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用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 摘摘 要要 作为基因药物的输送材料，聚阳离子（polycation）非病毒载体和病毒及脂质体 载体相比具有无传染性、基因担载密度和担载量大、化学结构可控制、性质稳定以 及可大量制备等优点而越来越受到研究者的重视，但聚阳离子需要克服转染活性低， 化学毒性大的问题。我们认为聚阳离子载体从实验试剂走向临床药物的关键在于材 料的化学设计必须兼顾从基因复合、体内循环、细胞靶向、内吞逃逸、基因释放到 载体代谢一系列生物学过程的每一个环节。根据这一思路，我们用体内天然存在的 单体作为基本构建单元合成了能够兼顾上述一系列功能聚阳离子基因载体。 本论文首先总结了聚阳离子非病毒载体的研究现状和目前存在的问题，并提出 我们的聚阳离子的设计思路，然后分三个部分分别介绍聚阳离子载体的合成和化学 表征，聚合物与质粒形成的复合物的物理化学表征，以及聚合物的体外生物学活性。 首先是聚阳离子载体的合成，先将精胺分子中的伯胺基团保护，然后以乙二醇 二氯甲酸酯为连接剂，连接小分子精胺，产物脱保护后得到具有氨酯结构的线状聚 合物，通过化学结构表征，确认得到了目标产物，凝胶渗透色谱测得聚合物的分子 量为 1144，降解实验结果显示，聚合物的降解时间比我们预期的要长。 然后是聚合物与质粒形成的复合物的物理化学表征，在质量比大于 3 时，聚合 物就可以完全的保护 dna，并形成结构紧密的纳米粒，纳米粒的平均粒径为 55nm， 表面 zeta 电位为 33mv，显示出复合物形成的纳米分散体系较为稳定，不会发生聚 集。这些特性都表明聚合物是理想的用于基因输送的材料。 最后是聚合物的生物学活性测试，聚合物对于荧光素酶和绿色荧光蛋白两种报 告基因都具有较好的转染效果，在 cos-7 和 293ft 细胞中都能够高效表达报告基因， 在质量比 7-10 时对 cos-7 的转染效率比阳性对照组 pei25kda 高出一倍。探针示踪 实验证实聚合物能够包裹着基因物质成功逃逸出溶酶体，然后靶向在细胞核附近。 sirna 基因沉默实验中，聚合物也显示出高的基因沉默作用。在这些高效转染基因 物质的基础上，细胞毒结果显示，聚合物具有比目前广泛使用的 pei25kda 更低的毒 性，在浓度 40g/ml 的时候，能保持 40%的细胞存活。 我们的研究给出了一种新型的以人体内天然存在的单体构建的阳离子聚合物， 它可以高效地缩合基因物质，包裹基因物质逃逸出溶酶体，并保护基因物质不受降 解，它还具有更低的毒性，具有进一步结构修饰的可能，为临床研究提供了新的思 路和方法。 关键词：关键词：精胺，基因输送，聚氨酯，聚阳离子，毒性 study on the polyc ationic gene vector which was synthesized from the endogenous substance abstract as a vector for gene delivery, cationic polymers possess several advantages, such as the safey, greater loading capacity and loading density, simple and controllable preparation, easier modification and more stable compared to the viral vectors and cationic liposomes. however, the cationic polymers also suffer from two major deficiencies: high cytotoxicity and low transfection efficiency. up to now, there are several kinds of cationic polymers which all stay on the phase of experiment reagent. so, to design a successful vector, we should take into account a series of biological processes, including condensing dna, circulating in vivo, targeting to special cells, escaping from lysosome, releasing dna and degrading. according to this, we synthesized a novel polycation for gene delivery with a natural molecular existed in the human sperm. there are three parts in this dissertation. i introduced the polycation from three aspects: synthesize and chemical characterization, physical chemistry and bioactivity. first, we used ethylene bis-(chloroformate) to link spermine which had had their primary amine protected and got a linear polymer. through the chemical characterization, we can confirm we have got what we want. the polymers molecular weight is 1144 and it has the longer half life of degradation than our anticipation. then it is the physical chemistry characterization. the agarose gel electrophoresis showed that the plasmid was fully protected at a ratio of 3:1 w/w. the zeta potential and particle size of the complexes were respectively 33mv and 50nm, fell into the suitable range. so we can get a compact and right size particle. to determine the bioactivity, cos-7 and 293ft cells lines are used to evaluate the transfection efficiencies and cytotoxicity. we found that polymer have high transfection efficiency to the cos-7 cells and 293ft cells, almost 2 times as that of pei 25kda, at the same time, it also had a certain activity of gene silencing by delivering sirna to hsc. we use the taqman probe to track the polylink-sp by using laser confocal microscope. we can confirm that the polymer can take the gene out of the lysosome successfully and then target to the surface of nucleus membrane. the transfection and cytotoxicity assay suggested that the polymer has the greater transfection efficiency but less toxicity compared with pei25kda, which would make it to be a potential nontoxic cationic polymeric gene carrier. to summarize, our research synthesize a novel polycation gene vector with a natural molecular in the human sperm. it can condense gene efficiently, escape from the lysosome and protect the gene against the degradation. also, it has lower cytotoxicity and still has the space for improvement in its construct. it provides the new thought for further application with non-viral vector in clinic research. key words: spermine, gene delivery, polycation, polyurethane, cytotoxicity 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文。 保密，在_年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 1 - 第一章第一章 绪论绪论 1.1 基因治疗基因治疗 基因治疗1-3，是将外源性基因物质（dna 或 rna）导入细胞，促成或者抑制 特定蛋白的表达，或者取代、修复有问题的基因，从而达到疾病治疗的目的。rna 干扰（rnai）技术的出现，它提供了在转录水平、转录后水平发挥基因沉默作用， 特异性地抑制致病基因的表达或肿瘤、及病毒增殖的治疗途径。rnai 作为药物其与 治疗靶点（mrna）的简单的对应关系使以往在治疗靶点确定后还需要花费庞大的 投入来设计、合成及筛选大量化合物并且研究其本身及代谢产物的毒性的传统新药 发现过程来说是一个划时代的革命。它使基因治疗从概念到治疗技术的一些路径大 大明朗化了。 基因治疗目前主要是针对那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如 血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等） 、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾 病（如艾滋病、类风湿等） 。 基因治疗的策略是多种多样的，概括起来有以下七种： （1）基因矫正 纠正致病基因中的异常碱基，而正常部分予以保留。 （2）基因置换 指用正常基因通过同源重组技术， 原位替换致病基因， 使细胞内的 dna 完全恢 复正常状态。 （3）基因增补 把正常基因导入体细胞，通过基因的非定点整合使其表达，以补偿缺陷基因的 功能，或使原有基因的功能得到增强，但致病基因本身并未除去。 （4）基因失活 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 2 - 将特定的反义核酸(反义 rna、反义 dna)和核酶导入细胞，在转录和翻译水平 阻断某些基因的异常表达，而实现治疗的目的。 （5）“自杀基因”的应用 在某些病毒或细菌中的某基因可产生一种酶，它可将原无细胞毒或低毒药物前 体转化为细胞毒物质，将细胞本身杀死，此种基因称为“自杀基因”。 （6）免疫基因治疗 免疫基因治疗是把产生抗病毒或肿瘤免疫力的对应与抗原决定族基因导入机体 细胞，以达到治疗目的。如细胞因子基因的导入和表达等。 （7）耐药基因治疗 耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药 物毒性的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。 目前临床上进行基因治疗主要有两种途径4：即 ex vivo 及 in vivo 方式。 （1）ex vivo 途径：这是指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞（或异种细 胞） ，经体外细胞扩增后，输回人体。ex vivo 基因转移途径比较经典、安全，而且效 果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度大，不容易推广； （2）in vivo 途径：这 是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病 毒型或非病毒性，甚至是裸 dna。in vivo 基因转移途径操作简便，容易推广，但目 前尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫排斥及安全性等一系列问题。 临床上进行基因治疗， in vivo 途径是首选， 而载体的问题就接踵而来， 正如 rnai 发明者诺贝尔奖得主 andrew fire 所强调的那样，rnai 走向临床治疗的关键是 有效的体内输送系统。目前研究的载体分为两类，病毒载体和非病毒载体，病毒载 体的安全隐患一直存在，各种非病毒基因载体中，聚阳离子与脂质体相比具有基因 担载密度大、担载量大、制备简单，便于化学修饰等优势，同时也存在着化学毒性 大、体内循环周期短（不利于靶向）的缺点，致使聚阳离子载体一直处于科学研究 方面，我们认为聚阳离子载体从实验试剂走向临床药物的关键在于材料的化学设计 必须兼顾从基因复合、体内循环、细胞靶向、内吞逃逸、基因释放到载体代谢一系 列生物学过程的每一个环节。 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 3 - 1.2 基因输送的生物学屏障基因输送的生物学屏障 生物体都具有排他性， 它们不可能也不允许其他的基因在其体内表达， 每天动物 体都会摄入大量的其他物种和它们的基因物质，却并没有表达出这些物种的蛋白， 说明生物体都具有一套消灭其他基因物质防止其被表达的方法，这也是我们进行基 因输送时需要克服的一系列复杂的生物学屏障5。 如下图 1-1 所示， 基因输送可以细化为五个过程， 缩合基因物质， 内吞进入细胞， 溶酶体逃逸，降解释放基因物质，基因物质进核表达，其中四个过程都有载体的参 与，而且这四个过程中，任何一个过程出现问题，都会造成输送过程的失败。可见 载体的作用是非常重要的。下面将对五个过程分别进行介绍，并结合每个过程谈谈 对聚阳离子载体的要求。 图 1-1 聚阳离子载体的细胞内转染屏障示意图 fig. 1-1 schematic of intracellular barrier for transfection with polycation 首先是基因物质的缩合， 在进入细胞以前， 载体需要将结构松散的质粒缩合为紧 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 4 - 密的纳米颗粒， 保护质粒不被核酶降解6-8， 而且形成的纳米颗粒的粒径要大小合适， 在 50-200nm 之间。这些条件要求阳离子聚合物载体的分子量足够大，结构中含有足 够的氨基密度，以便其一方面高效的缩合基因物质，另一方面可以形成大小合适的 纳米粒。 接下来是细胞内吞过程， 这是一个被动靶向的过程， 因为大多数的聚阳离子载体 表面都有富足的正电荷，这样可以被动的黏附细胞表面带负电荷的蛋白，从而经内 吞进入细胞。在被动靶向的基础上，还可以更进一步，那就是受体介导的内吞，我 们都知道细胞表面有许多种受体，肿瘤细胞和正常细胞表面表达的受体的种类和数 量有所不同，受体和相应的配体相互作用可以非特异性的提高细胞的摄取率，而且 能达到提高药效减少毒副作用目的。目前研究较多的受体介导的细胞靶向有很多， 如聚赖氨酸与去唾液酸糖蛋白结合可以提高体内体外的肝靶向9-10， 甘露糖受体对巨 噬细胞的靶向11-13和叶酸受体对肿瘤细胞的靶向14-17，还有低密度脂蛋白18-19和转 铁离子受体介导的癌细胞的靶向20-23。另外上文提到的纳米颗粒的大小也是一个很 重要的因素， 因为细胞内吞对输送载体与 dna 形成的纳米粒的大小有非常严格的限 制，大于 200nm 的颗粒不能经内吞方式进入细胞24-25，而太小的颗粒，由于内吞时 形成的脂质膜的表面张力太大，也不能经内吞进入细胞。这些问题要求聚阳离子载 体的结构上含有一些活性基团，以便进行靶向基团的修饰，另外还要求聚合物有足 够的氨基密度，与 dna 形成的纳米粒表面有正的 zeta 电位，这样的纳米分散体系 就比较稳定，不容易发生聚集。 第三个过程是溶酶体逃逸， 经过内吞进入内涵体后， 细胞首先会将一些内涵体囊 泡上的质子泵打开，内涵体环境中的 ph 会迅速下降，然后细胞会融合一些溶酶体进 入内涵体，溶酶体中含有大量的酶，其中就包括破坏基因输送的核酶，低的 ph 值更 有利于这些酶发挥作用。这是基因输送中最为关键的一个过程，决定着基因输送的 成败。对于这一过程，病毒具有天生的克服这一生物学屏障的能力，而对于非病毒 载体，目前有两个被研究者广为接受的理论，一个膜融合理论26-27，一个是质子海 绵理论28-29。前者用于解释阳离子脂质体逃逸溶酶体的原理，通过直接与细胞膜融 合或者通过细胞内吞作用进入，随后与内涵体膜发生融合。而质子海绵理论用于解 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 5 - 释聚阳离子载体逃逸溶酶体的原理，阳离子聚合物，顾名思义，是指那些结构中有 很多能接受质子或者电子的基团的聚合物，这些基团能够发挥“质子海绵”的作用， 缓冲掉内涵体中的质子，使其中的 ph 值不下降，细胞会继续向其中泵入质子，为了 维持电荷的平衡，内涵体外会有大量的氯离子进入，随着这一过程的进行，内涵体 中离子的浓度增加会导致渗透压的增大致使内涵体破裂，释放基因物质进入细胞质 中。要通过质子海绵作用突破内涵体，要求阳离子聚合物有足够的未质子化的氨基， 另外，咪唑基团也具有质子海绵的特性，也可用于构建聚阳离子基因载体30-32。 然后是释放基因物质， 在逃逸出溶酶体进入细胞质后， 载体最主要的任务已经完 成，这时候需要将基因物质解包装下来33，这样基因才有机会接触到转录子，进而 进行表达。这一过程要求阳离子聚合物能够降解成小分子，这样一方面可以释放出 基因物质，另一方面会降低阳离子聚合物本身产生的毒性。 最后一个过程就是基因进核表达了， 这也是目前研究最少的一个过程了， 基因物 质如何进入细胞核，进入多少都不清楚。而基因必须进入到细胞核才能够表达出蛋 白，现在最有可能的途径就是处于有丝分裂期，细胞的核膜会消失，基因物质可以 通过扩散进入细胞核的区域34-36。 1.3 存在存在的的问题问题和和解解决方案决方案 基因治疗的关键是获得有效进行基因转染的载体。缩合基因物质，经内吞进入 细胞这两个过程的要求聚阳离子载体可以很容易达到，而目前在应用方面，它面临 毒性大和转染效率低的两大挑战，怎样在确保转染效率的情况下，降低载体的毒性 成为研究的热点。总结下来，主要从两个方面来解决这个问题。 1.3.1 pei 衍生物衍生物 pei是研究最为广泛的聚阳离子非病毒载体，其转染活性随分子量变化，分子量 25kda的pei转染效率最高，同时无法降解细胞累计毒性较大，目前对它的改造主要 包括两个方面： 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 6 - （1）对它进行一些修饰，最常用的有聚乙二醇（peg）修饰37-39，可以大幅度 的降低聚合物的毒性，增加其复合物的溶解性，也可以延长体内的循环时间40-41， 但是修饰后聚合物结合dna的程度降低，而且转染效率随peg的接入量增加而降低。 还有学者报道用环糊精修饰pei42，可得到毒性低而转染效率更高的聚合物，但是引 入的环糊精容易引起溶血。还有一种方法是在pei上共价连接一些靶向配体，增加细 胞的非特异性摄取率，实现靶向治疗，也能达到降低毒性的目的。还有进行丙胺酰 化，十二烷基化43等，都能够达到降低毒性的目的。 （2）另一方面，由于分子量800da的pei既没有转染活性，也没有细胞毒性。所 以就会很自然的想到用可降解的基团连接小分子pei合成具有新的结构基团的载体。 这样可以一并解决解包装和细胞毒性两个问题。连接基团不同，聚合物的转染效率 也会有差异，这方面的文献报道较多44-47，如kim等以戊二醛连接小分子pei形成具 有亚胺结构的阳离子聚合物，亚胺结构在酸溶液中不稳定，会快速降解，但是由于 复合物在内吞小泡中会遇到酸性环境，所以它的毒性小是以降低转染活性为代价的。 而forrest等用二丙烯酸酯构建的具有酯结构的pei衍生物，降解产生的酸不利于内吞 逃逸时质子海绵作用的发挥。还有用聚乙二醇二甲基丙烯酸酯，聚己酸内酯二甲基 丙烯酸乙二醇酯等连接小分子pei得到阳离子聚合物载体。 1.3.2 合成新型的阳离子聚合物合成新型的阳离子聚合物 由于pei是不能降解的，所以围绕它得到的衍生物始终不能够彻底地降解为无毒 的小分子，所以很多学者就着眼于寻找其他的可用于基因输送的阳离子聚合物，如 聚赖氨酸（pll）48-49，聚赖氨酸在溶酶体逃逸时还必须有氯喹的帮助，才能够获得 一些阳性结果，而且它还表现出了明显的细胞毒性；还有pamam，树状结构的带有 氨基的聚合物和聚磷脂50-51，溶解性好，转染效率高；还有壳聚糖52，明胶等天然 的高分子，生物相容性好、可生物降解，但转染效率不高。还有学者利用组合化学 的原理53-54，合成了上百个化合物，然后用细胞实验进行筛选，寻找有活性的化合 物，并总结化学结构与转染活性的关系。本课题也是从这个方向入手，寻找新的用 于基因输送的载体。 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 7 - 1.4 本研究的思路和实验方案本研究的思路和实验方案 基于以上的思路，为了从根本上解决聚阳离子毒性的问题，我们首次以人精子中 天然存在的精胺分子作为基本构建单元设计并合成了能够兼顾上述一系列功能并可 最终降解回到起始状态的聚阳离子基因载体。 精胺是具有两个伯氨、两个仲氨、分子量为202的多氨基分子，存在于人的精子 中，对基因物质在精子中的凝聚起着关键的作用。精胺凝聚基因作用有赖于其在精 子中的高浓度，精胺离开精子被体液中稀释后便丧失了这一能力。如果将多个精胺 连接成聚合物，则在聚合物骨架上的精胺等于重新获得了局部高浓度及基因凝聚能 力。如果精胺分子之间的连接结构可以在适当的时候降解，则被静电凝聚的基因物 质可以被释放出来同时聚阳离子也回到无毒的天然单体状态。 我们选择二氯甲酸酯作为连接剂，将伯氨保护的精胺聚合，脱保护后成为聚阳离 子。其剩余的氨基足以通过静电作用络合基因物质；其中未质子化的氨基足以在内 吞体中诱导质子海绵作用，使基因物质实现内吞逃逸；其氨酯链接的降解55-56可帮 助基因物质在靶细胞胞浆中释放；而其回到天然状态的降解性能则缓解了聚阳离子 化学毒性的隐患。通过报告基因的转染实验，以及细胞毒性实验显示了这一载体相 当于pei25kda的基因表达效率和大幅降低的细胞毒性，证明了上述设计的可行性和 一举几得的功效。 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 8 - 第二章第二章 聚阳离子基因载体的合成与表征聚阳离子基因载体的合成与表征 本章的研究工作是通过有机合成得到目标的聚合物，并对聚合物做初步的结构 和其他参数的表征。研究内容包括：1. 通过三步反应得到目标的聚合物。2. 目标聚 合物的化学结构表征，包括核磁共振，紫外和红外表征。3. 采用凝胶渗透色谱对目 标聚合物的分子量和降解特性进行表征。 2.1 仪器与材料仪器与材料 2.1.1 仪器仪器 re120 旋转蒸发仪 瑞士步琪实验设备有限公司 bs110s电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 85-2 恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司 alpha 1-4冷冻干燥机 gefriertrocknungsanlagen dzf-3真空干燥箱 上海福玛实验设备有限公司 恒温摇床 上海福玛实验设备有限公司 干燥箱 上海福玛实验设备有限公司 超纯水系统 millipore 高效液相色谱仪 waters ultrahydrogeltm 250 (300mm7.8mm)凝胶柱 waters 凝胶渗透色谱 perkin elmer.inc 移液器 eppendorf paragon 1000 傅里叶变换红外光谱仪 perkin elmer.inc mercury plus 400 核磁共振波谱仪 varian inc. 2xz-2旋片式真空泵 上海雅谭真空设备有限公司 kq-100db超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 9 - 透析袋(mwco=3500) 经宏科达生物技术有限公司 xw-80a 涡旋混合器 上海琪特分析仪器有限公司 2.1.2 材料材料 精胺 sigma-aldrich 乙二醇二氯甲酸酯 sigma-aldrich 带支链的聚乙烯亚胺 sigma-aldrich 三氟乙酸乙酯 sigma-aldrich mw=800da, sigma-aldrich mw=1300da, sigma-aldrich mw=2000da, sigma-aldrich mw=25000da, sigma-aldrich 氘代试剂 百灵威 高纯氮 上海瑞利化工气体有限公司 液氮 上海嘉日宝化工有限公司 氯仿（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司 三乙胺（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司 氢化钙 国药基团化学试剂有限公司 无水甲醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司 硫酸镁（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司 乙酸乙酯（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司 冰醋酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司 无水醋酸钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司 2.2 聚阳离子基因载体的合成聚阳离子基因载体的合成 阳离子聚合物的合成过程分为三个部分： 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 10 - 1. 精胺的保护 首先，在无水甲醇中加入硫酸镁，用物理方法预除其中的微量水，过夜之后， 搭蒸馏装置重蒸甲醇；然后，对反应所用的三口瓶，单口瓶进行无水无氧处理（即 反应装置首先在 120的烘箱中过夜，第二天趁热搭好装置，用油泵抽掉装置中的空 气，辅助用吹风机加热反应装置，除去反应瓶壁上的吸附水，冷却后充入除水的高 纯氮，如此反复三次，则认为装置中为无水无氧环境） ；准备工作就绪后，就开始加 料，称取一定量的精胺，加入新蒸的甲醇溶解，用注射器加入到三口瓶中，然后按 照化学计量比 1:1 量取三氟乙酸乙酯，由于反应发生迅速，故为了控制反应只发生在 伯胺基团上，滴加三氟乙酸乙酯时，需保持反应温度在-78，采用乙酸乙酯-液氮体 系，缓慢滴加三氟乙酸乙酯，滴加完成后 1 小时，再换成冰浴反应一小时，停止反 应，搭冷阱用油泵抽调溶剂甲醇得到白色粉末状固体。产物做核磁共振进行结构验 证。 2. 保护的精胺与乙二醇二氯甲酸酯反应 首先，对于反应的溶剂氯仿和缚酸剂三乙胺，加入氢化钙回流 48 小时以上；然 后无水无氧处理反应的瓶子，过程如上描述；再称取一定量的第一步的反应产物， 加入约 20ml 氯仿和 5ml 三乙胺溶解， 注射器量取 10ml 的新蒸氯仿加入到滴液漏斗 中，按照化学计量比 1：1 量取乙二醇二氯甲酸酯也加入到滴液漏斗中，在冰浴中滴 加。反应进行两天以后，减压蒸馏掉溶剂，得到透明油状液体，用蒸馏水洗三次， 把水洗液和产物放入-20进行预冻。过夜之后，冻干水洗液。gpc 测定反应产物的 分子量。水洗液做核磁共振。 3. 产物的解保护 第二步反应的产物中加入适量甲醇和浓氨水，60回流搅拌 6 小时，然后旋转 掉溶剂。 得到终产物， 第二天， 加入 nacl 和水溶解产物， 3500 分子量的透析袋透析， 透析进行两天后，将透析的产物放入-20预冻，冻干机冻干透析产物得到纯化后的 终产物。整个反应的流程图如下图 2-1： 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 11 - h2nn h h nnh2 f3c h n h n n h n h cf3 o o *n no o * nh f3c o o o nhcf3 o *n no o * nh2 o o nh2 ocf3 o + methanol chloroform ethylene bis-(chloroformate) methanol strong ammonia 图 2-1 聚合物合成的流程图 fig. 2-1 synthesis scheme of the polymer 2.3 聚阳离子基因载体的表征聚阳离子基因载体的表征 2.3.1 核磁核磁 为了确定反应产物的结构，采用核磁共振表征部分产物的结构，首先是第一步 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 12 - 精胺经三氟乙酸乙酯后保护的产物的核磁共振谱图，如下图 2-2a 所示，从精胺的结 构可以看出，精胺上共有五种氢，与伯胺相连的氢 nh2ch2-，保护之后得到 f3cconhch2-基团， 受位羰基和位三氟甲基的影响化学位移从 2.8 移动到 3.48， 证明了精胺上的伯胺基团已经被保护了。第一步保护伯胺基团，一方面是因为它在 内吞逃逸的时候发挥较大的作用，另一方面，线状的聚合物比支链状的聚合物具有 更低的细胞毒性57-58。 图 2-2b 是第二步反应中水洗液的核磁共振谱图，结果如下，从谱图可以看出， 水洗液中含有缚酸剂三乙胺，常温条件下，三乙胺的沸点为 89.5，在减压蒸馏中 会很快与氯仿一起蒸出而从产物中除去，水洗液中含有三乙胺，说明它与反应生成 的盐酸发生了反应生成了盐，从而可以通过水洗和透析除去。 图 2-2c 是反应经过解保护和透析后的终产物的核磁共振谱图，从谱图形状可以 看出，峰的形状均为苞状，预示反应生成了高分子的物质。精胺中-nhch2ch2-和 nh2ch2ch2-位置的氢由于直接与胺基相连，化学位移在 2.7 左右，而反应之后， -nhch2ch2-变为-oconch2ch2-， 由于酯基团的吸电子作用亚甲基上的氢的化学位 移从原来的 2.8 移到了 3.0，这可以证实，乙二醇二氯甲酸酯成功连接了精胺分子。 另外，理论上，单体中三类氢的数量的比值为 1:3:2，而谱图上三类氢的积分比值也 大致是 1:3:2，理论结果与谱图结果完全符合。 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 13 - 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 14 - 图 2-2 伯胺基团被保护后的精胺（a） 、反应产物水洗液（b）和合成的聚合物（c）的核磁谱图 fig. 2-2 the spectrum of 1h nmr. (a) the protection of primary amine groups of spermine; (b) washing water of the reaction solution(c) the polymer 2.3.2 红外红外 为了进一步验证所得产物的结构，将聚合物与 kbr 一起混合压片后，测定产物 的红外吸收光谱，结果如图 2-3 所示。 图 2-3a 为精胺中的伯胺被三氟乙酸乙酯保护后的红外谱图，可以看出，在 3449 cm-1处的强吸收峰，是仲胺的 n-h 的对称和反对称的伸缩振动，2932 cm-1-2778 cm-1 之间的的吸收是精胺结构中亚甲基的 c-h 的伸缩振动， 而 1702 cm-1处的吸收是酰胺 的特征吸收峰，称作“酰胺带” ，是 c=o 的伸缩振动所致，而这个吸收峰的位置 比正常的酰胺吸收频率要大，是因为三氟乙酸乙酯与伯胺发生反应后生成的三氟甲 基电负性比较大，吸电子诱导效应使得吸收峰位置蓝移，这个特征吸收峰也证实精 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 15 - 胺的伯胺基团成功被三氟乙酸乙酯保护了。1582 cm-1处的吸收是酰胺带，是仲酰 胺 n-h 的面内弯曲振动；1482 cm-1-1438cm-1处的吸收是亚甲基的 c-h 的弯曲振动， 1224 cm-1-1121 cm-1处的吸收是三氟甲基中 c-f 的伸缩振动峰。 图 2-3b 为解保护后经透析得到的终产物的红外谱图，由于产物经过解保护之后 就去除了 f3c-co-基团， 再通过透析除去了小分子和低分子量的物质， 剩下高分子量 的物质，对谱图分析可知，在 3416 cm-1处的双吸收峰，是伯胺的 n-h 的对称和反对 称的伸缩振动，说明解保护反应顺利进行，产生了伯胺基团；2955 cm-1处的吸收是 精胺结构中亚甲基的c-h的伸缩振动， 而1683 cm-1处的吸收是酰胺的特征吸收峰 “酰 胺带” ，是 c=o 的伸缩振动所致，而这个吸收峰的位置比正常的酰胺吸收频率要 大，是由于二氯甲酸酯中氧的电负性比较大，吸电子诱导效应使得吸收峰位置蓝移， 这个特征吸收峰证实乙二醇二氯甲酸酯成功连接保护的精胺而形成聚合物。1560 cm-1处的吸收是酰胺带，是仲酰胺 n-h 的面内弯曲振动；1487 cm-1和 1430cm-1处 的吸收是亚甲基的 c-h 的弯曲振动。 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 16 - 图 2-3 保护后的精胺(a)和终产物(b)的红外谱图 fig. 2-3 ft-ir spectrum of protected spermine(a) and the polymer(b) 2.3.3 聚合物的紫外吸收测定聚合物的紫外吸收测定 聚合物的分子量是聚合物一个重要的参数， 目前测定聚合物分子量最方便的方法 为凝胶渗透色谱法，简称 gpc，它依附于高效液相色谱，操作简单。 高效液相色谱一般常用的检测器为紫外检测器，所以就需要在做 gpc 之前测定 聚合物的紫外吸收情况，配制 10mg/ml 的聚合物的水溶液，在全波长紫外扫描器上 检测聚合物的紫外吸收情况，结果如图 2-4，吸收的波长集中在 215nm 处，吸收不特 征，而且易受溶剂的干扰，所以在测定聚合物的分子量时不能采用紫外检测器，只 能选择示差折光检测器。 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 17 - 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 100200300400500600700 吸收波长(nm) 吸光度 图 2-4 聚合物水溶液的紫外吸收谱图 fig.2-4 ultraviolet absorption spectrum of the polymer solution 2.3.4 凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱测定聚合物的分子量测定聚合物的分子量 为进一步了解聚合物的物理化学属性， 分别对解保护之前的产物和解保护之后的 产物做分子量大小的表征，结果如图 2-5，图 2-5a 为解保护之前的产物的凝胶渗透 色谱图，由于在解保护之前，产物不溶于水，所以 gpc 在 dmf 中进行，色谱条件 为：流动相 dmf 中含有 0.01m 的溴化锂，流速为 1 ml/min，检测器为示差折光检 测器，采用聚苯乙烯为标准物测得重均分子量为 12103。 图 2-5b 为解保护之后的产物的凝胶渗透色谱图，产物溶于水，所以 gpc 在水中 进行，色谱条件为：流动相水中含有 0.05m 的叠氮化纳，流速为 1 ml/min，检测器 同上，采用葡聚糖为标准物测得重均分子量为 1144。 可以看出， 聚合物分子量的测定结果随色谱条件和标准物的变化非常大， 而标准 物与待测物质的结构相差越大，结果的偏差就会越大。 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 18 - 图 2-5 氨基解保护反应前的产物(a)和解保护反应后的产物(b)的 gpc 谱图 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 19 - fig.2-5 gpc chromatograms of product (a) before the unprotected reaction; (b) after the unprotected reaction 2.3.5 凝胶渗透色谱测定聚合物的降解凝胶渗透色谱测定聚合物的降解 凝胶渗透色谱中，由于测定条件和标准物对高分子分子量的测定结果影响很大， 所以在测定聚合物的降解实验时，采用自购的凝胶柱，以结构与合成的聚合物结构 相似的聚乙烯亚胺（pei）为分子量的标准物，测定聚合物的降解情况。 经考察得到的色谱条件如下： 色谱柱：waters ultrahydrogeltm 250 (300mm7.8mm)，排阻范围 200-30000； 检测器：示差折光检测器； 流动相：ph 为 4.5 的醋酸盐缓冲液； 检测器温度：40； 柱温：40； 流速：1.0ml/min； 进样量：20l； 标准品：sigma 公司的 mw 为 800，1300，2000da 的 pei。 待测样品是一系列降解了不同时间的聚合物溶液， 具体的操作是， 先称取一定量 的聚合物，然后用 ph=4.5 的缓冲液溶解得到 10mg/ml 的溶液，取 500l 作为 0 时 刻的待测样品，然后将剩余的样品放入 37的恒温摇床中，每天相同时间取样 500l，放入-20的冰箱中保存，样品收集一周后测定。 标准品和待测样品一样，需要配制成 10mg/ml 的溶液，充分溶解后用 0.45m 的滤膜过滤，取滤液进样。调整好仪器状态后，开始测定三个标准品，得到的保留 时间如下表 2-1 所示， 由于重均分子量的对数值与相应的保留时间具有线性关系， 由 此可得到回归方程，lgmw=-0.9166tr+10.558，r=0.9999，线性关系很好。 表 2-1 不同分子量标准品 pei 对应保留时间 tab.2-1 retain time of different molecular weight pei standards by gpc 用人体内源性单体构建的聚阳离子基因载体的研究 - 20 - mw tr lgmw 800 8.352 2.90309 1300 8.119 3.113943 2000 7.918 3.30103 第二步测定待测样品，得到的 7 条色谱曲线，叠加比较之后结果如图 2-6 所示， 然后结合回归方程，根据重均分子量的定义式 2-1，可以计算得到待测样品的重均分 子量。 mw=(riimi)/ rii (2-1) 其中 mw 为重均分子量， rii 为待测样品在保留时间 i 时的峰高， mi 是待测样品 在保留时间 i 时的分子量。 图 2-6 待测样品色谱图比较 fig.2-6 difference between the chromatograms of samples 计算出待测样品的重均分子量