（环境工程专业论文）纤维素高效降解菌的分离鉴定及固态发酵条件研究.pdf

蘸辫交通大学矮童繇究生学像喜仑文第l 癸 摘要 纤维素资源的开发利用一直魁国内外研究的热点，而嵩产纤维索酶菌株 的寻找与开发是制约其发展的关键。本论文熬予获得高效泽解纤维素麓株这 一鏊靛窭发，姨窟焱凝蕈、蕊本条、壤、串粪等样鑫串分离蜀1 3 稼髓在隧 羧甲基纤维素钠( c m c n o 为唯碳源的固体墙养基上生长的菌株，通过滤纸 崩解测试、刚果红纤维素平板识别，以及液体和固体产酶撩定，最后从中筛 选褥劐掾分解终维素筵力较强豹真甍，经初步攀定为脉纹豫菌【| | 嚣 ( n e u r o s p o r a ) 中的躲纹孢菌( n e u r o s p o r as p 。 。 通过对该菌株的固体发酵条件进行单因予优化实验，初步确定了熊培养 基最饿的碳源和氮源种类及其添加比例，即稻草粉：麸皮= 9 ：1 ，n h 4 n 0 3 0 。5 ；戳及最逶蘩莽条终：搂耱秘羚7 2 h ，飘滚毙1 ：3 ，接耱量l m l ，p h 蓬 自然，培养温度3 0 ，产酶培养时间9 6 1 1 。此时菌株的c m c 酶活和滤纸酶 活分别为3 5 5 1 1u m l 一、3 8 6 7u m l _ 。随后将该菌株与另外几株真菌进 行混秘培养，结果发现c m c 酶活及滤纸酶活都有所撼离，分别遮到了 4 3 4 7 0 6 u ，m l _ 、4 6 9 。9 2u 。m l 。 嚣我函瓣嚣瘸子纤维索簿生产的藏撩， 其滤纸酶活力仅为i o o u m l 。可见，脉纹孢菌( n e u r o s p o r as p 1 具有较强分 解纤维索的能力，惭利用菌株间的协同效应进行混和菌株培养能够进步增 强野缎索魏复合系懿整访酶活力，跌嚣提囊纡缝素静利用窀，并为实际生产 中有效处理农佟甥稿秆等纤维索瓷源提供瑾论基础。 关键词：脉纹孢菌( n e u r o s p o r as p ) ：纤维素蹲；固态发酵；混和菌 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 1 页 a b s t r a c t t h es e a r c ha n de x p l o i t a t i o no fe f f i c i e n tc e l l u l o l y t i cs t r a i n si st h ek e yf o rt h e e x p l o i t u r ea n du t i l i z a t i o no fc e l l u l o s er e s o u r c e st h a ti sa l w a y st h ef o c u si nt h e i n t e r n a t i o n a lr e s e a r c hf i e l d i no r d e rt oo b t a i ne f f i c i e n tc e l l u l o s e - d e c o m p o s i n g m i c r o b e s ，t h ea u t h o ri s o l a t e s1 3s t r a i n sf r o mp u t r i ds t r a wa n dw o o d ，s o i l ，a n d c a t t l ef e c e se t c ，w h i c hc a ng r o wi nt h es o l i dm e d i u mu s i n gc m c - n aa sa no n l y c a r b o ns o u r c e o nt h eb a s i so ft h e s es t l a i n s ，as t r a i no ff u n g it h a tcand e c o m p o s e c e l l u l o s ee f f i c i e n t l yi ss c r e e n e dt h r o u g ht h ee x p e r i m e n t so fd e c o m p o s i t i o no f f i l t e r p a p e r ，i d e n t i f y i n g o f c e l l u l o s e - c o n g or e dm e d i u m ，l i q u i da n ds o l i d f e r m e n t a t i o n ，a n dp r e l i m i n a r i l yi d e n t i f i e da sn e u r o s p o r as p t h ee x p e r i m e n to fs i n g l ef a c t o ro p t i m i z a t i o na b o u tt h es o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o no ft h es t r a i ni sc a r r i e do u t ，a n dt h er e s u l t ss h o w st h a tt h eo p t i m a l c a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c ea r es t r a w ：b r a n = 9 ：l ，n h 4 n 0 30 5 ；a n dt h eo p t i m a l c o n d i t i o nf o rc u l t u r ea r ei n o c u l u m sa g e7 2 h ，t h er a t i oo fs o l i dt ol i q u i d1 ：3 ， i n o c u l u m ss i z el m l ，c u l t u r et e m p e r a t u r ea r o u n d3 0 ，c u l t i v a t i n gf o r9 6 h ， n a t u r a lp h t h ec a r b o x y lm e t h y lc e l l u l a s e ( c m c a s e ) a c t i v i t ya n df i l t e r p a p e r a c t i v i t y ( f p a ) o ff u s a r i u ma r e3 5 5 1 1u m l a n d3 8 6 7u - m l 一1r e s p e c t i v e l y u n d e rt h i so p t i m a lz y m o t i cc o n d i t i o n s i nt h ef o l l o w i n gm i x e dc u l t i v a t i o n ，t h e c m ca c t i v i t ya n df p ae n h a n c es i g n i f i c a n t l y ，a r e4 3 4 7 0 6 u m l a n d4 6 9 9 2u m l r e s p e c t i v e l y h o w e v e r , t h ef p ao fs t r a i n st h a th a v eb e e na p p l i e dt ot h e c e l l u l a s ep r o d u c t i o ni nc h i n ai s o n l yi o o u m l s oi t c a nb es e e l 2t h a t n e u r o s p o r as p i sa ne f f i c i e n tc e l l u l o s e - d e c o m p o s i n gs t r a i n ，a n dt h em i x e d c u l t i v a t i o nc a ni m p r o v et h ew h o l ee n z y m ea c t i v i t yo ft h ec e l l u l a s es y s t e mb yt h e c o o p e r a t i v ee f f e c ta m o n gt h em i c r o b e s ，a n dp r o m o t et h eu t i l i z a t i o no fc e l l u l o s e r e s o u r c e s ，a sw e l la sp r o v i d i n gt h e o r e t i cd i r e c t i o nf o rt h ee f f i c i e n tt r e a t n a e n to f c r o ps t r a wi np r a c t i c a lp r o d u c t i o n k e yw o r d s ：n e u r o s p o r as p ；c e l l u l a s e ；m i x e ds t r a i n s ；s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n 西南交通大学硕士婿究熊拳位论文 簋。生垂 第 耄绪论 1 + 1 纤维素篱效降鳃菌分离、筛选的意义 纤缝素是植耪缨施壁豹主要藏份，约占接搦予羹翡1 1 3 1 1 2 ，它是蟪球上 分布最广、含爨最丰富、整成垂鼗高的瓣视纯舍物f l l 。据不完奎统计，全球 每颦通过光合馋用产生的纤维素最高选1 7 1 0 1 2 t 1 2 1 ，其中大部分尚来被剩穰 藏寒玻食理零l 薅( 懿囊接焚魏) ，毽嚣全挺器被嚣发蘩l 攫鹃焱转纾缳蘩产麓不 怒2 ，我鞫约骞5 0 三l 土敕农菲废赛躲在毋闽逸头被宣爨烧撵。这不仅渡 费了宝贵的自然资源，而且仝世界每年圈农林废弃物焚烧造成的激接经济损 炙达数专亿元l l ，热上盘予焚烧露产生熟滚滚滚烟，以及拯簸懿丈量意密气 锩严重影响了公路、靛空蜜垒，潘染了鼙：境，瓣气靛、生慈等毽造成了严囊 豹影确。 众所周知，石浊、煤和必然气集中代表了地球上的能源，是光合作用产 戆经过识万年演变薏懿获鬃物。按爨蠢兹全煎赛懿露漓溃鞣速废擞及露开发 源潮储蘩来看，戮2 l 整纪麓个对剿石浦豹供艘将会牺满。援然，寇未来几十 荦煤、石油矿麟的储缀有蘩保持充足，1 搿把煤变成液态碳甄燃料的加工技术 也会建变起来，但是煤郛穗油矿藏鲍拜漱具有受面环境影嫡，势大量使鼹矿 痿爨辩溪趣了空气孛c 0 2 瓣含量，簸甏瀵熬了垒球谈交疆一一滋室效应熬 萄耱性。嚣美嚣纯学按会鹫糖爨，难一辩营我器溜熬涎然滚瓣蹩黪缝黎凌奔 物，如农业生产上的秸秆、波壳、甘蔗瀵；伐术及术材加工后的水屑和键屑： 城南静黧传垃圾( 毽捂褒纸、硬纸援及爨赛饔花园巾驰废褰物) 等，整韪爨 这貔废豢耪遗j 窭生物转纯戒燃耨或蛋崮震，菲褪不会减少靛食垒产，逐能秘 驹解决聪代废榴憝嚣瀚题，簌雨减少环瓣污染，既能蕊乙醇的形式提供使用 方便、可再生的能源米减少对矿物燃料熊依赖，又戆缓勰粮食和渤物饲料短 姣l 粥。魄魏说，我鏊簿年馁黧余瓣旗释襄l 亿t ，麴祭葵孛睾熬辍程熏，可 产溪糖1 0 0 0 刀t 4 l 。鑫迎搿见，禳秘纾缀素这耪哥辩瀣囊激鹃潜在徐毽是不 可估量的。 尽繁a 类袋大部分动物并不熬漕讫野维素，僵怒潮鼹微生浆或英癸泌鹣 绎缓素熬麓将绣维素薅纯楚= 糖戢萃糖，惩予燕产容翳被凌物教l 受窜i 嚣、营 烈南交通大学颂士研究生学位论文第2 页 养徐值高的新壅镧稃、肇缅魏鬣自等，而不能直接利用纤维索作碳源的酿酒 酵母也可以利用单糖为底物避步发酵生产酒精。可见，纤维素酶猩充分利 用农作物稻秆等农副产品废弃物，降解秸秆中的纤维素，开辟新的能源和粮 食方嚣具鸯巨大数潜力，这方藤鲍磅究弓 越人 f 】越来越多魏关注睁“j 。然鼹， 目前用于纤维素酶生产的菌株，如术霉、街霉及曲霉等，普遍存在酶活力较 甄熬酒题弘8 ”，窝我晷震于叟产熬藏株，其滤纸薅活力仅为i o o u m l 。 因此，筛选高效纤维素分解菌，确定纤维素酶的发酵工艺条件，是利用秸秆 纾缓索静关键，其有重鬟翡经济债蕊帮现实意义。蔼霹辩季j 弼秸器发酵产酒 精，以及饲用纤维紊酶的生产应用也具有广阔的开发前墩。 1 2 国内外研究进展 1 2 1 天然纤维素的构成 2 ，纤维素懿缱袋私结梅 全球遴过光合作用鼹产生黥生物璧中，最主要、最零见鹣成份是本质野 维素，几乎占了全部光含作用产物的一半，它主舞由纤维素、半纤维素和术 康素这三类聚会躲擒成。在囊簿檀物缨憨蘩戆维簿缀缓孛，这三类聚会貔绫 此通过非共价键及共价键紧密连接，形成水质纤维素这种复台物，它占整个 缨您于蓁懿9 0 豁上，镣耱聚合耪懿数耋在不懑释及不褥年龄鹣援麓闯，甚 至同一植物的不间部分都是不同的。一般说来，水稻、小麦及玉米等主要农 彳乍物秸释静纤维素含量为3 0 3 5 ，半纤维素食羹为2 5 3 0 ，木质索 含量为2 0 2 5 t o ”1 。 一个纤维素聚合物罴由成千上万的葡萄糖分予通过届1 , 4 糖菅键连接而 成的嶷链分子，基本重复单位是纤维二糖( 凝1 - 1 ) 1 3 l 。纾维素中耀邻蘩莓糖绕 糖苷键的中心轴旋转1 8 0 。，因此，最束端的纤维二糖可以出现两种不同立 体化学形式中的镁一耪，绥缕褰聚会链逶避链内畿键形藏裹乎、謦状懿稳定 结构，而位于相邻链间的氨键使它们在很多具有相同极性的平行链中彼此强 烈相曩终爱，结象形戏缀长熬莲大结磊获聚合糖一徽纾丝。徽牙丝在一超 形成陋大的纤丝，这些纤丝在薄层中组织我一起并形成植物细胞壁不同层的 框架结构。纤维豢纾丝其有嵩液寄穿医一一分子摊列整齐的结晶区和相对不 规则、松散的无定形区。结晶纤维素片断的致密续构，使得纤维素不溶于水， 盈比其它葡萄耱聚台物( 如淀粉) 更难降解。可见，纤维索的结晶性决定了纤 维素枣孝料是否容翳棱纤缎素酶蹰水解。 疆赢交通大学硕士研究擞学位论文第3 页 图1 - 1纾绦索长链分子泞断壤影郫努为一个纤维= 糖单元1 半纤维素鼹班非共价键的方式与纤维索连接的多聚糖的统称。在多数情 况下，半纤维索分子不是由一个单一的糖苛聚合而成，而是由2 - - 6 个不同的 糖繁组成。在细胞壁中，絮充填在纤维寨框架中，姆绛维素交黎程一起蠢形 戏复杂熬结鞠。峦j 迸哥冕，繇便是半纤维索疆容荔被降解，也哭裔当纤维素 被水解时，它才可能全部水解。而术质索则是由苯冈烷单位随机构成的共聚 物，它是地球上数量最多的芳香族聚合物。木质索和半纤维素一超作为细胞 阑膜壤充在缨筑壁懿擞缨终缝之阕，热辫本震纯缝织鹣缨憝壁，瓣霹宅氇存 教于细胞闯隙，把楣邻的绷胞粘结在一起。 木质素和半纤维素形成牢固的结合朦，紧紧地包围着纤维豢，阻碍纤维 豢孵与其接触，限制了纤维豢酶活性的发挥，这是影响酶反应敏感性的另一 个霪要嚣因。强本纾维孛，本震素与帮转结螽绎缝綮结合藏为蠡然器对予化 学作用和生物作用抗性最强的材料之一。因此，在豳内外的应用研究中，首 先是通过预处遐改变天然纤维( 木质纤维索) 的结构、降低纤维素熊状物的结 熬发、破坏本膜素和纤维索之阁静结合，增热绎维豢本解酶与终维素的接黢 磷穰，飙丽掇淼酶解效率。 1 2 1 2 纤维素材料的预处理 垦蓠，纾维索的谟处瑷方法主要考物理法、他学法及生物法。 1 ，2 1 2 1 物瑷法 西南交通大学硕士研究生学位论文第4 页 包括机械粉碎、高温、高压水蒸气热处理、y 射线、微波处理等f l l1 2 】。 这些处理的目的在于降低纤维素的结晶度、破坏木质素与纤维素的结合层。 1 机械粉碎 这是纤维素预处理中最常用的方法，本实验在进行固态发酵之前也采用 了这种方法处理纤维素原料。机械粉碎能使颗粒变小，降低结晶度，对处理 高结晶度、高度木质化的材料有较好的结果。其中，尤以振荡球磨、高温研 磨效果更好。然而，这种方法需消耗大量能源，据计算，该过程所耗能量占 由纤维素转化为葡萄糖整个过程中所需电能的5 0 6 0 。此外，它也并不 适合所有材料的处理，如棉纤维。 2 蒸煮、高压蒸汽爆碎 蒸煮处理是用1 5 0 2 0 0 c 的饱和水蒸气处理原料1 0 2 0 m i n 后，利用高温 高压下的饱和水蒸气改变木质索的结构，破坏木质素、半纤维素的结合层。 而高压蒸汽爆碎技术则是近年来发展较快的一项新技术，效果较好、成本低、 无污染。在2 0 0 。c 左右的高温下，半纤维素、木质素开始部分降解，变得易 被有机溶剂或稀碱抽提，加上突然减压爆碎的机械分离作用，破坏了植物纤 维的细胞结构，使纤维素的酶解性明显增强。然而，目前该工艺存在的最主 要的技术问题是，原料废渣蒸汽爆碎预处理结果不够理想。此外，蒸汽爆碎 的温度和时间对酶解率的影响非常复杂【1 3 l 。总的来说，只有采用高温( 2 2 5 * c 以上) 短时( 2 r a i n 以内) 处理才能提高酶解率。因此，开发设计出耐高压力 ( 4 m p a 以上) 的蒸汽爆碎装置是该工艺的重点与难点。 3 高能辐射 高能辐射( 高能电子、y 射线) 处理可使纤维素物料的可溶性增加，有 利于纤维素的酶水解。然而高能辐射处理的成本高达1 3 8 1 5 6 美元吨，目前 还很难用于大规模生产。 1 2 1 2 2 化学法 利用碱、酸，以及其它一些有机溶剂或化学药品处理，可以破坏木质素 与纤维素之间的紧密结合。 1 碱处理 碱处理可以使木质素结构裂解、半纤维素部分溶解，纤维素则因水化作 用而膨胀，纤维素的结晶度也有所降低【1 1 】。据报道，用1 的n a o h 在1 2 0 处理纤维素原料1 h ，能脱去8 0 以上的术质素；用2 的n a o h 在3 0 c 处 理6 h 、5 0 。c 处理l h 或7 0 c 处理2 0 r a i n 都能得到明显的效果i t 4 】。然而，碱处 西南交通天警硕士研究煞学位论文繁5 页 理后的纤维索融然对酶的敏感性增加，假因其膨胀憾及粘度增加，底物浓度 一般不能超过1 0 t 1 5 1 。同时，碱处理虽肖较强的脱去术质素和降低结晶度能 力，疆在楚毽i 霆疆孛，会瓣本矮素等戏分滚失造成予物臻壤少，教楚揍失太 多、同时还存在试剂回收、中和、洗涤、成本过大等系列闯题。 2 稀酸处理 这种方法主要是用于处理木质纤维索中的半纤维索。由于它跳在1 0 0 以下较爵逮滚勰予稳酸中，强蠹乏可爱浓建必2 豹h 2 s 0 4 在1 0 0 袋1 0 0 以 下对甘蔗渣避行处理。同时，还可从中荦取水解产擞的糖，用予制备酒精或 其他产品 1 1 】。可见，稀酸处理既对纤维索物料进行了预处理，同时又可以得 到半纤维素水解产生的的糠渡。倘若能够壤好地剽耀这一优势，鄹么它也将 会是一耪缀商发展翦途静颥簸瑾方法。 1 2 1 2 3 生物法 垦前，国内辨选择分缝本质素的微嫩物和酶进行天然纤维綮蹶处理磺究 较多，本褥鬻簸藿能使本激素分子侧镶筑纯耱莠香环裁纯裂解嗣。近年来， 菜些真菌降解术质素己开始应用于工业缴产和环境处理，如黄原獭毛平革菌 和p h l e b i ab r e v i s p o r 等白腐菌已应用于造纸工业中的生物制浆，生物漂白等 过程。璜典等l e 欧嚣家裂麓廷纾维素酶熬担子蓥突交拣霹纾缨豢；| 跨辩送雩亍聪 本质素处理，取褥了显著静教果 ”1 ”。缀然微生物处理具有节约化工原料、 能源和减轻环境污染等方两的优点，但其最大的一个缺点是处理周期过长， 从而限制了这项技术的推广。 练上瑟邃，羲疆莲辩予改变天然绎维( 本震纾缭索) 戆缝 晦，降低鳝维 豢丝状物的鳍晶度、脱去术质素，提高酶解效率起蒋楚关重要的作用。但是 幽于现阶段所研究的预处理方法存在着能耗大、设铸条件限制、成本高，以 及二次污染等闲题，蟊兹逑泰找到较为会理有效豹野缨素兹处理方法。 1 2 2 纤维潦的降解 经过预处理后的天然纤维索通过酸水解或酶水解柬进行糖化。其中，酸 承鼹洼毽令了羧法颓处理，它莓分为耢羧承瘿弱浓黢窳瓣嚣类。警茬1 9 1 0 年国矫就开始了关于术材黻水解的研究，1 9 3 0 年建瓶超了酸永麓术材的糖纯 工业。迄今为此，虽然研究人员直农寻求用不同的方法来提高酸水解工艺 的糖化率，然蕊总的来说并没有太大的进展【坫l 。这主爨是因为存在以下一些 淹越。其一，骧隶磐条 孛骛瓣，霹莰餐露疼淫馋焉。鲡：疆酸承熊罴要在蒿 讴南交通大学硕士硪究生学位论文第6 页 温商压下( 温度般控制在1 0 0 - - 2 0 04 c 之间) 进行，因此就要求设备其有耐酸、 耐压的特点，从恧增加了成本。其二，蓑采用浓酸水艇法，晟然滠度、压力 有所降低，但反应时间会相_ 陂延长，且试剂难以回收，操作安全憾较低。此 於，在酸墩孵避程中，出于尊蘸的逛一步分疑，还会产生糠袋等窝毒甥黢。 目前看来，这项工艺鼷待解决的问题是如何以墩经济的办法将酸和糖分离开 来。若蔻实王霆这步，不仅敬髭够强投裂耀，嚣显还鸯嚣予糖滚遂一步发酵 产酒精。 1 2 2 1 纾维素麓的缀或及作带枫谶 虽然麸愿璎上讲，纾维豢麴酶瓣j 童纛期是终缝素大分予上鹃1 , 4 耱棼 键断裂的过程。然而艇于纤雉素结构的复杂性，任何单一的酶组分都难以将 葵宠全降瓣，嚣魏霉簧一令笺杂静海落系寒共溺完惑这项耀蓬静经务。瑗已 确定，大多数微生物产生的纤维索酶是个多缀分的酶体系【1 2 】。纤维素酶包 括多稀拳解酶，构成了一个炭杂斡纤维素酶系统。按萁往质冒将纤维素酶大 致分为以下三类i ”j ： 内切葡聚糖酶( e n d o 1 ，4 d g l u c a n a s e ，e c ，3 2 1 4 ，简称e o ) ， 或称c m c 酶或c x 酶，作用予纤维黎分子内部的非结熬区，隧机水鼹璺1 , 4 糖 苷键，将长链纤维素分子截短，产生大爨带非还原性末端的小分予纤维索。 e g 包括掰耱异橇酶1 2 0 le g 、e g i i 。 外切葡聚糖酶( c x o 1 ，4 b ，d g l u c a n a s e ，e c ，3 2 1 9 1 ，简称c b h ) ， 或称绥维二耱零解酶、微鑫纤维素戆或c l 酶，终窝乎绎维素分子寒璇，东 解0 1 , 4 糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。c b h 感木霉的主要纤维素酶， 篷捂两耱拜构释滢l ；c b hl 、c b h i i 。 b 葡萄糖苷酶( b ”g l u c a n a s e ，e c ，3 2 ，1 ，2 1 ，简称b g ) ，或称纤维 素二糖酶。这类酶将纤维二糖承解成蔼懿耱分予。虽然它帮纤维索无作蠲， 但它可以消除上述两种酶催化反应的终产物对反应的抑制作用，从而加快反 应遽度。b g 一般亩7 1 4 个氨基酸绦成鼢2 鄯。 综上所述，纤维豢酶是具有不同底物特异性的多酶复合物。关于它的作 用梳制，不同静研究者根据辩不同静徽黧街鲆维素酶的研究结果挺出了不同 的看法【2 4 啪】。最然纤维素酶促使纤维素转化成鬻萄糖过程的细节黧今仍不清 楚，但题普遍认为是纤维索酶各种组分协同作用的结果，也就是通常所说协 同理论学说( s y n e r g i s i n ) 1 i 。箕具体连餐如图1 2 掰嚣： 西南交通大学硕士研究生学位论文 第7 页 内切葡聚糖酶( c x 酶)外切葡聚糖酶( c l 酶) b 一葡萄糖苷酶 无定形纤维素j l 。结晶纤维素土纤维二糖上+ 葡萄糖 ( 非结晶区) 图1 - 2 纤维素酶水解机理 由于纤维素结晶区的分子排列整齐，无定形区分子排列松散，故无定形 区更容易被纤维素酶所水解，而结晶区却很难作用【1 孙。因此，对于经过前处 理之后的纤维素而言，内切葡聚糖酶( c ，酶) 首先进攻的是其非结晶区，产生 了聚合度较低的碎片，形成外切纤维素酶( c 1 酶) 需要的新的游离末端，c i 酶 便从这些多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，由0 葡萄糖苷酶进一步水解 纤维二糖产生葡萄糖【2 7 2 8 1 。上述这种纤维素酶水解机理便是目前最易被人们 所接受的内切- 夕h 切协同性理论。然而考虑到纤维素酶是种复合酶，各个酶组 分尚未完全清楚，目前关于c 1 、c ；的概念和作用还有很多争论，这部分工作 还有待进一步研究“。 1 2 2 2 产纤维素酶菌种的筛选与开发 纤维素微生物的研究始于1 9 1 2 年，到现在大致经历了3 个高峰发展时 期：五十年代以前主要是研究防止微生物对天然纤维的破坏作用；六十到 七十年代针对世界人口的剧增，主要研究利用纤维素资源生产单细胞蛋白； 七十年代以后，随着能源危机和环境污染，研究的重点又逐步转移到开辟新 能源和防止环境污染上来。近二、三十年来，在纤维素酶菌株的选育、纤维 素酶组分及降解机制、纤维素酶合成的调节和控制以及纤维索酶应用等诸多 分枝课题都取得了很大的进展。然而，由于目前现有的纤维索酶的酶解效率 普遍偏低，远不及淀粉酶和蛋白酶，从而影响了纤维素酶的大量生产和广泛 应用 1 2 1 。因此，进一步寻找和开发出高产纤维素酶菌株，并不断改善和优化 培养条件，这是纤维素资源能否高效利用的关键。 自然界中纤维素酶的来源是相当广泛的，真菌、放线菌及细菌等在定 条件下能产生纤维素酶( 见表1 1 ) ，原生动物、软体动物和昆虫等也能产生纤 维素酶【l2 鲫j 。迄今为止，国内外已有大量关于纤维紊酶生产菌株的研究报导 p “”j ，其中研究较多的是真菌中的木霉( t r i c h o d e r m a ) 和细菌中的热纤梭菌 两南交通大学看页士研究生学位论文第8 页 ( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) i 3 3 - 3 7 1 。 凌1 - 1 产纾缳素酶魅主要微生物盼5 2 、5 3 5 4 l 微生物种类属名或菌种名 木霉属( t r i c h o d e r m a ) 萎氏本霉t r i c h o d e r e e s e i 绿色木霉t r i c h o d e r m av i r i d e 袋氏本霉t r i c h o d e r m ak o n i n g i i 拟康氏术禧t r i c h o d e r m ap s e u d o k o n i n g i i 膏霉属( p e n i c i l l i u m ) 细小青霉p e n i c i l t i u m p u s i l t u m 特异青霉p e n i c i l l i u n ln o t a t u m 冀蘸 缝状毒霉p e n i c i l t i u m f u n i c u l o s u m 披f 氧型，中温菌) 斜卧青撵p e n i c i l l i u md e c u m b e n s 鼗霉葳( a s p e r g i l l u s ) 黑曲霉a s p e r g i l l u sn i g e r 麴霉a s p e r g i l l u st e r r e u s 根越属( r h i z o p u s ) 熏裉霉r h i z o p u sn i g r i c a n s 漆斑霉属( m y r o t h e c i u m ) 疣孢漆斑霉m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a 爨球漆斑毽m y r o t h e c i u mm e t a n o s p o r u m 放线菌 ( 好氧垄) 黑致旋丝放线菌删c t i n o m y c e sm e l a n o c y c l e s ) 玫瑰色放线藏联r o s e u s ) 纤维放线菌0 c e l l u l o s a e ) 疆南交通文警硕士骚究警学位论文繁9 页 大量研究发现，由于大多数细菌对纤维素的降解并非依靠胞外酶进行 的，而是将纤维索酶组装成个大复合体，称为纤维索酶体( c e l l u l o s o m e ) ， 势褥它瓣羞在缨照表覆，露戴糖隆予纾缀素奔质上慰装进行降鳃豹【2 ”3 ”。 因此，通过发酵液直接测定篡酶活时，一般都较低( 低于1 0 9 l 释。、4 ) ， 热 纤梭菌除外( 其产酶水平与飘氏木霉相当，但其生长激适温度较商：6 0 ) 。 曼然这样的测定结果不可靠，然而若菌株无法形成臌外酶，那么对于纤维素 酶麴生产寒落魄没有多大浆实焉馀篷。魏状奏蘩燹不强，它们畿够缆产圭| 三大 量的纤维素酶，并将其分泌到细胞外参与分解纤维索，从而有利于纤维素酶 的生产提取。般来说，真黼都含有三种酶组分，不过由于种类的不同，三 葶孛酶维分黪占魄倒不一样f 3 3 l 。懿t r e e s e i 能合成大爨鲍c b h 謇珏e g ，但 ，葡萄糖营酶滔力穰低i 4 2 啪i 。困此，在纤维素承解过程中，纤维二耱大量积 累，从而反馈抑制了c b h 和e g 的活力，降低了酶解散率，影响纤维素水解 为碗萄糖。近年来。研究人员在改进纤缎索酶系组成方面做了大壤工作，通 遭谯纯培莠基缀残，改邀蘩穆缝合来提褰蘩莓糖棼溪缝【4 。”，不_ j 篷这方嚣工 作并没有太大豹进展。 目前，各阑学者仍在努力寻找高效的纤维素分解菌，同时也在积极构建 纤维素分解“工程箧”。研究发现，纤维索水解效率主聚取决于纾缳素酶系中 各缀分静魄铡耨注震。一簸寒说，天然绥菡器霉菌瓣纤维素酶系遴繁是不完 全的。如t r e e s e i 缺乏b 葡萄糖菅酶，而a n i g e r 的p ，葡萄糖苷酶活力很高， 但其它纤维索酶组分活力却很低f 4 0 j 。糟在t r e e s e i 纤维素酶制剂中补加 a 。n 汶e r 夔8 壤莓搂营酶馒霹大幄度提蹇零簿纤维素底携熬速率1 4 引。鸯至鹜 箭氇尚未有关予a n i g e r 静葡蔫糖蕾酶基因在z r e e s e i 中壹接装达的报道。 不过，四个z r e e s e i 的纤维紫酶基因和个a n i g e r 的8 葡萄糖瞥酶基因已分 别在酿漕酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 巾获得表达，从而为构建能直接利用 终缝素熬s , c e r e v i s i a e “王纛蕴”提撰了蒺礁辩。翻，瓣蓑这方羲王箨歪在避 一步研究之中。 另外，目翁许多已克隆的真菌( 如z r e e s e i ) 纤维豢酶基因都爵在e c o l i 中 获褥表达，但怒由于其表达宠( 平低以及e c o l i 不能分泌蛋自震，尚无法商最 纯川。不过，若熊将该蒸因溺嵩效表这蒸馥豹癀动予糯染色钵起始位点藏台， 则袭达量会大增。此外，利用基因工程平段对纤维紫酶分子进行改造，如通 过定点突变技术或盒式突交技术，改变活性中心或溜性中心附近游干个氨基 鼗残基，裁缝够提意蓦淫瞧，增强怼酸躐、毫渥戆莛雩受戆力芦n 。邃些舔是馨 静纤维素分解蒴基西工程上的重点研究内容。 西南交通大学颂士研究生学位论文 第1 0 页 12 3 纤维素酶的生产 优良蘩耱是稳离纤维素酶活力静关键，焉遥宜豹= 萋产方法帮培养条 孛籍 是发簿优良菌种性能、得到较商酶产量的保证。纤维索酶的生产主凝有固态 发辞窝液态发酵两种方式 垃】。在圆体培养和液体培养_ i 妻程中，要遥巍控制温 度、p h 和通风量，固体培养逐要保持一定的水分葶湿度，丙波体培养中还需 采用搅拌及消泡处理方法。程工业奎产上，由于出发菌种、原料、设备、目 的产品的不同，采用的生产方法积培养条传各有麓异1 5 孙。 1 2 3 1 液体发酵法 液体发酵法怒搭将微生物接种到液体培养基中进行培养 5 翻。其般的生 产工艺过程是将纤维素必物质( 妇稻革及玉米秸移) 粉碎艇2 0 爨( o 。8 5 m m ) 以t 进行灭菌处理，然后送鬣发酵釜内发酵，同时加入纤维素酶菌种，发酵时间 约必7 0 h ，温度低予6 0 。采用净化蘑敕炙麓空气扶釜底运入避孬气滚搂搀， 发酵完的物料经胝滤机压滤、超滤浓缩和喷雾干燥后制得纤维素酶产品。其 工艺滤程懿下固： 菌种 l 槠秆类物质+ 发酵刊立滤_ - 浓缩旰燥产品 图1 3 液体发酵法工艺流程图 般来说，液体发酵法的培养祭件容易控制，不翁染菌，生产效率商， 节省劳动力，产赫质量椽定，适合予大援模工业怯生产。过去，美嚣、墨本、 丹麦等发达国家谯这方面的工作做得较多，我国尚处予试验阶段删。然而， 出予箕动力瀵耗；筵大，设备要求过蔫，嚣蘩疆羲嚣髂发黪生产线戆鞠继投产， 以及市场竞争对低成本、高产出的迫切需求，固体发酵王艺已日益受到注髓。 1 2 3 2 戳体发簿法 匿体发酵又称固态发酵，是撂微生物农没鬟皴尼乎没毒游裹求麴霪态验 湿培养基上的发酵过程。固态的湿培养基般含水量在5 0 旋右，而无游离 求滚塞。戴培葵纂逯鬻跫“手握残霞，落壤蕤教”，鼹戳鼗蓑黪也霹称麓半整 体发酵。纤维素酶的固体发酵生产工艺与液体发酵法基本上致，同样也是 鼓农僖物穗符为主要嚣辩”。篷予蠢静焉乎纾维寨酶垒产的麓株大雾数蒲于 好氧菌，因此这炎菌株的固体发酵生产主凝是通过将接种后的培养熬摊开铺 烈南交通大学颂研究生学位论文第1 1 页 在容器表面，静麓发酵，也可通气或翻动，使菌株能迅速获得氧，并散去发 酵产生的热。由于耳前固体发酵工装的优势日盏突出，越来越多的生产厂家 采用这项技术生产纤维索酶。荩优势如下： 蕾先，圈体发酵魄渡钵发酵具蠢更裹的产酶率，d s c h a h a l ”l 遴过黠强 体及液体发酵工藏产率的分丰斤比较发现，阉体发酵的酶产率( 2 5 0 4 3 0 i u g 纤 维素) 毙滚体发酵豹赘产率( 1 6 0 2 5 0 i u g 纤维素) 壤热了缝7 2 。莰鑫桂、萤 淡君【5 8 】通过对7 2 v i r i d e 产纤维素酶固体发酵和液体发酵进行比较研究后发 褒，蓊者酌酶产率偿i 滤纸酶活表示) 籀对予磊者来说，提高了2 5 ，其中c l 酶提高2 8 ，c 。酶提高4 2 ，b 葡萄糖箭酶提高4 9 ，且酶组份比率高于 后者。究蔡原因，主要是由予磊前豳内外广泛采用的产纤维豢酶菌种是冀菌 f 如术霉) ，巽菌习惯生长于静止的环境中，并同时发出蓠丝体与底物紧密接 触。由此可见，潮态发酵环境条件与自然状态下的真菌生长习性较为接近， 这样便有利 二菌橡产生较为竞巷的终维素薅体系。嚣在渡体搅拌发酵过程中， 该类菌株往往生长不良，在发酵罐中只长菌丝体。由予真菌不同部位所分泌 豹酶缀分移在缀大差异，霞戴蕴橡邀孬滚体发酵瓣麴甄缰分没有生长寒全豹 固体发酵酶组分率富、比例适当。此外，由于纤维素基质本身不溶于水，也 靛不澍于谶行液体发酵。逶过这些疆究哥疆发臻，在遗用冀蘩进行产酶发酵 时，采用豳体发酵工艺比较台适。 其次，在大瓶模生产方面，霜俸发酵奎产纤维素酶阮液体发酵法更经济、 更节约。这主要是因为程工业生产中，液体发酵德要消耗大擞的能摄。有研 究发现，在同样的基质条件下，液体发酵院固体发酵多耗电能8 1 0 倍( 蒸汽未 计) t 5 7 1 。一方蘑，发酵罐内搅拌浆揽拌耗髓匡大，热之液体发酵的培养周期 长( 短则7 。8 d ，长则l l d 以上1 5 9 1 ) ，从而使其需要消耗更多的能量。相比之下， 整体发酵壤莠时阏短( 3 a 左右) ，虽燹霉搂搏，这棒一束慧终了大量靛残本及 能源。另一方面，在后续酶提取过稷中，由于液体发酵的水檄多，纤维索酶 豹爨取予澡不缓器要游艇更多静电艉帮蒸汽，嚣越还黉溪粪备受糟楚 l 冬设备。 相比之下，固体发酵不仅能耗低，且操作简单，投资少。 既矫，值褥糖密的楚，我国嚣前液体发酵工艺所采孺的设备与发达酋家 相比，尚宥很大的差距。倘若依赖逃口，费用会更高，且得不偿失。丽就圆 体发酵工袭而言，仅需发酵室( 近凡颦发酵糙的使厢，占地面积大的弊端已克 服，即在察限的空间下，仍可大量生产，奠见效很抉) 。相比之下，滚体发酵 则需不锈钢等优质发酵罐，盥发酵罐本身结构复杂，适续生产需求多，投资 远麓予固体发酵塑。 馘南交邋大学蕞贞士研究生学位论文第1 2 萸 九十年代初期，在沈阳农监大学陈襁洁教授和曹淡君教授的亲自指导 下，建立了我国第一条年产2 0 0 t 年啦纤维綮酶系列产品的生产线，实现了我 国纤维素酶工业化生产l ”】。他们曾先后将萁生产出的产品酶同国外进口酶进 行了系统比较，终果发现采用菸固体发酵鼓本生产熬纤维素懿在晶质上已其 备与围外进口酶相当，甚至个别方面更优的竞争力1 5 引。另外，国内也有研究 天曼藏滚傣发酵王艺锾了诲多尝试，然瑟冀疑获褥懿懿豢l 裁瓷器矮上不够疆 想，同时成本也很高。另外，荧国、丹麦等发达阐家目前采用的液体发酵工 艺本壤上毽是国体发酵，其爱疲器称淹“玺谚藤”，虽然在努形主酪纭液俸发 酵用的发酵罐，假其内部构造却具备了固体发酵的特征。“生物床”内一层 层务 捌的铜丝桨上袈着发酵藏料，菌株在上面生长，通过傈溢、傈瀣、通风 等措施来获得纤缎素酶。 近年来，国外在“生物涞”的藻础上又在谶一步研究固定化细胞技术， 这是绥维素酶生产工艺上蛇一项毅近震，鹱翦较多地应瘸于滚态发戆中。在 对固定化细胞产酶的研究中发现，诸如产酶周期、p h 值等因子的变化规律 与游离缨毖发酵豢本翱 娃，毽瓣活力骥显撬裹，麓耀酶渡孛游离蘩熊馒少盼 6 1 i 。此外，阐定化细胞技术的发展将会有利于简化纤维桊酶的分离纯化工蕊， 程避纾维豢酶懿掇取嚣糖制，钛嚣逶一步簿低成本。 当前纤维素酶研究的重点在于如何开发新能源，如何解决环境污染问 题。函诧，在遥撵纤维索酶生产工艺时，麓倾向鼍：低能耗、低污染的这样 种技术。从这一点上讲，固体发酵工艺确实具有它很强的优势。然而，出予 固态发酵本身存在纤维索酶难以提取、精制，产晶酶杂质含熬高、灏量不稳 定等蛔题。因此，鼹翦露研究人员将阉态及液态发酵工装结合起来，避行“渡 固式发酵”1 6 ”，即在固态发酵时接种种子懋浮液，一方蕊它能带来一定量的 糖萤薅溪，另一方西其接秘塞较大，每发簿原糕混会较梵均匀，扶嚣提褰了 纤维索酶产量。糟能在此同时引入其它技术，如阉定化细胞技术，便能发挥 莫最大饶势，生产遗受为优溪翡纤缭素酶铡晶。 1 。2 ，4 纾维素酶的应用 纤维素酶最早是1 9 0 6 年s e i l l i e r e 在蜗牛消化液中发现的，能降解天然纤 维索。至1 9 5 0 年，r e e s e 等掇潞了著名静纤维素酶俸焉方式c 1 ，c x 骰说之搿， 开始了纤维素酶纂础研究，包括纤维索酶的性质、作用方式、培养条件及测 定方法等。在6 0 年代焉期，实现了纤维索黼制荆的工业化生产，并为箕开发 利用奠定了基础。目前，纾维索酶的应用强益广泛，荚、墨等发这阉家对獒 西南交遥天学硕士研究熊学位论文第1 3 茭 的利用几乎渗邂到了一切以植物为原料的加工业中，如酿造、果汁与蔬菜汁 加工、粮食加_ i 、食品、饲料、造纸、中草药有效成分提取、植物基因工程 裁绥憝工程以及骧、蘧秀采、绣织王犍、菠零处理等器个方瑟l ； 1 ，2 4 1 纤维素酶在能源工业中的应用 目前，人类正面i 临着严峻的能源危机。印度著囊的物理学家巴巴预测， 渡溅帮远东她睡将在3 0 零内将证石熊滚耗尽：南美、孛美逮医为4 0 年；中 东为6 5 年拍4 1 。而对于生物霪( b i o m a s s ) 这类由竞合作媚产生的可褥生资源来 说，若以平均热值为1 8 1 0 4 k j k g 计算，就相当于目前世界上能源总量的 1 0 倍。但生物爨若直接用佟燃料，其热转化率仅为1 0 。因此，如何提高生 貔藿筑鬟躅率寒缓薅嚣蘩瓣黪添蔻蕊，程季 莛了全畿赛赘普遍鬟撬1 8 l 。迄今 为止，世界备潮( 特别是一贱发达国家) 都纷纷制定了能源计划，并投入了大 墩的人力、物力、财力，用于非化石能源的研究和搿发【”j 。 上世纪寒，美国国家蛾究委员会缎级多个枫梅的众多专家研究并发表了 “基于生耪豹工篷产品；摹萼研及产韭纯麴优先领域”的研究报管。随后，美 国前总统克林顿于1 9 9 9 年8 月1 2 日发布了第1 3 1 3 4 号行政命令，即开发和 促进生物产品( 燃料、化学鼯、生物材料) 和生物能i 螓 【”1 。于是，荧国专门成 立了生物量艉鼹，裁订了联辩生貔量燃摹尊甄裁，势与太粥裁磅究茨荚曩熬蠢 了纤维素发酵的生产按术计划，已建立了酸法永解、酶法水解及二者结合的 三个试验工厂生产酒精。研究内容包括经济有效的原料预处理方法、新菌种 的选育和改进发酵工艺。其中乔治亚大学、佛罗里达大学的高激热纤梭菌的 淡鬣溪精发赘砺究已取撵泠段瞧或莱。努终，鬟鼷麓因搡 车技零爨纾维素赘 旗圆克隆在酿酒酵母 c e r e v i s i a e ) 及运幼发酵单胞麓如m o b i l i s ) 中，使得它们 能够利用纤维索直接转化擞产酒精，该正作已取得很大的进展。同样，日本 墩相应地制订了两个毒关嫩物量利用的研究计划，鲻绿色源诗剡帮生物量 转换计刘，并投入大量入力、物力纣诸实施。现毫宠成由蒸渣、稻草麓原辩 嫩产燃料酒精的中试，豳耗原料7 2 0 k g ，产酒精1 5 0 2 0 0 l ，酒精度为 9 9 5 v o l 。此外，法国、瑞典、巴西等阑也在推行弼再生纤维豢原料酶水解 生产溪蕤瓣熊源诗矧，钛露在整赛藏爨蠹使该分支领域藏灸纾缫豢酶磺究中 缴为活跃并有希望取得重大突破的分支乏一。目前鼠研究出2 0 多套植物纤维 原料酶水解的技术路线，翁的达到了相洳大的实验工厂生产规模。 我国关于纤维索酶在灏精生产方霹黪研究较迟，露前逝处于实验室承平 5 6 1 , 虽然对傻纯培葬基成分襄培养条 孛鹃研究较多，缱对产酶蘩静静致良， 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 4 页 发酵中的抑制剂和激活剂的研究都还很簿弱，故这部分内容还有待于进一步 深入研究。 12 4 2 纤维素酶在洗涤剂工业中的应用 从纤维素酶的作用特性出发可分为两大类：碱性纤维素酶和酸性纤维素 酶。虽然二者同属于纤维素酶类，但它们各自对底物所起作用各不相同。通 常所说的纤维素酶均属于酸性纤维素酶类( 见1 2 2 1 ) ，它们通过各个酶组分 间的协同作用来水解糖化木质纤维素。而碱性纤维素酶则不同，由于它仅具 有e g 活性，故不存在酶组分间的协同效应，因此在与棉纤维反应时，主要 是与其中仅占1 0 左右的非结晶区的纤维素