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硝基苯在鲫鱼和鲤鱼体内的累积与释放研究 摘要 硝基苯( n i t r o b e n z e n e ) 是一种剧毒化学品，属于我国确定的5 8 种优先控制的有毒化 学品之一，又在世界“环境优先控制有毒有机污染物”名单前列。它广泛应用于生产农药、 燃料、炸药、医药、多聚体及其他化工产品。环境中的硝基苯主要来自硝基苯的生产过程 和生产苯胺的工业废水，污染河流。采用水生生物毒性试验的方法来研究硝基苯对水生生 物的富集作用，是评价硝基苯类化合物危险的一个必不可少的部分，为进一步研究此类化 合物的毒性提供依据。本研究采用半静态水质接触染毒方式，用0 5 m g l 和3 o m g l 的硝 基苯分别对鲫鱼和鲤鱼染毒，进行生物累积及释放试验，气相色谱法测定鱼体内硝基苯含 量。样品的前处理技术采用匀浆提取和超声提取结合的方法，提取速度快，提取效率高并 且稳定，样品回收率较高。样品的净化采用自制净化柱的方法，其中填充氧化铝和无水硫 酸钠。结果表明：高、低剂量组鱼体不同器官对硝基苯的富集表现基本一致。其中，鱼鳃、 肠对硝基苯摄取较迅速，累积量大，鲫鱼鳃中硝基苯最大浓度值达1 5 2 1 m g k g ，鲤鱼鳃 中最大浓度值为1 3 4 1 m g k g 。硝基苯在肌肉中进行多次分配。肝、肾富集曲线呈现不同 的变化特征，间接证明其中发生了硝基苯的代谢转化。心脏在2 5 天左右达到最大值后富 集逐渐稳定。0 5 m g l 组低剂量组处理鱼的富集系数较大。用3 o m g l 的硝基苯处理， 鲫鱼鳃对硝基苯的富集系数为2 3 5 ，肠2 3 0 ，肌肉1 6 0 ，肝1 6 1 ，肾1 9 5 ，心脏1 3 4 ； 0 0 5 m g l 的硝基苯浓度组为：鳃5 0 0 ，肠4 3 2 ，肌肉3 0 4 ，肝3 4 2 ，肾3 8 ，心脏2 6 。 不同浓度组之间相比，鱼体对硝基苯的富集与释放均表现出了相同的规律性，不同浓度下， 同一生物的生物富集因子有一定的差异，低浓度组的生物富集因子比高浓度组的生物富集 系数大富集相对稳定，生物富集达到峰值的时间也不同，暴露于高浓度组的生物先于低浓 度组达到富集峰值。由同一剂量组下不同基因型鱼各器官的富集系数进行比较，鲫鱼对硝 基苯更易富集，累积量大。用在0 0 5 浓度硝基苯水溶液中饲养4 5 天的鱼进行清水释放 试验，结果表明释放初期鱼体各器官中硝基苯清除迅速，释放速率符合一级动力学方程， c = 册以”，鱼体各器官的释放半减期为1 3 0 1 9 0h ，相关指数在0 7 9 5 - - 1 8 3 2 之间。 鱼鳃内硝基苯浓度在5 6 h 释放9 5 9 6 ，心脏则在8 2 h 释放达到9 5 。但清除不完全。硝基苯 在两种鱼体内的各个组织和器官中富集系数不同，对硝基苯的富集能力有一定的差异，其 中鳃的富集量较大，鲫鱼高剂量组和低剂量组鱼鳃中硝基苯的累积量分别为0 0 5 0 m g 和 0 0 1 8 m g ，鲤鱼的分别为0 0 3 3 m g 和0 0 1 6 m g 。心脏中硝基苯累积量少，高、低剂量组分 别为0 0 0 3 m g ，0 0 0 1 m g 。根据计算平均累积量，不同种鱼体内各器官硝基苯累积量分布 规律一致，表现出肌肉 鳃 肠 肾 肝 心脏的规律。本研究结果是评价硝基苯对水生生态 环境影响与危害的一个重要指标，为进一步研究硝基苯污染对鱼的危害及其对渔业安全影 响提供基础资料。 关键词：硝基苯，鲫鱼，鲤鱼，富集，释放 s t u d yo nt h eb i o a c c u m u l a t i o n ，e l i m i n a t i o na n dd i s t r i b u t i o no fn i t r o b e n z e n e i nc a r a s s i u sa u r a t u sa n dc y p r i n u sc a r p i o a b s t r a c t n i t r o b e n z e n e ( n b ) ，ah y p e r - t o x i cc h e m i c a l ，i so n eo f5 8 埘o n t yc o n t r o l l i n gp o l l u t a n t so fc h i n aa n d i s o nt h el i s te n v i r o n m e n t a lp r i o r i t yp o l l u t a n t i tw i d e l ya p p l i e si nt h em a n u f a c t u r eo fa g r i c u l t u r a l ，f u e l ， d e t o n a t o r , m e d i c i n e ，m u l t i m o ra n do t h e rc h e m i c a lp r o d u c t i o n n bi ne n v i r o n m e n tw h i c hi sm a i n l yf r o m i n d u s t r i a le f f l u e n t sd u r i n gt h em a n u f a c t u r eo fn ba n da n i l i n ec a np o l l u t ew a t e rb o d y b i o - a e e u m u l a t i o n ， e l i m i n a t i o no f n i t r o b e n z e n ei nc a r a s s i u sa u r a t u sa n de y p r i n u se a r p i ow a ss t u d i e du n d e rs e m i s t a t i cc o n d i t i o n s ， a n du s e d0 5 m g la n d3 0 m g ln i t r o b e n z e n ea q u e o u ss o l u t i o nt os i m u l a t ec o n t a m i n a t e dw a t e re n v i r o n m e n t g a sc h r o m a t o g r a p hw a sa p p l i e dt od e t e c tn i t r o b e n z e n ei nf i s h u s e dh o m o g e n a t ea n du l t r a s o n i ce x t r a c t i o ni n s a m p l i n gp r e p a r a t i o n 。r n l i sm e t h o di sf a s t , h i g h - e f f i c i e n ta n ds t a b l e ，t h er e c , o v t 玎yr a t eo fs a m p l e i sh i g h u s e d s e l f - m a d eg l a s sc o l u m nw h i c hi sw i t ha l u m i n aa n da n h y c l r o u ss o d i u ms u l f a t ei ni tt op u r i f y i n gt h es a m p l e s i t w a si n d i c a t e dt h a tt h ea c c u m u l a t i o no fd i f f e r e n tt i s s u e si n0 5 m g ll e v e lw a st h es a m ea sw h i c hi n3 0 m g l l e v e l b r a n c h i aa n di n t e s t i n ea b s o r b e dn bf a s ta n dm o r e t h em a x i m u mo fn bw o r e15 ，21m g k gi nc a r a s s i u s a u r a t u sb r a n c h i aa n d1 3 4 1 m g k gi ne y p r i n u sc a r p i ob r a n c h i a n bi nm u s c l eh a dm u l t i p l ed i s t r i b u t i o n t h e c 1 1 1 v o so fl i v e ra n dk i d n e yw e r ed i f f e r e n tf r o mc u r v e so fo t h e rt i s s u e s a b n o r m a lp e a k sp r o v e di n d i r e c t l yt h a t t h e r ew a sm e t a b o l i ct r a n s f o r m a t i o no fn i t r o b e n z e i nl i v e ra n dk i d n e y h e a r th a dt h em a x i m u mi nt h e2 5 m d a y , t h eb e c a m es t a b i l i z a t i o n t h eb c fi n0 s m g ll e v e lw a sh i g h e rt h a nt h a ti n3 o m g ll e v e l t h eb c f v a l u e so fc a r a s s i u sa u r a t u st i s s u e sw i t h3 0 m g j ll e v e lw e r e ：b r a n c h i a2 3 5 ，i n t e s t i n e2 3 0 ，m u s c l e1 6 0 ，l i v e r 1 6 1 ，k i d n e y1 9 5 ，h e a r t1 3 4 w i t ho 5 m g lt h e yw o r e ：b r a n c h i a5 ，0 6 ，i n t e s t i n e4 3 2 ，m u s c l e3 0 4 ，l i v e r3 4 2 ， k i d n e y3 8 0 ，h e a r t2 6 0 ，t h eb c fv a l u e so fc a r p st i s s u e sw i t h3 0 m g ll e v e lw e r e b r a n c h i a1 5 4 ，i n t e s t i n e 1 4 5 ，m u s c l e1 3 3 ，l i v e r1 4 0 ，k i d n e y1 4 4 ，h e a r t1 3 3 w i n lo 5 m g lt h e yw e r e b r a n c h i a4 2 2 ，i n t e s t i n e4 1 4 ， m u s c l e2 4 4 ，l i v e r2 5 2 ，k i d n e y3 3 6 ，h e a r t2 4 2 t h ct i m ew h e na p p e a r e dm a x i m u mi no 5 m g ll e v e li sf a s t t h a ti n3 0 m g ll e v e l 。i nt h es a m el e v e lc a r a s s i u sa u r a t u sa b s o r b e dn bm u c hm o r et h a ne y p r i n u sc a r p i o w h e n n bi nf i s h e sr e a c h e de q u i l i b r i u m ( 4 5 d ) i no 5 m e , ll e v e l ，t h ec a r a s s i u sa u r a t u sw a su s e dt od or e l e a s et e s t ， w h e nt h et e s tb e g a nn bi na l lt h et i s s u er e l e a s e df a s t t h er a t e so fe l i m i n a t i o ni nt w ok i n d so ff i s hw e r eq u i c k a n da c c o r d e dw i t hf u - s to r d e rk i n e t i c se q u a t i o n ，c = c o e 一a n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r eo 7 5 9t o 1 8 3 2 t h eh a l f - l i f ep e r i o d sw e r e ：b r a n c h i a1 3 0h ，i n t e s t i n e1 6 7h ，m u s c l e1 4 6h ，l i v e r1 7 9h ，k i d n e y1 7 4l i ， h e a r t1 9 0h a l lk i n d so ft i s s u e sh a dd i f f e r e n tc u m u l a n tv a l u e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed i s t r i b u t i o no f n i t r o b e n z e n ei nd i f f e r e n tt i s s u e sf o l l o w e dt h er u l e ：m u s c l e b r a n c h i a i n t e s t i n e k i d n e y l i v e r h e a r t a n dt h e c a r a s s i u sa u r a t u sa n de y p r i n u sc a r p i of o l l o w e dt h es a m er u l e k e yw o r d s ：n i t r o b e n z e n e , c a r a s s i u sa u r a t u s ，c y p r i n u sc a r p i o ，a c c u m u l a t i o n ，e l i m i n a t i o n m 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 学位论文作者签名：j k 嘭j 遗 签字日期：矿矿 年伯，7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 学位论文作者签名：了投也j a 签字日期： 二】i ，誓年历7 e 导师签名：芝毫陟妣 签字日期：勿口年乡月夕日 吉林农业大学硕士学位论文硝基苯在鲫鱼和鲤鱼体内的累积与释放研究 1 1 硝基苯污染概述 1 前言 硝基苯( n i t r o b e n z e n e ，n b ) 是一种剧毒化学品，属于我国确定的5 8 种优先控制的有毒 化学品之一n 1 ，广泛应用于生产农药、燃料、炸药、医药、多聚体及其他化工产品昭3 1 。 硝基苯又称密斑油，室温( 2 0 ) 下硝基苯为无色或淡黄色、具苦杏仁味的油状液体。可溶 于水，易溶于乙醇、乙醚等多数有机溶剂。硝基苯系易燃的芳香族化合物，闪点8 8 。c ( 闭 口杯法) ，在空气中的爆炸极限( 下限) 为1 8 。硝基苯比重大于水，浓度较高时会沉入水 底，长时间保持不变，又由于其在水中有一定的溶解度，所以造成的水体污染会持续相当 长的时间。沸点为2 1 0 。9 ，是半挥发性有机物。 人体接触硝基苯，其蒸气能经肺吸收，也可经皮肤缓慢吸收，其液体易经皮肤吸收。 皮肤对液态硝基苯吸附可达o 2 3 o m g c m 2 h o u r h l 。硝基苯的主要致毒作用有以下几个方 面：1 形成高铁血红蛋白的作用主要是硝基苯在体内生物转化所产生的中间产物对 氨基酚、问硝基酚等的作用】。2 溶血作用。发生机制与形成高铁血红蛋白的毒性有密切 关系。硝基苯进入人体后，经过转化产生的中间物质，可使维持细胞膜正常功能的还原型 谷胱甘肽减少，从而引起红细胞破裂，发生溶血。3 肝脏损害。硝基苯可直接作用于肝细 胞致肝实质病变，引起中毒性肝病、肝脏脂肪变性，严重者可发生亚急性肝坏死哺1 。4 急 性中毒者还有肾脏损害的表现，此种损害也可继发于溶血。同时硝基苯又具有致突变性。 因此硝基苯是我国确定的优先控制的有毒化学品之一，又在世界“环境优先控制有毒有机 污染物”名单前列国1 。美国环保局将硝基苯列为d 类致癌物质，r j d 类为没有充分数据证明 对人类有致癌作用的物质。国际癌症研究机构( i a r c ) 认为硝基苯属于2 b 类，即表示在动 物中有致癌作用，在人类中证据还不充分或没有证据。在我国地表水环境质量标准 ( g b 3 8 3 8 2 0 0 2 ) 中，集中式生活饮用水地表水源地特定项目限值硝基苯为0 o t 7 m g l ，这 与美国环保局发布的保护人体健康水质基准中硝基苯的限值一致。最新的俄罗斯饮用水标 准于2 0 0 2 年1 - 月实施，其中硝基苯限值为0 2 m g l ，宽于我国国家标准。 硝基苯不能自然产生，是人工合成的化合物p 1 ，有工业和非工业两种来源，尚未发现 天然成因的硝基苯。释放到水环境中的硝基苯主要来自其在工业上的使用。工业上硝基苯 是在硫酸催化下，由苯与浓硝酸的硝化反应生成。硝基苯生产过程中可产生0 1 的排放， 而当硝基苯作为溶剂使用时，其挥发损失更大。洗涤废水是硝基苯生产流程中最大的污染 源，其硝基苯含量可达2 0 0 0 m g l ，并含有少量苯、硝基酚、硫酸盐、硝酸盐等成分。其它 以硝基苯为原料的工业，废水中硝基苯含量一般在2 0 0 - 3 0 0 m g l 之间，苯胺含量3 0 m g l 左 右。硝基苯废水排放占普通工业废水的2 。非工业来源方面的主要在市政污泥焚烧装置、 危险废弃物填埋场和垃圾填埋场等场地空气中硝基苯浓度的监测中发现。其成因是氮氧化 吉林农业大学硕士学位论文硝基苯在鲫鱼和鲤鱼体内的累积与释放研究 物存在下苯的大气反应，或苯胺的臭氧氧化。硝基苯在大气中的保留时间为1 9 0 天，去除 过程除光解外，可能包括硝基苯的沉降( 相对于空气的蒸汽密度为4 卜4 2 5 ) ，而降水和降 尘的淋洗则可忽略。空气中的硝基苯部分进入到水环境，也可成为水环境中硝基苯的一个 污染来源。据统计们，在生产、储运和使用过程中，全球每年排入环境的硝基苯超过1 0 0 0 0 吨。随着精细化学工业的发展，对硝基苯的需求不断增长，每年进入环境的硝基苯数量持 续增加。 硝基苯可被光解作用或微生物的生物降解作用降解。 硝基苯的物理性质表明，尽管速度不快，但它可以从水中转移到空气中。硝基苯在空 气与水中的光降解作用是很慢的，空气中直接的光解作用试验表明，存在期低于l d ，但测 定的羟基半衰期反应时间是1 9 2 2 3 天。在臭氧作用下，反应速度还要慢。在水中，直接 光解作用的降解速度要快得多( 半衰期为2 5 _ 6 d ) ，然而间接光解作用( 羟基，h 原子，含 水电子的光氧化作用) 起的作用很小( 通过致敏物质集中，氢氧根的半衰期反应在1 2 5 天到 1 3 年之间) 。由于硝基苯适度的水溶性，相对较低的蒸汽压，在某种程度上可认为它在空 气中可被雨水带走。关于水中硝基苯挥发的准确数据有些争议，通过计算机模型计算，挥 发作用的半衰期是1 2 天( 河里) 川8 天( 富养分的湖里) 。在文献中被证实的最短时间是l 天 ( 河水里) ：在另一项微观世界的试验研究中，模拟土地引入废水，报道指出硝基苯不是挥 发，而是完全被降解。降解研究表明，硝基苯在污水处理厂被降解是需氧过程，在缺氧情 况下降解速度要变慢。在废水中如果高度浓缩，硝基苯可能会降解不完全。高浓度硝基苯 可能还会抑制生物降解其他废物的作用。生物降解硝基苯主要依靠适应环境的微生物群 体，不适应环境的接种物降解通常因非常缓慢而忽略不计，因此降解过程主要发生在微生 物群体适应环境之后。在缺氧的环境中，即使是在微生物适应环境后降解硝基苯也是非常 缓慢的。 1 2 硝基苯的环境毒理学研究 毒理学( t o x i c o l o g y ) 指研究毒物对于生物体的毒性反应、严重程度、发生频率和毒性 作用机制的科学m 3 。环境毒理学是利用毒理学方法研究环境污染物对生物，尤其是人体健 康的影响及其机理的学科。研究环境毒环境毒理学的任务不仅要研究环境污染物对生物个 体的损害作用，而且要研究对生物群体、生态系统、甚至特定环境下的整个生物社会的损 害作用及其防治对策。环境毒理学属于环境科学范畴，也是生物科学和毒理学的分支学科。 它已从单纯研究毒物的学科，飞速发展成为- - f 现代的综合性的学科n 2 1 。主要内容包括： ( 1 ) 研究环境毒物与肌体相互作用的一般规律，包括毒物接触肌体后的吸收、分布、代谢 转化、排泄等过程和毒作用机理，探求其对肌体健康损害的早期反应指标，预测其对健康 的潜在危害，以便及早防治。( 2 ) 研究环境毒物对肌体影响的作用条件及其影响因素，除 主要通过动物实验外，还应结合现场调查，以观察环境毒物在环境中的浓度、分布、变迁、 2 吉林农业大学硕士学位论文硝基苯在鲫鱼和鲤鱼体内的累积与释放研究 侵入方式、接触时间以及其他作用条件对肌体反应的影响。( 3 ) 研究环境毒物及其转化产 物的毒性和评定方法，主要包括各种毒性试验，以测定其急性、蓄积性、亚急性、亚慢性、 慢性毒性和“三致性，以及多种有毒物质共存时的联合毒性。从剂量一反应关系中得出 对肌体作用的相对安全界限( 最大无作用水平) ，为制定环境卫生标准提供依据。多年来 的实践证明，环境毒理学已在环境化学物的毒性评定、人体健康效应、环境病病因和发病 机理研究、环境卫生标准的研制等方面发挥了积极作用。 1 2 1 水生生物毒理学 水生生物毒理学是研究有毒物质对生物活体和水生生物生态系统作用的性质和机理 的学科。研究的范围包括水体中主要生物类群的代表性生物的毒性实验，如游泳性生物的 代表氇类，浮游动物代表蚤类以及浮游植物代表藻类的毒性实验。水生生物 毒理学提供的信息，可以在环境科学中得到多方面的应用：1 作为制定水质标准的基础资 料。水生生物急性与慢性毒性实验可获得毒物对各类水生生物的半致死浓度l g 。和最大无 效应浓度。水生生物在水环境中占有非常重要的作用，因此在制订水环境标准时，水生生 物毒性实验的结果是不可缺少的基础资料。2 综合评价水质状况。造成水体污染的因素往 往是多方面的。采用物理或化学的方法可得出水体中各种污染物的含量。通常当几种有毒 物质共存时，其共存的毒性往往不是简单的加和，其间会发生协同或拮抗作用。使用毒理 学方法对水质进行综合性的监测，可以得到直观简明的评价结果。在另一类更为特殊的情 况下，若评价的水体成分复杂，或由于方法的检出限的限制，使用化学的方法在技术上存 在难度，在这种情况下应用毒理学方法进行水质评价，往往能得到较好的效果。3 评价毒 物对人体健康的影响。水体中有毒物质不仅对水生生物产生危害，而且还会通过食物链对 人体健康产生影响。利用在较低浓度下的生物累积试验，研究毒物在食物链中的传递机理， 有利于认识毒物对人体的潜在影响。4 解决由于毒物污染引起的环境纠纷。用理化监测手 段可以精确地分析水体中各种有毒物质，但在实际工作中出现的污染纠纷的复杂性，仅仅 使用理化监测的结果来分析污染事故的原因有时资料不足。应用毒理学实验手段获取污染 水体对水生生物造成危害的第一首资料，再结合理化监测的结果，可以获得有说服力的结 果。 水生生物毒性试验是环境毒理学的研究方法之一。水生实验动物生活在水中，自然成 为水环境保护研究不可缺少的材料，更因其对环境污染的敏感性，成为环境保护科学研究 的重要的实验动物。在经济合作与发展组织( o e c o ) 推行的化学品环境管理要求的生物效应 和降解与蓄积两个类别的测试数据中，均有近5 0 为水生生物的测试项目，可见水生实验 动物对于环境保护科学研究的重要性n 。常用于水生生物毒性试验的生物有三类：游泳性 水生生物，主要指各种鱼类；浮游动物，以蚤类为代表；浮游植物，如藻类。其中鱼类是 水生生物中较为重要的一种，鱼类对水环境变化反应十分敏感，且容易观察，常被用作各 吉林农业大学硕士学位论文硝基苯在鲫鱼和鲤鱼体内的累积与释放研究 种水体污染有机物生物毒性试验的材料。 水生生物毒理学研究的方法有：生物生长指数试验、光减率试验、贝类开壳率试验、 鱼类生理生化反应试验、鱼类回避试验、代谢试验、富集试验、致突变试验等。外源性化 学物在机体内的富集作用是化学物发生慢性中毒的物质基础。 生物富集指同一生物个体在生长发育中直接从环境介质或从所消耗的食物中吸收并 积累外来物质会随着其生长发育而不断增加的现象，其程度可用富集系数表示。生物富集 系数( b c f ) 反映一种化合物被生物体富集时可能达到的程度。在稳定状态下试验鱼体内 受试物浓度与试验液中受试物浓度的比值，就是该化合物在鱼体中的富集系数。它是估算 水生生物富集化学物质能力的一个量度，是描述化学物质在生物体内累积趋势的重要指 标。o e c d 组织提出了生物富集系数的多种测定方法m 1 ，主要有静态法和流动法两大类。研 究化合物生物富集是化学品危险评价的一个必不可少的部分汹3 。鱼类能通过鳃与表皮，从 水中富集污染物质，也能从饵料中蓄积污染物质。本研究是鱼在半静态不投食情况下进行 的。 。 1 2 2 国内外研究进展 硝基苯对水生生物的毒理学报道国内外都很少，多见于硝基苯类物质或硝基芳族化合 物对各类水生生物影响的报道。p o - y u n gl u n 础等( 1 9 7 5 ) 用一个包含6 条食物链的水生生态 系统模拟装置对硝基苯的环境行为进行了研究。研究结果表明，硝基苯浓度为0 o l m g l 珈1 m g l 时，其在水生生物中的储存和富集不明显，大部分硝基苯滞留在水中，有机体 将硝基苯代谢为苯胺、硝基酚等。1 9 8 7 年，d e n e e r 等n ”研究7 2 2 种硝基芳族化合物对发光 菌、蛋白核小球藻、隆线蚤类的急性毒性，并根据化学品结构与生物活性相关的结构一活 性定量关系( q s a r ) 得到相应的q s a r 表达式。金琼贝n 砌等选择隆线蚤为试验材料，以松花 江水体中可检出的2 4 种硝基芳烃化合物为测试毒物，研究硝基芳烃化合物对隆线蚤的毒理 学效应，求取了毒性数据4 8 h - l g 。刘静玲n 钔等报道了2 ，4 一二硝基甲苯与6 种硝基芳烃共 存时对斜生栅列藻的生态毒理效应。t h o m u l k a 心等报道了硝基苯和三硝基苯对海洋细菌的 联合毒性。a l t e n b u r g e r 乜等研究了1 4 种硝基苯对藻类的联合毒性。袁星心引等分别测定了 取代苯胺和苯酚对鲤鱼的9 6 h l ，对发光菌的1 5 m i n - e c 。以及对绿藻的4 8 h - e c 5 。，表明三 种水生生物的毒性之间有显著的相关。王春梅1 等研究了1 8 种硝基苯对大型蚤的毒性与结 构相关性，建立了预测硝基芳烃化合物毒性数据的预测方程。徐镜波昭们等应用鱼体肝脏体 外直接染毒测定e r o d 的方法，以苯并( a ) 芘作为诱导e r o d 活性的模型化合物，探讨了9 种 硝基苯的毒性。结果表明在一定浓度范围内，9 种硝基苯对鲤鱼肝微粒体e r o d 的活性均有 诱导作用，剂量效应关系明显。 目前关于硝基苯类化合物对实验生物的毒理学效应研究报道比较多，然而针对硝基 苯对水生生物如鱼类、软体动物、浮游植物或浮游动物等的毒性报道大部分局限于其致死 4 吉林农业大学硕士学位论文 硝基苯在鲫鱼和鲤鱼体内的累积与释放研究 率的研究上，探讨硝基苯在水生物体内的富集与消除对生物体正常生化过程的影响、 以及其组织损伤效应的研究很有限。王阳峰汹1 等考查了1 3 种硝基苯类化合物对大型蚤的 2 4 h 和4 8 h 半数致死浓度。结果表明硝基苯类化合物因其取代基的不同或其取代基位置的不 同而对大型蚤表现出不同的毒性，且对二硝基苯的毒性最强。游学军胆引等研究了对氯硝基 苯对草鱼种的急性和亚急性毒性实验，分析了对氯硝基苯对草鱼肝胰脏过氧化氯酶( c a t ) 活性的影响并探讨了对氯硝基苯对草鱼活性氧自由基产生的影响和可能的致毒机制度及 其剂量一效应关系以及草鱼粘液的解毒功能。h a l l 乜 曾报道过硝基苯对黑头呆鱼的急性毒 性数据l g ( i l c 5 。) 为3 0 2 。袁星等测定了该类化合物对鲤鱼的半致死量，并讨论了该类化 合物电子结构与毒性的关系。已报道对硝基苯能抑制草鱼肝胰脏过氧化氢酶的活性， 严 重时可导致鱼类的死亡啪3 。郎佩珍位钔等设计出流动式生物浓缩试验装置，保证暴露水中硝 基苯浓度稳定，其暴露浓度为4 m g l ，测得的l g b c f 值为0 7 6 ；在消除实验中，测得硝基苯 的半减期为0 5 h ，并推测在富集过程发生了代谢转化，从而提出与之相符的生物浓缩机制 与动力学模型，即认为动态试验条件下硝基苯的生物积累过程可能伴有滞后发生的酶促代 谢过程，并遵守滞后酶促动力学。籍国栋等们以硝基芳烃对发光菌的半数有效浓度e c 5 0 和黑呆头鱼9 6 h 急性浓度值为生物活性参数，首次应用次最低空轨道能e n l u i o 对硝基芳烃 进行多参数q s a r 研究，结果表明，硝基芳烃化合物的活性不仅与最低空轨道能e l u m o 有关。 朱志宁懵浓度为0 0 5m g l 的硝基苯水溶液饲养鲤鱼做富集和释放的实验表明富集不明 显。王斌2 以3 5 种硝基苯类化合物对黑呆头鱼的急性毒性数据l g ( i l c 5 。) 为研究对象，根 据受体学说模型，建立l g ( 1 l q 。) 对相关理化参数的q s a r 方程，从而探讨硝基苯类化合物 的致毒机理。研究结果表明，硝基苯对鱼类的急性毒性是由化合物的亲电反应性决定的， 而化合物的亲电反应性主要是受苯环上硝基的数目和位置决定。薛良义3 1 等采用单细胞凝 胶电泳技术( s i n g l ec e l lg e le l e c tr o p h o r e s i s ， s c g e ) 对染毒为0 1 、0 2 、0 3 和 0 4 m g l 浓度的鲫鱼血细胞进行观测后发现硝基苯对鲫鱼血细胞d n a 的损伤明显，并且呈现 明显的剂量一效应关系。沈洪艳等泓1 用静水生物测试研究了对氯硝基苯( p - n c b ) 、间二硝基 苯( m - d n b ) 和2 ，4 一二硝基氯苯( c d n b ) 对锦鲤鱼的急性毒性，并报道对氯硝基苯、间二硝基 苯和2 ，4 一二硝基氯苯对锦鲤鱼的急性毒性顺序为2 ，4 一二硝基氯苯 间二硝基苯 对氯硝 基苯，3 种化合物的安全浓度分别2 2 1 3m g l 、1 4 5 3m g l 和0 0 6 9 2 m g l 。 1 3 硝基苯的分析方法 1 3 1 样品前处理方法介绍 对硝基苯在动物体内的提取方法，文献介绍的较少。根据其他有机污染物的萃取方法， 前处理技术主要有以下几种。 1 3 1 1 蒸馏法水蒸气蒸馏法是一种较传统的提取方法，适用于具有挥发性的，能随水 蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。此类成分的沸 5 吉林农业大学硕士学位论文 硝基苯在鲫鱼和鲤鱼体内的累积与释放研究 点多在1 0 0 以上，并在1 0 0 左右有的蒸气压。文献报道较多的为各种挥发油成分的提取。 传统水蒸气蒸馏法存在一定的缺点，如装置中的胶塞可能在提取过程因有机溶剂泡而污染 样品，提取时间长等。但迄今为止，水蒸气蒸仍为一种较传统的提取方法。 1 3 1 2 索氏提取法索氏提取( s o x h l e t ) 是种液圃萃取，利用相似相溶原理通过反复 抽提，使样品中的有机成分溶解于有机溶剂中，然后蒸发有机溶剂，剩余物为样品中所要 提取物。将固体物质研碎，可以增加固液接触的面积。使用在沸腾时冷凝下来的萃取溶剂 对固体物质反复进行萃取，从而可以使萃取溶剂的用量大大减少。副。索氏提取法般常用 于对植物和土壤的提取，样品与溶剂充分接触，使萃取完全。王萍等啪1 用索氏提取法成功 的分离了小苏打试样中的聚丙烯酰胺与丙烯酰胺。 1 3 1 3 匀浆萃取法匀浆萃取是指生物组织利用匀浆装置进行组织匀浆或磨浆，通过机 械及液力剪切作用将样品撕碎，并加入化学性质相似的萃取剂，以提取活体组织中有效成 分的一种提取方法。匀浆萃取装置具有强度很高的粉碎效果、对各种动物、植物的组织均 能起到匀浆和混合的作用。在不同的速度下，能破碎不同的细胞膜，尤其对各类纤维性较 强的植物以及动物组织的小量内脏、肌肉等进行粉碎、分析更为适合。对有机物和水，不 相容的两种液体之间的高效分散、乳化和水中微量有机化合物、脂溶物、有机溶酶、可溶 性物质的萃取也非常适用。祖元刚等b 7 对鲜法匀浆萃取烟叶中茄尼醇的工艺进行了研究， 确定了最佳的工艺参数，使茄尼醇的提取率达n o 7 2 2 ，并将该法与超声提取、索氏提取 和超临界二氧化碳萃取进行了比较，结果匀浆提取是超声提取、索氏提取、超临界二氧化 碳萃取的1 3 2 、1 6 2 倍、1 9 8 倍。鲜法匀浆萃取所用提取时间短，提取溶剂用量少，常用 于对氨基酸、蛋白质和萜类物质进行提取删。 1 3 1 4 超声提取法超声提取的原理主要包括机械作用、热学作用及空化作用，是利用 超声波辐射产生的强烈的空化效应“、机械振动1 、热效应h 钔、高的加速度、乳化、扩散、 击碎和搅拌等多种作用， 增加物质分子运动的频率和速度、溶剂的穿透力， 从而加速目 标成分进入溶剂。超声提取可极大地提高提取效率，具有节约溶剂，简便快速、重复性好、 不影响提取物的活性等许多优点，它作为一种有效提取手段在动植物、土壤等样品分析的 前处理中被广泛使用。例如施卫平等3 曾利用超声波萃取法测定污染水稻中甲胺磷的含 量；陈忠林等m 1 用超声萃取法测定污泥中的硝基苯，试验从样品预处理到检测完毕只需 9 0 m i n ，得出该方法是测定沉积物中硝基苯含量的高效方法的结论。王力h 钉研究了沉积物 中六氯苯的超声萃取条件。杨伟球等m 1 比较了索氏提取法与超声波提取法测定土壤中六六 六残留量，表明两者结果没有显著的差异性，而超声提取法更节省时间，并减少实验室的 污染。 本研究采用匀浆提取和超声波提取两种方法，更好的的提高了样品的回收率。 1 3 2 硝基苯的检测方法 6 吉林农业大学硕士学位论文 硝基苯在鲫鱼和鲤鱼体内的累积与释放研究 目前国内用于测定荇染物硝基苯类的方法有紫外分光光度法m 1 、气相色谱法“ 、极谱 法啪1 、伏安法m 1 、高效液相色谱法璐训，它们各有其特色。其中分光光度法和气相色谱法应 用最为广泛。 1 3 2 1 气相色谱法气相色谱法自1 9 5 2 年问世以来，经过5 0 多年的发展，现在已成为一 种重要的分离分析方法。其特点如下：( 1 ) 分离效能高，分析速度快。一般的气相色谱分析 一次仅需几分钟，最长也在几十分钟内完成：( 2 ) 样品用量少，检测灵敏度高。这是由于普 遍使用了高灵敏度的检测器而广泛应用于分析痕量杂质和超纯物质等。( 3 ) 选择性好。对 物质有不同作用力的固定相，在适当的温度下，使组分的分配系数有较大差异，从而分离 恒沸混合物、沸点相近的物质、简单的同位素、空间异构体、同分异构体、旋光异构体等。 ( 4 ) 应用范围广。气相色谱法能广泛应用于热稳定性好的气体和易挥发物或可转化为易挥 发物的液体和固体样品的定性与定量分析。根据对水样处理方法的不同又可分为液一液萃 取法、吸附富集法、液上空间法、直接进水样法。直接进水样法不会引入干扰成分，不会 造成被测组分的损失，快速、简便、精确，而且对检测器的性能不会产生影响。g b l 3 1 9 4 9 1 规定了地表水、工业废水和地下水中硝基苯的气相色谱测定方法。测定生物样品中的微量 硝基苯，先要净化处理样品，再用萃取法将硝基苯萃取出来，再用气相色谱进行测定。1 9 9 8 年b a d e r 哺u 使用g c m s 选择性离子监测法来来测定硝基苯的化合物，包括尿液中硝基苯。分 析物在微克每升范围内可被检测到，此方法可用来检测职业的或通过环境接触人们。樊萍 哺副详细列举和比较了分析硝基苯的各种气相色谱法周集体旧1 等报道了液一液微萃取气相 色谱法测定小量水样中痕量硝基苯，使用f i d 检测器和d b - i 大口径毛细柱，不需要对有机 相进行干燥处理。利用有溶剂效应的柱温程序提高了柱效和检测灵敏度。l o m l 水样可获得 0 5ug l 的检测下限。方法的精密度优于4 ，回收率大于9 5 。王玉军嵋引等建立了气相色 谱测定植株样品体内硝基苯含量的方法，采用d b - 1 7 0 1 石英毛细管色谱柱分离，g c - pe c d 检测，3 个水平添加时的平均回收率为9 5 9 。李青山、贺尊诗嘲1 采用毛细管气相色谱法分 析了水中痕量硝基苯类和氯代烃类化合物。采用国产的g d x - 5 0 2 树脂吸附，苯作洗脱剂， 用附有s c 3 h 和6 3 n i 电子扑获检测器的玻璃毛细管s p - 2 3 0 5 全型气相色谱仪同时分析两类化 合物，结果表明此法操作简便、准确、灵敏，检测下限可达p p t 级，测定误差小于1 0 。 借分析模拟水样对该法的可靠性加以验证，重复9 次，测定的r s d 在1 2 卜5 8 之间。 1 3 2 2 高效液相色谱高效液相色谱( h p l c ) 法也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。 它是以液体作为流动相的一种色谱法。它可以分离检测极性强，分子量大以及粒子型样品， 尤其对不易气化或受热易分解的样品检测更能显示出它突出的优点。近年来，采用高效固 定相、高压泵和高灵敏度的检测器，柱前或柱后衍生技术、以及计算机连用等，大大提高 了液相色谱的检测效率、灵敏度、速度和操作自动化程度，现己成为有机锡化合物痕量检 测不可缺少的重要检测方法。液相色谱应用于硝基苯的检测多集中在水体中，刘敬东嘲1 曾采用高效液相色谱测定水中硝基苯。王静馨嘞1 用高效液相色谱法( h p l c ) 分析了苯胺中微 7 吉林农业大学硕士学位论文 硝基苯在鲫鱼和鲤鱼体内的累积与释放研究 量硝基苯。王建刚等采用反相高效液相色谱法测定废水中硝基苯含量，建立了分析废水中 硝基苯含量的方法。方法采用s p h e r i s o r bc m 色谱柱( 2 5 0 r i o n x4 6 m i n x5um ) ，甲醇一水一醋 酸( 7 0 ：2 9 ：1 ) 为流动相，流速0 9 m l m i n ，2 6 2 n m 为检测波长。结果表明，该方法准确、 快速，回收率9 7 0 一1 0 1 - 4 ，相对标准偏差小于2 5 ，线性范围在0 4 _ 1 0 0g m l 。用 上述方法分析实际水样结果令人满意。 1 3 2 3 分光光度法p i o t r o w s k i 墙铂首先使用比色法，使吸收复合物通过l o m l 冰冷的水来 测定硝基苯在空气中的水平。将5 l 气体通过l o m l 水可使灵敏度达到3 心，自差系数为5 。 国家环保局水和废水监测分析方法第三版中规定硝基苯的测定采用“还原偶氮 光度法”作为常规分析方法，该方法是在含硫酸铜的酸性溶液中，由锌粉反应生成初生 态的氢， 将硝基苯还原成苯胺，经重氮偶合反应， 生成紫红色染料，进行比色测定。 1 3 2 4 伏安法金利通等1 用阴极溶出伏安法测定了水中痕量硝基苯。以n a f i o n 化学修 饰电极作工作电极，硝基苯在其上富集1 5 m i n ，回收率为1 0 5 6 9 卜1 1 3 1 ，检测限低至 0 0 0 2 u m l l ，检测范围为o 0 1 珈2 u m l l 。华秀等旧1 也作了类似的研究工作，但硝基苯 同系物之间的干扰难以消除。人工神经网络( a n n ) 一伏安分析法则可消除这种影响，且同时 可对邻、间、对二硝基苯混合物进行定量分析啼引。该法是将反向传播算法的前馈神经网络 用于导数脉冲伏安分析，以盐酸一氯化钾一乙醇溶液为介质，悬汞电极作工作电极。通过对 网络结构和参数的优化，加快了训练速度，提高了预测准确度。预测的相对误差分别为 4 2 6 、4 9 9 4 - 和4 8 6 。此法( a n n ) 优于最小二乘法( p l s ) 。此外，张霞采用吸附溶出伏 安法也测定了废水中的二硝基苯。 1 3 2 5 极谱法这是一种测定废水中硝基苯同系物的常见方法。制药及染料等工厂的废 水中常含有硝基苯，对人和动物中枢神经、血液、心脏毒性较大并有溶血等病症。中华医 学科学院环境卫生监测站推荐硝基苯分解定氮法的最低检出浓度为0 7 2 m g l ，经典