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稻瘟病菌m n h 6 和m t p l 基因的克隆和功能分析 摘要 稻瘟病是一种严重危害水稻的毁灭性病害,其病原菌为子囊菌k l a g n a p o r t h e g r i s e a 。稻瘟病菌也是一种研究病原真菌一寄主植物相互作用的模式生物。研究 稻瘟病菌致病的分子机理不仅对于了解病原真菌一寄主的互作机理,而且对于开 发新的杀菌剂具有重要的促进作用。稻瘟病菌致病相关基因的克隆和功能分析是 研究稻瘟病菌致病机制的一种快速且有效的途径。非组蛋白基因6 ( n z n h 6 ) 和i i i 型膜整合蛋白( m t p l ) 是稻瘟病菌的两个功能未知的基因。目前为止,还没有在 稻瘟病菌或其他丝状真菌中研究过m n h 6 和m t p l 基因或其同源基因的功能。本文 克隆了m n h 6 和m t p l 基因,通过d n a 同源置换分别敲除了这2 个基因,并分析了 基因缺失引起的稻瘟病菌表型和致病性变化,确定了这2 个基因在稻瘟病菌生 长、发育和致病过程中的部分功能。 主要研究结果如下: 1 利用长距离p c r 从稻瘟病菌附着胞e d n a 文库中克隆了u n t h 6 和m t p l 基因的 e d n a 序列,并从基因组d n a 中克隆了m n h 6 和m t p l 基因的全长d n a 序列。 2 使用多种分析软件,分析和预测了m n h 6 和m t p i 蛋白的结构和功能。m n h 6 为 非组蛋白( d n a 结合蛋白) ,属于h m g b 蛋白家属。m t p l 为一种i i i 型膜整合 蛋白,具有8 个跨膜区,可能结合在细胞膜上。 3 通过构建基因敲除载体和原生质体转化,分别获得了m n h 6 缺失或m t p l 缺失 的基因缺失突变子,并从d n a 水平和r n a 水平进行了验证。 4 突变子a m n h 6 的菌落形态不同于野生型g u y l l ,菌落呈灰白色,菌丝稀疏, 生长速度变慢,产孢菌丝细胞壁的溶剂疏水性消失,菌丝细胞壁容易被细胞 壁降解酶降解,产孢减少,孢子形态变得细长,孢子的附着胞形成率降低, 附着胞的膨压降低,附着胞对寄主植物表面的穿透能力减弱,侵入后生长速 度减慢,喷雾接种后对大麦和水稻c 0 3 9 的致病性消失。枷占基因重新引入 am n h 6 后,突变子的表型恢复。 5 m n h 6 - g f p 融合蛋白主要在细胞核内表达,说明撤h 6 蛋白的作用位点主要在 细胞核内。m n h 6 在稻瘟病菌致病循环过程中的各个发育时期具有重要作用, 如菌丝生长,产孢,附着胞形成,穿透,侵入生长等时期,表明m n i i 6 是稻瘟 病菌致病性和完成侵染循环所必需的。 6 突变子a m t p l 的菌落形态类似于野生型g u y l l ,但菌丝颜色较黑,产孢减少, 孢子萌发延迟,附着胞形成延迟,离体接种发现突变子对大麦和水稻c 0 3 9 的致病性与野生型一致。突变子am t p l 在各种培养基上的生长速度与野生型 没有差异,两者附着胞膨压也没有区别。 7 m t p l 启动子指导的g f p 蛋白主要在稻瘟病菌的菌丝和孢子中表达,附着胞中 表达量较少。m t p l 基因对于稻瘟病菌的生长没有明显的作用,但对于稻瘟病 菌的产孢、孢子萌发具有重要的作用。它对于稻瘟病菌的致病性是非必需的。 关键词:稻瘟病菌;m n h 6 ;m t p l :非组蛋白;膜结合蛋白;功能分析 m c l o n i n ga n df u n c t i o n a la n a l y s i so f m n h 6a n dm t p lg e n e si n r i c eb l a s tf u n g u s ,m a g n a p o r t h eg r i s e a a b s t r a c t r i c eb l a s ti sas e v e r ed i s e a s et oh a r mr i c ea n dt h er i c eb l a s tf u n g u si sa w e l l - k n o w na s c o m y c c t em a g n a p o r t h eg r i s e a t h i sf u n g a lp a t h o g e nh a sb e e nu s e da s a p r i m a r ym o d e l f o re l u c i d a t i n gv a r i o u sa s p e c t so ft h ep a t h o g e n h o s ti n t e r a c t i o nw i t h i t sh o s t a n dt h er e s u l t st or e s e a r c ht h em o l e c u l a rb a s i so ft h i sd i s e a s en o to n l yh e l pu s t ou n d e r s t a n dt h ep a t h o g e n h o s tp l a n ti n t e r a c t i o n ,b u ta l s op r o m o t et oe x p l o i tn e w b a c t e r i c i d e i d e n t i f i c a t i o no fp a t h o g e n i c i t y - r e l a t i v eg e n e si saq u i c ka n de f f e c t i v es t e p t os t u d yt h em o l e c a l a rb a s i so ft h i sd i s e a s e an o n h i s t o n e6 ( m n h 6 ) a n dat y p e i i i i n t e g r a lm e m b r 卸ep r o t e i n ( m t p l ) a r et w ou n k n o w np r o t e i n si nf u n c t i o n so fr i c e b l a s tf u n g u s u n t i ln o wg e n e s , n m h 6a n dm t p l ,o rt h e i rh o m o l o g o u sp r o t e i n sw e r e s t u d i e di n r i c eb l o tf u n g u so ro t h e rf i l a m e n t o u sf u n # i nt h i sp a p e r , m n h 6a n dm t p l g e n e si n 正g r i s e aw e r ec l o n e d a n dt h e i rr o l e si ng r o w t h d e v e l o p m e n ta n d p a t h o g e n i c i t yw e t ep a r t l ya n a l y z e da n di d e n t i f i e db yt a r g e t e dg e n er e p l a c e m e n t t h er e s u l t sa r es h o w e da sf o l l o w i n g : 1 e d n af r a g m e n t so fm n h 6a n dm t p l g e n e sw e r ec l o n e df r o m 肛g r i s e a a p p r e s s o r i u me d n al i b r a r ya n df u l ll e n g t hd n af r a g m e n t so ft h e s eg e n e sw e r e c l o n e df r o mg e n o m i cd n a b yl d - p c r 1 v 2 t h es t r u c t u r e sa n df u n c t i o n so fm n h 6a n dm t p lw e r ea n a l y z e da n dp r e d i c t e db y u s i n gs e v e r a lb i o l o g i c a ls o f tw a r e s m n h 6i san o n h i s t o n e ( d n ac o m b i n i n g p r o t e i n ) ,b e l o n g i n gt oh m g bp r o t e i nf a m i l y m t p l i sat y p e - 1 i ii n t e g r a l m e m b r a n ep r o t e i n ,h a v i n ge i g h tt r a n s m e m b r a n ed o m a i n s 3 k n o c k o u tm u t a n t so f m n h 6o r m t p lw e r eo b t a i n e ds e p a r a t e l yb yg e n er e p l a c e m e n t v e c t o rc o n s t r u c t i o na n df u n g a lt r a n s f o r m a t i o n a n dk n o c k o u tm u t a n t sw e r e i d e n t i f i e di nd n aa n dr n al e v e lu s i n gp c r , s o u t h e r nb l o t ,r t - p c r ,a n d r e a l t i m er t - p c r 4 n u l lm u t a n ta m n h 6p m d u c e da p p e a r c do f f w h i t eh y p h a e ,s h o w e dr e d u c t i o ni n g r o w t h ,c o n i d i a t i o na n da p p r e s s o r i u mf o r m a t i o n ,a n da l s os h o w e dr e d u c t i o ni n a p p r e s s o r i u mt u r g o rp r e s s u r e a n dt h eh y p h a ew e r em o r er e a d i l yw e t t a b l eb ya s o l u t i o n c o n t a i n i n gs d sa n de d t aa n d m o r ee a s i l y d i g e s t e db yr u n g a l c e l l - w a l l d i g e s t i n ge n z y m e s t h ea p p r e s s o r i ap r o d u c e db y a m n h 6m u t a n t s s h o w e dd i m i n i s h e dh o s tp e n e t r a t i o na n dt h ei n f e c t i o u sh ”h a eo fa m n h 6m u t a n t s s h o w e dr e d u c e di np l a n t ag r o w t h t a r g e t e dd e l e t i o no fm n h 6r e s u l t e di nt h e g r e a t l yr e d u c e dv i r u l e n c ec a p a c i t yt ob a r l e ya n dr i c ec 0 3 9 i ni n f e c t i o na s s a y s 5 m n h 6 - g f pf u s i o np r o t e i nw a so b s e r v e dm a i n l yi nn u c l c o l u s a n dt h i si m p l i e d m n h 6 p r o t e i nm a i n l yf u n c t i o n si nn u d c o l u s m n h 6p l a y ss i g n i f i c a n tr o l e si nt h e a l l d i f f e r e n td e v e l o p m e n te v e n t so ft h ef u n g u sg l o b a l l yd u r i n gi t sd i s e a s ec y c l e s u c ha sv e g e t a t i v e 伊o w t h ,c o n i d i a t i o n , a p p r e s s o r i u mf o r m a t i o n , p e n e t r a t i o n , i n f e c t i o u sg r o w t ha n dc o n i d i a t i o ni nd i s e a s e dt i s s u e si nm g r i s e a t h ep l e i o t r o p i c e f f e c t so nf u n g a lm o r p h o g e n e s i se x h i b i t e db ya m n h 6m u t a n ts u g g e s t e dt h a tm n h 6 v i sr e q u i r e df o re f f e c t i v ep a t h o g e n i c i t ya n dc o m p l e t i n gt h ed i s e a s ec y c l eo fr i c e b l a s tf u n g u s 6 n u l lm u t a n t 曲l 妒js h o w e dr e d u c t i o ni nc o n i d i a t i o n ,d e l a y e di ng e r m i n a t i o na n d a p p r e s s o r i u mf o r m a t i o n ,a n di t sh y p h a es h o w e db l a c k e rt h a nw i l dt y p es t r a i n b u t m u t a n t ss h o w e dn od i f f e r e n c e si ng r o w t h ,a p p r e s s o r i u mt o r g o r , a n dv i r u l e n c e c a p a c i t yt ob a r l e ya n d r i c ec 0 3 9 7 g f pc o n t r o l l e db ym t p lp r o m o t o rw a se x p r e s s e dm a i n l yi nh y p h a ea n ds p o r e s , l e s se x p r e s s e di na p p r e s s o r i a m l p lh a so ov i s i b l ee f f e c t so nt h eg r o w t ho fr i v e b l a s tf u n g u s h o w e v e r , i th a ss i g n i f i c a n tc f f e c t so nc o n i d i a t i o n ,c o n i d i u m g e r m i n a t i o no ft h ef u n g u s a n d , m t p l i sd i s p e n s a b l ef o rp a t h o g e n i c i t yo f 腻 k e y w o r d s :m a g n a p o r t h eg r i s e a ;r i c e b l a s t f u n g u s ;m n h 6 ;m t p l ;n o n h i s t o n e ; m e m b r a n ep r o t e i n ;f u n c t i o n a la n a l y s i s v i 致谢 谨以此文献给所有关心我的老师、同学、朋友和家人 首先,要深深的感谢我的导师闵航教授。感谢导师多年来对我的悉心指导、 生活上的关心爱护、人生态度上的积极影响和谆谆教诲。闵老师渊博的专业知识、 严谨的治学态度、执着进取的科研风范以及教书育人的奉献精神都使我受益匪 浅,都将成为我终身的宝贵财富。我的每一点进步无不凝聚着导师的心血,值此 论文完成之际,谨向闵老师致以崇高的敬意和衷心的感谢 在我的学习和工作期间,还得到了林福呈教授的大力支持和帮助,以及微生 物教研室的陈声明老师,陈美慈老师,贾小明老师,马晓航老师,陈中云老师和 林小清等全体教师的无微不至的关心和帮助,在此表示衷心的感谢 感谢和我一起学习和工作过的同学和朋友们。非常幸运,我曾经与一个和睦、 温暖、追求上进的集体共同学习,感谢实验室已经毕业的韩如畅、吴坤、阮爱东、 夏颖、叶央芳博士和周德平、张光亚、吴小伦、潘克侠、徐晓宇、梅建风等全体 同学,还有正一起工作的吕镇梅博士。感谢他们在我学习期间给予的帮助、鼓励 和关心! 在此祝他们前程似锦、事业有成 感谢我的父母和家人给予我的关心、理解和支持。是他们的默默支持和奉献 支撑着我走到今天。 最后,向参加本论文评阅和答辩的专家、教授致以最诚挚的谢意 吕琴 2 0 0 6 年6 月3 0 日 浙江大学紫金港校区 1 稻瘟病与稻瘟病菌 第一章文献综述 稻瘟病俗称稻热病、火烧瘟、叩头瘟,是严重危害水稻的一种毁灭性病害 ( o u ,1 9 8 5 ) ,主要危害叶片、茎秆、穗部。世界上每年由稻瘟病造成的水稻产 量损失在1 0 一3 0 之间( b a k e r e l 以,1 9 9 7 ) 。稻瘟病在整个水稻生育期都会发生, 根据受害的时期不同和部位不同,可以分为苗瘟、叶瘟、叶枕瘟、节瘟、穗颈瘟、 枝梗瘟和谷粒瘟等,其中穗颈瘟对产量影响最大,而叶瘟是稻瘟病的显著的标志 之一。穗颈瘟:初期形成褐色小点,后使穗颈部变褐,也会造成枯白穗。枝梗或 穗轴受害造成小穗不实。叶瘟:在整个生育期都能发生,分蘖至拔节期危害较重。 叶瘟病斑可以分为4 种类型一一慢性型病斑:开始在叶上产生暗绿色小斑,渐扩 大为梭菜斑,常有延伸的褐色坏死线。病斑中央灰白色,边缘褐色,外有淡黄色 晕圈,叶背有灰色霉层,病斑较多时连片形成不规则大斑,这种病斑发展较慢; 急性型病斑:在感病品种上形成暗绿色近圆形或椭圆形病斑,叶片两面都产生褐 色霉层,条件不适应发病时转变为慢性型病斑;白点型病斑:感病的嫩叶发病后, 产生白色近圆形小斑,不产生孢子,气候条件适宜时,可转为急性型病斑;褐点 型病斑:多在高抗品种或老叶上,产生针尖大小的褐点只产生于叶脉问,较少产 孢,该病在叶舌、叶耳、叶枕等部位也可发病。 稻瘟病菌是引起水稻稻瘟病的病原真菌。稻瘟病菌的有性态为m a g n a p o r t h e g r i s e a ( h e b e r t ) 标尺r ,属子囊菌亚门。无性态为p h y r i c u l a r i a g r i s e a ( c o o k e ) s a c c , 称灰梨孢( = p y r i c u l a r i ao r y a ec a r ,称稻梨孢) ,属半知菌亚门。除了水稻外。 稻瘟病菌也对其它植物,如小米( e l e u s i n ec o r a c a n a ) 、大麦( h o r d e u mv u l g a r e ) 、 小麦( t r i t i c u m 口倒咖川) 造成严重的危害( 1 9 a r a s h ie ta 1 ,1 9 8 6 ;e k w a m u ,1 9 9 1 ) 2 稻瘟病菌的生活史和侵染循环 稻瘟病菌的生活史包括有性和无性2 个阶段。有性阶段由2 个不同交配型的 菌株交配后形成子囊和子囊孢子。稻瘟病菌的交配型由交配基因m 口n 一1 和m a t l 一2 控制。无性阶段为营养菌丝分化形成分生孢子梗和梨形分生孢子。在自然界, 稻瘟病菌主要通过无性阶段完成生活史,分生孢子是植物的主要侵入源。其典型 的分生孢子由3 个细胞组成。 稻瘟病菌无性孢子落到水稻叶片表面后,侵染过程即开始。当孢子与水相遇 后,孢子释放出顶端分隔内的粘胶,使孢子紧紧粘附在水稻叶片表面( h a m m e r , 1 9 8 8 ) 。水稻叶片表面具有一层蜡质角质膜,该膜具有很大的疏水性,而粘胶使 孢子粘附在这一疏水的排斥性表面。对粘胶的部分成分分析表明粘胶由蛋白质、 糖类和脂肪组成( h o w a r d e t a l ,1 9 9 6 ) 。粘附后2 h 内,孢子萌发并产生芽管。孢 子萌发仅需要丰富的游离水,不需要外界营养。芽管通常从孢子的一个顶端细胞 伸出并生长( b o u r e t te ta 1 ,1 9 9 0 ) 。芽管顶端也会分泌一种粘胶物质,使芽管紧 紧粘附在植物叶片表面,防止被水滴冲走( k o g a e t a l ,2 0 0 4 ) 。4 h 内,芽管生长 停止,顶端钩状体形成并膨大形成附着胞( h o w a r d e t a l ,1 9 9 6 ;x i a o e t a l ,1 9 9 4 : b o u r e t t e t a l ,1 9 9 0 ;h a m e r e t a l ,1 9 8 8 ) 。 孢子萌发后,芽管的生长和分化取决于其所依附的表面特性。基质的硬度是 芽管分化的一个重要因子,如稻瘟病菌孢子只能在坚硬的固体表面形成附着胞, 而不能在液体表面或软基质表面形成附着胞( x i a oe ta l ,1 9 9 4 ) 。而基质的疏水 表面也会激发附着胞的形成,通过类似于水稻叶片表面蜡质的作用( h a m e r e t a l , 1 9 8 8 ;l e ee t 以,1 9 9 4 ;g i l b e r te ta l ,1 9 9 6 ;b e c k e r m a ne ta l ,1 9 9 6 ) 。l e e 和d e a n 发 现附着胞形成率大小与附着表面的疏水度相关( l e ee t a l ,1 9 9 3 ) 。亲水基质,如 玻璃表面,不能诱导附着胞形成( h a m e r e t a l ,1 9 8 8 ,l e ee t 以,1 9 9 4 ) 。 孢子萌发后不久,产生芽管的细胞进行一次有丝分裂。一个细胞核留在孢子 内,而另一个细胞核通过芽管移动,与孢子和芽管的细胞质内容物一起转移到正 在形成的附着胞中( v e n e a u l t f o u r r e y e t a l ,2 0 0 6 ) 。这些细胞质内容物还包括储 存在发育中的附着胞大液泡的脂滴( t h i n e s e t a l 2 0 0 0 ;w e b e r e t a l ,2 0 0 1 ) 。随后 在附着胞和芽管之间形成隔膜。随着附着胞成熟,其细胞壁出现黑色素沉积,最 终形成黑色素层( h o w a r de ta l ,1 9 9 6 ) 。黑色素层允许水分子自由通过,但溶解 于水的物质不能自由通过,从而让附着胞建立并维持一个很大的细胞内膨压 ( h o w a r de ta l ,1 9 9 6 :m o n e ye t 以,1 9 9 6 ) 。附着胞的黑色素化过程完成后,附着 胞产生一根狭小的菌丝侵染栓。 侵染栓对水稻叶片的穿透因附着胞产生巨大的膨压而得以完成。附着胞膨压 2 在孢子萌发后2 4 - - 4 8h 之间产生( h o w a r de ta 1 ,1 9 9 1 ) 。膨压稍有降低就会阻止 附着胞在人工表面或水稻叶片表面穿透( d e j o n g 甜a 1 ,1 9 9 7 ) 。测量结果表明附 着胞膨压高达8 0 m p a ,相当于4 0 倍汽车轮胎的压力( h o w a r de ta l ,1 9 9 6 ) 。附 着胞黑色素层的作用在于限制了细胞壁的渗透性,有利于细胞内渗透物质的积累 和膨压的产生( m o n e y e t a l ,1 9 9 6 ) 。甘油是一种可溶性物质,产生的渗透势足以 使附着胞产生巨大的膨压。在膨压产生过程中,甘油在细胞内累积浓度超过3 t o o l l 1 ( d e j o n g e t a l ,1 9 9 7 ) 。黑色素基因缺失的突变子不能在细胞内积累甘油, 而用黑色素合成抑制剂三环唑处理的附着胞,细胞内也同样不能积累甘油 ( d e j o n g e t 口f 1 9 9 7 ) 。 侵入后,侵染栓分化成侵染菌丝,迅速在水稻叶片内生长并侵染其它细胞。 接种7 2 h 后,病原菌生物量达到感染叶片的1 0 ( t a l b o t e t a l ,1 9 9 6 ) 。5 7 d 后, 分生孢子梗上分化出大量新的分生孢子,并从病斑中释放出来。每晚可以产生 2 0 0 f f - 6 ( ) 0 0 个孢子并持续约2 周时间。这些新形成的孢子被潮湿的空气带到邻近 的植物并开始新的侵染过程( t a l b o t ,1 9 9 5 ) 在冬天,稻瘟病菌以菌丝和分生孢子形式在稻草和稻谷上越冬,完成侵染过 程。 3 稻瘟病菌附着胞形成过程的调控 稻瘟病菌附着胞的发育包括两个阶段:识别阶段和成熟阶段( b o u r e t t & h o w a r d ,1 9 9 0 ;h o w a r d v a l e n t , 1 9 9 6 ) 。识别阶段为孢子萌发产生芽管及由芽管 检测附着胞形成的诱导信号过程阶段。附着胞发育的成熟阶段包括附着胞的形 成、细胞壁分化、黑色素层的沉积、膨压产生等。 3 1对植物表面信号分子的识韵 稻瘟病菌通过与坚硬的、疏水的表面接触启动附着胞形成过程( l e ee ta 1 , 1 9 9 4 ;g i l b e r te t 口f 1 9 9 6 ) 。在非诱导表面,萌发的孢子除了末端膨大及形成钩状 体外不能继续发育形成附着胞,而是发育成典型的营养菌丝体。通过添加角质单 体和蜡质1 1 6 h e x a d e c a n e d i o l ,可以在非诱导型表面诱导附着胞形成( g i l b e r te t a l , 1 9 9 6 ) 。通过添加c a m p 也可以在非诱导表面上激发萌发的孢子形成附着胞( l e e 3 甜以,1 9 9 3 ) 。因而,稻瘟病菌萌发孢子能够对环境因素作出反应,先区别不同的 表面,再进而形成附着胞( b e c k e r m a n e t a l ,1 9 9 6 ;l e ee t a l ,1 9 9 3 ) 。 通过基因插入突变( r e m i ) 法获得的p t h n 。突变子在疏水表面上不能有效 形成附着胞,致病性也相应减弱。突变子的附着胞形成过程类似于野生型孢子在 疏水性表面的生长过程,但仅仅表现为末端膨大并形成钩状体。p t h n 基因编码 一个具有多个跨膜区域的跨膜蛋白。该蛋白不仅位于细胞膜上,还与细胞器,尤 其是与液泡相联系。p t h l l p 感受的表面信号有可能通过g t p 连接蛋白信号机制 传至细胞内。添加角质单体,p t h n 突变子不能在疏水表面形成附着胞,说明突 变子不能直接识别附着胞诱导信号;而加入外源c a m p 可以弥补其表型缺陷, 说明p t h l l 基因在c a m p 途径的上游起作用( d e z w a a n e ta 1 ,1 9 9 9 ) 。 m p g l 是另一个参与疏水表面识别过程的基因。m p g l 基因编码一种真菌疏水 蛋白,属于l 型真菌疏水蛋白,参与菌丝和水稻叶表的互作( t a l b o t , 1 9 9 9 ) 。m p g l 在附着胞形成早期或侵染过程的晚期表达量很高。通过基因替换获得的m p g l 突 变子的表面疏水性减弱,附着胞形成率降低8 0 以上,致病性减弱( t a l b o t e t 以, 1 9 9 3 ) 。电子显微镜观察发现突变子孢子表面缺少野生型孢子普遍具有的小棒层 ( 两性薄膜层) 。小棒层使真菌表面具有疏水性( t a l b o te ta 1 ,1 9 9 6 ) 。疏水蛋 白是小棒层的主要成分,疏水蛋白在空气与水的界面或亲水性与疏水性的界面以 高分子复合物的形式自我组装成小棒层( w e s s e l s e t a l ,1 9 9 7 ) 。 真菌粘附到疏水表面的过程与疏水蛋白的自我组装有关( w o s t e n ,e t 以, 1 9 9 4 ) 。稻瘟病菌芽管形成时向胞外分泌m p g l p 蛋白单体。m p g l p 蛋白单体 在体外可自动组装形成一层两性薄膜,亲水表面朝向正在生长的芽管,疏水表面 向外与水稻表面相接触,从而增加亲和力,使菌体牢固附着于水稻表面( k e r s h a w & t a l b o t , 1 9 9 7 ) 。此黏着过程作为诱发真菌侵染结构分化的信号诱导附着胞的形 成( t a l b o t e t a l 。1 9 9 6 ) 。外源c a m p 可以恢复m p g l 基因的缺失突变子的表型,形 成正常的附着胞,说明m p g l 基因在c a m p 途径的上游起作用( t a l b o te ta l , 1 9 9 6 ) 。因为m p g l 突变子还能够形成附着胞,说明还有其它成份参与这一识别 过程( t a l b o te t4 。1 9 9 3 ;t a l b o te tn ,1 9 9 6 ) 。 m h p l 是另外一种疏水蛋白( h 型疏水蛋白) ,在植物表面定植和产胞中高 度表达,而在菌丝中很少表达。突变子m h p l 一在稻瘟菌形态发生的很多方面具有 4 缺陷,如产孢减少,孢子萌发率降低,附着胞形成率降低和侵入后生长缓慢( k i m 甜a l 2 0 0 5 ) 。 3 2 信号传导过程 疏水表面的识别引起一系列调节附着胞分化和功能特化的信号过程的发生 ( 图1 - 1 ) 。 图1 - 1 稻瘟病菌( 肛g r s e a ) 和酿酒酵母( & c e r e v i s i a e ) 主要信号途径的比较( d e a n e t a l , 2 0 0 5 ) f i g 1 - 1c o m p a r i s o n o f m a j o rs i g n a l l i n g p a t h w a y s b e t w e e n s c e r e v i s i a ea n d m 鲥s ( d e a n e t 以2 0 0 5 ) 3 2 1c a m p 途径 通过添加c a m p 或类似物质,可以诱导稻瘟病菌萌发孢子在非诱导表面形成 附着胞。腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶分别为c a m p 合成与降解酶,调节细胞内 5 c a m p 浓度。添加磷酸二酯酶抑制剂也能诱导附着胞形成。因此,附着胞形成过 程伴随细胞内c a m p 水平的上升( l 胱d e a n ,1 9 9 3 ) 。 三聚g 蛋白的a 亚基调节腺苷酸环化酶的活性。与表面受体结合的g 蛋白 通过把表面信号传递到细胞内的效应器上,参与许多真核细胞的生长与分化。在 丝状真菌中,g 蛋白也参与真菌的致病过程( b o l k e r e t a l ,1 9 9 8 ) 。从稻瘟病菌中 克隆了3 个g 蛋白的a 亚单位:m a g a ,m a g b 和m a g c ( i _ i ue t a l ,1 9 9 7 ) 。m a g a 或m g a c 基因的缺失不影响稻瘟病菌的致病性,但m a g c 。突变子的孢子形成能力 降低。而m a g b 基因的缺失抑制了稻瘟病菌的营养菌丝生长、孢子发生、附着胞 形成。m a g b 。突变子的致病性减弱,交配能力也减弱( l i u e t a l ,1 9 9 7 ) 。同样m a g b 的显性缺失突变子( d o m i n a n tn e g a t i v em u t a n t s ) 在生长、产孢、致病性方面也有 严重的表型缺陷( f a n ge t 以,2 0 0 0 ) 。 c a m p 主要通过激活c a m p 依赖性蛋白激酶p 渔起作用。c a m p 结合到无活性 的p k a 激酶的调节亚单位引起p k a 催化亚单位( c p k a ) 的释放。活化的催化亚 单位可能激活磷酸化级联过程或迁移进入细胞核磷酸化目标蛋白( m o e h l y r o s e n , 1 9 9 5 ) 。研究发现c a m p 水平在附着胞形成过程中上升,激活p k a ( l e e e t 以, 1 9 9 3 ) 。在疏水表面上正在形成附着胞的孢子的p k a 活性要高于在疏水表面或液 体培养中进行营养生长的孢子( k a n g e t a l ,1 9 9 9 ) 。 c p k a 缺失使附着胞的分化明显滞后,形成小的没有功能的附着胞,不能穿透 表皮致病( m i t c h e l l h a m e r ,1 9 9 5 x u e t a l l 9 9 7 ) 。但c p k a 。突变子在侵染菌丝形 成以前的表型都正常,如细胞核迁移进入附着胞、隔膜形成、附着胞黑色素化、 紧紧粘附于水稻叶片表面等,在侵入水稻后的生长能力也不受影响( x ue ta 1 , 1 9 9 7 ) 。c p k a 很可能在甘油的累积过程中起作用。添;b i c a m p 可以诱导亲水表 面上生长的c p k a 突变子形成附着胞,说明存在其他参与表面识别的c p k a s ( x u e t a 1 ,1 9 9 7 ) 。正在分化的芽管中的p k a 活性对于形成正常的附着胞非常关键,这 在很大程度上可能是由于c a m p 信号途径调节碳水化合物移动及脂类在附着胞 中贮存( a d a c h i h a m e r ,1 9 9 8 :t h i n e se ta 1 ,2 0 0 0 ) 。 细胞内源性c a m p j s j :寸j n a c l 编码的腺苷酸环化酶合成( c h o i & d e a n , 1 9 9 7 ;a d a c h i h a m e r , 1 9 9 8 ) 。稻瘟病菌m a c l 基因缺失突变子的孢子形成和萌发 能力减弱,营养生长存在缺陷,交配能力弱化( a d a c h ie t a l ,1 9 9 8 ;c h o i e t a l , 6 1 9 9 7 ) 。m a c 突变子在诱导表面上不能形成附着胞,没有致病性,而c a m p 可以 恢复突变子的附着胞形成能力( c h o i e t a l ,1 9 9 7 ) 。对& c e r e v i s i a e 的三个p k a 催化亚单位仰l 口、t p k 2 和t p k 3 的各种研究表明:三种p k a 催化亚单位 在调节丝状真菌生长方面具有不同的作用:t p k l 和t p k 3 = :要抑制菌丝生长,而 t p k 2 激活菌丝生长【t o d ae ta 1 ,1 9 8 7 :p a ne ta 1 ,1 9 9 9 。 3 2 2m a p 激酶途径 m a p k ( m a p 激酶) 级联过程在附着胞形成的c a m p 信号的下游起作用。有 丝分裂原激活的蛋白激酶( m a p k s ) 及其上游的调节激酶组成一个功能单位, 将细胞外围的输入信号传导至细胞核,引起相应基因的表达。m a p 激酶的激酶 ( m a p k k ) 激活m a p 激酶( m a p k ) ,而同时m a p 激酶的激酶的激酶 ( m a p k k k ) 激活m a p 激酶的激酶( m a p k k ) 。活化的m a p k 然后被传送到细 胞核,并与各种分子( 主要为各种转录因子) 相互作用,调节新基因的表达。 在丝状真菌中,已经克隆了m a p i 磴径的各种组成基因并确定了在真菌发育 和致病性等各方面的作用( k r o n s t a d e t 口f ,1 9 9 8 ;d i c k m a ne ta 1 ,1 9 9 9 ;m a d h a n i e t 以,1 9 9 8 ;a l s p a u g he ta 1 ,1 9 9 8 ;l e n g e l e re ta 1 ,2 0 0 0 ) 。在稻瘟病菌中也已经克隆 了3 个编码在附着胞形成及功能方面起作用的m a p k 的基因:p m k l ,m p s l 和 o s p l ,其中p m k l 基因在致病过程中最重要。p m k l 基因与酵母信息素反应途径 ( p h e r o m o n er e s p o n s ep a t h w a y ) 的m a p k 基n f h s 3 和k s s l 高度同源( x u & h a m e r , 1 9 9 6 ) 。m p s 膜压力激活的s i t 2 基因相有8 5 相似性,可以恢复s l t 2 缺失突变予的 热敏性生长( x u e t a l 1 9 9 8 ) 。o s p l 与调控高渗透压信号途径的一个酵母m a p k 基因矗0 9 j 最相似( d i x o ne t 以,1 9 9 9 ) 。 p m k l 。突变子在交配方面没有任何缺陷,在营养生长或产孢方面也没有任何 缺陷,但通过喷射或接种到受伤植物叶片表面,对水稻没有致病性。p m k l + 突变 予不能形成附着胞,但在玻璃表面萌发的孢子受n c a m p 诱导后能够开始形成附 着胞,不过仅仅是末端膨大及形成钩状体,不能形成附着胞、不能恢复其它功能。 因此推$ 0 p m k l 基因可能在c a m p 途径的下游起作用( x u e t a l ,1 9 9 6 ;g a o n u s s , 1 9 9 6 ;k r o n s t a d 1 9 9 7 ;l e v e t a l 。1 9 9 9 ;t a k a n o e t 以,2 0 0 0 ) 。而已有证据表明在玉 米黑粉菌u s t i l a g om a y d i s o p c a m p 途径和m a p k 途径是联系在一起的,可以相 7 互影响( k a m i n s k y ie t a l 。1 9 9 9 ) 。在附着胞形成过程中,激活的p m k l 迁移到细 胞核。然后与转录因子或附着胞发育必需的下游靶基因互相作用。用p m k l - g e f p 转化4 , m k l 突变子,得到的转化子具有完全的致病性、形成成熟的附着胞。在附 着胞形成初期,p m k l 一g e f p 均匀地分布在孢子和未成熟的附着胞中。在附着胞 分化的晚期,p m k l g e f p 转移到细胞核中。这样,p m k l 可能与转录因子相互 作用,这种相互作用引起附着胞成熟和功能需要的基因的表达。p m k l 基因不仅 可以对表面信号发生反应,调节附着胞的形成,而且对菌丝在水稻中的扩展有关 ( x u & h a m e r ,1 9 9 6 ) 。稻瘟病菌孢子储存的碳水化合物和脂肪在p m k lm a p k 途径的控制下转移到附着胞,在c p k a s u m l 编码的p k a 全酶的作用下通过脂肪和 糖原的降解和区域化产生膨压( t h i n e s 甜a 1 ,2 0 0 0 ) 。 m p s l 。突变子的孢子形成能力和产孢率下降,气生菌丝具有缺陷。生长在固体 培养基上的m p s l 突变子菌落对于细胞壁降解酶的敏感性增强,发生进行性的自 我解体。通过添i l l l m o l l - 1 的山梨醇可以抑制上述2 种缺陷。m p s l 。突变子的附着 胞形成不受影响,但不能穿透叶片,没有致病性。但喷射孢子到受损伤的叶片表 面或注射到叶鞘都会引起损伤。说明m p s l 是真菌发育的各个阶段维持细胞壁结 构完整性必需的,也是附着胞的某些功能必需的( x u ,e t a l ,1 9 9 8 ) 。 在真核细胞中,高度保守的m a p k h o g l 信号途径调控细胞膨压的产生。 o s m l 基因的缺失没有引起稻瘟病菌营养生长的缺陷,仅是产孢量减少。8 0 m l 。突 变子对高渗压的反应受损,与阿拉伯糖醇的积累有关。在高渗环境下,突变子的 生长减慢,形态出现缺陷。而附着胞形成与致病性不受影响。甘油是稻瘟病菌积 累在附着胞的一种主要的产生渗透压的物质,所产生的巨大渗透压用于穿透水稻 叶片。因而在稻瘟病菌中,o s m l 介导的m a p k 途径可能不依赖于产生附着胞膨压 的信号途径独立起作用( d i x o ne t a l ,1 9 9 9 ) 。 3 2 3c a 2 + 离子途径 磷脂酶c ( p l c ) 水解磷脂酰肌醇- 4 ,5 二磷酸( p i p 2 ) ,产生二酰甘油( d a g ) 和1 ,4 ,5 三磷酸肌醇( 球3 ) 。i p 3 促使存储存在细胞内钙池( 非线粒体) i 拘c a 2 + 释放出来,d a g 和c a 2 + 直接激活钙调蛋白介导激活的钙离子依赖性蛋白激酶 ( p k c ) 。通过与硬质表面接

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