基因工程的工具酶ppt课件.ppt

基因工程的工具酶,遗传信息编码在核酸分子上，主要定位在DNA分子上。,DNA,RNA,Pro,基因结构示意图,基因工程的工具酶,基因工程操作中最常用的工具酶,主要内容,1限制性核酸内切酶2DNA连接酶3DNA聚合酶4修饰酶,SUMMARY,1限制性核酸内切酶,1.1引言-核酸酶和限制性核酸内切酶的定义1.2限制性核酸内切酶的命名1.3限制性核酸内切酶的分类1.4限制性核酸内切酶活性及其影响因素,核酸酶（Nuclease）：通过切割相邻两个核苷酸残基之间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。1）按作用对象可分为:Deoxyribonuclease(DNAase)后者叫calfintestinalalkalinephosphatase(CIP)。,碱性磷酸酶的活性,注意：CIP的比活性比BAP的高出10-20倍，CIP在SDS中68就可完全失活，而BAP却是热抗性酶。,末端转移酶(terminaltransferase):是末端脱氧核苷酸转移酶简称。来源于前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。功能：催化5脱氧核苷三磷酸进行53方向的聚合作用,逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3-OH端。,4.2末端转移酶,末端转移酶的催化作用,用途：(1)主要用于给外源DNA片段和及载体分子加上互补同聚物尾巴；(2)标记DNA片段的3末端。,4.3T4多核苷酸激酶,来源：T4polynucleotidekinase来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。功能：催化-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA的5-OH末端（图）。,T4多核苷酸激酶的活性（正向反应）,DNA/RNA（单链或双链）,T4多核苷酸激酶的交换活性,用途：（1）标记DNA的5-末端；（2）使缺失5-P末端的DNA发生磷酸化作用。,4.4S1核酸酶,来源：来源于稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）功能：是一种高度单链特异的核酸内切酶。注意：对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。,S1核酸酶的活性,用途：(1)测定真核基因中间隔子序列位置；(2)去除DNA片段中突出的单链尾巴；(3)打开cDNA合成时形成的发夹环结构。,一,连接方式(一)相同粘性末端的连接来源:相同的酶同尾酶问题:极性有两种可能同尾酶连接后,不能用任何一种酶酶切.称为焊死.,(二)平头末端的连接粘性末端-分子内部连接,平头末端-分子间的连接.提高连接效率的方法:加大酶用量(10倍)加大平头末端底物的浓度加入10%PEG(8000),促进分子间的有效作用加入单价阳离子,150-200mMNaCl提高反应温度平头连接同样存在两种极性,(三)不同粘性末端的连接突出5末端Klenow补平,或S1核酸酶切平,然后平头连接突出3末端T4-DNApol切平,然后平头连接突出末端不同Klenow补平,或S1核酸酶切平连接后,可能恢复限制性位点,甚至还可能产生新的位点.XbaI与HindIII(XbaI恢复),XbaI与EcoRI(均保留),BamHI与BglII(产生ClaI位点),(四)人工粘性末端的连接5突出的末端外源片段先用Klenow补平;然后用TdT补加polyC;载体片段也用Klenow补平,加polyG,退火不经连接即可转化.目的是:不使酶切位点遭受破坏.3突出的末端外源片段先用TdT加polyG;载体片段加polyC;然后退火;再用Klenow补齐;连接平头末端可直接用TdT补加末端,但以加polyA/T为佳.这样稍微加热,AT区就会出现单链区域,然后用S1核酸酶水解即可回收片段,(五)粘端与平端的连接linker:人工合成的,含有限制性内切酶识别序列