（环境工程专业论文）脱氢酶活性测定方法及其应用研究.pdf

哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 摘要 目前，在污水生物处理工艺控制过程中，由于大部分测定污水生物处理 系统生物活性的方法比较烦琐，需要高尖端的仪器，因此，使得监测污水处 理系统的实际运行效果十分困难。针对该问题，本文对比污泥脱氢酶活性 ( s p e c i f i cd e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y , s d h a ) 这一指标进行了试验研究。 实验室以人工配制的啤酒废水为处理对象，利用序批式活性污泥反应器 ( s e q u e n c e b a t c h r e a c t o r , s b r ) 及厌氧接触反应器( c o n t i n u o u ss t i r r e d t a i l k r e a c t o r , c s t r ) 分别培养好氧与厌氧污泥，以常温萃取法为基础，对s d h a 测定方法进行了系统的研究。 从好氧污泥总脱氢酶活性测定中萃取剂的选择入手，选择了七种萃取剂 进行对比试验研究，结果表明：丙酮( 8 5 ，v v ) 是污泥总t t c 脱氢酶活性 测定中的最佳萃取剂；对s d h a 测定过程中的影响因素进行了探讨：f 1 ) 在重金属对t t c s d h a 和比氧消耗速率( s p e c i f i co x y g e nu p t a k er a t e ，s o u r ) 抑制的对比试验中，选择了c u 2 + 、z n 2 + 和c d 2 + 为研究对象，发现三种重金 属对t t c s d h a 的5 0 抑制浓度( m e d i a ni n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ，i c 5 0 ) 依次 为1 5 2 m g l 、8 9 8m g l 和1 2 1m g l ；对s o u r 的i c 5 0 依次为o 6 7m g l 、 4 3 5 m g l 和1 5 7m e , l 。可见，对于t t c s d h a 毒性最强的为c d 2 十，对于 s o u r 毒性最强的为c u 2 + ；总体来说，s o u r 对重金属抑制更为敏感一些。 ( 2 ) 在不同浓度基质对s d h a 的影响试验中，研究了乙酸、丙酸、乳酸、正 丁酸和葡萄糖五种基质存在情况下的t t c s d h a ，结果表明：加入不同的 基质后，每种基质都会在某一浓度处产生峰值，但出现峰值的浓度却是不同 的，此浓度即为该基质的最佳浓度；另外，当基质浓度超过其最佳浓度时， 都会对脱氢酶活性产生抑制作用。( 3 ) 在选择测定i n t - s d h a 的萃取剂时， 分别以好氧污泥和厌氧污泥为研究对象，比较了甲醇、乙醇、乙醇( 7 0 ， v v ) 、正丁醇、乙酸乙酯、四氯乙烯+ 丙酮( 2 3 ，v v ) 和丙酮( 8 5 ，v v ) 七种 萃取剂的萃取性能，结果表明：在两种处理系统中，甲醇均是i n t - s d h a 测定中萃取剂的最佳选择。并对厌氧污泥t t c s d h a 最佳测定条件进行了 研究，得到了厌氧污泥t t c s d h a 的测定步骤；最后，用t t c s d h a 表征 了活性污泥增长曲线各阶段污泥活性的变化，通过与s o u r 的对比试验， 结果表明：t t c s d h a 与s o u r 具有良好的相关性，其相关系数 r = 0 9 3 9 0 。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 另外，在最佳萃取剂选择研究中，提出了萃取常数的概念，用以表示萃 取剂萃取能力的大小；为了便于比较t t c s d h a 与s o u r ，将t t c s d h a 的单位以0 2 的摩尔质量表示。脱氢酶活性测定方法及其应用研究，对于提 高污水生物处理构筑物的处理效率，促进污水生物处理技术的发展，具有十 分重要的意义。 关键词污水生物处理；比污泥t t c 一脱氢酶活性( t t c s d h a ) ；萃取剂 比氧消耗速率( s o u r ) ；重金属抑制 堕查堡三些奎耋三主鎏圭兰堡丝兰 a b s t r a c t a tp r e s e n t i ti sd i f f i c u l tt om o n i t o rp r a c t i c a lc i r c u l a t i o n e f f i c i e n c y o f w a s t e w a t e rt r e a t m e n ts y s t e m si nt h e p r o c e s sc o n t r o lo fw a s t e w a t e rt r e a t m e n t p l a n t sb e c a u s em o s td e t e r m i n a t i o nm e t h o d so fb i o l o g i c a la c t i v i t ya r ec o m p l i c a t e d a n dh i g h l ya d v a n c e di n s t r u m e n t sa r en e e d e d i nv i e wo ft h ea b o v e m e n t i o n e d p r o b l e m ，s p e c i f i cd e h y d r o g e n a s ea c t i v i t y ( s d h a ) w a si n v e s t i g a t e db ye x p e r i m e n t i nt h i sp a p e r b e e rw a s t e w a t e rw a s a r t i f i c i a l l yp r e p a r e di nt h el a b o r a t o r y , s e q u e n c eb a t c h r e a c t o r ( s b r ) a n dc o n t i n u o u s s t i r r e d - t a n k r e a c t o r ( c s t r ) w e r ed e s i g n e d t o i n c u b a t ea e r o b i ca n da n a e r o b i ca c t i v a t e d s l u d g er e s p e c t i v e l y b a s e do nt h e m e t h o do fn o r m a lt e m p e r a t u r ee x t r a c t i o n ，t h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o do fs d h a w a s s y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d s t a r t i n gf r o mt h es e l e c t i o no f e x t r a c t a n ti nt h ed e t e r m i n a t i o no ft o t a ld h a t h ec o n t r a s tt e s to fs e v e ne x t r a c t a n t sw a sc o n d u c t e d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t a c e t o n eo f8 5p e r c e n t ( v v ) w a st h em o s t o p t i m a le x t r a c t a n tf o rt h ed e t e r m i n a t i o n o ft o t a ld h aw i t ht t ca sa r t i f i c i a le l e c t r o na c c e p t o r ( t t c d h a ) t h ef a c t o r s i n f l u e n c i n gd e t e r m i n a t i o no fs d h a f o ra e r o b i ca n da n a e r o b i ca c t i v a t e ds l u d g e w a s i n v e s t i g a t e d ：( 1 ) i nt h et e s to f i n h i b i t i o no f s p e c i f i ct t c d h a a n ds p e c i f i c o x y g e nu p t a k er a t e ( s o u r ) b yh e a v ym e t a l ，h e a v ym e t a li o no fc o p p e r ，z i n ca n d c a d m i u mw e r ec h o s e n m e d i a ni n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ( i c s 0 ) o fs p e c i f i ct t c - d h aw e r e1 5 2 m g l 8 9 8m g la n d1 21 m g lr e s p e c t i v e l y , i c s 0o fs o u r w e r e o 6 7 m g l 4 3 5 m g la n d1 5 7 m g lr e s p e c t i v e l y t o x i c i t yo fc a d m i u mi o nw a s s t r o n g e s tf o rs p e c i f i ct t c d h a ，a n dt o x i c i t yo fc o p p e ri o nw a ss t r o n g e s tf o r s o u r a si ss h o w nt h a ts 0 u rh a sh i g h e rs e n s i t i v i t yt h a ns p e c i f i ct t c d h a ( 2 ) i nt h et e s to fi n f l u e n c eo fs u b s t r a t eo fd i f f e r e n tc o n t e n t r a t i o no ns p e c i f i ct t c d h a ，a c e t i ca c i d ，p r o p i o n i ca c i d ，l a c t i ca c i d ，b u t y r i ca c i da n dg l u c o s e a s s u b s t r a t ew a ss t u d i e d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a te a c hs u b s t r a t eh a sap e a kv a l u ei na c e r t a i nc o n c e n t r a t i o n ，b u tt h ec o n c e n t r a t i o no fp e a kv a l u ei sd i f f e r e n t a n dt h e c o n c e n t r a t i o ni st h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no ft h es u b s t r a t e i na d d i t i o n s d h a w a si n h i b i t e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e e x c e e d e dt h e o p t i m a l c o n c e n t r a t i o n ( 3 ) i nt h es e l e c t i o no fe x t r a c t a n ti nt h ed e t e r m i n a t i o no fs p e c i f i c 1 1 1 堕玺鎏三、业尘兰三兰堡圭兰堡竺圣 i n t - d h a ，e x t r a c t i n gc a p a b i l i t yo f m e t h a n o l ，e t h a n o l ，e t h a n o lo f7 0p e r c e n t ( v v ) ， b u t a n o l ，e t h y la c e t a t e ，t e t r a c h l o r o e t h y l e n e + a c e t o n e ( 2 3 ，v v ) a n d a c e t o n ew a s c o m p a r e df o ra e r o b i ca n da n a e r o b i c a c t i v a t e ds l u d g er e s p e c t i v e l y , t h er e s u l t s s h o w e dt h a tm e t h a n 0 1w a st h eo p t i m a le x t r a c t a n to f t h ed e t e r m i n a t i o no f s p e c i f i c i n t d h ai nt w o s y s t e m s t h eo p t i m a l v a l u eo f p a r a m e t e r si n f l u e n c i n g d e t e r m i n a t i o no f s p e c i f i c t t c d h af o ra n a e r o b i ca c t i v a t e d s l u d g e w a s i n v e s t i g a t e d ，a n dd e t e r m i n a t i o np r o c e d u r eo fa n a e r o b i c a c t i v a t e d s l u d g e w a s o b t a i n e d f i n a l l y , t h es l u d g ea c t i v i t i e s i ne a c hp h a s eo fm i c r o o r g a n i s mg r o w t h c u r v ew e r ei n d i c a t e db ys p e c i f i ct t c d h a 。w h i c hw e r ec o m p a r e dw i t hs o u r ， t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sag o o dc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tb e t w e e ns p e c i f i c t t c d h aa n ds o u r ，a n dt h ev a l u eo fc o r r e l a t i o nc o e f f i c i a n tw a s0 9 3 9 0 i na d d i t i o n ，t h ec o n c e p to fe x t r a c t i n gc o e f f i c i e n tw a sp r o p o s e dt oi n d i c a t e e x t r a c t i n gc a p a c i t yi n t h es e l e c t i o no fo p t i m a le x t r a c t a n t t oc o m p a r es p e c i f i c t t c d h aw i t hs o u r ，t h eu n i to fs p e c i f i ct t c d h aw a sc o n v e n e di n t o0 2 e q u i v a l e n t t h er e s e a r c ha n da p p l i c a t i o no f d e t e r m i n a t i o nm e t h o do fs d h a w i l l p l a yac r i t i c a lr o l ei ne n h a n c i n gt h er e d u c t i o ne f f i c i e n c yo fb i o l o g i c a lt r e a t m e n t p r o c e s sm a dp r o m o t i n g t h e d e v e l o p m e n t o fw a s t e w a t e rb i o t r e a t m e n tt e c h n o l o g y k e y w o r d sw a s t e w a t e rb i o t r e a t m e n t ；s p e c i f i ct t c d h a ( t t c - s d h a ) ；e x t r a c t a n t ； s p e c i f i co x y g e nu p t a k er a t e ( s o u r ) ；h e a v y m e t a li n h i b i t i o n - i v - 哈尔滨工业大学t 学硕士学位论文 1 1 课题背景 第1 章绪论 污水处理技术是随着社会进步和科学技术的发展而产生并不断发展的。尽 管随着水资源的短缺及人们节水意识的提高，人们在千方百计节约用水，但伴 随着人口增长、社会文明程度及国民经济的发展，生活、生产的用水量和排水 量仍在逐年增加。目前全世界污水排放量已超过4 2 0 0 亿m 3 a ，大大超过了水 体自净能力，使许多水体受到了不同程度污染【”。 一直以来，s s 和b o d 两项指标常用来衡量污水的处理效果，然而，随着 工业化进程的不断加快，大量难降解、对环境造成严重污染的合成有机物不断 出现，而且这些合成有机物的对污水处理厂的正常运行造成了负面影响。不论 排放或回用，哪一种标准都有许多项污染物排放指标的限定。而且随着认识的 扩展和监测方法的进步，许多原来未被注意的指标，都会新增进来。比如水的 色度、浊度、油、泡沫、微量有机物( 如酚、苯并( a ) 芘、甲醛、苯胺、硝基苯 等) 、难降解有机物( 如l a s ) 、氮、磷、重金属、氰等都是不久前才加以限定 的，而美国环保局称之为优先污染物的1 1 4 种毒性有机物【2 】，也已引起了各国 重视。 目前，尽管研究者已经寻找与探索出许多新的适合于去除不同污染物的污 水生物处理工艺，但人们发现当前各种工艺普遍存在的问题是处理工艺不能达 到设计要求。如来自美国的一项调查显示，美国有大约一半的污水厂污染物的 去除量都不能达到当初的设计要求。造成这种问题的因素很多，但最大的因素 可能是污水处理过程中不能充分发挥反应器中微生物的活性而使处理系统具有 稳定的运行效率。因此，近年来人们正在寻求准确、快速而有效的评价污水生 物处理系统中微生物活性的方法【3 】。 污水生物处理系统处理效果的好坏从本质上来说主要依靠存活的微生物的 新陈代谢活性，但当前在污水处理厂的实际工艺控制过程中，人们主要测定的 还是混合液悬浮固体浓度( m i x e dl i q u o rs u s p e n d e ds o l i d s ，m l s s ) 或混合液挥发 性悬浮固体浓度( m i x e dl i q u o rv o l a t i l es u s p e n d e ds o l i d s ，m l v s s ) 。这两种方法 都不能测定细胞的活性，测定的只是细胞的粗重，并不能区分开来活性污泥中 所含有的活细胞和死细胞及非生物性挥发固体之间的差别降6 】。然后人们又开 哈尔滨工业人学工学硕士学位论文 始尝试着利用脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 或核糖核酸含量 ( r i b o n u c l e i ca c i d ，r n a ) 、活菌菌数( a c t i v eb a c t e r i an u m b e r ，a b n ) 、氧摄取 速率( o x y g e nu p t a k er a t e ，o u r ) 、三磷酸腺苷( a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ，a t p ) 和脱氢酶活性( d e h y d r o g e n a s ea c t i v i t y ，d h a ) 等能够测定微生物活性的指标去 测定污水处理系统中活生物量 7 1 1 1 。 在这些参数中，d n a 和r n a 含量都能够反映活的和死的细胞，但测定方 法太烦琐，需要高尖端的仪器，且耗时长。o u r 被用来测定好氧污泥处理系 统中的生物活性，而不能应用在厌氧处理工艺中。另外，因为这项指标需要特 殊的仪器和专业技术人员操作，因此很少被应用在实际的污水处理工程中控制 污水的处理过程。a t p 和d h a 是最有前途的生物活性参数，因为它们都与微 生物的新陈代谢途径联系起来，因此能够区分活性的和非活性的生物量。然 而，a t p 受限制之处是它仅仅能反映反应器中微生物的总的活性，而不能区分 一个反应器里面不同的生物菌群。 1 2 国内外研究现状 1 9 5 9 年b u c k s t e e g 和t h i e l e 提出了t t c ( 2 ，3 ，5 氯化三苯基四氮唑) 一 脱氢酶活性试验，并用此试验测量了活性污泥的活性。他们还首次提出利用 t t c 去测定活性污泥的新陈代谢速率和毒性物质的抑制情况【l2 j 。此后，t t c 脱氢酶试验就被广泛应用于活性污泥工艺过程的研究并取得了很大的进展。许 多研究者报道了t t c d h a 与o u r 、a t p 、生物降解分数和总平板计数之间存 在着良好的线性关系1 1 3 , 1 4 1 。 f a h m y 和w a l s h 阐述了t t c 作为氢受体的优点，即可以利用空气中存在 的氧【1 5 1 。但是b u c k s t e e g 、t h i e l e 和l e l l l l a r d 等人都没有指出必须从样品中排除 氧【1 ”。l e n h a r d 得出结论：需要抽空试管的时间几乎不能证明是合理的【l 7 1 。 s h i k 和s t a c k 从样品中除去了氧【1 。 后来，研究者又对其它四唑盐作为电子受体的情况相继进行了探讨，其中 有1 n t 、x t t 、m t t 等 1 9 , 2 0 ，s t e n t e l a i r e 等人以四唑盐m t t 作为电子受体， 测定真菌孢子生存能力，该方法的灵敏性通过确定m t t 被孢子还原的最佳培 养条件( 培养温度为5 0 0 ，p h 值为8 ) 而得到相当的提高。结果表明脱氢酶 活性与由c f u 方法测得的活孢子数存在良好的相关性 2 1 1 ；以i n t 为电子受体 来测定微生物电子传递体系( e t s ) 活性的方法已经应用在土壤和水生环境 2 2 】； z i m m e r m a n 等人描述了利用i n t 来测定水生环境中呼吸细菌的方法【2 3 】。e t s 哈尔滨工业大学工学硕十学位论文 活性是呼吸细胞的一个指示性特性，并且可以通过用光电显微镜观察其浓厚、 稳定性等来测定。t r e v o r s 等人描述了一种测定土壤e t s 活性的方法从土 壤中提取i n t 的还原产物并通过分光光度分析法测其浓度 2 4 , 2 5 l 。 虽然国内在这方面的研究起步较晚，但是也已经取得了一定的成果。在萃 取剂的选择方面：陈颂原发现，丙酮和甲醛萃取t f 的效果优于乙醇；朱南文 等人在测定t t c d h a 时采用的萃取剂是甲苯【2 6