（微生物学专业论文）林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 文题目 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留 的去除麦；r级别 学生 姓名 张东升 i 喜翌i 微生物学 导师1 姓名i 陈红歌 学位论文 是否保密 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生签名： 日期：年月 日 导师签名：7 享；彀 日期少够年乡月掳日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学气产亭夸斧密后适用于夸謦蟹。l 宇吴l 研究生签名毒陋烈导师签名噼彳z 私学院领导签名 印建1 日期：沙够年多月涉日日期少埠石月循日期：o g 年6 月叼日 致谢 本论文是在导师陈红歌副教授的悉心指导下完成的。三年来，导师陈红歌 女士在教学科学研究中严谨治学、一丝不苟、辛勤耕耘、始终把工作放在第一 位的工作作风，给我留下了最为深刻的印象。她生活简朴、平易近人，她诲人 不倦、任劳任怨，在每一位学生的生活和学习上，都倾注了大量的心血和汗水， 深受我们的尊敬和爱戴! 她不仅传道授业解惑，还言传身教地教我们如何为人 处事。博学、审问、慎思、明辨、力行，在她身上都能得以展现! 三年来，从 课题的选题、试验方案的设计到论文框架的构思、语言的修善，工作中的每一 个环节，恩师都给予了关键、耐心的指导和帮助。一日为师，终身为父! 桃李 不言，下自成蹊! 在此，我谨向恩师陈红歌老师表示我最衷心的感谢和最诚挚 的敬意! 三年来，在做课题的过程中，贾新成教授、吴坤教授、丘立友教授、宋安 东副教授、刘亮伟副教授、张世敏博士、王明道博士和刘新育老师等就试验中出 现的一些问题，提出了不少建议和具体解决办法。赵柏叶、赵玉萍等老师为试验 的顺利进行也提供了诸多帮助。在平时的学习、工作中，院领导也给予了很多关 心和爱护，在此一并致谢! 我要感谢与我朝夕相处的学友们，李岳桦、黄惠敏、阮森林以及0 4 级的康 静、张品品、鲁晓娟、吕帅、朱广军等，正是他们的帮助，使我战胜了工作中 遇到的无数困难和挫折! 几年的共同生活和学习，也使我们结下了深厚的友谊， 彼此间亲如兄弟姐妹，情同一家! 最后，我还要特别感谢我的父母、家人和朋友，是你们的鞭策、鼓励、无 私奉献以及始终如一的理解和支持使我顺利地完成了学业! 是你们无私的爱给 予了我战胜一切困难的信心和勇气! 谢谢你们! 张东升 2 0 0 8 年5 月于郑州 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 摘要 本试验的第一部分是光催化降解林可霉素废水中林可霉素残留的研究；第二部分是去除 林可霉素发酵残渣中抗生素残留的研究。 在试验的第一部分，我们用紫外灯作为光源，以锐钛型t i 0 2 为催化剂降解林可霉素。 探讨了光照时间、初始p h 值、初始浓度、催化剂用量和载铜t i 0 2 复合催化剂对光催化降解 的影响。结果表明一，t i o ：用量为0 4 9 l ，p h 为5 ，林可霉素初始浓度为6 0m g l ，室温条件 下，光照9 0 m i n 林可霉素降解率为1 0 0 ；掺杂1 c u 2 + ( 摩尔分数) 的t i o z 复合催化剂，光催化 活性高于纯t i o z ，其光催化降解效率较纯t i o z 提高2 2 在用发酵法生产抗生素林可霉素的过程中，会产生大量抗生素发酵残渣，里面富含有机 质，蛋白质含量高，是很好的动物饲料原料但由于其中有一定量的抗生素残留，无法直接转 化为洁净、无污染的绿色饲料在试验的第二部分，我们根据林可霉素在酸性条件下不稳定 的性质，通过加酸调节p h 值、高温加热，寻找发酵残渣中林可霉素最佳去除条件。结果表 明，无机酸硫酸在温度1 2 5 c 、p h l 4 0 以下，有机酸柠檬酸在温度1 2 5 、p h l 6 0 以下( 或 柠檬酸与湿渣质量百分比为1 8 9 6 ) ，对样品中林可霉素残留有较好的去除效果，且处理时间 相对较短( 2 h ) 。 关键词：林可霉素；发酵残渣；废水；去除 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 1 文献综述 1 1 林可霉素概述 林可霉素( l i n c o m y c i n ) 产品形式为盐酸林可霉素，又称洁霉素，是1 9 6 2 年发现的由 林可链霉菌林可变种( 4 - 1 0 2 4 ) 所产生的一类治疗由革兰氏阳性菌所感染的主要抗生素。林 可霉素是含氮杂环类，分子式：c 。8 h 。n 。0 。s h c i h ：0 ，分子量：4 6 1 0 2 ，其化学名为6 一( 卜甲基 一反一4 一丙基- l - 2 - 吡咯烷甲酰氨基) 一卜硫代一6 ，8 一二脱氧一d 一赤式q d - 半乳辛吡喃糖苷盐酸 盐一水合物。其结构式见图1 所示。n 。2 1 c h 3 i 图l 林可霉素结构式 f i g u r eic h e m i c a ls t r u c t u r eo fl i n c o m y c i n ， t c l ，h 2 0 林可霉素为白色结晶性粉末，有微臭或特殊臭；昧苦。本品在水或甲醇中易溶，在乙醇 中略溶。林可霉素为碱性物质，结构稳定耐热，在7 0 0 c 放置6 个月，活性不下降。呈色反 应：a 与h ：s o 。反应，呈橙红色；b m o l i s h ( q 一萘酚试验) 反应：取l m l 样品液，加入 5 q 一萘酚乙醇溶液2 滴，摇匀。沿壁缓缓加入0 5 m l 浓h 2 s 0 4 。在试液与h z s 0 。交界处很快 形成紫红色环，表明含有糖、多糖或糖苷，林可霉素呈阳性反应；c 与c 。s 0 a 反应：林可 霉素与c 。s o 。碱化得蓝色络合物。心1 林可霉素抗菌谱与红霉素相似，但又不完全相同( 其抗菌谱见表1 ) 。最低抑菌浓度在 0 1 5 - - 一2 5ug m l ，对葡萄球菌、链球菌、双球菌等革兰氏阳性菌与红霉素等大环内酯类抗 生素有类似的抗菌活性，对溶血链球菌、草绿链球菌抑制作用比红霉素好，其最低抑菌浓度 低于o 51 1g m l 。但对革兰氏阴性杆菌如肺炎杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌和大肠杆菌、真菌 及病毒无效。林可霉素和青霉素、氯霉素、氨苄青霉素、头孢菌素或四环类抗生素没有交叉 耐药性，与红霉素等大环内酯类抗生素存在交叉耐药性。林可霉素作用机理为与细菌核糖核 蛋白体5 0 s 亚基结合，影响氨酰基- t r n a 的氨酰基末端与核糖核蛋白体结合，阻断转肽反应 及肽链延长，从而抑制细菌蛋白质合成。比4 1 一般林可霉素由林可链霉菌林可变种( 4 1 0 2 4 ) ，通过液体深层发酵生产，其提取工艺 流程如图2 。 2 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 表l 林可霉素抗菌谱 t a b l e1a n t i b a c t e r i a lm a po fl i n c o m y c i n 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 图2 提取工艺流程图 f i g u r e2e x t r a c t i o np r o c e s sm a p 4 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 1 2 林可霉素发酵残渣 1 2 1 主要成分 在制药过程中产生的废渣主要是发酵液预处理进行固液分离时形成的药饼部分，其主要 成分是微生物菌体细胞、未降解的固形有机物、无机盐和少量的抗生素及代谢产物。提取抗 生素之后的林可霉素菌丝渣，营养物质含量丰富。经实测，( 干物基础) 含粗蛋( 5 1 4 0 以上， 粗脂肪8 4 ，粗纤维1 1 ，钙5 3 ，磷0 9 ，微量矿物元素大大高于饼粕类饲料。其重金属 铅含量甚微，仅0 o b p p t a 。每g 湿渣中林可霉素含量约为2 0 0 0 u 左右。 根据对菌渣中主要成分的分析可知，菌渣是做动物饲料最好原料。再加上菌渣中还含有 微量的抗生素残留，对畜禽生长都有诸多好处隋1 。因此，对菌渣通常的处理办法就是将其通 过干燥使水分小于1 0 ，再添加一些其它物质直接做成动物饲料。 1 2 2 做动物饲料的好处 自上世纪5 0 年代，动物科学家们发现，饲料中低浓度的抗生素可明显地促进畜禽生长。 饲料抗生素广为使用，世界上各饲料生产国几乎无一不在饲料中添加各种抗生素。应该说近 半个世纪以来，饲料抗生素对预防动物疾病，促进动物生长，提高饲料报酬确实起到了积极 的作用f 5 - 7 】。据统计，世界上有二十多种抗生素及十几种合成抗菌类药物被应用到饲料中。 6 0 、7 0 年代至8 0 年代初是抗生素被饲料行业应用得最多的时期，受到了饲料厂商和饲养者 的欢迎，得到了人们的认可。那么抗生素有哪些作用，作用的机理是什么? 1 2 2 1 防治疾病 众所周知，环境和饲料中存在着多种微生物，其中就有导致疾病的病原微生物，这些病 原微生物很容易通过口腔、呼吸道进入动物体内。抗生素能干扰病原微生物的细胞壁合成， 损伤菌体的细胞膜，影响病原微生物内r n a 合成酶体系和蛋白质合成体系，从而阻碍病原微 生物在消化道中的大量繁殖，减少动物的发病率。尤其对威胁养禽业的球虫病。在尚无较有 效的球虫疫苗的情况下，在饲料中添加抗球虫药物( 如聚醚类抗生素) 是目前有效的预防措 施。 1 2 2 2 提高饲料利用率 抗生素能抑制和杀灭病原微生物，防止无意义的营养消耗，提高了饲料在动物体内的利 用率。在猪饲料中添加抗生素，可使猪对能量、蛋白质和磷的表观消化率提高。很多实验证 明，在中等的饲养条件下，应用抗生素能使饲料利用率提高6 一1 5 。 1 2 2 3 其他作用 据报道盯1 ，有的抗生素有提高动物的受精率和繁殖率，改善动物的色素沉积和提高瘦肉 率等作用。 1 2 3 做动物饲料的弊端 虽然在现代的动物养殖中，使用抗生素是预防疾病、促进生长和提高饲料转化率的最重 要的手段之一。但是随着抗生素的广泛使用，人们逐渐认识到它存在着些弊端，主要有： 5 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 1 2 3 1 药物残留 抗生素随饲料在动物消化道发挥作用后，进入动物的血液循环，经肾脏的过滤大多数随 尿液排出体外，但仍然有一些残留在动物体内。残留的这些抗生素积累在动物产品如肉、蛋、 奶中，直接威胁着人体健康。因此欧盟严格规定了抗生素添加剂的用量，并规定在动物的组 织中必须不能检出有药物残留，这就对我国出口畜禽产品提出了更高的要求。 1 2 3 2 病原微生物产生耐药性 抗生素的使用抑制或杀灭了大部分对药物敏感的病原微生物，但有少量细菌产生了耐药 性阳1 。细菌的耐药性可通过耐药因子( r 因子) 在数小时内从药菌株同敏感菌株传递，甚至可 以在微生物种内、种间以至属间进行传递，使更多的病原微生物产生耐药因子，并且可在不 同抗生素之间产生交叉耐药性，结果使抗生素的防病作用大大降低，甚至无效。不仅如此， 在过去3 0 多年的时间里，欧洲和美国的专家就此进行了调查，结论是细菌在动物体内对药物 的耐受性可能转移给人。虽然耐药因子传递频率只有1 0 一，但由于细菌数量大、繁殖快，在 这一频率下仍造成抗药菌株的扩散和蔓延，治疗疾病时采用常规剂量得不到效果。如果这种 抗生素是人畜共用或人用抗生素，这种耐药性还可以通过畜产品传给人类 9 j ，对人类身体健 康产生危害的同时，也给疾病的治疗带来了困难【l0 1 。据有关报道显示，在饲料中长时间的 使用低剂量的抗生素，会增加耐药性产生的几率。为克服这种弊端，人们试图研制更新更有 效的抗生素，但由于耐药性这个问题始终无法解决，新的抗生素也会慢慢失去预防作用，饲 料抗生素的应用进入了恶性循环。有些专家甚至认为，在这场人与细菌的“赛跑”中，细菌 已处于“领先地位”。所以，在畜牧业中尽量少用抗生素，是非常明智之举。 1 2 3 3 引起动物发病或死亡 动物体内既存在有害的病原微生物，也生长着一些有益的微生物，例如乳酸杆菌、芽孢 杆菌等，它们能帮助动物机体合成营养物质、维持正常的免疫能力。体内的微生物菌群相互 制约，构成一个平衡的体系。抗生素的使用不仅抑制或杀灭了病原微生物，同时也抑制或杀 灭了动物机体内的有益菌，打破了微生态平衡，导致动物某些维生素缺乏，免疫能力降低， 甚至使非敏感菌和真菌大量繁殖，引致消化吸收的障碍以至继发性感染，造成动物发病或死 亡。如抗生素肠炎的发生与滥用抗生素有密切关系。据中国兽医杂志报道( 1 9 9 2 ) ，令人惶恐 的”疯牛病”也是由于长期给牛注射抗生素、激素和羊马下水制成的一种三合一针剂导致的。 1 2 3 4 其他不良作用 长期使用抗生素，使畜禽机体产生依赖性，限制了体内免疫细胞机能的发挥，使机体免 疫功能下降，抵抗疾病能力降低；使用抗生素有可能使动物产生基因突变、畸形、致癌；抗 生素大量排出动物体外，也可能造成环境污染 1 5 1 。 1 2 4 目前困境 鉴于抗生素严重的副作用和人们对健康安全食品的需求不断增加，国际市场上对出口动 物食品的安全检测日益严格，国家对饲料中抗生素残留的去除日益关注，多次发文要求饲料 6 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 中不得检出抗生素残留。欧盟委员会立法从1 9 9 9 年7 月1 日起禁止在饲料中添加杆菌肤、 螺旋霉素、维吉尼亚霉素、泰乐菌素4 种抗生素。美国f d a 已从农业用途中取消了青霉素、 四环素、红霉素、林可霉素、泰乐菌素和维吉尼亚霉素。目前，欧盟已经在动物饲料中全面 停止所有抗生素包括促进剂的使用。专家指出，抗生素作为饲料添加剂的时代将过去，应恢 复其治疗药物的身份8 1 。 目前，国内大多数抗生素生产企业的发酵菌渣都被禁止用作动物饲料引，大多被当作燃 料焚烧掉，这是对潜在资源的极大浪费1 1 2 5 发展前景 迫于国家饲料安全法规的压力，以及肩负人类健康安全的神圣使命，许多抗生素发酵生 产企业也在不断寻求发酵菌渣更为有效的开发利用途径。比如，通过添加某些无机盐做成复 合肥料等1 引。不过，如果能够去除残渣中的药物残留，再添加一些微生态制剂、酶制剂、 中草药制剂 2 0 - 2 2 】，生产出不含抗生素的绿色饲料，仍不失为一种最有价值的利用途径。年 产2 3 0 0 吨、亚洲最大的林可霉素生产企业南阳普康药业就是一家致力于这方面研究开 发的公司之一。 南阳普康年湿渣生产能力大约为1 3 5 0 0 吨，全国湿渣生产能力数千万吨。因此，如果本 研究获得突破，将直接给南阳普康及全国近百家类似林可霉素生产企业带来相当可观的经济 效益，同时，也会产生很好的社会效益和环境效益。 1 3 林可霉素废水 1 3 1 林可霉素生产废水的概述 林可霉素原料药生产废水主要来源于发酵液经溶媒( 如丁醇) 提取后剩余的残液，其有 机浓度高，成分复杂，主要成分为碳水化合物、蛋白质、类酯物，亦含少量对微生物有抑制 作用的抗生素、溶媒等，c o d 为1 4 0 0 0 1 8 0 0 0 m g l ，p h 值呈碱性。另外还有一部分冲洗废水， 这部分废水c o d 浓度较低，主要含有大量菌丝体，s s 为2 0 0 0 m g l ，p h 值呈酸性。林可霉素 生产废水不但具有一般抗生素工业废水的特点，而且因为林可霉素对革兰氏阳性菌具有强抗 菌能力而使得生物处理具有较大的难度，国内对林可霉素生产废水的治理要求迫切，但难度 较大，其单独处理技术国内尚未见报道。 1 3 2 林可霉素生产废水的传统处理工艺 该废水若单独采用好氧处理，由于废水有机物浓度高，并且含有大量不易降解的有机物 和少量有毒有害物质，好氧微生物难于存活，生化性较差。通过厌氧处理不仅可去除废水中 大部分污染物，而且可使废水中大分子、难降解的有机物分解为小分子有机物，同时可降低 废水中的有毒有害成分，改善废水的生化性能，为下一步好氧处理提供条件。经验表明，经 过厌氧处理后的废水再进行好氧处理污染物的去除率可明显提高。 厌氧处理方法多种多样，根据该废水的特点，目前采用国际上先进的上流式厌氧污泥床 ( u a s b ) 技术。该技术处理高浓度有机废水目前在国内外已得到广泛应用，其主要优点为： 7 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 u a s b 容积负荷大，污染物去除率高，可直接处理高浓度有机废水； 动力消耗低，并且可产生大量沼气； 耐冲击负荷能力强，有机负荷可达5 卜1 0 o k g c o d m 3 d ； 污泥产生量少，可节约污泥处理费用； 厌氧反应器可以季节性或间接性运转，厌氧菌可长期处于休眠状态，在工厂因故停 产运行一段时间后，再开工系统能迅速启动。 好氧处理目前国内常采用“间接式活性污泥法”，a p s b r 法。其核心构筑物是s b r 反应池， 该池集初沉池、曝气池、二沉池于一体。污水进入池中，在微生物的作用下得到净化，经静 止沉淀、泥水分离后，将处理后的水通过滗水器排出池外。其运行模式按操作顺序，由进水、 反应、沉淀、排水和闲置等五个基本过程组成。 1 3 3 光催化降解在废水处理中的应用 1 3 3 1 光催化降解废水的优势 近年来，以能源利用和环境保护为背景，有机污染物的光催化降解瞳3 。2 刚研究十分活跃， 国外称之为高级氧化工艺( a d v a n c e do x i d a t i o np r o c e s s ，简称a o p ) 。采用半导体多相光催 化治理环境污染是近年日益重视的新技术，它在废水净化处理中发挥着巨大潜能。h o f m a n n c 和m i l l s c 等人进行了详细的评述性报道。它不仅在常温常压下可以进行，还有下列优点驯： ( 1 ) 能耗低，反应条件温和，在紫外光照射下就能发生；( 2 ) 反应速度快，有机污染物可在几 m i n 到数h 内被完全破坏( 生成c 0 2 和h 。0 及其它物质) ，这种方法避免了聚环产物的生成；( 3 ) 降解没有选择性。几乎能降解任何有机物；( 4 ) 消除二次污染，是现代生产的清洁工艺。由 于光催化反应在环境保护方面有着广泛的应用前景，因此，近十年来对这一领域的研究越来 越引起人们的重视旧。 1 3 3 2t i 0 ：光催化作用机理 半导体多相光催化是指半导体材料吸收外界辐射光能激发产生导带电子( e ) 和价带空 穴( h + ) ，进而与吸附在在催化剂表面上的物质发生一系列化学反应的过程。半导体的能带 结构常是由一个充满电子的低能价带和一个空的高能导带构成，它们之间的区域称为禁带。 半导体的禁带宽度一般为0 2 3e v ，是个不连续区域。半导体的光催化特性就是由它的特 殊能带结构所决定的当能量大于禁带宽度的光照射t i o z 微粒时，产生电子空穴对，价带上 的电子会跃迁到导带，成为导带电子( e 一) ，同时在价带留下一个空穴( h + ) 空穴通常被0 h 一 和h ：0 俘获，生成具强氧化能力的自由基o h ，几乎可以无选择地氧化多种有机物，是光催 化氧化地主要活性物质。电子通常被吸附在颗粒表面的o ：俘获，生成如一并进而与h 作用生 成o h 等一系列自由基。可见，向t i o z 水体系曝气，可加快有机物的降解速率。但是，由于 电子和空穴也能在催化剂微粒内部或表面发生复合并以热量方式将激发能释放，从而缩短了 空穴寿命，故抑制电子空穴对复合可提高t i o z 的光催化活性。为了有效俘获电子或空穴，俘 获剂在催化剂表面的预先吸附是十分重要的旧2 。 8 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 1 3 3 3 光催化降解在环境治理中的应用 光催化氧化法对环境污染物具有很好的去除效果，一般经过一段时间的持续反应，有机 物最终能被完全矿化。特别是对于用传统的化学方法难以去除的低含量污染物，光催化氧化 降解显得更有意义。光催化氧化技术在环境治理中的应用主要有染料废水的处理、卤代有机 化合物的处理、农药的去除、空气净化、无机污染物废水的处理、光催化杀菌等。 在染料的生产和应用中，排放的废水里残留的染料分子进入水系会造成严重的环境污 染，其中有的含有苯环、胺基、偶氮基因等致癌物质。常用的生化法对于水溶性染料的降解 效率较低。近年来，对利用光催化降解染料的研究日益增多，国内外研究者已经对亚甲基蓝、 罗丹明、甲基橙、耐酸大红染料、刚果红等染料进行了大量研究。只要选择适当的实验条件， 大多数染料的去除率都很高。美国c o r o l a d 太阳能研究所采用液固相光催化法对污染的地下 水进行处理，将半导体催化剂粉末加入水中，经太阳光照射，光催化反应使水达到饮用标准。 国内王怡中等3 5 1 用t i o 。作为光催化剂，对甲基橙的光催化降解作了大量的研究工作，结果 表明t i o ：，对低浓度的甲基橙溶液有很好的脱色降解效果。 卤代有机化合物主要包括卤代芳香烃、卤代脂肪烃、卤代脂肪酸等。这类物质毒性大、 分布广，在各国提出的优先控制有害物质“黑名单”中占有相当大的比例。这类物质在光催 化分解过程中，一般先烃基化，再脱卤，逐步分解直至完全分解为c 0 z 和h z 0 等简单的无机物。 光催化过程在处理卤代有机化合物方面显示出了良好的应用前景，目前关于这方面的研究己 有很多报道，对于氯仿阳6 | 、4 一氯苯酚7 3 引、卤代二恶英b 训等物质的光催化降解机理都有详细 的讨论。 农药可以分为除草剂和杀虫剂，其危害范围很广，在大气、土壤和水体中停留时间长， 所以农药的分解去除备受人们的关注。利用光催化去除农药的优点是它不会产生毒性更高的 中间产物，这是其他方法无法比拟的。张新荣n 7 i 等用空心玻璃微球附载t i o z 降解有机磷农药， 取得了良好的效果。国内陈士夫等h 对于t i o z 光催化降解有机磷农药废水的研究指出，该法 能将有机磷完全降解为p 0 。 ，中压汞灯下c o d c r 除去率达9 0 ，利用太阳光作室外实验c o d c r 除去率达7 0 。 光催化反应在常温常压下可以使得多种有害气体分解为无害气体，而光催化剂本身在反 应中并不消耗。有学者对炼化厂的恶臭有毒气体进行了光催化降解研究，实验选择有代表性 的硫化氢、甲硫醇和乙硫醇混合气体作为降解物，结果表明光催化剂可以使这些有害气体完 全分解。 水中的无机污染物的种类比有机物少，最常见的包括金属离子和氯化物。很多无机物在 光催化剂的表面也具有光催化活性。氯化物是一种分布很广的污染物，目前主要来源是电镀 工业，另外汽车尾气、塑料、油漆、采矿等也是重要的污染源。h i d a k a 等到研究证明，t i o z 可以有效地用于含c 盯工业废水的光催化降解。光催化为金属离子污染物提供了一条新的治 理途径，利用光催化还原过程可以使低浓度的金属离子得到回收。戴遐明3 1 研究j t i o 。和z n o 9 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 超细粉末对水溶液中c r 即的光催化还原作用，结果表明t i0 2 的光催化效率比z n 0 高，光照9 0 r a i n 后，铬的含量达到国家废水排放标准。 光催化杀菌是在光催化氧化过程中产生经基自由基，其氧化势能可以将绝大多数的微生 物杀死。日本、美国在利用光催化消灭大肠杆菌、癌细胞等方面都取得了良好的效果。日本 本田三共公司与京都大学k a g i t a n i 等采用气固相光催化法，研制出实用性强的脱奥杀菌装 置。我国在杀菌方面也做了大量的研究工作，二氧化钛光催化薄膜在陶瓷器具上对大肠杆菌 和金黄葡萄球菌具有良好的杀菌效果，其杀菌率可达9 0 以上。 国外的a g a t i n od ip a o l a ，m a u r i z i oa d d a m o ，v i n c e n z oa u g u g l i a r o 等人】对光催化降解 受林可霉素污染的废水进行了一些研究探索，得出，通过光催化降解，林可霉素最终被分解 成c o ：、h ：o 、s o 。、n o 。一、n h 以及微量的胶状的硫。国内还未出现光催化降解林可霉素废 水的相关报道。 1 0 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 2 引言 我国是微生物发酵产业大国，在利用微生物发酵生产抗生素的过程中不可避免地产生大 量的废弃物，仅南阳普康药业集团年湿渣生产能力大约就为1 3 5 0 0 吨。其中主要是废水和废 渣，废水和废渣的排放不仅会造成环境的污染，而且也是巨大的浪费。 在制药过程中产生的废渣主要是发酵液预处理进行固液分离时形成的药饼部分，其主要 成分是微生物菌体细胞、未降解的固形有机物、无机盐和少量的抗生素及代谢产物。一般每 l o o m 3 的发酵液可形成大约3 0 - - 4 0m 3 的湿菌渣。对菌渣的处理通常的做法是将其通过干燥 后使水分小于1 0 ，再添加一些其它物质直接做成动物饲料。但是，动物在吃食了这种含有 抗生素的饲料以后会产生一系列问题。首先是耐药眭，长期低浓度吃食抗生素会使畜禽机体 对抗生素的敏感性降低，即产生耐药性。虽然耐药因子传递频率只有1 0 一，但由于细菌数量 大、繁殖快，在这一频率下仍造成抗药菌株的扩散和蔓延，治疗疾病时采用常规剂量达不到 效果。如果这种抗生素是人畜共用或人用抗生素，这种耐药性还可以通过畜产品传给人类， 对人类身体健康产生危害的同时，也给疾病的治疗带来了困难。其次是破坏畜禽体内的微生 物平衡：畜禽体内既有有害菌，又有有益菌，正常情况下它们保持平衡状态，滥用抗生素破 坏了体内平衡格局，使自身免疫能力下降，导致畜禽消化吸收障碍以致继发性感染。有抗菌 药物残留的动物源食品会破坏人体肠道菌群的生态平衡，致病菌群大量繁殖，损害人类健康。 鉴于这种危害，许多国家和地区都相继禁止了这类由抗生素发酵残渣而来的饲料的使 用。目前，欧盟已经在动物饲料中全面停止所有抗生素包括促进剂的使用，多数菌渣也因此 被加热焚烧掉。一些厂家也在试图探索其他的开发利用方向，比如通过添加某些无机盐做成 复合肥料等。因此，制药工业中废弃物的治理和综合利用是药物生产中不可或缺的任务，该 工作进行的好，就会带来环境效益和经济效益的双赢。 南阳普康药业生产的林可霉素发酵废渣蛋白含量较高，干渣中粗蛋白含量为4 6 4 7 ， 是生产优质动物饲料极佳原料，但由于发酵废渣中残留大量抗生素，而存在很大的使用隐患。 目前未见任何有关林可霉素发酵废渣残留抗生素去除的报道，从而使研究林可霉素发酵废渣 中残留抗生素的去除更有意义。 另外，林可霉素生产过程中废水的排放不可避免地进入水环境，引起水体污染。由于林 可霉素化学性质特别稳定使之在自然条件下很难降解引，导致污染水质长期恶化，严重危害 人类的健康。因此，含林可霉素废水的综合治理倍受国内外学者的关注h 制。 本文针对南阳普康药业林可霉素发酵残渣及废水中的抗生素残留，分别设计了不同的处 理路线和方法，进行了抗生素残留去除的试验。 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 3 材料与方法 3 1 试剂与药品 林可霉素发酵残渣：南阳普康药业集团提供，初步测定湿料中林可霉素残留效价为 2 0 0 0 u g , 林可霉素标准品：南阳普康药业集团提供，标定效价为8 4 0 u m g ，1 个效价定义为11 tg 纯林可霉素具有的抑菌效果； 纳米t i o ：江苏常泰纳米材料有限公司，平均粒径3 0n m ，t i o z 含量 - - - 9 8 ；钛酸四 正丁酯，化学纯；林可霉素、硝酸铜、氢氧化钠、盐酸、磷酸、硫酸、琥珀酸、柠檬酸、冰 醋酸、乳酸、酒石酸均为分析纯。 3 2 主要仪器 一 立式圆形高压灭菌器：l d z x 一5 0 k b 型，上海申安医疗器械厂生产；哈纳h 1 8 4 2 4 p h 计； 2 2 0 v - 2 5 0 w 中压汞灯( 紫外线高强度杀菌灯) ；马福炉。 3 3 林可霉素废水的处理 3 3 1 复合t i 0 。催化剂的制备 准确称取c u ( n 0 。) ：2 h ：05 0 7 3 6g ，配成浓度为0 4 2m o l l 的c u ( n o 。) z 溶液5 0 0m l 。采 用溶胶一凝胶法制备复合t i o ：粉体。取1 7 5m l 无水乙醇于4 0 0m l 干燥洁净的烧杯中，搅拌下 依次加入1 7 0 1 8 9 钛酸丁酯、1 5m l 三乙醇胺、6 0m l 无水乙醇和2 0m l 蒸馏水，搅拌3 0 m i n 后， 向上述溶液中滴加入0 4 2m o l l 的c u ( n o 。) 。1 2m l ，继续搅拌1 h 。室温静置，得c u2 掺入的 t i o ：溶胶。将所得溶胶于1 0 0 。c 下干燥，石英研钵充分研磨粉碎后，在4 5 0 c 高温下煅烧3 h ， 得c u 2 掺入量为l ( 摩尔分数) 的t i 0 2 复合催化剂。汹瑚1 3 3 2 光催化降解林可霉素废水 精确称取林可霉素1 0 0 0 9 溶于5 0m l 蒸馏水，充分搅拌，定容至5 0 0m l ，得含量为2 0 0 0 9 l 的储备液。取储备液3 0m l 于1 0 0 0m l 的烧杯中，用蒸馏水稀释为6 0m g l 的林可霉素供 试溶液，加入0 4 9 锐钛型t i 0 2 光催化剂，避光超声分散3 0 m i n ，置自制光催化反应器内，以 2 5 0 w 紫外高强杀菌灯为光源，灯距液面5 c m ，控制反应温度2 5 。c ，搅拌下反应。不同时间取 样，样品经10 0 0r m i n 高速离心分离3 0m i n ，微孔滤膜过滤后用蒸馏水稀释至适当浓度， 然后测残留抗生素效价，根据效价折算出降解后林可霉素的浓度，按下式计算林可霉素降 解率： c n c r 1 = 1 0 0 g 式中c 卜初始溶液浓度，m g l ； 卜反应液浓度，m g l 。 1 2 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 3 4 处理后的林可霉素废水的检测 3 4 1 生测法管碟法晦” 3 4 1 1 指示菌菌悬液的制备 指示菌为藤黄八叠球菌：河南农业大学生命科学学院微生物实验室保存；指示菌培养基 为：蛋白胨5 9 ，琼脂1 5 2 0 9 ，牛肉浸出粉3 9 ，酵母浸出粉6 9 ，葡萄糖1 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ， 1 2 1 下灭菌3 0 m i n 。 取藤黄八叠球菌的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有上述配制的三角瓶培养基中， 2 6 c 培养2 4 h ，用0 9 的灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。 3 4 1 2 标准林可霉素溶液的配制 用电子天平准确称取林可霉素标准品4 8m g ，放入烧杯中加少量蒸馏水溶解，然后移入 5 0 0 m l 容量瓶，加蒸馏水定容。用1 0 m l 移液管吸取1 0 m l 加入1 0 0 m l 的容量瓶，加蒸馏水定 容得林可霉素标准品溶液效价为8 0 u m l 。再取一定量稀释二倍得4 0 u m l 。 3 4 1 3 供试品林可霉素溶液的配制 将处理后的林可霉素水溶液按合适比例稀释成二倍差浓度，浓度范围在4 1 2u m l 3 4 1 4 效价测定 制备平板：取6 套无菌培养皿，分别加入约2 0 m l 培养基后，置水平玻璃板上凝固，作 为底层；另取冷却至5 0 c 左右的5 0 m l 培养基，加入l m l 试验菌悬液，迅速摇匀后，用1 0 m l 破口吸管取6 m l 混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。 在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4 个牛津杯。 用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。 将培养皿平稳送入恒温箱，3 7 。c 下培养1 6 - 1 8 h 。用游标卡尺测量抑菌圈直径，计算效价。 3 4 2 高效液相色谱法( h p l c ) 采用安捷伦11 0 0 型高效液相色谱仪，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相：0 0 5 m o l l 硼砂溶液( 用8 5 磷酸调p h 至6 0 ) 一甲醇为4 ：6 ，流速1 0m l m i n ，紫外检测器波长2 1 4h i l l 。 3 5 林可霉素发酵残渣的处理 3 5 1 无机酸的不同p h 溶液的配制 在试验过程中，先后用了盐酸、磷酸、硫酸三种无机酸。下面以硫酸为例介绍不同p h 值的硫酸的配制。 在前期试验中，验证酸是否对样品中的林可霉素有去除作用，我们用p h 试纸作为酸度 调节的检测标准，粗略的测定。加适量的蒸馏水于5 0 0 m l 的烧杯中，再用玻璃棒把硫酸沿器 壁缓缓加入烧杯，同时用玻璃棒搅拌混匀。根据不同的酸度要求，加入不同的酸量，同时用 精确p h 试纸测定，配制p h 依次为o 5 、1 5 、2 5 、3 5 的溶液。把配制好的足量的不同p h 值的酸分别和一定量的样品混合加入三角瓶中，然后加热处理。 当与标准林可霉素溶液做效价比对有处理效果时，为了精确p h 值，我们再使用p h 测定 1 3 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 仪配制一系列溶液，缩小精确p h 值范围。 3 5 2 有机酸的不同p h 溶液的配制 对于有机酸，综合考虑各方面因素，我们选用了乳酸、琥珀酸、醋酸、酒石酸以及柠檬 酸等五种有机酸。其中琥珀酸和柠檬酸是固体颗粒，其它均为液体。液体酸p h 配制，与无 机酸相同。琥珀酸和柠檬酸的配制，可用一定量的百分比浓度与一定的p h 值相对应。 3 5 3 林可霉素发酵残渣的样品处理 为了防止腐败变质，把从南阳普康药业取回的林可霉素发酵残渣在一2 0 c 先冷冻。使用 时，把冷冻的样品在微波炉里加热解冻，然后用烘箱在7 0 c 加热烘干，备用。称取适量放 入三角瓶中，然后加入上述已配好的酸溶液到合适处，加热处理。 测定干料的大致效价：把干料加一定量的蒸馏水充分使林可霉素溶解，然后再加水稀释 5 0 0 倍，在吸取l m l 稀释1 0 0 倍。再与一系列标准品做效价对比，找出干料的大致效价范围。 干料的大致效价为5 5 0 0u g 。 3 6 处理后的林可霉素发酵残渣的检测 3 6 1 生测法一管碟法哺1 用电子天平准确称取林可霉素标准品3 6m g ，放入烧杯中加少量蒸馏水溶解，然后移入 5 0 0 m l 容量瓶，加蒸馏水定容。用l o m l 移液管吸取l o m l 加入l o o m l 的容量瓶，加蒸馏水定 容得林可霉素标准品溶液效价为6 0 5 u m e 。 把处理后的林可霉素发酵残渣按照预先未处理时的估计效价，稀释到6u m l 左右。 用上述配制的培养基和菌悬液为原料倒双层平板，待冷却后用镊子轻轻放上牛津杯，每 平皿均匀放三个。然后加样，一个加标准，其余两个加降解处理液，做好标记，后文中以直 径1 、直径2 表示。加入的标准品和降解处理液都要经过细菌滤器，防止杂菌污染。加入时 用移液器，调节位置在2 5 0 微升。最后水平放入3 7 。c 恒温培养箱培养1 6 1 8 h ，观察结果， 做好记录。 3 6 2 高效液相色谱法( h p l c ) 取林可霉素最佳处理条件下的处理结果，进行h p l c 检测( 同3 4 2 ) 。 1 4 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 4 结果与分析 4 1 林可霉素废水的光催化降解处理 4 1 1 反应时间对光催化降解的影响 用6 0m g l 的林可霉素配水作为供试水，t i 0 ：催化剂投加量为0 4g ，不同时间降解率 测定结果见图3 。 1 2 0 1 0 0 冰8 0 茎6 0 遨4 0 2 0 0 02 04 06 08 01 0 0 时n m i n 图3 反应时间对降解军的影响 f i g 3 e f f e c to f t h er e a c t i o nt i m eo nd e g r a d a t i o nr a t e 由图3 可知，反应9 0 m i n 后，林可霉素去除率达1 0 0 ，反应初期林可霉素的去除速率变 化很快，前1 0 m i n 就达至1 j 4 2 6 ，这可能是由于t i0 2 粉末的吸附作用。 4 1 2 催化剂用量对光催化降解的影响 不同的t i 0 。光催化剂用量下，反应9 0 m i n ，林可霉素光催化降解配水的效果见图4 。 oo 2o 4o 60 81 催化剂用量( g l ) 图4 催化剂用量对降解率的影响 1 5 o 0 0 o o o o 2 0 8 6 4 2 9 6 斛琏遨 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 f i g 4 e f f e c to f t h ea m o u n to f c a t a l y s to nd e g r a d a t i o nr a t e 由图4 可知，在无催化剂存在时，光降解率很低，为6 2 5 9 6 ：催化剂用量为0 1 9 l 时，降 解率仅有4 8 2 ，随着催化剂用量增加，降解率明显提高；用量为0 4g l 时，降解率达 到1 0 0 ；继续增加催化剂用量，降解率反而下降。w a n g 等娜1 在双酚a 的光降解中也得到了 同样的结果。这是因为t i o ：光催化林可霉素的降解反应是非均相反应，反应是在催化剂表面 上进行。当催化剂的加入量较少时，反应液中t i 0 ：的浓度较小，被吸附活化的林可霉素少， 光子的能量没有得到充分的利用，光催化降解效果差；随着催化剂的用量增加，反应液中的 t i o ：粒子浓度不断增加，对被降解化合物分子的吸附能力加强，吸附量增加，光量子效率得 到提高，降解速率加快；又因为t i o 。颗粒为不溶性物质，浓度太高时会使反应液的浊度增 加，透光率减小，阻挡紫外光线的投射深度，导致光催化降解率下降。 4 1 3 初始p h 对光催化降解的影响 不同p h 值下反应9 0 m i n ，林可霉素的去除效果见图5 。 1 2 0 1 0 0 永8 0 鐾6 0 姥 遨4 0 2 0 0 0 24681 01 2 p h 值 图5 初始p h 值对降解军的影响 f i g 5 e f f e c to fp hv a l u eo nd e g r a d a t i o nr a t e 由图5 可知，p h 在3 - 1 0 时，林可霉素降解率为1 0 0 一5 3 1 。随着p h 值的升高，林可霉 素降解效率降低。这是因为随着反应的进行，有机碳不断转化为无机碳，在碱性溶液中这些 无机碳以h c 0 。或c 0 。2 继续存在于溶液中，而这两种离子是很强的h o 清除剂，它们的存在必 然会降低h o 的浓度；在酸性条件下，无机碳都以c 0 。的形式逸出，不会影响h 0 的浓度。 再则，t i o z 在水中等电位溶液的p h 为6 ，所以林可霉素在酸性条件下的去除效率高于碱性： h o + c 0 3 2 ，h o 一+c 0 3 一： h 0 + h c 0 3 一一1 - 1 2 0 + c 0 3 一； 另一方面，根据林可霉素在碱性条件下稳定，而在酸性条件下不稳定的性质，也能说明 林可霉素在酸性条件下更容易被催化降解 1 6 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 4 1 4 溶液初始浓度对光催化降解的影响 不同初始浓度的林可霉素溶液，反应9 0 m i n ，光催化降解的效果见表2 和图6 。 表2 初始浓度对降解率的影响 t a b l e2e f f e c to fi n i t i a lc o n c e n t r a t i o no nd e g r a d a t i o nr a t e 浓度( m g l 1 ) 降解率 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 8 5 9 7 5 6 6 7 3 6 0 5 匕 吕 一 b o 巨 刨 蜊 琏 趁 0 8 0 02 0 初始浓度( m g l ) 8 01 0 0 图6 降解速度随初始浓度的变化 f i g 6c h a n g eo fd e g r a d a t i o nr a t e sa si n i t i a lc o n c e n t r a t i o n 由表2 和图6 可知，随着初始溶液浓度增大，反应速度加快，但降解率显著降低。这是因 为对于非均相催化反应，催化剂用量决定其表面大小。在稀溶液范围内增加初始浓度有利于 溶质分子向催化剂表面的扩散，吸附量增加，反应速度加快；当初始浓度增加到一定值时， 催化剂表面吸附达到饱和，反应物分子的扩散对反应速度影响较小，表面反应为控速步骤， 此时增加初始浓度对反应速度影响很小，从而降解率会显著降低。 4 1 5 复合催化剂对光催化降解效率的影响 掺杂1 c u 弘复合型t i o ：催化剂反应9 0 m i n ，林可霉素溶液降解的效果见图7 。由图7 可知， 句t i o ：晶格中掺杂c u 2 能使林可霉素的光催化降解率明显提高。这是因为金属离子掺杂的纳 米t i o ：，由于金属离子的存在，使得一部分被激发至u t i o z 导带的电子转移给c u 2 + ，提高了光 生电子与光生空穴的分离效率，使o h 的产率有所提高，林可霉素的降解效果更好怕卜。 1 7 林可霉素发酵残渣及废水中抗生素残留的去除 1 2 0 1 0 0 苫r8 0 斛c n 琏b u 遨4 0 2 0 o 2 04 06 08 01 0 0 时间m i n + 锐钛型 一载c u 型 图7 载c u ”催化剂对降解率的影响 f i g 7 e f f e c to f c u 2 + f f i 0 2p h o t o c a t a l y s to nd e g r a d a t i o nr a t e 4 1 6 最佳反应条件下含林可霉素废水的降解 取南阳普康药业林可霉素发酵废液，依据其所含林可霉素的量，将废液调整至林可霉素 浓度为6 0m g l ，在t i o ：催化剂用量为0 4g l ，初始p h