（环境工程专业论文）细菌胞外聚合物的合成规律及应用.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 微生物絮凝剂是利用生物技术，从微生物体或其分泌物中提取、纯化而获得的一种 高效、安全的新型水处理药剂。制约生物絮凝剂应用的主要因素之一是培养基成本偏 高，因此寻找廉价原料，特别是以高浓度有机废液作为替代发酵培养基显得意义重大。 本文利用从活性污泥中筛选出的一株絮凝剂产生菌g x 4 1 ( 初步鉴定为p s e d o m o n a s s p ) ，着重考察了该菌株利用壳聚糖生产废水生产生物絮凝剂的合成规律。培养条件 为：2 5 0 m l 三角瓶中装入5 0 m l 壳聚糖生产废水( c o d 约4 0 0 0m g l ) ，1 5 0r p m ， 3 0 。c 摇床暗培养。产物的絮凝活性与菌体生长量呈正相关，培养1 8 h r 活性即达到最大 值，对数生长期后期和静止期早期是收获絮凝剂的最佳时期。此后，延长发酵培养时 间，发酵产物的絮凝活性略有下降。废水培养基灭菌与否对絮凝剂合成的影响不大。絮 凝活性物质主要分布在发酵液中，菌体细胞也表现出一定的絮凝活性。培养液经中速离 心获得的上清液对高岭土悬液的絮凝活性高达9 0 以上。在培养过程中考察了外加碳 源、外加氨源、外加磷源、摇床的转速、装液量、培养基的初始p h 值等影响因素对于 假单胞菌p s e d o m o n a ss p g x 4 1 合成微生物絮凝剂的影响。 采用重复补料的分批发酵方式进行了絮凝剂的半连续生产，考察了补料时间、补料 配比、补料初始p 1 4 等对获得絮凝性能稳定的微生物絮凝剂的影响以及工业化的可行 性。 考察了假单胞菌p s e d o m o n a ss p g x 4 1 合成的微生物絮凝剂与常用无机絮凝剂聚合 氯化铝复配应用的的可行性。用这种方法处理生活污水与壳聚糖生产废水，试验的结果 表明上述复配的方法是可行的，不但减少了絮凝剂的用量，提高了处理效果，同时微生 物絮凝剂在与聚合氯化铝复配时无需再投加额外助絮剂，降低了处理成本。 考察了假单胞菌p s e d o m o n a ss p g x 4 1 合成的微生物絮凝剂对于无机类和有机类废 水的处理能力。通过实验发现，该种微生物絮凝剂适用范围较广，对于几种典型的无机 类和有机类的废水都有着良好的絮凝效果，而且处理时絮凝剂投加量都相对较小。 关键词：生物絮凝剂；假单胞菌；废水；复配 细菌胞外聚合物的台成规律和应用 p r o d u c t i o nr u l e sa n d a p p l i c a 娃o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r i c s u b s t a n c e s ( e p s ) a b s t r a c t b i o f l o c c u l a n t sp r o d u c e db ym i c r o o r g a n i s m sa r ee x p e c t e dt ob eu s e f u lb e c a u s et h e ya r e s a f ef o rt h ee n v i r o n m e n ta n dh u m a n b u tt h e r ea r ep r o b l e m ss u c ha se x p e n s e sc o m p a r e dw i t h s y n t h e t i cf l o c c u l a n t s t oc u td o w nt h em e d i u mc o s ta n dr a i s ep r o d u c t i v i t yo f t h eb i o f l o c c u l a n t ， s o l l l ek i n d s o f o r g a n i ci n d u s t r i a lw a s t e w a t e rw e r e 两。d t os e r v ea sm e d i u m s n es t r a i ng ) ( 4 1 ( i d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a ss p ) ，p r o d u c i n gb i o f l o c c u l a t i n gs u b s t a n c e s ， w a si s o l a t e df r o ma c t i v a t e d s l u d g eb yu s i n gk a o l i nc l a ys o l u t i o n g x 4 1 c a n g r o wo n w a s t e w a t e r o f p r o d u c i n g c h i t o s a n et op r o d u c eb i o f l o c c u l a n t f e r m e n t a t i o nw a sc a r r i e do u to n a r o t a r ys h a k e r ( 1 5 0r p m ) a t3 0 f o r2 4 h r 、v i t l l5 0 m lo ft h em e d i u mi n2 5 0 m lf l a s k s t h e p r o d u c t i o n o ft h ef l o c c u l a n tw a sa s s o c i a t e dw i t he e l l g r o w t h 1 1 1 ei n a x i m u mf l o c c u l a n t f o r m a t i o nw a so b s e r v e da tt h ee n do f l o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s ea n d t h ee a r l ys t a t i o n a r yp h a s e a f t e r7 0h rt h ef l o c c u l a t i n ga c t i v i t yo fc u l t u r eb r o t hd e c r e a s e ds l o w l y w h e t h e rt h ec u l t u r e m e d i u mw a ss t e r i l i z e do rn o tm a d el i t t l ed i f f e r e n c eo nb i o f l o c c u l a n tp r o d u c t i o n b o t ht h e c u l t u r eb m t ha n dc e l l sh a df l o c c u l a t i n ga c t i v i t yt h r o u g h o u tt h ep r o c e s so ff e r m e n t a t i o n 。1 h e c e l l - r e m o v e ds u p e m a t a n tw i t hh j g h f l o c c u l a t i n ga c t i v i t ym o r et h a n9 0 w a so b t a i n e db ym i l d c e n t r i f u g a ls e p a r a t i o n ( 8 0 0 0r p m ) a n o t h e rf e r m e n t a t i o n s t y l e ( f e d - b a t c hc u l t u r i n g ) f o r b i o f l o c c u l a n tw a s 缸i e d t h e f e r m e n t a t i o np r o c e s sw i t ha a n dem e d i u mh a s g o ts u c c e e d e d a tt h es a m et i m e ，ai o to f f a c t e r s w a r es t u d i e d ，s u c ha sp h ，t i m e b i o f l o c c u l a n t b y p s e u d o m o n a s s p g x 4 1a n dp o l y a l t a n i n j mc h l o r i d ea r ec o m p l e x e d 1 劢e c h e l a t e df l o c c u l a n ti sa p p l i e dt od o m e s t i cs e w a g ea n dw a s t e w a t e ro f p r o d u c i n gc h i t o s a n e , t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h et r e a t e dm s u l ti sb a t t e rt h a na n yo n eo f i t sc o m p o n e n t sa n dr e d u s e s d o s a g e o f b i o f l o e c u l a n ta n d p o l y a l u m i n i m c h l o r i d e w h e nf l o c c u l a t i o r lt e s t sw e r ec a r r i e do u tu s i n gi nv a r i o u ss o l i dw a s t e w a t e rs u c ha ss o i l s u s p e n s i o n ，k a o l i ns u s p e n s i o n , s p i n n i n gw a s t e w a t e r , f l o c c u l a t i n ga c t i v i t y w a s m a r k e d l y i n c r e a s e di nt h ep r e s e n c eo f c a 2 + c o m p a r e d w i t ht h a to ft h ec o n t r o lw h e r ed i s t i l l e dw a t e rw a s u s e di n s t e a do f c a t i o ns o l u t i o n s 1 1 1 es y n e r g i s t i ce f f e c t so f c a 2 + w e r em o s te f f e c t i v ea tb a s i c p h r a n g e s c o m p a r i s o n w i t ho t h e r i n o r g a n i c a n d o r g a n i cf l o c c u l a n t s ， b i o f l o c c u l a n t b y p s e u d o m o n a s s p a l s os h o w e dh i g h e rf l o c c u l a t i n ge f f i c i e n c yo i lm a n y d i f f e r e mw a s 对e w a t e r k e yw o r d s ：b i o f l o c c u l a n t ；p s e u d o m o n a ss p ；w a s t e w a t e r ；c o m p l e x e df l o c c u l a n t i i 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得 大连理工大学或其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢 意。 作者签名：谊狴日期：趔：! ：蛰茎 大连理工大学硕士学位论文 前言 絮凝技术是污水处理的主要方法之一，同时也是微生物发酵过程中实现产物本体分 离的重要手段。絮凝剂一般分为3 类：无机絮凝剂( 以铝盐和铁盐为主) 、人工合成高 分子絮凝剂( 以聚丙烯酰胺系列絮凝剂为主) 和天然生物高分子絮凝剂( 如壳聚糖系列 和淀粉系列) 。 无机絮凝剂、有机合成高分子絮凝剂以及天然生物高分子絮凝剂已经得到了广泛应 用，但无机絮凝剂和有机合成高分子絮凝剂在使用过程中存在不安全，应用成本过高， 经济效益差等缺点。在这种背景下，研究和发展絮凝效果好、适应范围广、易生物降 解、对环境无二次污染的新型絮凝剂就成为了迫切而有意义的课题。微生物絮凝剂是一 种由微生物生长代谢产生的特殊生物高分子物质，主要包括机能性蛋白、机能性多糖 类、脂肪、d n a 等大分子物质，这就决定了其具有生物可降解性，对环境和人类无毒 无害，特别是在直接关系到人类健康的食品、发酵和医药工程领域里，应用生物絮凝剂 不仅可以克服聚丙烯酰胺等合成高分子絮凝剂有毒有害的缺点，还可以回收废水中的营 养物质作为饲料或堆肥，在降低出水c o d 的同时节省资源。同时絮凝剂产生菌来源。 泛，获得方法简单，易于采取生物工程手段实现工业化，因此颇具发展前途。 本论文的主要工作是研究微生物合成胞外聚合物生产生物絮凝剂的合成规律以及 解决制约生物絮凝剂应用的关键问题之一，即絮凝剂的生产成本问题。本论文所研究的 菌种为p s e u d o m o n a s s p ，g x 4 1 ( 假单胞菌属) ，是大连理工大学环境与生命学院基因工程 实验室自行筛选得到的，主要研究其生长规律、絮凝剂合成规律、发酵生产的影响因素 等问题。由于目前开发的各种生物絮凝剂大都是在实验室条件下以葡萄糖、果糖、蔗 糖、半乳糖、淀粉等作为有机碳源，以酵母浸出汁、牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白氨基酸等 作为有机氮源经纯培养发酵获得，存在培养基成本偏高的缺点。因此，本文利用有价值 的废弃物( 富含营养的有机废水) 来制备生物絮凝剂，力图通过微生物发酵、抽提、精 制的办法获得具有生物分解性和安全性的高效、无毒、廉价的新型水处理药剂，探索一 条变废为宝的新路径；在获得性能稳定产物的同时进一步探索其半连续生产的可行性： 通过对实际废水的处理过程，掌握p s e u d o m o n a s s p g x 4 1 ( 假单胞菌属) 产生的絮凝剂的 细菌胞外聚合物的合成规律和应用 应用参数；通过假单胞菌p s e u d o m o n a s , s p g x 4 1 产生的微生物絮凝剂与其它常规絮凝 剂( 如聚合氯化铝、硫酸铝等) 复配处理一些实际废水的研究，以期找到复配应用的可 行性，降低絮凝剂的投加量，提高絮凝剂的处理能力，从而扩大生物絮凝剂的应用范 围。 2 大连理工大学硕士学位论文 1 文献综述 絮凝剂又称沉降剂或混凝剂，可将液体中不易沉降的固体悬浮物凝聚、沉淀，从而 广泛应用于发酵工业后处理、食品加工、木疏浚施工、废水处理等领域。絮凝效果的 好坏很大程度上取决于絮凝剂的性能。 从传统意义上讲，絮凝剂可分为三类：( 1 ) 无机絮凝剂，如聚合硫酸铝、聚合氯 化铝、聚合硫酸铁、活化硅酸、明矾等：( 2 ) 人工合成高分子絮凝剂，如聚氧化乙 烯、聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯酰胺及其衍生物；( 3 ) 天然有机高分子絮凝剂，如碳水 化合物类( 多聚糖类) 、甲壳素、壳聚糖类( 甲壳素脱乙酰化的产物) 和微生物絮凝剂 类。许多无机絮凝剂和人工合成的高分子絮凝剂凭借良好的絮凝效果和较低的成本已被 广泛使用，但是他们在应过程中存在着较大不安全性和潜在的二次污染：如铁盐、铝盐 药剂使用耗量大，而且应用过程中具有一定的毒性和腐蚀性，铝离子容易引起老年痴呆 症；聚丙烯酰胺、聚丙烯酸等虽然用量小，絮凝速度快，但此类高分子物质的残余单体 具有“三致效_ | 立( 致癌、致畸、致突变) ，对人体和生物毒害很大，因此应用范围受到 限制。壳聚糖、淀粉衍生物、明胶等天然有机高分子絮凝剂是从天然物质中提取并稍经 化学改j 眭处理得到的物质，此类物质无毒或低毒，对生态环境无不利的影响，但也存在 絮凝活性较弱，单独使用絮凝净化效果不理想和使用成本较高等缺点。微生物絮凝剂作 为天然生物高分子絮凝剂的重要种类，它克服了无机絮凝剂和有机絮凝剂的上述缺点， 不但具有无毒、无二次污染等特点，而且由于产生絮凝剂的微生物种类繁多，生长快， 易于采取生物工程手段实现工业化，因而是一种极具发展前途的水处理药剂之一。 微生物絮凝剂的分类方法有很多，按照来源的不同主要分为三类【1 1 2 】：( 1 ) 直接利 用微生物细胞的絮凝剂，如某些细菌、霉菌、放线菌和酵母菌，它们大量的存在于土 壤、活性污泥和沉积物中。( 2 ) 利用微生物细胞壁提取物的絮凝剂，如酵母细胞壁的 葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和n 乙酰葡萄糖胺等成分据可作为絮凝剂。( 3 ) 利用微生 物细胞代谢产物的絮凝剂。微生物细胞产生的具有絮凝活性的代谢产物有的储存在胞内 在为内源代谢物，有的则分泌到胞外或粘附在几包表面，或者脱离菌体，游离于发酵液 当中。这种分泌到细胞外的具有絮凝活性的高聚物称为胞外生物高聚物絮凝剂 ( e x t r a c e l l u a rb i o p o l y m e r i cf l o c c u l a n t s ，简称e b f ) ，本文介绍的主要是此类微生物絮凝 齐。 3 。 细菌胞外聚合物的合成规律和应用 1 1 微生物絮凝剂的研究概况 1 1 ，1 絮凝剂的产生菌 微生物絮凝性的最早报道是l o m sp a s t e u r ( 1 8 7 6 ) ”的关于酵母菌( l e v u r ec a s s e e u s e ) 絮凝性。自1 9 3 5 年b u t t e r f i l e d 4 1 从活性污泥中筛选出絮凝剂产生菌后，人们便开始了广 泛研究微生物胞外分泌物与絮凝作用两者之间的关系了从而筛选出了许多种絮凝剂产生 菌。1 9 7 6 年，j u 蜥n a k a m u r a 等人从细菌、霉菌、放线菌、酵母菌等2 1 4 株微生物中筛 选出了1 9 种具有絮凝能力的微生物，其中以酱油曲霉( a s p e r g i l l u ss o j a e ) 产生的絮凝 剂a j 7 0 0 2 产生的絮凝剂效果最好 5 1 。1 9 8 5 年，ht a k a g i 等人研究了拟青霉素属 ( p a e c i l o m y c e ss p 1 - 1 ) 产生的微生物絮凝剂1 6 j ，精制的获得p f 一10 1 絮凝剂。p f - 1 0 1 对 枯草杆菌、大肠杆菌、啤酒酵母、红血细胞、活性污泥、纤维素粉、羧甲基纤维素、括 性碳、硅藻土、氧化铝等均有良好的絮凝效果。1 9 8 6 年r k u r a n e 7 1 等人从能降解酞酸 脂的微生物中筛选出日本旱田土壤中常见的红平红球菌( r h o d o c o c c u se r y t h r o p o f i s ) ， 利用该菌研制开发的n o c 一1 是目前发现的最好的生物絮凝剂。该絮凝剂对大肠杆菌、 酵母、泥浆水、河水、粉煤灰水、活性碳水、膨胀污泥、纸浆废水均有良好的絮凝和脱 色效果。能产生絮凝剂的微生物有很多种，细菌、放线菌、真菌以及藻类都可以常胜絮 凝剂，现将目前国外已报道的部分絮凝荆厂生均归纳至表1 1 。这些已经鉴定的微生物 大量的存在于土壤、活性污泥和沉积物中，它们产生的絮凝剂不仅可以用于处理废水和 改善活性污泥的沉降性能，还能在微生物发酵工业中实现微生物细胞与产物的分离。 袁11 产生絮凝剂的微生物1 8 】| 9 【1 0 l t a b l e1 1t h e b i o f l o c c u l a n t - p r o d u c i n gm i c r o o r g a n i s m s e b f 产生菌菌类e b f 产生菌名称菌种发现者、年份 4 查堡堡士查堂堡主堂焦堡皇 b a “7 l u s s p k 5 m ，1 9 9 3 k l u y v e r o m y c e s r m a r x i a n u ss o u s a 等，1 9 9 2 kc w 0 “e s c e mk a k i i 等，1 9 9 0 菌 m e t h y l o b a c t e r i w n r h o d e s i o n u m t o n g 等1 9 9 9 f i d b 吨m s p e n d o 等。1 9 7 9 l a c t o b a c i l l u s f e r m e n t w n f u m i o 1 9 9 1 b r e v i b a c t e r i u mi n s e c t i p h i i l w nn a k a m u r a 等，1 9 7 6 s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s n a k a m u r a 等，1 9 7 6 鸯型：丝型竺璺鉴! 翌堡塑坚苎型! 竺堡! ! 丝 a m a r a et a k e d a 等，1 9 9 2 放 线 菌 n o c a r d i ar e s t r i c a n o c a r d i ac a l c a r e a n o c a r d i ar h o c k f f s t r e p t o m y c e sg r i s e u s t o n g 等1 9 9 9 t o n g 等1 9 9 9 t o n g 笔1 9 9 9 s h i m o f u r u y a 等，1 9 9 6 s t r e p t o m y c e sv i n a c e u s n a k a m u r a 等，1 9 7 6 此外国内也筛选了不少优良菌株，如本实验室选, q l 的p s e u d o m o n a s s p g x 4 - 1 ( 假单 i n n ) g ) ( ”1 ，王镇选出的4 种菌株，尹华筛选出的g s 一7 【1 3 1 ，邓述波发现的a 一9 菌l “1 ， 黄民生的q 一1 ，q - 2 ，y _ 3 菌【1 5 1 ，张本兰分离的p - a l c a l i g e n e s 8 7 2 4 菌1 6 1 ，陆茂林等分离 一5 一 细菌胞外聚台物的台成规律和应用 出来的j i m 一8 8 ，j i m 一1 2 7 1 ”，南开大学选出的n x 1 ”，台湾邓德丰选出的c 6 2 细菌 等，内蒙古工业大学的卢文玉等从蔬菜地土壤中筛选出一株有产絮凝剂的产气肠杆菌 ( e n t e e r o b a c t e r a e r o g e n e s ) 【2 0 】。 自欧洲生物技术联盟( e f b ) 将控制污染的微生物絮凝剂定为环境生物技术后，随 着生物基因工程领域许多重大突破的取得，环境科学工作者将生物技术和絮凝技术结合 起来，微生物絮凝剂的研制和开发迅速发展起来，我国也在生物技术长期发展纲要中将 生物絮凝剂作为明确的发展方向之一。 1 1 2 微生物絮凝剂的化学组成和结构 现在所研究的微生物絮凝剂的种类繁多，性质结构各异。经研究发现，微生物絮凝 剂的成分多是由蛋白质、糖蛋白、粘多糖、纤维素、核酸等高分子物质组成。 1 蛋白质 蛋白质是微生物絮凝剂的重要组成之一。j n a k a m u r a 等人【2 1 】早在19 7 6 年的研究中 就发现a s p e r g i l l u ss o j a ea j 7 0 0 2 产生的絮凝剂的主要成分就是蛋白质和己糖胺。m t a k e d a 等人瞄】在对絮凝剂n o c 1 进行分离纯化中发现蛋白质的存在对于其絮凝活性有 着至关重要的作用，而与糖份无关。在随后的硫酸铵和正丁醇萃取精制的实验中得知， n o c l 的主要成分是蛋白质，分子中含有较多的疏水性氨基酸，这是其絮凝性优良的主 要原因之一。王镇等人对其实验室筛选的四株絮凝剂产生菌所产生的絮凝剂进行分析， 三株产生的絮凝剂是由核蛋白组成，另一株产生的絮凝剂是由多糖蛋白组成1 1 2 】瞄 2 多糖 多糖类物质也是目前已经鉴定的生物絮凝剂的重要组成之一。p a e c i l o m y c e ss p 1 1 产 生p f 一1 0 1 絮凝剂是由氨基半乳糖以。一1 ，4 糖苷键连接而成的粘多糖，n 一未取代的半乳 糖残基约占8 0 ，n 一端乙酰化的半乳糖残基约为8 1 2 4 。f - j 1 是c y a n o b a c t e r i u m p h r i m i d i u ms p j l 合成的一种硫酸脂化的杂多糖生物絮凝剂，主要成分为糖醛酸、鼠李 糖、甘露糖以及半乳糖1 2 5 】。纤维素也是一种常见的多糖类物质，同时也是某些生物絮凝 剂的主要活性组分，但是微生物所产生的纤维素通常不像其它生物絮凝剂一样游离于菌 体之外，而是紧紧地依附在产生菌的细胞壁上，直接引起菌体的絮凝沉降。由于该类絮 凝剂主要引起菌体本身的絮凝，因此适用的范围十分狭窄。 3 脂类 k u r a n e 在1 9 9 4 年首次从r h o d o c o c c u s e r y t h r o p o u ss - l 的培养液中分离出一种脂类絮 凝剂，这是此类生物絮凝剂的首例报道，也是目前为止国内外发现的唯一的脂类絮凝 剂。利用酸解、酶解的方法以及结合h p l c 、t l c 、g c m s 等分析手段测定其详细的分 6 一 大连理工大学硕士学位论文 子结构，发现含有葡萄糖单霉菌脂酸( g m ) 、海藻糖单霉菌酸脂( t m ) 和海藻糖二霉 菌酸脂( t d m ) 三种组分，其中霉菌酸脂的碳链长度从c 3 2 到c 4 0 不等，以c 3 4 、c 3 6 和 c 3 8 居多。m t a k e d a 等人却从同一株菌的发酵液中分离到了蛋白质性质的n o c 。1 絮凝 剂。对于这一现象k u r a n e 认为，在水溶液中r h o d o c o c c u se r y t h r o p o u s 产生的絮凝剂是 有多肽和甘油酯组成的聚合体，两者通过强烈的自身絮凝剂作用结合为一体，并且具体 独立的絮凝活性，仅在有机溶剂( 如丙酮) 的处理下才能分离【2 6 1 。由于两人使用的提取 方法不同，因而从同一株菌的培养液中得到了不同性质的生物絮凝剂。 4 核酸 k a z u os a k k a 和h a j i m et a k a h a s h i 2 7 1 用3 m o l l 的盐酸胍处理p s e u d o m o n a ss t r a i nc 1 2 0 的菌体细胞后，c 1 2 0 失去了絮凝活性，当再加入分子量大于6 x 1 0 6 u 的完整e c o l i 双链d n a 或含有高分子d n a 的盐酸胍浸提掖时，c 1 2 0 重新恢复 了絮凝活性，可见高分子量的天然双链d n a 是使c 1 2 0 菌体细胞凝集的直接原因。 m w a t a n a b l e 等人1 2 7 j 也报道了一种d n a 类生物絮凝剂，他们从泰国虾养殖场的水底污 泥中分离到一株光合细菌，鉴定为r h o d o v u l u ms p p s 8 8 ，研究发现亥菌在黑暗好氧和光 照厌氧的条件下均具有絮凝活性，并且絮凝活性与该菌分泌到胞外的d n a 有直接关 系。 现将一部分微生物絮凝剂的化学组成归纳见表1 2 表1 2 部分微生物絮凝剂的化学组成 t a b l e1 2c h e m i c a ls t r u c t u r eo f s o m eb i o n o c c u l m a t s 絮凝剂产生菌絮凝剂组成 a l c a l i g i n e n ec u p i c l u sk t 2 0 1 t “1 a l - 2 0 1 多聚糖类物质，分子量超过2 0 0 万，含有4 2 5 葡萄糖，3 6 3 8 半乳糖，8 2 5 葡糖醛酸和1 0 3 乙酸 a n a b a e n o p s i sc i r c u l a r i s 含酮酸残基和中性糖的酸性多糖 a s p e r g i l l u sp a r r a s i t i c u sa h u 7 1 6 5 分子量在3 0 万到l 百万之间，由半乳糖胺残基 以a - 1 ，4 糖苷键相连的直链大分子，n 未取代的 半乳糖胺残基随机分布于多糖链上 a s p e r g r i l l u s s o j a e a j 7 0 0 2 “”分子量大于2 0 万，含有2 0 9 半乳糖胺、0 3 葡萄糖胺、3 5 3 2 - 葡糖酮酸和2 75 蛋白质， 半乳糖胺和葡糖胺均非乙酰化 1 1 4 ：6 1 ：o4 ) 和糖蛋白( 葡萄糖、甘露糖、半乳 一7 一 细菌胞外聚合物的合成规律和应用 糖) b a c i l l u s 1 i c h e n i f o r m i s c c r c l 2 8 2 6分子量超过2 0 0 万主要成分为聚合谷氨酸 口1 1 b a c i l l u ss pd p - 1 5 2 ”“ 葡萄糖、甘露糖、半乳糖和岩藻糖( 摩尔比约为 8 ：4 ：2 ：1 ) b a c i l l u ss u b t i l i s 主要成分是聚谷氨酸 b a c i l l u s m e g a t e r i w n a 2 5 ”1 b p 2 5 多糖类物质，含葡萄糖和甘露糖两种单糖( 摩尔 比4 0 ：t ) ，连接键包括l ，6 糖营键和伍- l ，3 糖苷 键。 c o r y n e b a c t e r i u m g l u t a m i c t u n ”“ r e a 一11 分子量超过l o 万，半乳糖醛酸和糖蛋白类 c y a n o b a c t e r i u m p h r i m i d i u r ns p j 1 ”1 结合有脂肪酸和蛋白质的硫化异多糖，其中多糖 由糖醛酸、鼠李糖、甘露糖和半乳路组成 尔比5 ：2 ：1 n o c a r d i a a m a r u e u k l ”f i x 三种以上物质组成的混合物，主要成分可能是多 肽，含有2 5 6 肾甘氨酸，1 3 8 丙氨酸和1 23 丝氨酸 n a n n o c y s t i ss p n u - 2 ”1 4 0 3 蛋白质，5 6 5 聚多糖( 葡萄糖、甘露 糖、葡糖醛酸摩尔比5 ：4 ：1 ) 胺、2 3 乙酰基、5 7 甲酰基，还含有n 未取 代的半乳糖胺，大部分以* l ，4 糖苷键相连 乳糖、琥珀酸、丙酮酸( 摩尔比为5 6 ：1 ：o 6 ：25 1 r h o d o c o c c u se r y t h r o p o u ss - 1 1n o c - 1 主要成分为蛋白质，并含有较多的疏水性氨基酸 从图表1 2 的内容可以初步确定，从化学组成上来讲，微生物絮凝剂的活性成分主 要是微生物代谢产生的各种多聚糖类、蛋白质( 或多肽) ，或者是有蛋白质( 或多肽) 的参与，脂类、d n a 等其它类型的生物絮凝剂较为少见。另外，一些絮凝剂中还含有 无机金属离子，如c a ”、m 9 2 + 、a 1 3 + 、f 分+ 等。大多数生物絮凝剂的红外光谱表明有羟 基、羧基、氨基和磷酸基团存在，z a j i c 和k n e t t i n g 4 0 1 认为是这些基团促进粘土悬液中粘 土颗粒的絮凝。大多数研究者认为羟基基团在絮凝中发挥重要作用，但也有人认为氨基 和磷酸基的作用更大【3 9 】。 一8 一 大连理工人学硕士学位论文 l 。2 微生物絮凝剂的絮凝机理研究 相对于经典胶体体系的絮凝机理而言，生物体系( 细胞间自我絮凝及微生物絮凝剂 引起的絮凝) 的絮凝机理目前还不是很清楚。微生物絮凝剂能使离散颗粒( 包括菌体细 胞自身) 之间相互粘附，并能使胶体脱稳，从而形成絮体沉淀从体系中分离出去。为此 人们先后提出过许多假说，如b u t t e r f i e l d 的粘质假说，g r a b t r e e 的酯合学说，f r i e d m a n 的菌体外纤维素纤丝学说等。 g r a b t r e e 的p h b 酯合学说是根据生枝动胶菌积累聚b 一烃基丁酸( p h b ) 提出的， 适用范围窄，只能解释部分产p h b 菌种引起的絮凝。 “类外源絮凝集素”假说则很好的解释了酵母菌的絮凝机理：即由絮凝酵母细胞壁 上的特定表面蛋白与其它酵母菌细胞表面的甘露糖残基之间的专一陛结合引起絮凝。絮 凝的供体对蛋白酶敏感，仅存在于絮凝细胞上；受体对蛋白酶不敏感，受甘露糖专一性 控制，存在于絮凝和非絮凝细胞上。甘露糖层的形态和结构的改变最终导致酵母细胞絮 凝活性的不可逆丧失。 f r i e d m a n 发现部分引起絮凝的菌体外有纤丝，认为是由于胞外纤丝聚合形成絮凝 物，因此提出了“菌体外纤维素纤丝”学说，该学说主要针对纤维素类絮凝剂。由于某 些微生物产生的絮凝物质并非游离于菌体培养液中，而是作为菌体细胞的一部分，或者 紧紧附着于细胞表面形成类似荚膜状物质( 如具有絮凝性能的酵母菌和纤维素产生菌) ， “类外源絮凝集素”假说和。菌体外纤维素纤丝”假说对此类非游离态絮凝剂的作用规 理作出了合理解释，但不能解释大部分絮凝现象。 目前人们普遍接受的是“桥联作用”机理，该机理认为大分子生物絮凝剂的絮凝过 程是下述几个物理化学过程共同作用的结果。 ( 1 ) 吸附架桥作用 絮凝剂大分子借助离子键、氢键和范德华力同时吸附多个胶体颗粒，在颗粒间产生 “架桥”现象，从而形成一种三维网状结构而沉淀下来。大分子的吸附架桥作用是桥联 机理的核心内容，也是促使胶体物质絮凝沉淀的最主要作用力。l e v y 等人阎以吸附等 温线和电位测定表明，环圈项圈藻p c c 一6 2 7 0 所产絮凝剂对膨润土的絮凝过程确实是 以“桥联”机制为基础的。 ( 2 ) 电中和作用 l e v y 等1 4 l j 在研究c y a n o b a c t e r i u mp h o r m i d i u ms p s t r a i nj 1 产生的絮凝剂f j 1 时指 出，在胶体颗粒的絮凝过程中，电中和效应也是不容忽视的。当生物高分子絮凝剂所带 电荷与颗粒带电性质相反时，颗粒因为吸附生物絮凝剂而使表面电荷密度降低j 从而颗 9 一 细菌胞外聚合物的台成规律和应用 粒之间能够充分相互靠拢使得吸引力成为主要作用力，为絮凝剂的架桥提供了有利条 件。 ( 3 ) 卷扫作用 形成小粒絮体的絮凝剂在重力作用下沉降，犹如一个过滤网下降，迅速卷扫水中胶 粒产生沉淀，卷扫作用基本是一种机械作用。 r 艾克斯将絮凝剂的架桥一絮凝反应过程归结为以下几个阶段： a 一聚合物在液相中分散 b 一聚合物于界面处吸附 e l 一界面处吸附的聚合物压缩而产生保护作用或“溶胶作用” c ：一部分覆有聚合物的颗粒相互碰撞，形成架桥。 其中c ，与c 2 互相竞争，两者竞争的结果取决于絮凝剂的浓度。当溶液中聚合物浓 度高时，会发生溶胶作用，以致无法实现架桥。艾克斯的架桥絮凝反应过程从机理角度 对“絮凝剂的最适浓度”问题做出了解释。 1 3 微生物絮凝剂的合成及絮凝影响因素 1 3 1 微生物絮凝剂合成的影晌因素 影响微生物合成絮凝剂的因素有很多，微生物的基因型、细胞的生理状态以及环境 因素都能对絮凝剂的合成产生影响。环境因素如培养基的成分、培养基初始p h 值、培 养温度等对絮凝剂合成的影响较大。值得说明的是某一特定菌种产生絮凝剂的最佳条件 一般不同于菌体生长的最佳条件。 1 碳源的影响 对于微生物，微生物的生长与碳源有着密切的联系，微生物合成絮凝剂同样与碳 源有着密切的联系。在re r y t h r o p o l i s 的培养过程中使用0 5 葡萄糖和o 5 蔗糖为碳源 时，絮凝剂的产量要高于以1 蔗糖和1 废糖浆( 含果糖、蔗糖和葡萄糖) 为碳源时的 产量【4 2 ；当以鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、纤维二糖作为培养碳源时，要么不利于菌体生 长，要么不利于絮凝剂合成【7 j 。在a l c a l i g e l v | l l l e sc u p i d u s 培养过程中使用葡萄糖、半乳糖 和果糖比用淀粉和麦芽糖对絮凝剂台成更有效嘲。 但对生长最合适的碳源并不一定就是对絮凝剂分泌最有利的碳源。例如，用浓度 为8 的废糖浆培养r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 时，菌体虽然生陈较快，絮凝率的产量却 不高h 2 j ；使用非水溶性碳源如橄榄油时，虽有利于菌体生长，但不利于絮凝剂合成。 在b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sc c r c l 2 8 2 6 的受试碳源中，葡萄糖、果糖、乳糖均不利于细胞 牛长和絮凝剂合成，而戊烯二酸、柠檬酸、甘油则是促进细胞生长和絮凝剂合成的有利 一1 0 一 大连理工大学硕士学位论文 碳源川。另外，在a s p e r g r i l l u s s o j a e 的培养基中加入过量的葡萄糖会降低培养基p h 值，从而抑制絮凝物质的合成，其它糖类对于a s p e r g r i l l u s s o j a 合成絮凝剂也有类似作 用【4 3 】。 为了降低生物絮凝剂的生产成本，人们开始寻找价格低廉的碳源 4 4 1 ：以乙醇、山 梨糖醇、甘露糖醇作为细胞生长和絮凝剂合成的替代碳源培养r e r y t h r o p o l i s 收到良好效 果，与果糖和葡萄糖相比，细胞生长量虽不如前两者高，但絮凝剂的产量和类型不发生 变化。受试的其它醇类如甲醇、正丙醇、乙二醇、甘油都可以作为絮凝剂生产的碳源， 其巾当培养基中乙醇浓度为1 时，每细胞浓度产生的絮凝剂活性最大，发酵时问缩短 为6 天，产生的絮凝剂能絮凝各种悬浮颗粒物。加上乙醇价格较低，还可省去生产过程 中的消毒过程，使得絮凝剂的工业生产简化。这些研究成果说明，可以利用含有醇类的 废水作为微生物合成絮凝剂的培养基。另外，罐头加工厂的含鱼血废物也可作为r e r y t h r o p o l i s 合成絮凝剂的优良碳源，但究竟是鱼血中哪种成分起作用尚不清楚【4 ”。 ( 2 ) 氮源的影响 培养基中氮源分为无机氮源和有机氮源。可作为无机氮源的有尿素、硫酸铵、硝 酸氨、硝酸钠等，可作为有机氮源的有酵母膏、酪蛋白、谷氨酸、丙氨酸等。研究结果 显示，在n o c 一1 絮凝剂生产过程中，无机氮和有机氮都可充当r e r y t h r o p o l i s 的氮源， 前者以尿素和硫酸铵为最佳，后者可采用酵母浸膏、酪蛋白氨基酸。采用氯化铵和硝酸 铵虽可促进菌体生长，但絮凝剂的活性只有以尿素和硫酸铵为氮源时的6 0 7 0 r l 。 拟青霉属( p a e c i l o m y c e ss p i - 1 ) 微生物以酪蛋白水解物为氮源时有利于絮凝剂产生， 当加入酵母膏或肉膏时，只有利于菌体生长，絮凝剂产量却没有变化【6 。bl 耙h e n i f o r m i s c c r c l 2 8 2 6 能利用氯化铵作为氮源合成絮凝剂，其它氨盐如硫酸氨则效果不佳，使用 硝酸氨时甚至无法合成絮凝剂 3 ”。在a s p e r g r i l l u ss o j a e 培养过程中，使用无机氮源如氯 化铵、硝酸铵、硫酸铵时，菌体生长缓慢，合成絮凝剂效率不高；而使用酪蛋白、酵母 膏、聚胨时则能促进絮凝剂的合成1 4 3 1 。 有学者已开始着中研究微生物絮凝剂合成的替代氮源在n o c 一1 絮凝剂的i l k 化生 产中，已开发出替代酵母膏的有机氮源，如豆饼、水产加工废水和牛血。采用豆饼具有 与酵母膏同样的效果，培养基成本可下降2 ，3 以上。采用水产加工废水能将n o c 一1 的 絮凝活性提高1 2 倍，生产周期大大缩短，成本下降7 0 8 0 ，采用牛血也有良好 的生产能力，但牛血浓度对絮凝剂的产量有较大影响。以麦芽根作为有机氮源生产 n o c l 的效果十分出色m ，k u r a n e 等人还介绍了采用米糠、鱼肉和葵花子粉作为培 养r e r y t h r o p o l i s 生产絮凝剂的氮源。 细菌胞外聚合物的合成规律和应用 ( 3 ) 碳氮比的影响 在产絮凝剂菌培养基中，碳氮比对微生物絮凝剂产生和繁殖也非常重要。在对红平 红球菌( r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sc c r c l 0 9 0 9 ) 进行考察时，发现碳氮比在2 0 3 0 之间 时，絮凝活性达到最大，碳氮比在低于1 0 或高于1 0 0 后，絮凝活性迅速下降1 4 9 o j 。在 c n 为o 6 - - i 1 4 时z o o g o l e as p 合成絮凝剂的活性较好，高于或低于此范围时，絮凝剂 活性便迅速下降1 4 7 1 。当培养基中葡萄糖浓度为2 5 9 l 时，降低c n ( 小于3 8 ) 可提高 z r a m i g e m 合成絮凝剂的产量删。 ( 4 ) 其它营养物质的影响 一些有机酸，包括2 一葡糖酮酸、5 一葡糖酮酸和葡糖酸等可以促进a s p e r t 7 l u s s o j a e 合 成絮凝剂，其中2 葡糖酮酸的效果最好【4 3 】。另外，培养基中的阳离子种类及浓度对微生 物合成絮凝剂也有影响，对于拟青霉属菌i 1 ，c a 2 + 能够强烈刺激菌体生长和絮凝剂合 成，n a 十、m 9 2 + 和k | + 却无影响，