葡萄球菌生物膜检测及与耐药性的关系.doc

葡萄球菌生物膜检测及与耐药性的关系 作者：张丽萍,李清,古丽娜依明,李玲玲,田刚【摘要】 目的 探讨临床标本中葡萄球菌形成生物膜的状况，研究有无生物膜的葡萄球菌的耐药性差异,帮助临床根据药敏结果选用抗菌药物，及时有效控制葡萄球菌医院感染。方法 采用刚果红,微量平板法检测生物膜形成,观察葡萄糖、乙醇、氯化钠对生物膜形成的影响;对临床标本分离的葡萄球菌进行鉴定和药敏试验。结果 刚果红法检测腐生葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(金葡菌)表皮葡萄球菌生物膜阳性率分别为10.0%、16.7%、40.0%；生物膜半定量法：表皮葡萄球菌生物膜阳性率TSB、TSB0.25%Glu、TSB2%Alc、TSB4%Alc、TSB2%NaCl、TSB4%NaCl分别为13.5%、34.6%、33.3%、29.2%、19.4%、32.1%，其中0.25%Glu、TSB2%Alc、TSB4%NaCl为最佳浓度；药敏结果，产生生物膜的葡萄球菌的耐药性对青霉素、红霉素和复方新诺明的耐药有增加趋势，耐药率分别为：86.43%、82.44%、78.35%。结论 临床标本葡萄球菌绝大部分能产生生物膜、葡萄糖、乙醇、氯化钠能促进生物膜形成；葡萄球菌对临床常用的抗菌药物耐药性严重，对其引起的感染可用万古霉素。 【关键词】 葡萄球菌 生物膜 耐药性 药敏试验 【Abstract】 Objective To study the formation of staphylococcal biofilm and the difference of drug resistance between Staphylococcus with or without biofilm,helping to choose the antibiotic according to the drug sensitive trial,controlling the staphylococcal inffectin effectivly and timely.Methods Biofilmforming ability was determined by congo red agar (CAR) and a semiquantitative microtiter assay using trypticase soy broth .Glucose,alcohol and Nacl were added to the medium separately to test their effect on biofilm formation by staphylococcal isolates.Results Biofilm formation was positive by 10.0% to Staphylococcus saprophyticus，16.7% to Staphylococcus Aureus, 40% to Staphylococcus epidermidis by congo red agar. The positive rate of biofilmforming by Staphylococcus epidermidis in TSB, TSB0.25% glucose, TSB2% alcohol, TSB4% alcohol, TSB2% NaCl and TSB4% NaCl were 13.5%、34.6%、33.3%、29.2%、19.4% and 32.1% respectively. drug sensitivity results shown that more and more Staphylococcus with biofilm had drug resistance to Penicillin, Erythromycin and sulfamethoxazole compound, resistance rate were 86.43%、82.43%、78.35% respectively. Staphyloccus collected from hospital were identified and drug resistanted. Conclusion Certain proportion of staphylococcal clinical isolates could form biofilm. Glucose, alcohol and NaCl can facilitate biofilm formation by Staphylococcus. The Staphylococcus had strong resistance to antibiotics. vancomycin can be used. 【Key words】 Staphylococcus;Biofilm;Resistance 葡萄球菌（stahylococcus ）很容易在插管和其它异物表面黏附，形成细菌生物膜。生物膜可保护细菌不受抗菌药物的作用，并降低机体免疫功能和细胞吞噬功能，致使感染难以治愈。细菌一旦形成生物膜会造成细菌表面抗原位点被覆盖和抗生素不容易穿入等后果，因而表现为耐药等特点12。近十余年来葡萄球菌已被认为是一种主要的医院感染的条件致病菌。为了了解葡萄球菌形成生物膜的状况及影响因素，我们用刚果红和半定量微量平板法对葡萄球菌进行生物膜定性定量分析和药敏试验，了解葡萄糖3、乙醇、氯化钠等因素对生物膜形成的影响及葡萄球菌生物膜与耐药性的关系，尤其对产生生物膜的葡萄球菌和没有产生生物膜的葡萄球菌耐药性进行研究,现报道如下。材料与方法 1.材料 （1）菌株 收集本院住院及门诊病人的尿、痰、分泌物和伤口等标本中葡萄球菌有90株，有60株是血浆凝固酶阴性葡萄球菌（CNS），其余 30株为金葡菌。ATCC25922株为ATCC的标准菌株，经鉴定为低生物被膜形成的葡萄球菌。 （2）培养条件 培养基为胰酪胨大豆肉汤（TSB杭州天和微生物试剂有限公司），脑心浸液琼脂（OXOID产品）；葡萄糖（Glu）、蔗糖、氯化钠（NaCl）、无水乙醇（Alc）、刚果红、蕃红花T均为国产分析物。96孔板酶标仪。抗生素纸片、MuellerHinton(MH)培养基（OXOID产品），除特别说明外所有细菌培养均在37有氧条件下培养。 2.方法 （1）生物膜定性 用选择血平板分离单个菌落接种于刚果红培养基上（刚果红0.8 g/L，脑心浸液干粉47 g/L，蔗糖36 g/L），37培养24小时后，再在室温放置24小时，金葡菌置72小时。产生生物膜的菌落变为黑色，不产生生物膜的菌落仍为红色。 （2）生物膜半定量 不同条件下生物膜生长情况的观察：从血平板分离的单个菌落接种于5 mlTSB、调成0.5麦氏浓度，分别用TSB、TSB0.25%Glu、TSB2%NaCl、TSB4%NaCl、TSB2%Alc、TSb4% Alc37培养12小时。观察哪项为最佳培养浓度。半定量测定：分别用TSB、TSB0.25%Glu、TSB2%NaCl、TSB4%NaCl、TSB2%Alc、TSB4% Alc 1100稀释后，加入96孔板，每孔200 l，每株菌6个平行孔，37培养24小时后，使用蒸馏水洗板三次，加入0.1%蕃红花T染液200 l染1 min，再用蒸馏水洗板三次，加入蒸馏水200 l，用酶标仪490 nm比色，读取数值。每个96孔板包括空白对照（单纯TSB）、阴性对照。选刚果红培养阴性，半定量培养20次均与空白对照吸光度值相近，为阴性对照株。 （3）药敏试验采用KirbyBauer琼脂扩散法 按美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS2000年版）判断标准和质控要求进行操作和判读结果。抗菌药敏纸片有：苯唑西林、青霉素、复方新诺明、红霉素、克林霉素、万古霉素、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、四环素、替考拉宁、阿莫西林/克拉维酸。 （4）统计学处理 采用卡方检验和方差分析对两组生物膜阳性率及吸光度进行统计学处理。结果 1.生物膜定性检测结果 30株金葡菌中5株产生生物膜，阳性率为16.7%；30株表皮葡萄球菌中有 12株产生生物膜，阳性率为40.0%；30株腐生葡萄球菌中有3株菌产生生物膜，阳性率为10.0%。经卡方检验,两组阳性率的结果比较都有显著性差异(P0.05)，表皮葡萄球菌的阳性率最高，其次为金黄色葡萄球菌，最后为腐生葡萄球菌。(见表1和表2)表1 表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌阳性率比较（略）注：与表皮葡萄球菌阳性率比较P0.05表2 表皮葡萄球菌与腐生葡萄球菌阳性率比较（略）注：与表皮葡萄球菌阳性率比较P0.052.生物膜半定量检测结果 阳性株筛选条件为：阴性对照平均值3倍标准差（阴性对照为0.10.05），阳性标准0.3，表皮葡萄球菌生物膜阳性率TSB、TSB0.25%Glu、TSB2%Alc、TSB4%Alc、TSB2%NaCl和TSB4%NaCl分别为13.5%、34.6%、33.3%、29.2%、19.4%和32.1%；表皮葡萄球菌组中0.25%Glu、TSB2%Alc、TSB4%NaCl生物膜形成率高于TSB（P0.05）；且它还高于TSB2%NaCl（P0.05）；其它各组间均无差异。这表明TSB0.25%Glu、TSB2%Alc、TSB4%NaCl为培养基的最佳组成成分，做半定量就可用此浓度的配比。表皮葡萄球菌的平均OD为0.3，其阳性率为29%；腐生葡萄球菌的平均OD值为0.15，其阳性率为12%；金色葡萄球菌的平均OD值为0.12，其阳性率为8%。由此可见，表皮葡萄球菌生物膜产生率明显高于其它两组。 3.药敏结果 产生生物膜的葡萄球菌对青霉素、红霉素和复方新诺明耐药最为严重，其耐药率可达86.43%、82.44%、78.35%；对苯唑西林、环丙沙星、克林霉素、庆大霉素的耐药率分别为68.56%、57.03%、51.05%、42.47%；其它像替考拉宁、阿莫西林较为敏感，未发现耐万古霉素的菌株。无生物膜的葡萄球菌对青霉素类、喹诺酮类抗生素和内酰胺类的耐药率也达50%以上，但有生物膜的葡萄球菌对抗生素的耐药情况比无生物膜的葡萄球菌更为严重。 讨论 近年来葡萄球菌的临床感染率不断上升，其主要原因在于它黏附在临床常用的多聚材料上，并形成生物膜，生物膜使葡萄球菌呈现慢性、持续性和反复性等生长特点，它可保护细菌不受抗菌药物的作用，并降低机体免疫功能和细胞吞噬功能，致使感染难以治愈。 葡萄球菌生物膜中存在多种主要的生物大分子，如蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖脂、磷脂等物质。生物膜这种多细胞结构的形成是一个动态的过程。因此，生物膜形成机制的研究已成为抗葡萄球菌感染的中心问题。本文对葡萄球菌生物膜形成选择的最佳培养基配方研究发现：0.25%葡萄糖、2%无水乙醇、4%氯化钠为最佳培基浓度，生物膜在此条件下形成明显，可能是与氯化钠浓度的选择有关。本文选择了0.25%葡萄糖、TSB2%Alc、TSB4%Alc、TSB2%NaCl、TSB4%NaCl这几种不同浓度培养葡萄球菌，从生物膜半定量检测的结果看，0.25%Glu、TSB2%Alc、TSB4%NaCl对生物膜的形成有很强的诱导作用。由此可见，作为条件致病菌的葡萄菌生物膜形成与培养基成分密切相关。不同的培养基成分有不同的信号转导机制。如0.25%Glu可诱导icaABCD表达，ica基因编码参与是PIA合成的糖基转移酶，ica基因是典型的原核操作子的结构，ica操纵子包括调节基因icaA和结构基因icaADBC。低生物膜形成的葡萄球菌主要由于icaA基因缺失。葡萄糖对生物膜的诱导作用主要是通过诱导ica基因的表达和多糖PIA 的合成而起作用的。2%Alc和4%NaCl可抑制icaR表达，激活SigB和RsbU因子，从而诱导生物膜形成。本文以表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和腐生葡萄球菌这三类菌株为对象，采用生物膜定性及半定量实验方法。通过研究不同成分的培养基对生物膜形成的影响，得出结论为临床标本葡萄球菌相当一部分可产生生物膜，其中0.25%Glu、0.2%Alc和4%NaCl能促使生物膜的形成，阳性率从强至弱依次为表皮葡萄球菌为29%、金葡菌为12%、腐生葡萄球菌为8%。 葡萄球菌生物膜形成与否和耐药性有密切的关系。本文选用12种抗菌药物对两组有无生物膜的葡萄球菌进行了药敏试验，结果显示：产生生物膜的葡萄球菌对青霉素、红霉素和复方新诺明类抗生素耐药，且耐药率高达80%以上，对苯唑西林、环丙沙星、克林霉素、庆大霉素的耐药率分别为68.56%、57.03%、51.05%、42.47%，对其它像替考拉宁、阿莫西林较为敏感。但未发现耐万古霉素的菌株5。没有生物膜的葡萄球菌，对青霉素类、喹诺酮类抗生素和内酰胺类的耐药率也达50%以上，但前者对抗生素的耐药情况比后者的更为严重。由此可见，葡萄球菌对喹诺酮类抗生素如环丙沙星、内酰胺类抗生素如苯唑西林、克林霉素，还有青霉素类等抗菌药物已高度耐药，这些不宜作为临床经验用药。单