（生物化学与分子生物学专业论文）盘基网柄菌细胞差异表达基因的研究.pdf

摘要 盘基网柄菌( d i c t y o s t e l i u md i s c o i 幽埘) 是一种低等的真核原生生物，在 营养丰富的条件下以阿米巴单细胞形式吞噬细菌为食，行二分裂方式繁殖生长。 一旦食物匮乏，单个细胞聚集成多细胞体，细胞历经细胞丘、蛞蝓体、拔顶阶段 完成发育和分化过程，最终形成由孢子细胞和柄细胞组成的子实体。在合适条件 下，孢子细胞萌发开始新生命周期。盘基网柄菌为了保证发育进程和保持细胞聚 集体的完整性，在发育的不同阶段表达了特定的细胞粘附分子。饥饿的盘基网柄 菌进入多细胞发育期时，在发育早期会表达粘附分子g p l 5 0 ，粘附分子g p l 5 0 调 节的细胞与细胞问的粘着影响了细胞丘“突出”的形成，由此影响了盘基网柄菌 多细胞发育的形态发生。盘基网柄菌与后生动物有许多共同的细胞生理生化反 应，如胞浆移动、吞噬作用、趋化性、信号转导以及一些发育事件如细胞分类、 模式形成和细胞类型决定等。盘基网柄菌属单倍体基因组仅3 4 m b ，包括六条染色 体和线粒体d n a ，每条染色体大小4 m b - 8 m b ，大约有1 1 0 0 0 个基因。尽管它们是真 核生物中最简洁的基因组之一，但是其基因与高等生物的基因有高度相似性。与 哺乳动物基因相比，盘基网柄菌基因中内含子出现频率少，长度一般都仅 1 0 0 - 2 0 0 b p ，外显子中a + t 含量约7 7 ，内含子及其邻近区域中的a + t 含量超过9 0 ， 这种碱基组成上的双峰分布是盘基网柄菌d n a 的一个突出特点，加之内含子的两 端都有规范的剪接位点，使之能很容易地从内含子及其临近区域中区分出外显 子；这样预测的基因结构就有很高的可信度。因此盘基网柄菌可作为一种模式生 物来研究细胞类型的分化及其相应基因功能。 本实验以k a x 3 野生型细胞和a k l 2 7 突变型细胞为材料，剥夺食物触发多 细胞的发育后，野生k a x - 3 细胞经历趋化性聚集、细胞丘形成和蛞蝓体阶段最后 形成子实体，发育顺利完成。而突变a k l 2 7 细胞由于不能表达g p l 5 0 蛋白，尽管 发育早期细胞趋化性聚集，但到疏松聚集阶段发育停滞下来，细胞的分化被锁住， 最后细胞解聚。g p l 5 0 为细胞丘内的形态发生建立一个粘附微环境，同时它也参 与调节细胞类型专一化和分化的信号途径。g p l 5 0 是一种细胞表面膜蛋白，它作 为粘附分子，推测介导细胞之间的信号传递，调节细胞内部的酶促反应，开启发 育所需基因的表达，进而推进发育进程。突变a k l 2 7 多细胞发育停滞，在基因表 达上必然与野生型k a x 一3 细胞存在差异。g p l 5 0 介导的信号途径影响了哪些发育 所需基因的表达，以及这些基因在盘基网柄菌发育中的作用正是本论文的主要研 究内容。、 采用m r n a 差异显示法来分析盘基网柄菌野生型k a x 一3 细胞与突变型a k l 2 7 细胞在多细胞发育阶段基因的表达差异。提取细胞发育重要阶段( 发育后1 2 h 、 11 6 h ) 的两种细胞总r n a ，反转录合成c d n a 第一链，进行不同锚定引物与任意引 物组合的差异显示。琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到两种细胞间存在明显的差异表 达条带。选取特征性的差异条带，进行回收，克隆，酶切和鉴定。最终n o r t h e r n 杂交检测，d 1 2 a ，d 1 6 b 和d 1 6 a 为阳性片段。片段测序并运用n c b i 数据库系统对 这3 个片段分别进行核苷酸序列同源性信息查询。并用r a c e p c r 对d 1 6 a 进行5 一端末端扩增，以期得到一条完整的基因。 分析结果表明：d 1 2 a 跟恶性疟原虫3 d 7 的虚拟蛋白的m r n a 有部分相似，但 是同源性很低，估计该片段可能是一个新基因，而d 1 6 b 跟盘基网柄菌的虚拟蛋白 的m r n a 高度同源，同源性高达9 9 ，但是该基因的功能还未明而对于它的功能我 们还需进一步的研究。d 1 6 a 与盘基网柄菌线粒体d n a 有较高同源性，氨基酸序 列比对发现它与盘基网柄菌线粒体核糖体蛋白s 4 ( d d m t r p s 4 ) 有同源性。d 1 6 a 代表的序列可能属于盘基网柄菌线粒体d n a 上一个o r f ，参与蛞蝓体阶段前孢子 细胞的分化。据此我们推测线粒体在盘基网柄菌多细胞的发育中也起着重要的作 用，上述数据都表明这些基因可能与盘基网柄菌的发育和细胞分化有着密切的联 系，这从另一个侧面反应出了g p l 5 0 蛋白在盘基网柄菌的发育中有重要的作用。 关键词：盘基网柄菌g p l 5 0m r n a 差异显示法n o r t h e r n 杂交5 r a c e - p c r a b s t r a c t t h es o c i a la m o e b ad i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mw h i c hp h a g o c y t o s i ss o i lb a c t e r i af o r f o o di sau n i c e l l u l a re n k a r y o t e u n d e rf a v o r a b l ec o n d i t i o n ，i tm u l t i p l i e sa sa u n i c e l l u l a ro r g a n i s m u p o ns t a r v a t i o n ，ap a t h w a yi n v o l v i n ga g g r e g a t i o n ，m o u n d ，s l u g , c u l m i n a t i o ns t a g e si n d u c e st h ef o r m a t i o no faf r u i t i n gb o d yc o n s i s t i n go fah e a do f s p o r e ss u p p o r t e do nas t a l ko fv a c u o l a t e dc e l l s s p o r e sa w a i td i s p e r s a la n dg e r m i n a t e i nf a v o u r a b l ec o n d i t i o n sf o ra m o e b o i dg r o w t h c e l l so fd i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u ma r e t r i g g e r e dt ou n d e r g od e v e l o p m e n tw h e nt h e yh a v ed e p l e t e dt h e i rf o o ds o u r c e d u r i n g t h ee a r l yh o u r so fd e v e l o p m e n t ，c e l la d h e s i o nm o l e c u l e sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n m a i n t a i n i n gt h eo ni n t e g r i t yo fc e l la g g r e g a t i o na n di n f l u e n c es u b s e q u e n tc e l l - - t y p e d i f f e r e n t i a t i o na n dc e l l s o r t i n g g p l 5 0i sn o r m a l l yf h s te x p r e s s e d a tt h el o s s a g g r e g a t i o ns t a g e a n dt h i sa d h e s i o nm o l e c u l ei si m p o r t a n tf o rd e v e l o p m e n t a w i d er a n g eo ff u n d a m e n t a lc e l l u l a rp r o c e s s e sa c o m m o nt od d i s c o i d e u ma n d m e t a z o a n s t h e s ep r o c e s s e si n c l u d ec y t o k i n e s i s 、m o t i l i t y 、p h a g o c y t o s i s 、c h e m o t a x i s 、 s i g n a lt r a n s d u c t i o na n da s p e c t so fd e v e l o p m e n ts u c ha sc e l ls o r t i n g 、p a t t e r nf o r m a t i o n a n dc e l l t y p ed e t e r m i n a t i o n t h eh e r e d i t a r yi n f o r m a t i o ni sc a r r i e do n6c h r o m o s o m e s w i t hs i z e sr a n g i n gf r o m4t o8m br e s u l t i n gi nat o t a lo fa b o u t3 4m bo fd n a , t h e e s t i m a t e dn u m b e ro fg e n e si nt h eg e n o m ei s11 0 0 0a n dm a n yo ft h ek n o w ng e n e s s h o wah i g hd e g r e eo fs e q u e n c es i m i l a r i t yt oh o m o l o g u e si nv e r t e b r a t es p e c i e s r e l a t i v et ov e r t e b r a t es p e c i e s ，t h eg e n o m e ，w h c hi s ( a t t ) r i c h ( 7 7 ) ，h a sl e s si n t r o n a n dh a sab r o a d l yu n i f o r mc o m p o s i t i o n o naf i n e rs c a l e ，n u c l e o t i d ec o m p o s i t i o n t r a c k st h ed i s t r i b u t i o no fe x o n s m a n yo ft h e s ec e l l u l a rb e h a v i o r sa n db i o c h e m i c a l m e c h a n i s m sa r ee i t h e ra b s e n to rl e s sa c c e s s i b l ei no t h e rm o d e lo r g a n i s m s ，m a k i n gd d i s c o i d e u mu n i q u em o d e lo r g a n i s mf o rt h es t u d yo ft h ec e l l u l a ra n dm o l e c u l a r m e c h a n i s m so ft h e s ep r o c e s s e s a f t e rf o o ds o u r c ei sd e p l e t e d ，t h ew i l d t y p es t r a i nk a x 3u n d e r g o e sc h e m o t a x i s ， c e l l a g g r e g a t i n gs t a g e 、m o u n d - f o r m a t i o ns t a g e 、s l u gs t a g ea n df o r m sn o r m a l f r u i t i n g - b o d yi nt h ee n d h o w e v e r , t h em u t a n t t y p es t r a i na k l 2 7 ，a sar e s u l to f a b s e n c eo f g p l 5 0 ，u n d e r g o e sn o r m a lc h e m o t a x i s ，b u ti sa r r e s t e da tt h el o o s ea g g r e g a t e s t a g e a k l 2 7c e l l se v e n t u a l l y d i s s o c i a t e i n t os i n g l ec e l l i na d d i t i o n ，c e l l - t y p e d i f f e r e n t i a t i o ni sb l o c k e di nt h e s em u t a n tc e l l s i ti sl i k e l yt h a tg p l 5 0p l a y sa r e g u l a t o r yr o l e i nt h et h ei n i t i a lm u l t i c e i l u l a rd e v e l o p m e n t g p l 5 0i sam e m b r a n e 酉y c o p r o t e i nw h i c hh a sb e e ni m p l i c a t e di nc e l l c e l la d h e s i o na n dm a yf u n c t i o na sa k e ym o l e c u l et r a n s f e r r i n gs i g n a l b e t w e e nc e l l s ，f u r t h e r r e g u l a t i n gi n t r a c e l l u l a r 5 - e n z y m e - c a t a l y z e d r e a c t i o n sa n d a c t i v i n ge x p r e s s i o n o f g e n e sn e e d i n g f u r d e v e k l p m e u t m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a yw a su s e dt oa n a l y s et h ed i f f e r e n c e so fg e n ee x p r e s s i o n b e t w e e nt h ew i l ds t r a i nk a x 一3c e l l sa n dt h em u t a n ts t r a i na k l 2 7c e l l st os t u d yt h e i n f l u e n c eo ft h ec e l la d h e s i o nm o l e c u l eg p l 5 0o nt h ee x p r e s s i o no fg e n e sn e e d i n gf u r d d i s c o i d e u md e v e l o p m e n t t o t a lr n aw a si s o l a t e df r o mk a x 一3c e l l sa n da k l 2 7 c e l l sd e v e l o p e df o r1 2 h 、1 4 ha n d1 6 h a f t e rt h er e v e r s et r a n s c r i p t i o na n dp c rr e a c t i o n , d i s t i n c td i f f e r e n t i a lf r a g m e n t sc o u l db es e e no n1 5 a g a r o s eg e l t h ec h a r a c t e r i s t i c d i f f e r e n t i a lb a n d sw e r er e c o v e r e da n dc l o n e d n o r t h e r na n a l y s i sr e c o g n i z e dt h et h r e e d i f f e r e n t i a lc d n af r a g m e n t s ，n a m e dd 1 地d 1 6 b a n dd 1 6 a , r e s p e c t i v e l ys p e c i f i cf o r t h e1 2 ha n d1 6 ho fd e v e l o p m e n t d 1 6 aw a sg o n ew i t h5 r a c e p c rr e a c t i o n w e e x p e c tt og e tt h ef u l ld i s t a n c eo ft h ed 1 6 a c o n c l u s i o n ：d 1 2 am a yb ean o v e lg e n ei nd d i s c o i d e u md e v e l o p m e n t n ep r o t e i n o fd 1 6 b m a yb ed i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mh y p o t h e t i c a lp r o t e i n ，b u tw ed o n tk n o wt h e f u n c t i o no ft h i sp r o t e i n w en e e dt of u r t h e rs t u d yt h ef u n c t i o no ft h i sp r o t e i n d 1 6 ai s 4 9 6b pi nl e n g t h , h a v i n gr e l a t i v e l yh i g hh o m o l o g yw i t hd d i s c o i d e u mm i t o c h o n d r i a l r i b o s o m a lp r o t e i ns 4 巾d m t r p s 4 ) d d - m t r p s 4p l a y sap o l ei nt h et r a n s i t i o no fd d i s c o i d e u mc e l l st od i f f e r e n t i a t i o n a n dm i t o c h o n d r i a la l s or e g u l a t e sd d i s c o i d e u m d e v e l o p m e n t p a r t i c i p a t i n gi np r e s p o r ec e l ld i f f e r e n t i a t i o nd u r i n gs l u gs t a g e t 1 l ed a t a a r es u g g e s t e dt h a tt h e s eg e n e ss h o u l db ei n v o l v e di nt h ed - d i s c o i d e u md e v e l o p m e n t w h i c hi sa l s os u g g e s t e dt h a tg p l 5 0p l a ya l lv e r yi m p o r t a n tr o l ei nt h ed e v e l o p m e n to f d d i s c o i d e u m k e yw o r d s ：d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mg p l 5 0 m r n ad i f f e r e n t i a l d i s p l a y n o r t h e r n5 ，r a c e p c 矗 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中作了明确说明并表示谢意 作者签名：独垫日期：造! ：i ：3 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留，使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在 解密后适用本规定 学位论文作者签名：狰奴 导臌：气移l 日期：塑1 ：f ：2日期：! 刁：二臣 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 第一章前言 第一节细胞粘附 在高等生物中，细胞间的粘着影响细胞运动、形状和组织结构。细胞粘着部 位的蛋白复合体还参与了细胞的信号转导，其中连环蛋白既调节细胞粘着，也调 节了细胞的信号转导。两者共同影响了细胞的分化、增殖和凋亡。但我们对高等 生物发育中细胞的粘着系统缺乏深刻的了解。低等的单细胞真核生物盘基网柄菌 ( d i c t y o s t e l i u m d i s c o i d e 埘) 有6 条染色体，其基因组是高等生物的基因组的1 。 在饥饿条件下，由单细胞生活状态进入多细胞发育期，整个发育期约需2 4 d 时。 该过程大致可分为4 个阶段：( 1 ) 细胞聚集( a g g r e g a t i o n ) 阶段，饥饿细胞在c a m p 诱导下形成细胞流。( 2 ) 细胞丘( m o u n d ) 阶段，细胞流样结构聚集成多细胞组成的 丘状结构。( 3 ) 蛞蝓体( s l u g ) 阶段，细胞丘垂直向上延伸形成的指状“突出( t i p ) ” 结构倒向基质，形成“蛞蝓”。( 4 ) 子实体( f r u i t i n gb o d y ) 形成阶段，“蛞蝓” 最终发育成由柄细胞和孢予细胞组成的子实体。因此，该过程类似于高等生物的 发育过程，有着严格的时间和空间的发育程序，并且受到精密的调控。在发育期 问，它们具有和高等动物十分相似的细胞粘着系统和信号转导途径，这就便于研 究细胞接触和粘着系统的进化，研究细胞粘着和信号转导对生物发育的作用和影 响，所以它们是研究细胞粘附的良好模式生物“1 。 1 盘基网柄菌多细胞发育期的细胞粘附 发育早期的细胞粘着在营养生长期，盘基网柄菌是单细胞的变形虫，以二分 裂繁殖生长。当食物耗尽时，它们进入多细胞发育期，变形虫分化成由孢子细胞 和起支撑作用的柄细胞和基盘结构组成的多细胞结构。它的复杂性可以和高等动 物发育相媲美。两者间主要区别在于高等动物由单个胚胎细胞发育而来，而盘基 网柄菌则由许许多多变形虫聚集来完成发育的。 在胞# b c a m p 诱导下，饥饿细胞趋化性爬向聚集中心，相互粘着形成细胞流。 有几种粘附分子调节细胞间的粘着，其中最主要的粘附分子是d d c a d 一1 ，也称为 接触位点b ( c s b ) 或g p 2 4 0 1 。细胞饥饿后不久即表达d d c a d - 1 。它们调节的粘着对 e d t a 和e g t a 敏感，提示了c a 2 + 涉及这个调节过程。分析克隆的肋翻俨基因，发 现它们与高等动物的钙粘蛋白的胞外域有某些同源性d d c a d 一1 似乎有两个钙离子 结合域“1 ，一个构成了钙粘蛋白中见到的钙结合的结构，另一个在c 末端，类似 于e f 一手形钙结合域。d d c a d 一1 与钙粘蛋白的区别是没有跨膜域。由c 末端连接到 还未鉴别清楚的连接蛋白上，这种连接对钙离子螯合敏感。d d c a d l 抗体和重组 的d d c a d l 蛋白可阻止细胞问e d t a 一敏感的粘着接触，提示邻近细胞上的d d c a d 一1 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 分子间是同嗜性的相互作用。 在细胞聚集的较后阶段，表达了另一个同嗜性粘着蛋白c s a ( 也称为g p 8 0 ) ， 其分子量是5 4 k d ，高度糖基化后，s d s - p a g e 电泳的分子量为8 0 k d ”1 。糖基化突 变型m o d b 细胞不会发生这种修饰。c s a 是免疫球蛋白超家族的球蛋白，类似于 神经细胞粘附分子n c a m 。它们通过脂聚糖锚定在膜上，我们知道通过该方式锚 定的蛋白质在脂双层中的运动比跨膜蛋白快1 0 1 0 0 倍，所以细胞间一旦发生粘着 时，许多c s a 分子马上会聚到这一局部区域，使粘着更加有效。与d d c a d - 1 不同， c s a 调节的细胞粘着对e d t a 和e g t a 不敏感，它们相互作用区域的氨基酸序列也已 弄清，模拟该区域的蛋白多肽可以阻止c s a 调节的细胞粘着。 发育中粘附分子的表达既有这种时空上的关系，在功能上也是互相关联的。 c s a 的表达依赖于d d c a d 一1 的功能，用e d t a 或肉碱阻止d d c a d 一1 调节的粘附时，大 大地降低c s a 的表达。没有d d c a d - 1 调节的细胞接触，即使用c a m p 脉冲信号刺激也 不能恢复e s a 的表达：但是在理解这些实验结果时必须小心，因为c a m p 信号也受 到细胞接触刺激影响，并且d d c a d - 1 作用的特异性也受到非议，因为其他一些因 子也有类似作用。 在细胞接触前，d d c a d - 1 只是分布于细胞伸出的伪足处，此处富含f 一肌动蛋 白，肌动蛋白多聚化的定位和d d c a d - 1 定位是如何连接的还不是很清楚。细胞最 初用d d c a d - 1 连接邻近细胞的伪足，随后伪足缩回，更多的质膜互相接触，该过 程由c s a 调节，f _ 肌动蛋白和此过程也有关联。此时d d c a d - 1 重分布于质膜的其他 区域。在细胞流发育阶段，这特别明显，细胞流中间的细胞完全通过c s a 来调节 细胞间的粘着，而d d c a d - i 贝j j 分布在细胞流边缘细胞的质膜上。 盘基网柄菌的这个粘着接触装配模式相似于在果蝇和秀丽线虫发育中见到 的上皮细胞层的闭合”1 。在这个闭合过程中，移动层前端细胞也是伸出伪足。在 线虫中，在沿接触细胞边缘伸出的伪足相遇时，触发了粘着连接的装配，由钙粘 蛋白一连环蛋白粘着系统调节蜘。闭合过程中涉及到的事件类似盘基网柄菌见到 的事件。动物中上皮细胞接触在机械力上比盘基网柄菌更稳定，因为盘基网柄菌 整个发育过程中，细胞都维持较高的移动。但是盘基网柄菌和动物( 例果蝇) 的发 育都涉及相同的事件：接触诱发、肌动蛋白细胞骨架的重排和形成更广泛的粘着 接触。 盘基网柄菌至少依赖4 种类型细胞问黏着位点来维持其多细胞体。细胞发育 开始不久，出现e d t a e g t a 敏感细胞黏着位点，卜2 m m o l le d t a 就可以阻断其结合， 由钙结合蛋白d d c a d - 1 调节”3 之后出现e d t a 敏感e g t a 抗性位点“”e d t a 抗性位 点称为结合位点a ，e d t a 浓度高达1 5 m m o l l 都能稳定维持细胞问的粘连，为发育的 聚集阶段所需：f 1 4 9 p 8 0 来调节“”在后聚集阶段，g p l 5 0 调节了另一类型的e d t a 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 抗性位点“” 发育启动后不久，细胞表面开始聚集e i ) t a 敏感细胞间结合位点在涉及到这 种结合的几类分子中，目前了解最清楚的，是一种2 4 k d 钙结合蛋白糖蛋白 ( g p 2 4 ) l o o m i s 已获得g p 2 4 的c d n a g p 8 0 的表达与e d t a 抗性细胞间粘着位点的出 现相平行，标志着盘基网柄菌的发育进入细胞聚集阶段但是g p 8 0 的合成限制在 聚集阶段，在后聚集阶段迅速下降，在提示g p 8 0 的作用是发育聚集阶段独有的，在 发育的后半阶段由其他粘附分子来替代g p 8 0 g p 8 0 分子分布在细胞两极，往往位 于细胞光滑的表面或相邻细胞的相似的伪足上g p 8 0 涉及了细胞最初的识别和细 胞间相互作用值得指出的是缺乏g p 8 0 表达的突变细胞依然保留了大量的e d t a 抗 性细胞粘着，这可能是后聚集阶段细胞粘附分子的累积这些分子可能替代了 g p 8 0 的作用，使细胞能够重新形成合适的细胞接触并使形态发生继续进行其中 之一就是g p l 5 0 分子 2 jg p l 5 0 蛋白在盘基网柄菌发育中的作用 在后聚集阶段，g p l 5 0 蛋白调节另一类型的e d t a 抗性位点“”，通过异嗜性 粘着的相互作用来调节细胞粘着。g p l 5 0 缺失，细胞的形态发生不能进行，发育 停滞在某一阶段，最终不能形成子实体“；而d d c a d - 1 和g p 8 0 突变细胞能完成 发育，主要原因是g p l 5 0 提前表达，在细胞粘着的功能上有替代d d c a d 一1 和g p 8 0 的作用，因此g p l 5 0 对多细胞发育有着不可或缺的作用。 最初把g p l 5 0 看作为主要的伴刀豆球蛋白a ( c o n a ) 结合糖蛋白。在细胞发 育l o b 能检测到g p l 5 0 蛋白，1 2 h 时细胞处于疏松结合阶段，出现依赖g p l 5 0 蛋 白的细胞粘着。1 。随着发育进程，g p l 5 0 明显增加1 。研究证实l a g c 基因编码 g p l 5 0 分子，一个9 7 k d 蛋白，被高度糖基化后，s d s p a g e 电泳结果为1 5 0 k d 。 数据库显示g p l 5 0 有潜在的i 阿序列，有哺乳类p l e x i n 和m e t 受体蛋白中发现 的免疫球蛋白样折叠o “。它们是异嗜性细胞粘附分子，但它们配体的性质还很不 清楚。“。g p l 5 0 通过这种细胞问异嗜性粘着的相互作用来调节细胞的粘着，以此 调节细胞类型分化“。 2 1g p l 5 0 分子与多细胞发育时空上的关系 发育上的这种时间性是以各分子对发育所起的作用中表现出来的：g p l s o 分 子突变细胞能表达d d c a d 2 1 和g p 8 0 分子，能进行早期发育，因此单依靠这两种分子 是不能完成发育的o ”所以在多细胞发育的重要时段，也就是说为了确定一个分 化程序，必须激活一个或一组关键基因，使发育能够继续进行，其表达的蛋白必然 会有重要功能，所以g p l 5 0 是异嗜性粘附分子。“，而g p 8 0 分子则是同嗜性粘附分子 i m - 2 5 正是这种不同的粘着机制使多细胞发育从疏松结合向紧密结合的转变，从 而使细胞开始进入分化阶段，换句话说，在不同发育阶段，细胞表达不同的粘附分 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 子，在细胞分化阶段，细胞表达异嗜性粘附分子，以保证发育的顺利进行：缺乏这 种异嗜性粘附分子的细胞就不能很好地完成发育 l a g c 基因编码g p l 5 0 蛋白2 1 在细胞疏松聚集阶段，l a g c 基因开始表达，其后的 整个发育阶段都有l a g c m r n a ”1 笔者的实验结果也证实了这一点从空间位置上 来说，是在图1 中看到的g p l 5 0 开始出现在多细胞聚集体外周，使疏松细胞聚集体 成为紧密聚集的细胞丘在细胞丘内，细胞经历了形态发生行为的变化，在紧密结 合的细胞丘表面形成一个“突出”，随后“突出”伸长成细高的指状结构，它们倒 向一边，然后像蛞蝓一样在基质上爬行“突出”是一个组织中心，协调蛞蝓体和 子实体的形态发生嘲蛞蝓体内细胞开始分化为前孢子细胞和前柄细胞，随后分 化成不同的空间模式，蛞蝓体前部主要由前柄细胞组成g p l 5 0 分子空间分布模式 与形态发生模式相辅相成在图2 和图3 中，可清楚地看至l j g p l 5 0 分子把蛞蝓体分 割成两个部分，前一部分是前柄细胞区，后一部分是前孢子细胞区：并且随着发育 进程，g p l 5 0 分子在前柄细胞区逐渐增加在前孢子区内是基本没有g p l 5 0 分子分 布的所以单从g p l 5 0 分子分布的空间位置来看，该分子与柄细胞分化有着密切 关系g p l 5 0 突变细胞不能表达前柄和前孢予细胞特异基因：如果把g p l 5 0 突变细 胞与野生型细胞混合培养，突变细胞形成柄细胞而不是孢子细胞结合本实验 结果，提示了g p l 5 0 分子与前柄细胞的分化有着密切的关系，并且在发育时空上也 有相关性 2 2g p l 5 0 分子分布位置与发育关系 盘基网柄菌细胞刚开始发育时所有细胞几乎是相等的，它们具有分化成孢子 细胞和柄细胞中任何一种的能力那么这种分化决定是如何做出的呢? 笔者已 发现g p l 5 0 分子与包裹细胞体的外膜形成有关系。”，因为细胞发育，包括使多细胞 体真正进入细胞分化阶段都需要一个相对独立的环境在这个独立的环境中两细 胞群若要相互明确分开需要某些外界信息，所以在分开过程中，需要暴露于细胞 表面的信号分子：g p l 5 0 分子是位于细胞表面的异嗜性分子，与信号传递有密切关 系，有可能在两细胞群分开时，g p l 5 0 分子起信号分子作用结合本研究和该分子 突变细胞就不能完成发育的结果，笔者推测其中原因之一可能是细胞分化的信号 传递中断，结果细胞不能分化，也就不能完成发育g p l 5 0 分子分布位置明显地把 多细胞体分成两个部分，这种整体结构上出现的空间区域的划分实际上限定了不 同区域内细胞的发育命运，使特定区域内细胞群密切关联在一起，然后各自向特 定方向发育而且随着发育进程g p l 5 0 分子在两个区域内的分布的量也明显不同， 在前柄细胞区明显多于前孢子细胞区所以有可能在盘基网柄菌多细胞发育中， 柄细胞先开始分化，随后引起孢子细胞的分化，最终发育成一个完整的子实体 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 第二节r a s 蛋白的作用 1 盘基网柄菌的r a s 家族 盘基网柄菌有一个巨大的r a s 蛋白家族，它的成员在发育周期的不同时 期表达的水平是不同。尽管已公布了六个r a s 基因的序列及其表达模式，但 目前只分离出了r a s g ，r a s d ，r a s s 和r a s c 四个基因。发育中细胞若失去相 应的基因后都会产生不同的细胞表型，表明这些基因的表达产物在细胞中承 担着不同的功能。r a p l 和r a s b 基因还没有成功分离但是可以肯定这两个基 因对细胞的生长也都是必需的。盘基网柄菌中的r a s d 蛋白与哺乳动物 h - r a s 有很高的同源性。r a s d 的m r n a 在营养生长期不表达，主要限于发育阶 段的后期1 。r a s g 和r a s d 一样都和h r a s 高度同源，虽然r a s gm r n a 表达 是在生长阶段，在聚集的时候开始消失，但在发育的后期r a s g 的蛋白量却很 丰富，甚至在r a s dm r n a 表达达到顶峰时，细胞内r a s g 蛋白的水平仍然高于 r a s d 1 。r a s b 也和h r a s 的蛋白相关，但并不像r a s g 和r a s d 那样有那么高 的同源性，它在整个生命周期都表达。r a s c 和r a s s 与其它r a s 蛋白有很少 的相关性，r a s c 在整个生命周期都表达嘲，r a s s 的m r n a 只在营养期和聚集 阶段表达。盘基网柄菌的r a p i 和人类的r a p i 蛋白有8 7 的一致性，d d r a p l 的m r n a 在整个生命周期都表达1 。 2 r a s d ：趋光性、向热性和分化 r a s d 在盘基网柄菌多细胞发育阶段大量表达，盘基网柄菌在聚集阶段具有 趋光性和向热性，对光源和热源高度敏感。缺失r a s d 的细胞形成的蛞蝓体在趋 光性和向热性方面都明显消弱了1 。这也就表明和盘基网柄菌感光性和感热性反 应有关的信号传导中r a s d 起着特定的作用。缺失r a s d 的细胞在生长和增殖方面 并没有出现什么明显的变化，从聚集开始，多细胞发育的所有阶段都跟正常的细 胞一样。相对于野生型细胞来说在激活型的r a s d 过量表达的细胞中将会出现前 柄细胞特有基因e c m a 和t a g b 的表达增加，同时使前孢子细胞特有基因c o t c 的 表达减少。那么由此是否可以得出r a s d 与前柄细胞的分化有关的结论昵? 通 过对r a s d 突变细胞中这三个基因表达时间和水平的测定发现跟野生型的细胞中 的表达情况并没有什么不同，由此也就说明了r a s d 在发育聚集阶段均衡前柄细 胞和前孢子细胞的作用并非是必需的。前面描述过在发育的多细胞阶段r a s g 的 蛋白含量非常的丰富，并且r a s g 蛋白与r a s d 有8 2 氨基酸的一致。因此可能在 这两种蛋白之间存在着某些补偿作用：一旦其中一个蛋白作用受损，另一个蛋白 就可能来补偿该蛋白的功能。 3 r a s g ：能动性和肌动蛋白的功能 r a s g 是盘基网柄菌在营养阶段主要表达的r a s 蛋白。r a s g 突变细胞表现出 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 细胞极化和正常伪足的缺失，细胞运动大大的消弱，迁移速度只接近野生型的一 半。”，对叶酸和c a m p 的趋化性减弱“。在悬浮培养基中r a s g 突变细胞的生长 速度比野生型细胞也缓慢得多，最终形成的细胞密度也比野生型低的多，形成的 细胞大多是多核的。那是因为正常的细胞进行胞质分裂时可以在分裂沟的下方形 成一个富含肌动球蛋白的收缩环，这个收缩环的收缩会使分裂沟逐渐加深，最终 使细胞一分为二。但是r a s g 突变细胞可以形成分裂沟但不能使分裂沟逐渐加深 使细胞一分为二，只留下一个富含肌动球蛋白的胞质桥1 。众所周知影响肌球蛋 白的各种突变，它们的胞质分裂都不很有效。r a s g 突变细胞表现出的胞质分裂 的受损以及肌动蛋白功能的缺失都在一定程度上反映了细胞骨架功能的紊乱导 致了这些不正常表型的出现。r a s g 对m a p k 激酶- - e r k 2 起负调控作用。c a m p 激 活e r k 2 而e r k 2 对c a m p 的聚集是必需的。在r a s g 缺失细胞中c a m p 刺激e r k 2 的磷酸化作用是加强的，而在过量表达激活型的r a s g 细胞中这种作用是减弱的。 导致这些细胞产生c a m p 的能力下降了，致使细胞不能聚集。所以无论是r a s g 缺失的细胞还是转化了激活型r a s g 的细胞它们的生长，移动和趋化性都受到阻 碍。这说明了在细胞信号传导中蛋白含量的精确水平是必需的。 4 1 l a s s ：胞吞作用和细胞移动速度 r a s s 突变细胞表现出生长不足与胞饮作用的急剧减弱有关，同时还表现出 了吞噬能力的缺陷，它们吞饮细胞或者是酵母微粒的速度比野生型慢2 3 倍。 r a s s 突变细胞在菌苔上形成的噬菌斑具有异常的表型，从表面上看这些噬菌斑 都有非常广泛的摄食边界，比野生型的大两到三倍且分散，但是仔细观察就能发 现噬菌斑仅是部分被吃空“”。这些观察最可能的解释是r a s s 突变细胞吞噬速率 的减弱同时伴随着一种异常快的移动速度，造成的结果是细胞还没有消耗完所在 地食物就迁移出去，造成噬菌斑大而且分散表型。不论是在液体培养基还是在菌 苔的培养基上( 这些条件将对细胞的移动产生很大的影响) ，r a s s 突变细胞移动 速度都要比它亲代细胞的快3 倍“。 r a s s 突变细胞之所以会具有异常的胞饮作用和迁移速度这与它们表型改变 有关。这些细胞高度极化，表面有许多肌动蛋白突起，而细胞表面与胞饮作用位点 有关的胞饮冠却减少，这些胞饮冠缺失的部位将会出现伪足。其主要原因是肌动 蛋白骨架的改变，使表层的f 一肌动蛋白主要集中在伪足部位；这说明在吞噬杯和 伪足之间存在着互相竞争关系，它们之间的竞争主要是对细胞骨架组织蛋白例如 冠蛋白和肌蛋白i 的募集竞争。当这些蛋白都集中于伪足时将会限制吞噬杯的形 成，反之若都集中于吞噬杯中将会影响到伪足的形成。所以任何引起细胞高效移 动的措施都将会阻止胞饮作用，在快速移动的细胞往往吞噬杯消失，因此移动非 常快的细胞表现出吞噬作用的减弱。由此可推测r a s s 的功能就是调节摄食和细 2 0 0 7 年华东师范丈学硕士学位论文 胞移动之间的平衡。d d p i k l 2 突变体快速的移动而胞饮作用却消弱。相反， 任何加强胞吞作用的结果都将削弱细胞的迁移速率。过量表达r a c e ( 属于r h o 蛋 白家族) 盘基网柄菌细胞的伪足缺失f - 肌动蛋白，但其胞吞作用则是野生型的3 倍1 。类似的反应也可在无菌培养中看到：在接种到无菌培养基上2 4 小时后观 察到细胞的胞饮作用增强，而它们的移动速度则减慢。表明了细胞移动的减弱对 于细胞的摄食是必须的。因此胞吞作用和细胞移动之间必然会存在着共同的调节 路径来平衡这两种功能，这个调节过程中可能需要r a s s 蛋白。 盘基网柄菌中r a s 蛋白可能的交换因子是r a s g e f b 。像r a s s 突变体