e n te n e r yb i n d i n gs i t e s a c c o r d i n gt ot h es l o p ea n d i n t e r c e p to ft h es t r a i g h tl i n e ，c a l c u l a t e dt h e d i s s o c i a t i o nc o n s t a n t s ( k d ) a n dq m 艇o fe v e r y b i n d i n gs i t e s k d la n dq m 舡1w e r e9 5 8 x 1 0 - 4 m o l la n d6 6 7 1 x m o l gr e s p e c t i v e l ya st o h i g h e s tb i n d i n gs i t e w h i l ek d la n dq m x lw e r e5 3 8 x 1 0 - 3 m o l la n d2 5 8 7 - t m o l g r e s p e c t i v e l y 舔t ol o w e s tb i n d i n gs i t e c o m p a r e dw i t he t h a n o lp r e c i p i t a t i o n ，t h eh i g hs e l e c t i v i t ya n dt h ee n d o p h i l i c i t yo ft h e m i p sm a yd e c i d ei t ss e l e c t i v i 哆i na d v a n c e t h ep r e p a r a t i o no fm i p sw a ss i m p l e ，f a s ta n d n e c e s s a r y , i tc a n r e d u c e dt h ep r e t r e a t m e n tt i m e ，t h ec o n s u m ea n dt h ee x p o s i t i o no ft h eo r g a n i c s o l v e n tg r e a t l y , a n dc o n f o r mt ot h eg r e e nc h e m i s t r yp r i n c i p l e ；i tc a nu s ew i t ho t h e rt e c h n i c a l a s s o c i a t i o na n dr e a l i z et h ea u t o m a t e do n l i n ea n a l y s i s k e yw o r d s ：c h o n d r o i t i ns u l f a t e ，m i c r o w a v ee x t r a c t ，e t h a n o lp r e c i p i t a t i o n ，m o l e c u l a r i m p r i n t i n gt e c h n i q u e i v 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容以外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：嗽殳 日期：椤7 牟占月 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密囱。 学位论文作者签名：嗽爱指导教师签名： 砷c i 年5 其| | b2 研年6 只 江苏大学硕士毕业论文 1 1 硫酸软骨素的研究概况 1 1 1 硫酸软骨素的来源 第一章绪论 硫酸软骨素( c h o n d r o i t i ns u l f a t e ，c h s ) 是从动物喉骨、鼻软骨、气管等富含硫 酸软骨素的软骨组织中提取的黏多糖，属生物高分子化合物【蚴。根据其化学结构的不同， 硫酸软骨素可分为硫酸软骨素a 、硫酸软骨素b 、硫酸软骨素c 和硫酸软骨素d 硫酸 软骨素e 等多种类型。不同动物体内所存在的硫酸软骨素类型不同，猪、牛、羊的喉骨、 鼻骨和关节骨中主要含有硫酸软骨素a ，鲨鱼、乌贼等海洋动物的软骨中主要含有硫酸 软骨素c 【3 】。 1 1 2 硫酸软骨素的化学结构 硫酸软骨素是由d 一葡萄糖醛酸和n 一乙酰- d - 氨基半乳糖交替连接而成的双糖聚合 物，通常含有5 0 - 7 0 个双糖分子，分子量大约在1 0 0 0 0 - 5 0 0 0 0 d 之间嗍。根据硫酸酯在 4 ( a 型) 或6 ( c 型) 位的位置不同。硫酸软骨素可分为硫酸软骨素a 、硫酸软骨素b 、 硫酸软骨素c 、硫酸软骨素d 等多种类型。其结构式如下图1 1 所示1 6 l 。 r i - s o ，。 r l _ s o j r 1 = h r - = h r l = s o ，” r ，= h r fh r _ = s 0 3 r ：= s 0 3 ” r 产s o 】1 o 硫酸软骨索a 硫瞍软骨索b ( c s 肄构化) 硫陵软骨崇c 硫艘软骨桑d 硫酸软骨索e 图1 1 不同化学结构的硫酸软骨素 f i g1 1 d i f f e r e n tc h e m i c a ls t r u c t u r ec h o n d r o i t i ns u l f a t e 1 h h h 义 h = 矧 | l = = 舻 酽 舻 胪 胪 江苏大学硕士毕业论文 1 1 3 硫酸软骨素的物理性质 硫酸软骨素为白色或微黄色粉末口1 ，由于其分子结构中带有羟基、羧基、硫酸基等 极性基团，故具有较强的吸湿性、易溶于水、难溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和 冰醋酸等有机溶剂阳j 钊。硫酸软骨素的水溶液呈粘稠性，在强酸、强碱及高温条件下易降 解为分子量较小的低聚糖，导致溶液粘度下降n 训。硫酸软骨素成盐后对热较稳定，8 0 c 亦不被破坏。不同化学结构的硫酸软骨素旋光度不同，见表1 1 1 。 表1 1 硫酸软骨素的旋光度 t a b l e1 1o p t i c a lr o t a t i o n so fc h o n d r o i t i ns u l f a t e 1 1 4 硫酸软骨素的化学性质 多数硫酸软骨素含有- s o 。h 和一c 0 0 h 等基团，是一种聚阴离子的高分子化合物，易于 n a + 、k + 、c a 2 + 、m 9 2 + 等阳离子结合【1 2 ，1 3 1 。 1 ) 还原性 硫酸软骨素含有半缩醛基，具有还原性，可将碱性酒石酸铜溶液中的c u 2 + 还原成红色的氧化亚铜【1 4 1 。 c o o n a 午o o n a 咖严curcooh+2篇+2cuohcho l _ i 卜 +厶l t n i t， i 丫n 1 如o k c o o k 2 江苏大学硕士毕业论文 2 ) 降解反应 硫酸软骨素在中性低温条件下较为稳定，而在高温强酸条件下易发生降解 反应，使其分子量降低f 1 5 】。硫酸软骨素也可以在硫酸软骨素裂解酶a b c 或硫酸软骨素 裂解酶b 等的作用下发生降解【1 6 1 。 3 ) 沉淀反应 硫酸软骨素含有的硫酸基可与b a 2 + 离子发生沉淀反应，沉淀物( b a s 0 4 ) 在 盐酸或硝酸中均不溶斛1 7 1 。 硫酸软骨素可以与苯肼在一定条件下反应生成糖脎【堋。 i 岫 rc(2ho r c - n n h 一 l 一x 一 h r c o + 30 一r c - + 5 ) 显色反应 ( 1 ) q 一萘酚试验将硫酸软骨素与q 一萘酚的混合溶液中加入浓硫酸，有紫色化合物 生成。其反应机理是硫酸软骨素先于浓硫酸反应生成糠醛或糠醛的衍生物，然后 再与q 一萘酚缩合生成紫色的缩合物【1 9 1 。 ( 2 )巴弗试验硫酸软骨素与巴弗试剂( 醋酸和醋酸铜的缓冲溶液) 的混合液与沸水 浴中反应，可析出红色的沉淀物刚。 c h o f o o h i + 2 c u a c 2 + h 2 0_ r ic h o h + 2 c u 2 0 + 4h a c ( 3 ) 间苯三酚试验硫酸软骨素与盐酸的混合液与沸水浴中反应生成物( 半乳糖醛酸) 与间苯三酚发生缩聚反应，生成粉红色的多环二芳基甲烷【2 1 1 。 3 严0 江苏大学硕士毕业论文 ( 4 ) 过碘酸试验一定条件下，硫酸软骨素与过碘酸可发生氧化还原反应。硫酸软骨 素的碳一碳键断裂并生成羧酸，而过碘酸被还原成碘酸。当反应溶液中加入硝酸 银时可生成白色的碘酸银沉淀【1 戤。 r c h ，o f l + h 1 0 4 + h 2 0 一r c h o + 2 r c o o h + 4 h 1 0 3 r c o h i o3 + a g n 0 3 _ a g l 0 3 + h n 0 3 ( 5 ) 对甲苯胺醋酸盐试验硫酸软骨素加热或与热磷酸反应后，生成的糠醛或糠醛衍 生物可与对甲苯胺醋酸盐反应生成红色化合物【她捌。 习_ 一o ，坚c 咛。冀ht 一。一， h o 多一叫。n 一夕一明，一c 咛一夕一妇幽= n 一删。n 一毽夕一叫， 1 1 5 硫酸软骨素的生理活性 硫酸软骨素具有调节机体免疫、预防细菌或病毒感染、抗凝血、抗血栓、激活脂蛋 白酶、调节机体脂类代谢和保持血管壁弹性等生物活性【矧。 ( 1 ) 预防动脉粥样硬化 硫酸软骨素可减缓动脉粥样硬化过程，其原理为硫酸软骨素能与血浆脂蛋白结合形 成复合物，从而降低血管壁通透性，阻止或限制大分子脂蛋白的渗入【2 4 1 。 ( 2 ) 降低血脂 硫酸软骨素具有降低胆固醇和甘油三脂的作用，其机理为硫酸软骨素能增强 毛细血管内某些脂酶的活性并促进该酶的释放，使甘油三酯降解为脂肪酬2 5 捌。 ( 3 ) 抗炎作用 硫酸软骨素对心肌、主动脉等的结缔组织具有明显的抗炎作用，其原理为硫酸软骨 素的阴离子能与炎性递质( 如组胺、5 一羟色胺、缓激肽等) 结合【明。 ( 4 ) 神经元的保护和修复作用 4 江苏大学硕士毕业论文 硫酸软骨素可减弱1 3 一淀粉样蛋白对海马神经元的破坏作用闭。c s p g 对酪氨酸诱 导的神经细胞死亡过程有延长和保护作用。经对此受体相关性酪氨酸磷酸化酶样作用， 可分解或降解酪氨酸，防止其对神经细胞的破坏作用【捌。 1 1 6 硫酸软骨素的应用 ( 1 ) 医学 ( a ) 治疗风湿病和关节炎 硫酸软骨素作为风湿病、关节炎、肩周炎、腰痛、神经痛、偏头痛等的治疗药物具 有很好的效果，其机理为硫酸软骨素可直接补充软骨的基质成分、减轻软骨成分的降解、 促进软骨细胞的代谢、恢复软骨细胞基质分泌功能、抑制关节内多种胶原酶的活性【3 0 1 。 ( b ) 防治动脉硬化的血栓 硫酸软骨素a 可用于治疗高血脂症，其机理为硫酸软骨素可防止由脂蛋白酶活性引 起的脂质沉着及血栓的形成。硫酸软骨素a 还可以通过降低血清胆固醇来治疗心绞痛等 疾病。 ( c ) 保存角膜 浓度为2 ( w v ) 的硫酸软骨素保存液能保持角膜内皮活性达1 4 天，而不含硫酸软 骨素的保存液只能保持7 天【3 1 1 。硫酸软骨素的存在可维持角膜的渗透性，使其形状保持 不变。此外，硫酸软骨素可抑制角膜内皮的脂类物质发生过氧化反应，使角膜得到更好 的修复和促进细胞的分裂，维持细胞内皮的活性【3 绷1 。 ( d ) 其他 硫酸软骨素可用于治疗肾炎，其原理是通过降低血清中的甘油三酯和改变脂质代 谢，促进肾损伤组织的修复【3 6 l 。硫酸软骨素用于解毒、镇痛及肝病、梅尼埃尔氏病等的 治疗方面效果也比较理想【3 7 】。 ( 2 ) 食品 添加于食品中的硫酸软骨素具有增强肉制品的持水性、保持肉的柔嫩性、掩盖异味、 防止褐变、改善其风味、口感及光泽度等作用p 8 】。硫酸软骨素与其他物质( 如苯丙氨酸、 5 江苏大学硕士毕业论文 v 小v 嘶、v 等) 调配可制成止痛膳食【3 9 1 。 ( 3 ) 化妆品 添加硫酸软骨素的化妆品具有强化结缔组织、扩张末端血管、促进营养吸收和废物 排除、改善皮肤细胞代谢和保持皮肤水分等作用【删。 1 1 7 硫酸软骨素的提取和检测 ( 1 ) 硫酸软骨素的提取 硫酸软骨素的提取通常采用中性盐法、碱法、碱一酶法、碱盐法等。中性盐法多采 用k c i 或n a c l 等溶液作为浸提液，其原理是在一定的离子强度下，软骨中的蛋白质与 硫酸软骨素发生分离而沉淀。碱法多采用不同浓度的n a o h 、k o h 、k ：c o 。等溶液作为浸提 液，其原理是连接硫酸软骨素与蛋白质的卜糖苷键在强碱作用下发生1 3 一消去反应， 使糖一肽键断裂，硫酸软骨素从蛋白多糖中释放出来，卜糖苷键上连接的羟基氨基酸 分别转化为相应的酮酸1 4 1 1 。酶法多采用胰酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、v 8 蛋白酶、肌 动蛋白酶、链霉菌蛋白酶等提取硫酸软骨素【4 2 l 。碱盐法可避免强碱条件下硫酸软骨素的 降解，其原理为稀碱条件下蛋白多糖可发生卜糖苷键的断裂，使硫酸软骨素释放，同 时一定的离子强度可使蛋白质沉淀析出【4 3 1 。 ( 2 ) 硫酸软骨素的纯化 ( a ) 溶剂法 溶剂法是指在混合组分的溶液中利用软骨中不同化学成分的溶解性差异，而将硫酸 软骨素与其他杂质相互分离的纯化方法。硫酸软骨素含有的硫酸基、羟基和羟基亲水性 基团，使其易溶于水，不溶于乙醇、甲醇、丙醇等有机溶剂。马淑涛等调节硫酸软骨素 溶液p h 为5 0 - 6 0 后加入氯化钠至其浓度为1 5 ( m v ) ，再加入乙醇至其浓度为6 0 7 0 ，可得到纯度为7 0 7 8 的硫酸软骨烈钥。采用甲醇和丙醇也可以得到同样的效果 【4 8 l 。 ( b ) 季铵盐沉淀法 硫酸软骨素在溶液中以聚阴离子形式存在。与季铵盐化合物( 如溴化十六烷基三甲 铵或氯化十六烷基吡啶等) 可形成水溶性很小的季铵盐络合物。这些络合物在低离子强 6 江苏大学硕士毕业论文 度的水溶液中不溶解，但当其增大到临界离子强度时，可发生解离并溶解，利用该性质可 使硫酸软骨素得到纯化【4 9 】。该纯化法一般需要控制硫酸软骨素的浓度为0 1 - 1 o ( m v ) ， 浓度过高，会使季铵盐化合物与其中的杂质发生沉淀反j 立【则。 ( c ) 超滤膜法 超滤膜法是利用滤膜孔径的不同使硫酸软骨素与其它非多糖类杂质分开，而得到分 子量分布范围较窄且纯度较高的硫酸软骨素的方法。采用稀碱浓盐提取猪喉、气管软骨 和鼻软骨组织，并采用相对分子质量为1 0 0 0 0 的切向流超滤膜进行超滤，超滤后含量提高 1 0 个百分点以上，达9 8 ，产品质量均一、色泽好【5 1 1 。 ( m 离子交换色谱法 离子交换色谱法是依靠库仑力的作用将物质吸附在交换剂上，然后选用合适的洗脱 剂进行洗脱，达到其纯化的目的。常用于硫酸软骨素纯化的阴离子交换剂有树脂、纤维素 和葡聚糖凝胶等。采用d o w c x x 2 型强碱型阴离子交换树脂，梯度洗脱体系为硼酸氯化 钠溶液，流速为2 0 m l r a i n ，柱温5 5 ，压力为1 5 3 4 k g c m 2 。当氯化钠溶液浓度为 1 5 m o i l 时，可得到纯度较高的硫酸软骨素，回收率为8 5 吲5 2 1 。采用弱碱型e c t e o l a - 纤维素柱，先用0 5 m o l l 的氯化钠溶液平衡柱子，上样后依次用不同浓度的氯化钠溶 液进行洗脱，可得到纯度较高的硫酸软骨素【5 3 1 。采用中强碱型d e a f _ , - 交联葡聚糖凝胶 ( a - 5 0 ) ，洗脱体系为氯化钠与t r i s h c i 的混合液，可得到硫酸软骨素的纯品【5 q 。 ( e ) 电泳法 根据化合物所带电荷类型和数量的不同，采用电泳法可将硫酸软骨素和其他杂质分 离开。电泳法具有分辨率、目标纯度和回收率较高的特点。采用双相电泳法纯化硫酸软 骨素时，第一相电泳条件为p h 6 0 的吡啶醋酸水( 1 0 ：1 ：8 9 ，v v ) 缓冲液，电场 强度为7 5 v c m ，电泳时间为6 0 m i n ；第二相电泳条件为p h 7 7 醋酸钡缓冲液，电场强度 为7 5 v c m ，电泳时间为1 3 0 m ：i n ，可得到纯度为8 2 0 5 ( w w ) 的硫酸软骨素【5 5 】。采用琼脂 糖凝胶电泳，电泳条件为0 5 m o l l 的1 ，2 一二氨基丙烷缓冲液( p h 9 o ) ，电流强度为 5 0 m a ，电泳时间为8 0 m i n ，可得到纯度为9 0 ( w w ) 的硫酸软骨素，但其回收率仅为4 5 【5 6 1 。 采用硝化纤维素膜电泳法，加样量为1 0 - 1 0 0 堰，电泳条件为0 1 m o l l 的醋酸钡缓冲液， 泳动度为5 7 5 1 0 c m a 。1 m i n ，电泳时间为4 0 m i n ，可得到纯度为1 0 0 ( w w ) 的硫 7 江苏大学硕士毕业论文 酸软骨素，回收率也是1 0 0 5 刀。 ( 3 ) 硫酸软骨素的分离 根据化学结构的不同，硫酸软骨素可分为硫酸软骨素a 、硫酸软骨素b 、硫酸软骨素 c 等类型。不同类型硫酸软骨素的生物活性不同，如硫酸软骨素a 具有降血脂、抗动脉粥 样硬化、抗心肌细胞炎症等作用，硫酸软骨素c 与蛋白质的复合体易于c a 2 + 结合，可防止 骨和软骨的石灰化等作用。 ( a ) 不同分子量硫酸软骨素的分离 h i d e m i t s u 等采用葡聚糖凝胶( s - 3 0 0 ) 柱( 2 3 m i n xl1 8 0 m m ) ，上样量9 5 m g ，洗脱液 为0 1 m o l l 氯化钠，流速3 0m l h ，柱温4 c ，可得到分子量1 0 0 0 0 8 0 0 0 0 的硫酸软骨素 5 s l 。采用琼脂糖凝胶( c l - 4 b ) 色谱柱( 1 5 m m x2 4 2 m m ) ，将1 2 9 m g 硫酸软骨素样品溶解在 2 5i i l l 浓度为3 2 5 m o l l 硫酸铵和1 o m m o l l 盐酸溶液后上样，其梯度洗脱体系为 3 2 5 1 7 0 m o l l 硫酸铵和l o m m o l l 盐酸，柱温4 ，可得到分子量1 0 0 0 0 1 8 0 0 0 的硫酸 软骨素1 5 9 1 。采用聚丙稀酰胺凝胶电泳，缓冲液为0 1 m o l l 的硼酸o 1 m o l l 的t r is 0 0 1 m o l l 的e d t a 二钠盐溶液( p h 6 3 ) ，可得到3 4 6 0 3 7 6 8 0 的不同分子量的硫酸软骨 素l 印】。 m ) 不同聚合度硫酸软骨素的分离 采用高效液相色谱法( s p h e r i s o r bs 5 硅胶柱，1 0m mx2 5 0i i f f n 梯度洗脱体系为p h 5 0 的0 0 0 2 0 2m o l l 高氯酸锂溶液，流速2 m l m i n ，可得到聚合度为2 、4 和8 的硫酸软骨 素【6 1 l 。采用1 0 的聚丙稀酰胺凝胶电泳( 1 5 0m m x1 4 0m m ，2 5m m 厚) ，缓冲液为0 2 m o l l 的t r i s 硼酸o 0 0 2m o l l 的e d t a 二钠盐( 1 ：1 ：1 ，v v ，p h8 3 ) ，电流2 0m a ，电压1 2 5v ， 电泳2 0m i n ，可将聚合度为6 、8 和1 4 的硫酸软骨素分开【蚓。 ( c ) 不同分子结构硫酸软骨素的分离 高效液相色谱法h j e r p ea 采用高效液相色谱法( h y p e r s i la p s 硅胶柱，4 6m m 2 5 0m m ) ，洗脱体系为p h1 0 的0 1 m o l l 的硫酸钠和0 0 5 m o l l 醋酸钠溶液，流速 0 7 m l m i n 分离硫酸软骨素a 和硫酸软骨素c ，保留时间分别为5 2 m i n 和6 4 m i n i 硎。采用 高效液相色谱法( p a r t i s i l 2 5p a c 硅胶柱，4 6m i l l x 2 5 0m m ) ，洗脱体系为乙腈甲 8 江苏大学硕士毕业论文 醇t r i s 2 硼酸( 1 3 3 9 ，v v ) 缓冲液，流速1 2m l m i n ，柱温4 0 c ，柱压6 0 k g c m 2 ， 分离硫酸软骨素a 和硫酸软骨素c ，保留时间分别为1 7 5 m i n 和2 3 5 m i n l 6 4 1 。采用高效液相 色谱法( p a r - t i s i l - l o p a 硅胶柱，4 6m m x2 5 0 咖) ，用0 1m o l l 氢氧化铵平衡柱子，上样 量为1i ig ，洗脱体系为乙腈甲醇( 3 ：l ，v v ) 和p h7 0 的0 5m o l l 醋酸铵缓冲液，流速 1 0m l m i n ，柱压1 2 6k g c m 2 ，硫酸软骨素a 和硫酸软骨素c 以及硫酸软骨素b 、d t f f l e 的保 留时间分别为7 3m i n 、8 5m i n 、9 0m i n 、1 0 5 m i n 和1 1 4m i n a s l 。 电泳法r e n z oc 等采用醋酸纤维素电泳( 6 0m mx7 5 m m ，2 栅厚) 分离硫酸软骨素 混合物，其电泳条件为：低温、p h5 0 醋酸钡缓冲液、电压2 0 0v ，电泳时间1 0 3 0m i n ，可 分离得到硫酸软骨素a 和硫酸软骨素c ，该法重现性好，且可一次性分离8 个样品【蛔。 薄层色谱法采用纤维素薄层色谱法( 2 0 0m i nx2 0 0i l h l ，0 1m i l l 厚) ，点样量 2 5 1 0 0 0ug ，先用正丁醇乙醇水( 1 3 ：8 ：4 ，v v ) 溶液脱盐6h ，再用展开剂为正丁醇 醋酸i n 氨水( 1 3 ：8 ：4 ，v v ) 溶液展开6h ，可分离得到硫酸软骨素a 和硫酸软骨素c ，回 收率为8 0 以上吲。等采用硅胶( 6 0 目) 薄层色谱( 5 0m m x1 2 0m m ，0 1m m 厚) ，点样2 0 i l g ，展开剂为正丙醇异丙醇正丁醇水( 1 1 ：4 ：1 ：4 ，v v ) 和0 0 4m o l l 氯化钠和o 0 1 m o l l 氨水中展开2 5h ，可将硫酸软骨素a 和硫酸软骨素c 分离开【鲫。 1 4 4 硫酸软骨素的检测 随着硫酸软骨素研究的广泛和深入，其检测方法和手段越来越多。硫酸软骨素的定 性检测方法一般采用特征显色法，显色剂可选用醋酸甲苯胺蓝、苯胺- 苯胺磷酸、 邻氨基联苯磷酸、茵香胺邻苯二酸等试剂硫酸软骨素的定量检测方法有紫外分光光度 法、色谱法、电泳法、原子吸收法、比浊法和配位滴定法等。 紫外分光光度法主要应用于硫酸软骨素的定量检测。根据显色原理的不同，紫外分 光光度法又分为e l s o n - m o r g a n 法、硫酸咔唑法、染色法和间苯三酚法等嗍。紫外分光光 度法具有应用广泛、重现性好、灵敏度高等特点，但容易受杂质的干扰。 色谱法主要应用于不同类型的硫酸软骨素的定性和定量检测。根据其分离原理的不 同。可分为离子色谱法、反相离子对高效液相色谱法和吸附高效液相色谱法等【硼。色谱 法具有分离效率和灵敏度高、重现性好等优点。 9 江苏大学硕士毕业论文 电泳法一般应用于不同结构或不同分子量的硫酸软骨素的定性检测。根据其支持体 的不同，可将其分为醋酸纤维素薄膜电泳法、聚酰胺凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法和 毛细血管区带电泳法等。电泳法具有检测速度快、选择性好、分离效率高、样品预处理 简单等优点【7 1 】。 硫酸软骨素在水溶液中会解离出等摩尔的硫酸根离子，原子吸收法可通过检测滴定 加入的过量钡离子，从而间接表征样品中硫酸软骨素的含量。比浊法是根据硫酸软骨素 的聚阴离子可与氯化十六烷基吡啶络合生成稳定的乳浊液，通过测定反应生成的络合物 来表征硫酸软骨素的含量的方法。配位滴定法是通过硫酸软骨素水解释放的硫酸根，用 氯化钡溶液进行滴定，从而间接表征硫酸软骨素含量的方法【碉。 1 2 分子印迹技术的发展概述 分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t e dt e c h n i q u e ，m i t ) 是制备对目标化合物具有 特定识别能力的聚合物的新技术，是结合高分子化学、生物化学等学科发展起来的一门 边缘学科。分子印迹的发展历史可以追溯到上个世纪四十年代，p a u l i n g 在研究抗原抗 体相互作用时提出了抗体形成的模板学说【7 3 1 ，1 9 4 9 年d i c k e y 在制备硅胶吸附剂时提出 的“专一性吸附 的概念，均可看作“分子印迹 的萌芽 7 4 1 。1 9 7 2 年德国学者w u l f f 等依据印迹分子和功能单体之间的共价键