（分析化学专业论文）生物活性小分子与金属表面相互作用的拉曼光谱分析.pdf

分析化学硕士论文 摘要 共焦显微拉曼系统具有很高的空间分辨率，表面增强拉曼光谱能够得到单分子 水平检测灵敏度信息，而自组装技术能够提供很好的分子模板，本文将三者技术联 用，在不同实验条件下，获得l 丙氨酸、乙酰一丙氨酸和磺胺分子在金属表面自组装 的增强拉曼光谱。根据振动量化计算和拉曼表面增强机制，解析上述分子与基底的 吸附作用机理。进行原位光谱化学和原位电化学分析，考察分子组装膜的稳定性和 构效关系。本论文具体内容如下： l 丙氨酸用途广泛，也是血液中含的主要氨基酸，是构筑蛋白质的重要氨基酸 之一。以银溶胶作增强基底，观察l 丙氨酸在银溶胶表面的拉曼光谱信息。实验表 明，l 丙氨酸可以吸附在银溶胶表面，并产生明显的s e r s 增强；l 丙氨酸吸附是通 过羧基和氨基中的氮原子与银结合来实现。 乙酰丙氨酸是一种氨基酰化氨基酸。大量研究结果表明，溶液的p h 值影响单分 子膜结构以及物理、化学甚至生物方面的特性。实验结果显示，通过调节p h 值，完 全质子化和完全去质子化的乙酰丙氨酸分子经自组装过程，都能在银电极表面形成 结构稳定、排列有序的单分子层。完全质子化的乙酰丙氨酸分子于通过亚氨基中的 氮原子和羧基基团的氧原子吸附在银表面，而酰胺基团则远离银表面；完全去质子 化的乙酰丙氨酸分子吸附在银表面不仅通过亚氨基中的氮原子和羧基基团的氧原 子，并且酰胺基团靠近银表面。 磺胺类药物抗菌谱广，性质稳定，便于长期保存，对控制感染性疫病有很好的 作用，是日常生活中的常见药物。通过特殊的电化学方法粗糙后，可以获得磺胺分 子在银表面上的s e r s 光谱。采用原位电化学方法从得到的s e r s 光谱分析结果表明， 磺胺分子能在银表面自组装成紧密有序的单分子层，并且电位对磺胺自组装单分子 膜有较大的影响。随着电位的负移，磺胺分子先是被拉近电极表面，当电位继续负 移，磺胺分子又开始远离电极表面直至脱附。 i h 分析化学硕士论文 a b s t r a c t t h ec o n f o c a ll a s e rr a m a nm i c r o s p e c t r o s c o p eh a sh i g hs p a t i a lr e s o l u t i o na n d s e n s i t i v i t ya sw e l la ss e r sc a np r o v i d et h ei n f o r m a t i o na tm o l e c u l a rl e v e l i na d d i t i o n ， s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ( s a m s ) t e c h n i q u ec a l lp r e s e n tau n i f o r ma n do r d e rm o l e c u l a r a r r a ya saw e l ld e f i n i n gm o d ef o rs u r f a c es t u d y i nt h i st h e s i s ，t h et h r e em e t h o d s m e n t i o n e da b o v e ，w e r ee m p l o y e dt o g e t h e rt oo b s e r v et h em e c h a n i s ma n dp h e n o m e n o no f s u r f a c ep r o c e s s t h em a i nc o n t e n t so ft h i st h e s i si n c l u d et h ef o l l o w i n gp a r t s ： l - a l a n i n ei sa p p l i e dw i d e l ya n dt h eo n ei m p o r t a n ta m i n oa c i dt ob u i l du pp r o t e i n s b a s e do nt h er e s u l t so fq u a n t u mc h e m i s t r yc a l c u l a t i o na n dt h em e c h a n i s mo fs e r s ，i t s u g g e s t st h a tl - a l a n i n ea c i dm o l e c u l e sa n c h o ro nt h es i l v e rs u r f a c et h r o u 曲c a r b o x y la n d n i t r o g e na t o m ss i n c et h es i g n a l sw e r em a i n l yd u et ot h ec a r b o x y la n dt h en i t r o g e no f l - a l a n i n ea c i d n - a c e t y l a l a n i n ea sa nn a c y la m i n oa c i dp r o v i d e sm u l t i p l ep o s s i b l ea d s o r p t i o n w a y sa tt h es u r f a c e 。a n dt h em o n o l a y e r so fn - a c e t y l a l a n i n ea tt h em e t a l l i cs u r f a c ec o u l d b es e r v e da sab i o c u m p a t i b l ef u n c t i o n a li n t e r f a c et oc o n s t r u c tb i o s e n s o r s t h er a m a na n d s u r f a c e - e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ( s e r s ) s p e c t r af u rn a c e t y l - a l a n i n es e l f - a s s e m b l e d o n t ot h es i l v e rs u r f a c ew e r er e c o r d e du n d e rd i f f e r e n tp hm e d i a a s s i g n m e n t so ft h e o b t a i n e ds p e c t r aw e r ep e r f o r m e db yt h ed e n s i t yf u n c t i o n a lt h e o r y ( d f t ) c a l c u l a t i o n sa t b l y p 6 - 3 1 1 gm e t h o d b a s e do ns e r sp r o d u c i n gm e c h a n i s m ，t h ea d s o r p t i o nf a s h i o n so f n - a c e t y l a l a n i n e a tt h es i l v e rs u r f a c e sw e r ed e d u c e dt h a tt h e f u l l yp r o t o n a t e d n - a c e t y l - a l a n i n ea d s o r b e do nt h es i l v e rs u r f a c ev i at h ei m i n eg r o u pt o g e t h e rw i t ht h e e a r b o x y l a t eg r o u p w h i l ei ta n c h o r e do n t ot h es u r f a c et h r o u g hn o tb o t ht h ei m i n ea n dt h e c a r b o x y l a t cg r o u p sa n da l s ot h ea m i d eg r o u pa f t e rc o m p l e t e l yd e p r o t o n a t e di nt h eb a s i c s o l u t i o n s u l f a n i l a m i d e sa r et h ef i r s te f f e c t i v ec h e m o t h e r a p e u t i ca g e n t st ob ee m p l o y e d s y s t e m i c a l l yf o rt h ep r e v e n t i o na n dc u r eo fb a c t e r i a li n f e c t i o n si nh u m a n s f u r t h e r m o r e ， s u l f ad m g sa n dt h e i rc o m p l e x e sh a v em a n ya p p l i c a t i o n s ，s u c ha sd i u r e t i c , a n t i g l a u e o m a o ra n t i e p i l e p t i cd r u g s ，a m o n go t h e r s a f t e rt h ee l e c t r o c h e m i c a l l yr o u g h e n e ds i l v e rs u r f a c e ， s e r ss p e c t r ao fs u l f a n i l a m i d es a m so nt h em e t a ls u r f a c ew e r eo b t a i n e d t h e e l e c t r o c h e m i c a la n di n s i t us p e c t r o e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sa r eu s e dt oi n v e s t i g a t et h e 分析化学硕士论文 r e l a t i o n s h i p so fs t m c t o r e - p r o p e r t i e sa n de x a m i n et h es t a b i l i t yo fm o n o l a y e r s n e e l e c t r o d ep o t e n t i a lw a sv a r i e db e t w e e n 1 5a n d0vi ns t e p so f0 1v a c c o r d i n gt ot h e o b t a i n e ds e r ss p e c t r a , i ti sf o u n dt h a t ，t h ec h a n g e so ft h ep e a k sa r ea l m o s tr e l a t e dt ot h e v i b r a t i o n a lm o d e so ft h eb e n z e n er i n g w i t ht h ep o t e n t i a lm o v e dm o r en e g a t i v e , t h e m o l e c u l ei sm u c hc l o s e rt ot h es i l v e rs u r f a c e a st h ep o t e n t i a ls h i f t i n gt of u r t h e rn e g a t i v e v a l u e s ，t h em o l e c u l eb e c a m ea w a yf r o mt h es i l v e rs u r f a c ea n dd e t a c h e df r o mt h es i l v e r s u r f a c ea t 】5 v v 分析化学硕士论文 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了 特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。 其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表示了谢 意。 作者签名：蝴吼加7 岳；口 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名艚导师签 日期：97 ，r 卜 ， 分析化学硕士论文 第一章绪论 生物分子作为功能性分子修饰在电极表面的研究报道较纠”，例如胱氨酸巯基 羧酸等，其末端基团可以根据需要剪裁、组合，为修饰电极功能的多样化、检测灵 敏度的提高、传感器的再生等提供了可能。功能型化学修饰电极所表现出的催化、 光电、表面配位、富集与分离、分子识别等效应和功能，己被广泛应用于生命科学、 环境科学、分析科学及材料科学等诸多方面【2 j 。同时电极表面在修饰电极中起到一 个模拟生物膜的作用因为生物分子和电极之间的电子传递过程更接近生物氧化还 原系统的原始模型【3 】。 基于以上的优点，生物分子修饰在电极表面上的行为研究成为目前科学家们竞 相研究的热点。而修饰电极又有很多方法，如单分子修饰有共价键合法，吸附法、 欠电位沉积法、l b 膜法和自组装( s e l f - a s s e m b l e ds a ) 膜法。其中，s a m s 是通过分子 与基体表面以及分子间的物理化学作用，自发构成的一类热力学稳定、排列规则的 单层膜，具有均匀一致，高密堆积和低缺陷等特点，与其他方法相比s a m s 具有更好 的稳定性和化学活性，特别是在控制由分子所造成的微结构和动力学性质方面有着 无可比拟的优越性【4 】。通过设计s a m s 成膜分子的组成和结构，达到精确的化学控制， 获得特定功能表面，因此，s a m s 也可表现出超分子结构的界面性质。由于s a m s 结 构高度有序和规整性为研究表面自组织过程、构效关系及界面现象等本质问题也提 供了一个理想简单的模型。而增强拉曼光谱( e n h a n c e dr a l n a l ls c a t t e r i n g ，e r s ) 技 术在之前的二十多年时间里发展非常迅速，凭借其受水的影响小、检测灵敏度高等优 点广泛应用在无机化学、有机化学、生物化学方面。尤其是发展而来的共焦显微拉 曼光谱技术有很好的空间分辨率而广泛应用在研究单分子层面上的化学及生物行 为。 本论文的主要工作就是利用表面增强拉曼光谱( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a n s c a t t i n gs e r s ) 和s a m s 技术联用对l 广丙氨酸、乙酰丙氨酸和磺胺分子在金属电极 表面的构型及其功能性进行研究。 分析化学硕士论文 1 1 拉曼散射 1 1 1 拉曼散射的基本原理【5 - s 电磁波与物质相互作用时会发生吸收、反射、散射等过程。其中散射光包括弹 性散射和非弹性散射两种，前者是频率不变的散射，也就是我们常说的瑞利散射： 后者是频率发射改变的散射，包括拉曼散射和布里渊散射。在这里，我们将简单介 绍一下拉曼散射。 1 9 2 8 年印度物理学家c v r a m a n 等研究人员发现了一种非弹性散射。当频率为 v o 的单色光入射到物质以后，物质中的分子会对入射光产生散射，散射光的频率为 v 0 士v ，即在激发线两侧各存在一条谱线，在低频一侧频率为v o - v 的谱线称为斯托 克斯线，在高频一侧频率为v o + v 的谱线称为反斯托克斯线。我们称这种散射为拉曼 ( r a m a n ) 散射。每种物质的拉曼线可以有若干对，每对线对应于物质的某两个能级间 差值( 振动、转动或电子能量间的差值) 。 e l e 。v e s ；t o k e s s c a t t e r i n g r a y l e i g h s c a t t e r i n g a n t i s t o k e s s c a t t e r i n g e x c i t e ds t a t e v i r t u a ls t a t e g r o u n ds t a t e f i g u r e1 1s c h e m a t i cd i a g r a mf o rr a m a ns c a t t e r i n gp r o c e s s 如f i g 1 1 所示，对于拉曼散射过程而言，在入射光v o 照射下，分子先由基 态e 0 ( 或振动激发态e 1 ) 被激发至虚态( v i r t u a ls t a t e ) 高能级，该能级介于基态和电子 分析化学硕士论文 第一激发态之间，随即发出光子，分子能量回到振动激发态e 1 ( 或基态e o ) ，光子失 去( 或得到) 的能量与分子得到( 或失去) 的能量相等，即6 e ：m 反映了振动能 级的变化。因此，根据入射光子和散射光子频率变化，就可以判断出分子含有的化 学键或基团。对于多原子分子，拉曼振动选律是a v = t i 。拉曼光谱的纵坐标是散射 光强度，横坐标为拉曼位移( v o - v ，单位c m 1 ) 。 1 1 2 拉曼散射效应的经典理论m 当入射光到达物质表面时，表面分子发生振荡，偶极子被极化。对于弹性散射， 分子诱导偶极矩p 与极化度a 可表示为 p = a e1 1 而入射光电场与时间t 的关系如下 e = e o c o s 2 n v o t 1 2 式中易为入射光电场振幅；坳为入射光频率；将式1 - 1 代入式1 2 得 p = a e o c o s 2 翻r v o t 1 - 3 在频率很小时，口可用泰勒级数( t a y l o r s e r i e s ) 展开，由于高次项相当于倍频及组 频，强度很小，故略去，仅取到二次项，见下式 口= 锄+ ( a a l o 。q ) q 1 - 4 式中a o 为分子平衡构型的极化度；阳叫跑) 是在平衡构型下极化度随波长和 键角变化的变量；q 为简正坐标，相当于振动位移坐标，是时间的函数，在谐振子 近似模型下可表示为 q = 函c o s 2 x v j c t 1 - 5 式中2 羽为分子基频振动。将式1 - 5 代入式1 - 4 得 口= a o + ( 别吧) ( q o c o s 2 _ j f v m t ) 1 - 6 将式1 6 代入式1 - 3 得 分析化学硕士论文 p = a o e o c o s 2 月r v o t + ( s a o q ) e o q o c o s 2 用r v m tc o s 2 确懂 1 - 上式进行三角函数变换 p2 嘞e o c o s 2 n y o t + 1 2 ( a a s q ) 岛q o c o s 2 罔( v o + v m ) t + c o s 2 刀( 枷砌妇 l - 8 式中，a oe o c o s 2 x t , s t 项对应瑞利散射，l 2 ( a a w q ) e o q o c o s 2 x ( v o , 均# ) t + c o s 2 s ( 协) f 】相当拉曼散射，1 1 0 - 协和 饥惭分别是s t o k e s 和a n t i s t o k e s 线。可见， 拉曼散射强度与极化度随平衡距差值变动速率( d a 8 q ) 有关。 拉曼散射经典理论无法解释为什么a n t i s t o k e s 线强度比s t o k e s 线的弱，以及 拉曼散射为何严格遵循选律等问题，但在拉曼散射量予理论中可以找到答案。由于 该问题与本论文内容无太多关联，故不在此作介绍。 1 1 3 拉曼散射的的特点阳6 】 分子光谱学在科学研究中占有重要位置，现有的分子结构等分子信息大多是从 分子光谱学中获得的。拉曼光谱属于分子振动和转动光谱范畴。拉曼光谱与红外光 谱联合使用，在物理、化学、材料科学、生命科学等诸领域有重要的应用价值拉 曼光谱技术在应用中具有红外光谱等不具备的优越性，主要表现为： 1 ) 拉曼光谱的频率位移a v 不受单色光源频率的限制。单色光源的频率可以根据样品 的不同特点而有所选择。红外光谱的光源则不能任意调换。 2 ) 激光的方向性强，光束发散角小，可聚焦在很小的面积上对极微量的样品进行测 定。拉曼光谱使用的激光为激发光源，其单色性好，因而拉曼光谱谱带比红外光谱 的谱带更尖锐，分辨性好。另外，拉曼光谱使用的激光光源性质使其相当易于探测 微量样品，如溶液、粉末、气体、薄膜、表面和许多其他类型的样品。 3 ) 用拉曼光谱进行光谱分析时，水是有用的溶剂，而对红外光谱，水是差的溶剂。 分析化学硕士论文 4 ) 单独一台拉曼光谱仪，就可覆盖整个振动频率范围。而傅里叶红外分析系统，为 了覆盖这个范围就必须改变检测器或光束劈列器，用传统的红外光谱仪测量必须使 用两台以上仪器才能覆盖这一区域。 5 ) 拉曼活性的谱带是基团极化率随简正振动改变的关系，而红外活性的谱带则是基 团偶极矩随简正振动改变的关系，拉曼谱带中包含的倍频及组频谱带比红外光谱中 的要少。拉曼光谱往往仅出现基频谱带，谱带清楚，分析起来要比红外光谱更简单。 另外，使用高功率脉冲激光器对受激拉曼散射和超拉曼散射效应等非线性现象的研 究可大大增加人们对物质固态和液态结构方面的认识。 1 2 共焦显微拉曼光谱技术 拉曼光谱虽然具有以上1 1 3 节所述的优越性，但由于物质分子的拉曼散射截面 很小( 1 盯建一1 0 3 0 c 柚2 ) 。有时会受到物质荧光的干扰等，因而很难获得较强的拉曼光 谱，这严重限制了应用和发展，直到激光出现后才有所改善，但仍不能满足一些研 究的需要。多年来，研究人员一直努力寻找获得理想拉曼光谱的技术方法。如今一 些先进的拉曼光谱技术己经出现，并在应用中取得非常有意义的成果。下面将简单 介绍其中的共焦显微拉曼光谱技术的知识，另一项非常重要的技术一表面增强拉曼 散射光谱将在下一部分重点介绍。 共焦技术是指把分析样品置于激光通过显微镜透镜后形成的聚焦点( 为一轮 廓鲜明的衍射受限光斑) 上，激光光斑激发产生的散射光由该透镜收集成像于像平 面上，像平面上放置一针孔光阑，针孔光阑与物平面上的激光焦点构成光学共轭， 能消除来自样品离焦区域( o u t - - o f - f o c u s - r e g i o n s ) 的杂散光，形成空间滤波，保证了 探测器检测到的散射光是激光采样焦点薄层( 1 9 u 纵深) 微区( 横向分辨率接近经典 分辨率理想值的0 7 倍) 信号的技术。其示意原理见f i g 12 激光共焦显微拉曼技术是激光科学、拉曼散射技术和显微共焦原理完美结合 的产物，因此，与常规拉曼技术相比，具备良好的空间分辨率即所谓的“光学切片” ( o p t i c a ls e c t i o n i n g ) 功能，可获得界面过程超薄层内的吸附物种分子行为以及分子 分析化学硕士论文 结构、取向等分子水平的信息。在此基础上，该技术还被发展成为一种表面成像 ( r a m a n i m a g i n go rm a p p i n g ) 方法，通过计算机严格控制的x y - 自动平台移动， 实现激光在样品表面区域扫描，获得每点的拉曼散射光谱，经计算机图像合成，可 显示界面物种分布。 f i g u r e1 2s c h e m a t i cd i a g r a mf o rc o n f o c a lr a m a ns c a t t e r i n g 1 3 表面增强拉曼光谱 就像其它科学领域的发展一样，表面增强拉曼散射6 u 咖c c e n h a n c e dr a m a n s c a t t e r i n g , s e r s ) 也经历了一个发现、确认、发展的过程。1 9 7 4 年英国科学家f l e i m a n n 等研究人员1 1 _ ，】首先发现了具有很大增强的拉曼散射现象。他的本意是想将所使用的 银电极经过电位多次氧化一还原处理以后，使其表面粗糙程度加大以增加其表面积， 分析化学硕士论文 希望通过该手段来增加表面被吸附分子的数目，以获得较强的拉曼信号强度。结果 他们意外地发现：吸附在银电极表面吡啶分子的拉曼散射信号强度大大地增强了。但 是他并没有意识到这是一种新的现象，而是简单地将所观察到的现象归因于较大的 吸附表面导致的吸附分子数目的增加。 直到1 9 7 7 年，j e a n m a i r e 18 1 ，和c r e i g h t o n 1 9 垮人分别独立地研究了f l e i m 锄等人 的实验，得到了相同的结果。经过分析后他们认为，仅靠简单地增大电极表面不足 以解释所观测到的增强程度，认定这是一种新的现象，并把它归结为一种全新的表 面光化学效应表面增强拉曼散射( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ) ，简称s e r s 所谓表面增强拉曼散射效应，是指当一些分子吸附到经特殊处理或制备的粗糙 金属或胶体表面( 如金、银、铜) 时，它们的拉曼光谱强度会增加1 0 4 - 1 0 6 倍。1 9 9 7 年， n i e d 、组瑚】和k n e i p p 小组分别报道了纳米银粒子上1 0 1 4 倍的s e r s 增强信号，实现 了表面吸附物种单分子检测。 s e r s 的发现，同时也促使了其它相关领域研究工作的复兴与发展，如经典电磁 理论、溶胶体系的研究等。同时也极大地推动了表面科学、材料科学等重要研究领 域的迅猛发展。 1 3 1 表面增强拉曼散射的基本原理 拉曼散射过程与入射光诱导和振动调制的分子偶极矩p 变化相关。当分子吸 附在金属表面后，表面对极化度口和入射光电场e 会产生影响，同时还要考虑电场 e 通过分子的四极偶极子极化度a 对诱导偶极矩p 的贡献，因此，式1 - 1 可改写为 p = a e + e s 1 - 9 从式1 - 1 中可见，由于口或( 和) e 在表面被极大地增强，加之表面电场梯 度大的对p 贡献也大，结果就在某些粗糙的金属界面上，观察到了很强的拉曼散射 增强。 同种分子各振动频率的表面增强因子不尽相同，因此s e r s 光谱特征与普通 拉曼散射光谱相比差异很大，除了有分子对称性因素外，还与拉曼散射表面增强机 分析化学硕士论文 制有关。目前，有多种s e r s 理论 2 2 2 3 1 ，但尚未有一个理想模型，能充分地阐述该 效应的全部特征，且许多理论间也还有争议。然而，人们公认粗糙化金属表面是构 筑s e r s 基质的关键，并认为可能有两种因素即电磁增强( e m ) 和化学增强效应， 对s e r s 产生作出了贡献阿j 。 电磁物理增强模型认为当激光照射到粗糙的金属表面时，表面等离子体被激发 到高能级，并与光波电场发生耦合共振，引起金属表面局域电场急剧增强，产生拉 曼散射增强。电磁理论能较好地解释为什么只有红色激光才能发现铜和金属表面 s e r s 、入射光角度以及分子偶极矩定向对s e r s 强度的影响等，并且比较成功地解 释了其它金属表面增强现象，如表面增强荧光光谱、表面增强光化学以及表面增强 非线性光学等。由于电磁增强所涉及的分子与金属间作用为物理吸附，而对分子的 化学性质并不敏感，原则上来讲，任何物理吸附在表面上的分子都应表现出增强效 应。然而，不同的物质分子在金属一电解质界面上的增强效应有很大的差别。说明 电磁增强理论存在局限性，不可能排除分子与金属表面发生化学吸附的化学增强机 制的影响。 化学增强模型认为s e r s 产生与电荷转移( c h a r g e t r a n s f e r 简记为c n 有关。在化 学增强机制中，电荷转移模型是被广泛接受的一种模型。该理论模型认为，分子首 先吸附在金属表面，分子基态能级可以发生一定频移或拓宽，从而与金属费米( f e r m i ) 面附近的空电子态发生共振跃迁，电荷在吸附分子与金属之间发生交换，电荷转移 的结果可以导致分子有效极化率增加，从而产生拉曼散射的增强。 电荷转移模型预示了产生拉曼增强的必要条件是吸附分子与金属表面发生化学 作用，形成化学键。因此，当分子与金属表面间距逐步拉大时，s e r s 效应因为化学 键的削弱而迅速减小，也即该增强机制表现为短程性。另外，电荷转移模型表明s e r s 效应还受分子在表面的取向情况的影响。化学类模型强调分子与金属基底间的吸附 是化学吸附，s e r s 谱图应与普通拉曼谱图有着明显的差别，从s e r s 谱上应可以观 察到大的频移、峰相对强度的改变或新峰的出现。 然而，通过理论计算，上述两种机制的增强因子都未超过1 0 4 ，与实验观察 值有差距，因此，有待提出更合理的机理来认识s e r s 本质。但毋庸质疑的是，经 多年的发展，s e r s 技术已成为表面科学中一种提供分子水平信息的有力工具。 分析化学硕士论文 1 3 2s e r s 的特性 尽管目前s e r s 机制理论仍有较大争论【捌，但是这些并不妨碍人们对其特性的 认识和了解【捌。 1 1s e r s 的最重要特性就是具有很大的增强因子，吸附在粗糙的银，金、铜、钠等贵 金属和碱金属表面的分子的拉曼散射强度要比普通的分子增加1 0 4 1 0 7 倍。 2 ) 实现s e r s 的金属表面要有一定亚微观或微观的粗糙度，也就是说金属基体只有在 它的表面被适当粗糙化后，才能显示s e r s 效应。 3 1 许多化合物能产篁e s e r s 效应，文献中已报道了几百种化合物的s e r s 光谱，其中 大都是杂环化合物。 4 ) s e r s 表现有长程性( 分子离开表面数十埃至上百埃仍有增强现象) 和短程性( 分子 离开表面1 2 埃效应便迅速减弱1 ，s e r s 强度随分子离金属基底表面距离的增加而迅 速降低。一般较小的分子被吸附到金属表面时，分子内部所有振动的拉曼信号都能 同样地被增强而观察不到距离效应，而较大的生物分子吸附到基底表面时，与表面 接近的基团显示出强的增强，而离表面远的基团的增强效应则较小。 5 ) 与普通拉曼相比，化合物的s e r s 谱大多数谱峰的频率稍有变化，但相对强度却有 很大的差别，即分子的不同振动模式增强因子不同，并有不同的激发曲线( 指增强极 大和激发频率的关系曲线1 。 6 谱通拉曼光谱信号的强度与激发光频率的四次方成正比，但s e r s 强度却不遵循这 一关系。s e r s 强度先随激发光频率降低而增强，在达到极大后，随激发光频率降低 反而下降。s e r s 强度和激发光频率的关系与金属基底有关，银基底对不同频率的激 发光都有较好的s e r s 效应，s e r s 强度的极大值在黄光或红光区；而对金和铜基底， 使用蓝光时，一般只有很小的s e r s 效应，s e r s 强度最大值相应的激发光频率要比 在银基底上的低。 7 ) 在单分子层吸附的情况下，s e r s 强度与覆盖度的关系是非线性的。并不是吸附在 粗糙金属基底表面的分子都能产生s e r s 效应，大部分的增强效应是由一小部分吸附 在金属基底表面活性位置的分子产生的。 分析化学硕士论文 8 ) 普通的拉曼光谱中，谱峰的出现完全遵守拉曼跃迁的选择性定则，即仅为红外活 性的振动模式将不会在拉曼谱图中出现。但对s e r s 光谱，选择性定则并不太严格， 有时在s e r s 光谱中能观察到与仅为红外活性振动模式相应的谱峰的出现。 9 ) 许多化合物特别是生物分子有较强的荧光，在测量此类化合物的普通拉曼光谱时， 往往受到很强的荧光的干扰而不能得到很好的拉曼光谱。但在测量s e r s 时，许多化 合物的荧光将被淬灭，因而能得到质量很好的s e r s 光谱。 1 0 ) 产生s e r s 的金属表面，同时还可能会产生不依吸附分子而变化的连续非弹性散 射现象。 1 1 3 s e r s 技术的应用及其研究进展 自s e r s 发现后很快在表面科学、分析科学和生物科学等领域得到广泛的应用， 为深入表征各种表面界面( 各种固一液、固气和固固界面) 的结构和过程提供分子水 平上的信息，如鉴别分子( 离子) 在表面的键合、构型和取向以及材料的表面结构。 s e r s 技术主要是研究与吸附分子有关的表面现象，是确定吸附分子的种类，测定 吸附分子在基体表面的取向、研究吸附分子在表面的反应、研究分子的吸附共吸附 等现象的强有力的工具。例如p e m b e r t o n 等【2 7 荆用s e r s 光谱考察了不同巯基烷烃 分子在光滑、机械或电化学粗糙化银表面上的s a m s ，评价了各种单分子膜的缺陷、 有序性和取向。k u d e l s k i 2 8 】研究了巯基乙醇在金、银和铜表面上s a m s 膜的s e l l s 光谱，发现溶液酸度能诱导其吸脱附平衡过程。一般来说，大多数s e r s 的应用都 是建立在对吸附分子的定性分析的基础上的。在单分子层的研究上，s e r s 技术主 要用于确定吸附分子在基体表面上的取向，大多数吸附分子取向的研究是以表面选 择性规则为基础的，表面选择性规则是建立在电磁增强的模型上的，认为垂直于基 体表面的振动谱带能得到很大的增强，而平行于基体表面的振动谱带增强较小。同 时还可以确定分子通过什么基团与基底表面相结合，确定分子的结构和构型等 在s e r s 现象发现后的最初时间里，研究的方向主要集中在特性及起因方面， 经过一段时间的发展目前及将来会采用多种技术联用。s e r s 和其它技术一样，既有 它的优势也存在缺点和不足。虽然s e r s 的应用范围不断地拓宽，已涉及化学、物理、 分析化学硕士论文 材料表征、生物医学诊断等众多领域，但是为适应复杂的检测要求，还需要发展可以优 势互补的联用技术，例如可以检测和鉴别分离产物的s e r s 和毛细管电泳或色谱联 用技术。s e r s 基底的制备一直是s e r s 技术最重要的研究领域而且对于扩大 s e r s 的研究范围和应用领域也起着重要的作用。利用日益成熟的纳米材料的制备 技术，获得颗粒形状和大小可以很好控制的纳米颗粒，并将其作为模型材料来研究 s e l l s 的增强机理也是目前的研究热点用。 1 4 现场电化学r a m a n 光谱技术及其在生物体系中的应用 常规的电化学研究方法是以电信号为激励和检测手段，它提供的是电化学体 系的各种微观信息的总和，难以准确的鉴别复杂体系的各种反应物、中间物和产物， 同时难以解释电化学的反应机理。近年来以谱学方法与常规电化学方法相结合产生 的光谱电化学技术得到迅速的发展【捌，并已成为在分子水平上现场表征和研究电化 学体系的不可缺少的手段。电化学原位拉曼光谱技术就是其中的一例，它能较方便 的提供电极表面分子结构的微观信息。近年来电化学拉曼光谱技术在生物体系中研 究也取得了一些进展。 由于生物活性大分子溶液的浓度比较稀，因此在进行电化学r a m a n 光谱测试 中会面临选择性和灵敏度两方面的困难，在过去二十多年的研究中，通过不断的技 术更新已逐步得以克服和改进。共焦显微拉曼光谱技术其准确的三维定位功能很高 的空间分辨率和纵深对比度，可对纳克甚至亚皮克级质量的物质微分析区域有影响 作用。配以不同波长的激光光源，该系统可在近红外、可见光以及近红外波段对各 种复杂样品进行非破坏性宏观或显微r a m a n 分析。由于采用激光强度较小的光源进 行测试，不会造成对生物活性分子的生物活性的破坏。因此，共焦显微拉曼光谱仪 与电化学测量仪器联用是进行生物电化学研究的有效工具。其中对生物体系的研究 报道也日益增多刚。 已经发现，肽键的振动可以产生多种类型的拉曼谱带，拉曼光谱可以测定蛋 分析化学硕士论文 白质和多肽的结构，包括测定二级结构，并对其中绝大多数谱峰的归属做了指认【7 。 拉曼光谱还对蛋白质中具有催化作用的酶进行了较深入的研究，主要工作包括测天 然溶菌酶的拉曼光谱频率和进行谱峰归属；核糖核酸酶的拉曼光谱的测量；核糖核 酸酶a 的构象变化和闪光光解作用等的研究工作【3 1 】。同时，该技术可以对生物膜进 行非破坏性的原位测试，因而能提供深入了解生物膜结构的信息，包括膜的流动性、 膜蛋白的作用以及膜中质的存在情况等。 1 5 本论文的主要工作 1 5 1 银溶胶上i 广丙氨酸的表面增强拉曼光谱和量子化学振动计算 ( a ) 2 0 种基本氨基酸都有各自独特的生理作用及生物化学行为，对它们的研究 可以对复杂生物体系的深入研究提供十分重要的信息和有益的基础。l 丙氨酸用途 广泛，是血液中含的主要氨基酸，是构筑蛋白质的重要氨基酸之一。 ( b ) 为了将s e r s 作为一种常规、在线的分析工具，所制备的s e r s 基底应具有 增强能力强、稳定、易于制备和储存、使用方便等特点。溶胶特别是银溶胶是目前 应用最多的s e r s 基底，因为它的制备无需特别的装置，容易制备和储存，增强能力 较好。 1 5 2 不同p h 值的乙酰丙氨酸溶液在银电极上表面增强拉曼光谱 ( a ) 乙酰丙氨酸是一种氨基酰化氨基酸，它在表面可能形成多位点吸附方式， 吸附位点可能是羧基、氨基或( 和) 酰氨键。 ( b ) p i - i 值是影响分子在表面吸附构型的重要因素之一。本文采用t s e r s 技术， 在分子水平上观察不同p h 溶液中乙酰一丙氨酸在银表面的自组装膜。结合量子化学 振动b l y p ，6 3 1 1 g 方法计算，对s e r s 光谱进行解析，分析p h 值对该分子的吸附方式 分析化学硕士论文 的影响。 1 5 3 银电极表面磺胺单分子层的s e r s 表征和i ns i t us e r s 光谱电化 学分析 磺胺( s u l f a n i l a m i d e ) 是磺胺类药物最基本的单体，应用广泛。目前对磺胺类 药物分子有广泛的研究，但对磺胺分子单体及它的配合物的研究还是非常有限。 t o p a c l ia 小组利用量子化学理论计算分别对c 0 和c d 与磺胺分子的配合物进行结构 分析，以及采用a bi n i t i o 算法对磺胺分子进行结构优化及光谱学行为在理论上进行解 析。但对磺胺分子及相关配合物利用拉曼光谱技术进行分析少见报道。因此论文考 察在银电极表面的磺胺分子s a m s 原位表面增强拉曼光谱及原位拉曼光谱电化学 研究及电位改变对s a m s 膜的影响。 分析化学硕士论文 第二章银溶胶上l 丙氨酸的表面增强拉曼光谱和量子化学振 2 1 引言 动计算 氨基酸是生物体中组成酶和蛋白质的基本单元，主要有两种存在形式，一种是游 离态，存在于生理体液中；另一种是结合态，存在于肽或蛋白质中。氨基酸在蛋白 质化学、生物化学、食品科学、临床医学等领域起着重要作用，因此，对其分析方 法的研究受到高度关注。 l 厂丙氨酸用途广泛，可以作为在无脂肪和低脂肪酸奶中的甜味剂，是血液中含 的主要氨基酸，是构筑蛋白质的重要氨基酸之一。对l 广丙氨酸在细胞膜上行为的基 础性认识，可以为深入研究复杂生物体系提供十分重要的信息，而金属界面常被用来 模拟细胞膜。 如绪论中所述，表面增强拉曼散射( s e r s ) 具有灵敏度高、水干扰小及适合于 研究界面效应等特点，被广泛用于表面研究和界面吸附状态研究、获得包括分子表 面取向、构型、吸附结构等信息 3 2 - 3 4 1 。在生物体系研究方面，s e r s 可直接分析水相 生物分子的结构状态，且样品用量少，与其他方法相比有着明显的优势。为了将s e l l s 作为一种常规、在线的分析工具，所制备的s e r s 基底应具有增强能力强、稳定、易 于制备和储存、使用方便等特点。因而新型s e r s 基底的制备在s e r s 的发展中有着 重要的地位，一直以来是s e l l s 领域研究的热点之一。溶胶特别是银溶胶是目前应用 最多的s e r s 基底，因为它的制备无需特别的装置，容易制备和储存，增强能力较好。 本文利用超灵敏的s e r s 光谱技术结合量子化学计算。在银溶胶表面上，研究l 丙氨酸的吸附状态及其相互作用模式，并探讨了其吸附作用特点。 分析化学硕士论文 2 2 实验方法 2 2 1 试剂 l 广丙氨酸( 生化试剂) ，购自中国第二军医大学政翔医用科技实业服务部，硝 酸银和柠檬酸三钠为分析纯，购白中国医药集团上海化学试剂公司。实验用水均为 去离子水。 2 2 2 银溶胶的制备 采用硝酸银的柠檬酸钠还原法【3 5 】，将9 0m 酊自酸银溶于5 0 0m l 蒸馏水中，将溶 液煮沸，然后在强力搅拌下将1 0 m l l 的柠檬酸钠溶液逐滴加入，使溶液保持沸腾 1 小时，将最终体积调至5 0 0m l 新制的银溶胶静置一周后使用。 2 2 3 实验仪器 拉曼光谱分析用d i l o r 公司的s u p c r l a b r a m i i 共焦激光拉曼系统，用1 8 0 0 9 m m 光 栅分光，分辨率为2c l n 1 ，低噪声液氮冷却型c c d 检测器( 1 0 2 4 2 5 6p i x e l s ) 。测量 时，采用物镜为5 0 倍长距离镜，用h e n e 激光器的6 3 2 8n m 线为激发源，加d o 6 滤 光片后功率为1m w 2 2 4 量子化学计算 用p m 3 半经验算法进行分子构型优化和振动计算。 分析化学硕士论文 2 3 结果与讨论 l 丙氨酸分子结构如图1 。粉末l 广丙