（环境工程专业论文）白腐真菌对模拟土壤中含氮杂环类化合物的降解研究.pdf

武汉科技大学硕士学位论文第l 页 摘要 氮杂环化合物是一类毒性较大、污染面广的难降解有机物，这类化合物对土壤环境带 来严重的污染，对土壤中氮杂环化合物的的处理研究对于污染土壤的治理有重要的意义。 白腐真菌由于其非专一性、广谱性等特点，被广泛的用于环境治理中，对于污染土壤的生 物修复方面也有积极的意义。本研究主要运用白腐真菌处理模拟土壤中的氮杂环化合物。 论文研究了白腐真菌侧耳属p l e u r o t 凇跳口f 螂的生物学属性，分别探讨了在人工合成 培养基和天然培养基中生长的白腐真菌的漆酶活性动力学，粗酶液中蛋白质含量的变化和 总糖的变化。 在单基质的模拟土壤中，分别考察了白腐真菌对喹啉和吲哚的生物降解过程，喹啉和 吲哚的去除率最高分别达到8 8 7 、8 9 9 。在模拟土壤的生物修复过程中，木屑对土壤中 喹啉和吲哚的去除有促进作用。在模拟土壤的含水率和土壤的p h 上考察了白腐真菌对喹 啉和吲哚的去除效果，确定了各自最佳的含水率条件和土壤p h 。在喹啉土壤中，土壤含水 率升高，去除率提高，土壤最佳p h 值为7 8 。在吲哚土壤中，含水率越低，去除效果越 好，土壤最佳p h 值为7 5 8 5 。从白腐真菌的投菌量方面进行研究，确定了投菌量对去除 效果的影响，投菌量越大，去除率越高。 在模拟土壤中单基质的生物修复过程中，白腐真菌分泌漆酶需要有诱导期来适应底物 和环境条件，天然培养基培养的白腐真菌在土壤环境中具有更好的耐受性。在共基质的模 拟土壤体系中研究了喹啉吲哚间的相互作用，喹啉对吲哚主要产生抑制作用。 关键词：白腐真菌；漆酶；喹啉；吲哚 第1 i 页武汉科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t n i t r o g e nh e t e r o c y c l i cc o m p o u n d s a r ek i n d so fm o r et o x i c ，w i d ep o l l u t e dr e f r a c t o r yo r g a m c s w h i c hb r i n gm o r es e r i o u sp o l l u t i o no fn i t r o g e ni nt h es o i le n v i r o n m e n t ，t h ep r o c e s s i n go f h e t e r o c y c l i cc o m p o u n d s f o rr e s e a r c ht oc o n t a m i n a t e ds o i lr e m e d i a t i o nh a v ei m p o r t a n t s i g n i f i c a n c e d u et on o n - s p e c i f i ca b i l i t y , b r o a ds p e c t r u mp r o p e r t ya n do t h e rc h a r a c t e r i s t i c so f w h i t e r o tf u n g i ，w h i t e r o tf u n g ia r ew i d e l yu s e di nt h ep r o c e s so fe n v i r o n m e n t a lm a n a g e m e n t ， a n dh a v ep o s i t i v es i g n i f i c a n ti nt h ea s p e c t so fb i o r e m e d i a t i o nf o rp o l l u t e ds o i l i nt h i sp a p e r , w h i t er o tf u n g iw e r eu s e dt od e g r a d en i t r o g e nh e t e r o c y c l i cc o m p o u n d s i ns i m u l a t i n gs o i l t h i sp a p e rs t u d i e db i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fw h i t er o tf u n g ip l e u r o t u so s t r e a t u s ，a n d d i s c u s s e dt h ec h a n g e so fl a c c a s ea c t i v i t y , p r o t e i nc o n t e n ta n dg l u c o s ec o n t e n to f w h i t er o tf u n g i i ns y n t h e t i cm e d i u ma n dn a t u r a lm e d i u m i nt h ed e g r a d a t i o ns y s t e m so fs o l o s u b s t r a t eo fn i t r o g e n o u sh e t e r o c y c l i cc o m p o u n d si n s i m u l a t i n gs o i l ，b i o d e g r a d a t i o n so fq u i n o l i n ea n di n d o l eb yw h i t er o tf u n g iw e r ed i s c u s s e d ，a n d r e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e m o v a lo fq u i n o l i n er e a c h e d8 8 7 a tm o s ta n di n d o l er e a c h e d8 9 9 t h e 钏王d i t i o no f 、o o dd u s tc o u l da c c e l e r a t e t h er e m o v a lo fq u i n o l i n ea n di n d o l e i n b i o d e g r a d a t i o no fp o l l u t e ds o i l t h ec o n d i t i o n so fv a r i o u sw a t e rr a t i oa n dp h v a l u ew e r es t u d i e d i nt h eb i o d e g r a d a t i o np r o c e s s e so fq u i n o l i n ea n di n d o l e ，a n dt h eb e s tw a t e rr a t i oa n ds o i lp h w e r eo b t a i n e di ns i m u l a t i n gs o i l i nq u i n o l i n e c o n t a m i n a t e ds o i l ，t h er e m o v a lw a sh i g h e rw h e n s o i lm o i s t u r ew a sr i s i n g , a n dt h eb e s tp hv a l u eo fs o i lw a s7 8 i ni n d o l e - c o n t a m i n a t e ds o i l ，t h e r e m o v a lw a sh i g h e rw h e ns o i lm o i s t u r ew a sr e d u c e d ，a n dt h eb e s tp hv a l u e o fs o i lw a s7 5 8 5 i nt h es t u d yo fi n o c u l a t i o ns i z eo fw h i t er o tf u n g i ，i n o c u l a t i o ni n f l u e n c eo nr e m o v a lo fq u i n o l i n e a n di i l d 0 1 ew a sd e t e r m i n e d ，w h i c hd e g r a d a t i o nw a si m p r o v e dw h e ni n o c u l a t i o ni n c r e a s e d i nt h ed e g r a d a t i o ns y s t e m so fs o l o s u b s t r a t es i m u l a t i n gs o i l ，t h el a c c a s ew h i c hs e c r e t e db y w h i t er o tf u n g in e e di n d u c t i o np e r i o dt oa d a p tt h es u b s t r a t e sa n de n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o u s ，a n d w h i t er o tf u n g ic u l t u r e di nt h en a t u r a lm e d i u mh a sb e t t e rt o l e r a c ei ns i m u l a t i n gs o i l i n t e r a c t i o n i nt h ed e g r a d a t i o ns y s t e m so fc o s u b s t r a t eo fn i t r o g e n o u sh e t e r o c y c l i cc o m p o u n db yw h i t er o t f u n g iw a sd i s c u s s e d q u i n o l i n eh a di n h i b i t i n ge f f e c to nd e g r a d a t i o n o fi n d o l e k e yw o r d s ：w h i t er o tf u n g i ；l a c c a s e ；q u i n o l i n e ；i n d o l e 武汉科技大学硕士学位论文第1 页 第一章引言 近年来，工业的迅猛发展导致了严重的土壤污染，固体废物不断向土壤表面堆放和倾 倒，有害废水不断向土壤中渗透，大气中的有害气体及飘尘也不断随雨水降落到土壤中， 给环境造成了极大的破坏。本文选择的土壤目标污染物氮杂环化合物广泛存在于焦化废 水、制药废水、染料废水、农药废水等工业废水中，木材防腐处理场地周围的土壤和地下 水中也普遍存在，煤焦油和页岩油中也含有高浓度的含氮化合物【l 】，石油中的含氮杂环化 合物也广泛的存在受石油污染的土壤中【2 】。氮杂环化合物多有致癌、致畸、致突变的性质 3 1 ，对环境和人体健康会产生潜在的危害，对氮杂环化合物污染的土壤的治理任重而道远。 1 1 氮杂环化合物的结构特点和研究现状 氮杂环化合物中的喹啉和吲哚是比较典型的难降解有机物，这类化合物的化学结构具 有较高的稳定性，毒害作用较大，对于氮杂环化合物的处理方法主要有高级氧化技术，物 理方法，生物方法，化学方法等。 1 1 1 喹啉的结构特点和研究现状 喹啉( q u i n o l i n e ，q ) ，别名苯并吡啶，氮杂萘，分子式c 9 h 7 n ，分子结构式如图1 1 。无 色油状吸湿性液体，具有强烈臭味，属于中等程度挥发有机物。沸点2 3 8 。c ，相对密度1 0 9 2 9 。 微溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。 。图1 1 喹啉的分子结构式 f i g 1 1t h em o l e c u l a rs t r u c t u r a lo fq u i n l i n e 喹啉及其衍生物对生物体具有毒害作用，且有一定的致畸性和致癌性。喹啉在化工、 医药、农药制造等行业用途非常广泛，由于它较强水溶性及扩散性，喹啉已经成为土壤及 水体中的常见污染物。 目前国内外对于喹啉的降解已经展开了广泛的研究。w a n gx i a o m a o 等【4 】在0 3 v 条 件下研究发现羟基自由基是喹啉降解的主要氧化剂，提高体系中的 o h 有利于提高总降解 速率。t h o m s e n 等【5 】探讨了喹啉在砂质土壤中的吸附、迁移和降解，研究表明喹啉可以完 全矿化。余纯丽等【6 】在活性炭纤维吸附处理喹啉废水的实验研究中发现喹啉的吸附符合 f r e u n d l i c h 吸附等温式；改性后的a c f 吸附速率加快，2 0 m i n 就达到吸附平衡。韩力平等 【7 】对受喹啉污染的土壤中引入喹啉降解菌进行了研究，表明了生物修复的可行性，并考察 了投菌量，泥浆含水量及氮磷的存在对生物修复效果的影响。 第2 页武汉科技大学硕士学位论文 1 1 2 吲哚的结构特点和研究现状 吲哚( i n d o l e ) ，别名2 ，3 苯并吡咯，分子式c 8 h 7 n ，分子结构式如图1 2 。无色片状结 晶，有强烈粪便臭味，属于中等程度挥发有机物。熔点5 3 。( 2 ，沸点2 5 3 c ，相对密度1 2 2 。 溶于水、苯和石油醚，易溶于乙醇、乙醚和甲苯。 h 图1 2 吲哚的分子结构式 f i g 1 2t h em o l e c u l a rs t r u c t u r a lo fi n d o l e 吲哚是在杂环化学和有机化学中占有重要地位，是重要的医药、农药、食品及饲料添 加剂、香料的原料，广泛存在于焦化废水、医药废水、染料废水中【8 】。吲哚在硝酸盐还原、 硫酸盐还原和产甲烷条件下都可以降解完全【l 】。吲哚在产甲烷和硫酸盐还原条件下会产生 了羟吲哚和吲哚满二酮 9 1 。傅敏等【1 0 】在超声波降解吲哚废水的实验研究中发现，超声处理 吲哚的降解规律符合一级反应。古昌红等f l l 】报道了在微波辐射作用下a c f 处理吲哚溶液， 3 5 m i n 去除率即可达9 8 ，微波辐射不能使吲哚发生降解，其作用是使a c f 的孔隙结构 发生变化，增加其吸附能力。马娜等【1 2 】在含氮杂环化合物吲哚的缺氧降解性能研究中发现 缺氧反硝化状态下吲哚具有较好的生物降解性能。 1 1 3 氮杂环化合物处理方法比较 目前氮杂环化合物的物化处理方法主要集中在废水处理的研究及应用中，多为预处理 方法，常见的主要有吸附法、吹脱、蒸馏或汽提法、泡沫分离法、混凝沉淀法、酸碱处理 法、膜技术、过滤法、萃取法、离子交换法、水解法等。氮杂环化合物经过预处理后，还 需进一步降解。 化学处理方法种类繁多，其中由于各种氧化法的高效性、反应器溶剂小以及处理对象 的针对性，在国内外处于比较活跃的地位，主要有光氧化法、催化湿式氧化法、超临界水 氧化技术、电化学氧化、高级氧化技术等。化学处理方法运行费用较高，操作复杂，难以 大规模采用，因此也限制了其广泛的推广应用。 生物处理技术最主要的特点是利用微生物将污染物分解并最终去除，与传统的处理技 术相比，具有快速、安全、费用低廉等优点，是一种新兴的环境友好替代技术【i 引。微生物 具有氧化还原作用、脱羧作用、脱氨作用、水解作用、脱水作用等各种化学作用能力，对 能量的利用要比高等生物更加有效，而且微生物高速度的繁殖和遗传变异性的酶体系能够 以最快的速度适应外界环境的变化 2 1 ，因此在对氮杂环化合物等异生物质的降解处理方法 上，微生物降解被认为是一项通过生物补救过程，从环境中清除污染物的更为有效的方法。 武汉科技大学硕士学位论文第3 页 1 2 氮杂环化合物的生物修复方法 1 2 1 氮杂环化合物的好氧生物修复 氮杂环化合物的分子结构、电荷特性、物化性质与生物降解特性有很大的关系，其好 氧生物降解途径一般起始于邻近氮原子的羟基化过程，羟基化所需的氧来源于水，羟基化 反应的催化酶多为含钼的酶。好氧降解在大多数情况下分为几个羟基化步骤，随后是杂环 或芳香环的双氧裂解。有的好氧降解途径中在环裂解前还包括还原反应【1 4 1 ，环的裂解是杂 环化合物在好氧条件下整个生化反应的限速步裂15 1 。 1 2 2 氮杂环化合物的厌氧生物修复 有研究表明【1 6 】，氮杂环化合物经过厌氧处理可以提高其生化性。厌氧微生物与好氧微 生物在生理方面和酶系统方面差异很大。厌氧微生物具有易于诱导和较为多样化的健全的 开环酶体系，这就为杂环化合物的厌氧酸化降解提供了有力条件，使其易于开环裂解，从 而顺利通过生化反应的限速步骤并有效降解【1 5 】。d 蛐o r g 17 】等研究指出氮杂环化合物的厌 氧降解速率明显低于好氧降解速率，喹啉和吲哚可以在厌氧条件下降解。张晓健等【l8 】研究 认为在厌氧条件下吡啶、吲哚、喹啉的降解速率为喹啉 吡啶 吲哚。李咏梅等【1 9 】研究表 明在厌氧条件下的几种氮杂环化合物由易到难的顺序为吲哚 异喹啉喹啉 吡啶 2 甲 基喹啉。上述实验结果的不同可能是由于试验条件的差异所导致，也说明了氮杂环化合物 的厌氧降解研究尚不透彻，可以进一步研究。 1 2 3 氮杂环化合物的缺氧生物修复 氮杂环化合物在焦化废水的厌氧缺氧好氧工艺处理中的缺氧段有很显著的去除效 果。在缺氧条件下，反硝化菌利用有机碳源作电子供体，以硝酸氮( n 0 3 - n ) 或亚硝酸氮 ( n 0 2 n ) 中的氧作电子受体来进行厌氧呼吸，同时达到去碳和脱氮的目的 1 8 , 1 9 】。上海焦 化厂酚、氰废水的生物处理工艺中的反硝化段不仅具有生物脱氮的功能，而且能使吡啶、 吲哚、喹啉得到较好的降解【2 0 1 。 1 2 4 氮杂环化合物在共基质条件下的生物修复 工业废水在生物处理过程中，混合基质下的难降解有机物的生物降解性能主要表现为 协同作用和拮抗作用。在吲哚与吡啶的共基质试验中 2 1 2 2 】，毗啶对吲哚的降解有协同作用， 吲哚对吡啶的降解有拮抗作用。在喹啉与吡啶的混合降解试验p 2 2 3 1 ，两者均存在拮抗作 用，且喹啉受到的影响显著大于吡啶受到的影响，喹啉是共基质降解的限制因素。全向春 等【2 4 】研究表明在喹啉与葡萄糖共基质时，葡萄糖的存在能够加快喹啉的降解，而喹啉对葡 萄糖的降解有抑制作用。目前关于氮杂环化合物在共基质条件下的作用机理还不是很清 第4 页武汉科技大学硕士学位论文 楚，有待继续研究。 1 2 5 氮杂环化合物生物修复发展前景 对于氮杂环化合物的好氧、厌氧及缺氧生物修复，多数研究选用的微生物主要为传统 分离培养方法筛选的单一降解菌种，当环境体系过于复杂时，该菌种很难发展成为系统中 的优势菌种，有时甚至无法生存。优势菌种也不具有降解杂环化合物的广谱性，在构建基 因工程菌方面仍存在困难f 2 5 】，降解菌种的酶体系作用机理也不太清楚。本研究采用的白腐 真菌是自然生态系统一部分，是具有特殊功能的生物类群，在对异生物质的微生物降解上， 白腐真菌是其中的佼佼者【2 6 j 。 1 ：3 白腐真菌的特性及漆酶研究进展 白腐真菌是指一类能引起木质白色腐烂的丝状真菌的集合。白腐真菌属真菌门，绝大 多数为担子菌纲( b a s i d i o m y c e t e s ) ，少数为子囊菌纲( a s c o m y c e t e s ) ，包括多孔菌( p o l y p o r u s s p ) 、平菇( p l e u r o t u ss p ) 、香菇( l e n t i n u se d o d e s ) 等2 0 0 多个品系，黄孢原毛平革菌 ( p h a n e r o c h a e r t ec h r y s o s p o r i u mb u r d s a l ) 是白腐真菌研究的模式菌种【2 7 】。 1 3 1 白腐真菌的特性 白腐真菌菌丝体通常为多核，少有隔膜，没有锁状联合，多核的分生孢子通常为异核， 担孢子是同核体，存在同宗配合和异宗配合两种交配系统【2 8 1 。白腐真菌通过分泌非专一性 的木质素降解酶系以单电子氧化、共代谢及脂肪过氧化等途径进行降解活动【2 9 1 。 白腐真菌在氮、碳、硫等营养物限制条件下能产生特殊的酶系，包括漆酶，木质素过 氧化氢酶和锰过氧化氢酶等，这些酶能有效降解各种异生物质。白腐真菌降解这些污染物 的关键在于其分泌的这些独特的胞外酶及其自由基降解机制，这种以自由基为基础的链反 应过程具有高度非特异性和无立体选择性，而且酶与底物是非一对一的关系，因此使得白 腐真菌具有非专一性、广谱性、细胞外性等特点 3 0 l 。 1 3 2 漆酶研究进展 白腐真菌对木质素和许多异生物质的降解，依赖一些酶的产生和分泌【2 7 1 。漆酶是一类 广泛分布于白腐真菌中的含铜多酚氧化酶【3 1 1 ，在白腐真菌木质素降解酶系统中，漆酶可在 碳和或氮存在条件下由菌体分泌【3 2 1 。 漆酶的催化中心由分工不同的三型铜组成：i 型铜催化电子传递，型铜活化分子氧， 型铜为铜二聚体主要吸收氧【3 3 1 。漆酶的i 型铜原子与氨基酸残基结合成为单核中心，从 而使酶表现为明显的蓝色，另外它还包含i i 型与i i i 型铜原子构成3 核中心。i 型铜原子是 初级电子的接受者，它参与分子内的电子传递，从而把电子从底物传递到其他铜原子上， 然后电子结合于3 核位点，该位点进一步把电子传递给结合到活性中心的第二底物氧分子， 武汉科技大学硕士学位论文第5 页 使之还原为水，同时底物成为自由基( 如图1 3 ) 。漆酶的适宜反应温度较低，酸性p h 值条件下催化效率较高，可作用的底物范围广泛，涉及的底物主要包括多酚、甲氧基替代 酚、芳香胺、苯硫醇、聚甲氧基苯及其它容易氧化的化合物3 5 1 。 图1 3 漆酶活性单元催化作用示意图 f i g 1 3t h ec a t a l y s i ss c h e m e so fl a c q u e re n z y m ea c t i v i t yu n i t 漆酶具有3 个铜离子结合位点，共结合有4 个铜离子【3 6 1 。漆酶的催化反应机理主要表 现为漆酶分子中四个c u 离子的协同作用和底物自由基中间体的生成，整个反应过程中需 要连续的单电子氧化来充分还原漆酶，然后还原态的酶分子再通过四电子来转移传递给分 子氧【3 7 1 ，同时底物形成自由基，它们或自身结合或相互偶联，形成聚合物或者偶联产物【2 9 1 。 白腐真菌漆酶的应用途径和领域相当广泛，现在已经成为多种工业废物处理研究中的 重要领域。漆酶能加剧五氯苯酚及其衍生物的降解【3 8 】，可以使多环芳烃几乎完全矿化【3 9 】， 能使氯代农药彻底分解】。漆酶广泛的应用于印染和造纸等工业燃料废水的研究中，对纺 织染料和造纸废水的脱色和降解效果显著【4 卜4 ”。漆酶在食品工业中也被广泛应用，处理啤 酒、果汁、葡萄酒等饮料中含有的酚或芳胺类物质】。漆酶由于自身的结构和生化特点， 因此在生物技术及环境保护方面有着广阔的应用前景。 1 3 3 白腐真菌生物降解的优点 白腐真菌独特的降解机制使其具备对各种各类化学物质的广谱而高效的降解能力，因 此白腐真菌也具备了有别于其他生物体系的优点。 ( 1 ) 不需经过特定污染物的预条件化【4 5 1 。白腐真菌降解系统的诱导与底物总体上是无 关的，它依靠营养限制( 主要是氮) 开启动降解过程。 ( 2 ) 动力学优势。白腐真菌通过自由基过程对化学物质进行转化，化学物质的降解遵 循的一般是准一级动力学。 ( 3 ) 对其他微生物的拮抗。白腐真菌产生的氧自由基氧化其他微生物的蛋白质、d n a ， 导致它们死亡。白腐真菌利用质膜上的氧化还原系统使其保持着一种竞争上的优势【2 7 】。 ( 4 ) 细胞外降解特征。白腐真菌降解系统的关键组分存在于细胞外，这使系统可以产 生非常强的有效氧化性物质( 如v a + 和o h ) ，而不构成对细胞的毒害。此外，有毒化学 物质也不必先进入细胞内再被代谢，这样真菌既能降解不溶性的化合物，也能降解有毒污 染物【2 刀。 ( 5 ) 降解底物的非专一性。白腐真菌的非特异性降解机制，使它们不仅能降解这种结 构不同的化学物质，甚至连杂酚油、芳氯物这样的化学物质的混合物也能被降解直至 第6 页武汉科技大学硕士学位论文 c o j 蚓。 ( 6 ) 对营养物的要求不高。白腐真菌能利用像木片、木屑、剩余谷物、农业废弃物等 廉价的营养源就可以有效的培养。 ( 7 ) 适用于固、液两种体系。白腐真菌可广泛地在土壤污染与水污染体系中起降解作 用。 1 4 本课题提出思路、研究意义、主要内容及创新点 1 4 1 课题提出思路 本课题中氮杂环化合物所处的环境体系为土壤环境，土壤作为大气、水体及固体废弃 物中的污染物在环境中迁移、滞留和沉淀的目标，是长期环境污染物的承受者【4 丌，土壤环 境具有多介质、多组分、多界面、非均一性和复杂多变的特点，这些特点导致了土壤的污 染不同于大气环境和水环境污染，从而使得土壤污染具有隐蔽性和滞后性、累积性与地域 性、不可逆转性及治理难而周期长的特点【玎】。污染土壤的这些特点导致对土壤中氮杂环化 合物降解修复产生一定的难度。 白腐真菌是自然界极其宝贵的生物资源，建立在独特的降解机制之上的白腐真菌对各 类化学物质具有广谱而高效的降解能力，白腐真菌在土壤污染控制中的研究和开发，要比 对水污染的控制，更接近污染发生地的现实环境，更可望实现工业化和工程化【2 7 】。白腐真 菌在污染土壤的治理方面已经展开了一些研究，在多环芳烃、五氯酚等污染的土壤中接种 白腐真菌，都取得了较好的治理效果。本课题组在前期研究中，探讨了白腐真菌在液体培 养条件下对单基质氮杂环化合物的去除效果及降解机理，研究了白腐真菌在共基质氮杂环 化合物体系中的降解情况，已经取得了一定的研究成果【2 5 1 ，试验表明白腐真菌降解氮杂环 化合物具有可行性。基于以上研究基础，本课题展开了白腐真菌对氮杂环化合物污染土壤 的修复研究。 1 4 2 研究意义 近年来，污染土壤修复的研究已成为国际上环境工程等相关专业的学科i ； 沿和重要研 究内容，污染土壤修复技术得到迅速发尉4 8 5 0 1 。对于由氮杂环化合物引起的土壤污染的环 境问题，采用常规的物化方法进行土壤修复效果不太理想，而生物修复技术被国内外专家 认为是最具生命力的环保方法及研究热点。 白腐真菌是自然界生态系统的一部分，是具有特殊功能的生物类群，结合污染土壤治 理的严峻形势，开发白腐真菌及其技术具有积极的现实意义。研究白腐真菌对模拟土壤中 氮杂环化合物的生物修复，能为研究其他人工合成化合物造成的土壤污染提供生物修复方 面的有益启示。 武汉科技大学硕士学位论文第7 页 1 4 3 研究的主要内容 ( 1 ) 培养环境对白腐真菌p l e u r o t ss p 降解土壤中喹啉和吲哚的影响研究 考察的具体环境因素包括接种量、含水率、土壤p h 等。通过单因素试验测定白腐真 菌对模拟土壤中喹啉和吲哚的降解情况，以获得喹啉和吲哚降解的最佳环境条件。 ( 2 ) 白腐菌p l e u r o t ss p 的生物学属性与土壤中的喹啉和吲哚的代谢过程的关系 在喹啉和吲哚的代谢过程中，白腐真菌的酶活活性起着至关重要的作用，通过对降解 过程中漆酶活性监测，确定白腐真菌p l e u r o t ss p 在土壤环境中生物学属性，并对土壤中喹 啉和吲哚的降解机理进行初步探讨。 ( 3 ) 共代谢条件下白腐真菌对喹啉和吲哚的降解过程中的作用形式 本课题采用喹啉和吲哚作为共代谢物质。通过白腐真菌对模拟土壤中同时存在喹啉和 吲哚时降解情况研究，考察喹啉和吲哚间的相互作用关系。 1 4 4 论文创新点 国内外研究学者多采用筛选出高效降解菌株降解土壤中的氮杂环化合物，本课题采用 白腐菌p l e u r o t ss p 对氮杂环化合物污染土壤进行降解研究，为微生物降解土壤中的氮杂环 化合物研究提供一种思路。 第8 页 武汉科技大学硕士学位论文 2 1 实验试剂与仪器 2 1 1 实验试剂 第二章实验材料与方法 表2 1 实验试剂 t a b 2 1c h e m i c a l s 2 1 2 仪器与设备 实验所用仪器与设备列于表2 2 所示。 武汉科技大学硕士学位论文第9 页 表2 2 仪器与设备 t a b 2 2e q u i p m e n t sa n da p p a r a t u s 2 3 喹啉污染土壤的制备 配制喹啉标准贮备液3 0 0 m g u ，称取高岭土3 0 9 于15 0 m l 锥形瓶中，取5 0 m l 标准贮 备液加入锥形瓶中，混合均匀后放在阳台自然风干后备用。土壤受喹啉污染程度为0 5 r a g 喹啉鹰高岭土。 2 4 吲哚污染土壤的制备 配制吲哚标准贮备液3 0 0 m r d l ，称取高岭土3 0 9 于1 5 0 m l 锥形瓶中，取5 0 m l 标准贮 备液加入锥形瓶中，混合均匀后放入阳台自然风干后备用。土壤受吲哚污染程度为0 5 m g 吲哚儋高岭土。 2 5 测定方法 2 5 1 土壤中喹啉的测定方法 取烘干后的土样l g ，加入1 0 m l 无水乙醇，摇匀后超声萃取3 0 m i n ，然后于3 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，采用紫外分光光度计测定上清液中的喹啉在3 1 3 n m 处的吸光值。实验测得喹 啉的平均回收率为9 0 8 。 2 5 2 土壤中吲哚的测定方法 取烘干后的土样l g ，加入l o m l 无水乙醇，摇匀后超声萃取3 0 m i n ，然后于3 0 0 0 r r a i n 离心l o m i n ，采用紫外分光光度计测定上清液中的吲哚在2 7 0 n m 处的吸光值。实验测得吲 哚的平均回收率为9 1 5 。 第1 0 页武汉科技大学硕士学位论文 2 5 3 土壤p h 的测定 采用电位测定法测定土壤的p h 值【5 1 1 。称取烘干后的土样l g ，加入5 m l 蒸馏水，搅拌 1 m i n 使土体充分散开后静置1 h ，测定上清液的p h 即为土壤的p h 。 武汉科技大学硕士学位论文 第1 1 页 3 1 菌种的来源及培养 3 1 1 菌种来源 第三章白腐真菌的生物学性质研究 白腐真菌，侧耳属p 昆u r o t u s 触纰。购自广东省微生物菌种保藏中心。 3 1 2 白腐真菌的保种 马铃薯培养基的制备：土豆去皮2 0 0 9 ，切条状，加入1 0 0 0 i i l l 水煮沸2 0 m i n 后，纱布 过滤土豆，滤液加2 0 9 葡萄糖、3 9 k h 2 p 0 4 、1 5 9 m 9 5 0 4 7 h 2 0 、8 m g v b l 、2 0 9 琼脂( 琼脂 可先单独在烧杯中加热溶化) ，倒入1 0 0 0 i i l l 烧杯中，加水补充至1 0 0 0 i i l l 后再加n a o h 和 h c l 调p h 至6 。将培养基通过漏斗分装在各试管中，用棉花和报纸封口包扎，置于不锈钢 双层立式蒸汽压力消毒器中于1 2 1 0 c 湿热灭菌3 0 m i n ，取出试管后摆放斜面，待马铃薯培 养基完全凝固后保存在冰箱中备用。 挑取一小块购置的菌种在已灭菌( 1 2 1 。c 下灭菌3 0 i i l i n ) 的斜面培养基( 马铃薯培养 基，见表3 4 ) 上培养，于恒温培养箱中3 0 0 c 下培养7 天。 表3 4 马铃薯培养基 t a b3 4p o t a t om e d i u m 组分 含量( 1 0 0 0 m l ) 马铃薯 葡萄糖 琼脂 磷酸二氢钾 硫酸镁 维生素b 1 2 0 0 2 0 2 0 3 1 5 0 0 0 8 3 1 3 人工合成培养基制种 准确称取人工合成培养基的试剂溶于1 0 0 0 1 1 1 l 烧杯中，分装在2 5 0 m l 三角瓶中，装液 量为1 0 0 m l ，采用纱布和报纸包扎封口，湿热灭菌3 0 m i n ，灭菌后放入冰箱中备用。 将己长满真菌的斜面菌种用接种钩钩取小块的菌种，接种到人工合成培养基中，放入 双层恒温振荡器中，于3 0 0 c ，1 5 叽m i n 摇床上培养7 天。 第1 2 页武汉科技大学硕士学位论文 表3 5 人工合成培养基 t a b3 5s y n t h e t i cm e d i u m 组分 含量( g 1 0 0 0 m l ) 葡萄糖 酒石酸按 磷酸二氢钾 磷酸氢二钾 硫酸镁 硫酸亚铁 氯化钙 硫酸锰 氯化钠 硫酸锌 硫酸铜 维生素b l 3 1 4 天然培养基制种 土豆去皮2 0 0 9 ，切条状，加入1 0 0 0 m l 水煮沸2 0 m i n 后，纱布过滤土豆，滤液加2 0 9 葡萄糖，加水至1 0 0 0 m l ，溶解均匀后分装在2 5 0 m l 三角瓶中，装液量为1 0 0 m l ，纱布和 报纸封口包扎，湿热灭菌3 0 m i n ，灭菌后放入冰箱中备用。 将己长满菌的斜面菌种用接种钩取小块的菌种，接种到天然培养基中，放入恒温振荡 器中，于3 0 0 c ，1 5 0 r m i n 摇床上培养7 天。 表3 6 天然培养基 1 h h3 6n a t u r a lm e d i u m 组分含量( g 1 0 0 0 m l ) 马铃薯 葡萄糖 2 0 0 2 0 3 2 菌种接入底物时间 选择在菌种接入液体培养基后的第六天，以防止底物的毒性抑制孢子的萌发、菌丝的 生长和酶的合成及活性等【2 7 1 。在白腐真菌接种的污染土壤反应体系中，底物的接入时间， 可以根据底物的毒性大小酌情考虑。 3 3 菌种基本特性测定 3 3 1 酶液制备 液体培养基通过纱布直接过滤，滤液即为粗酶液。 o j m j j鸺叭毗吆毗 ，o m 0 0 m 仉c ；c ；m 武汉科技大学硕士学位论文第1 3 页 3 3 2 漆酶酶活测定 反应在2 5 0 c 3 0 0 c 下进行，分别取i m l 的o 5 m m o u l a b t s 和i m l 的o i m o l l 醋酸 钠缓冲液( p h 5 o ) ，再添加i m l 酶液启动反应。在4 2 0 n m 下测定吸光值的变化。酶的单 位定义为每分钟氧化i p m o l a b t s 的酶量( e = 3 6 0 0 0m 1 l 锄。1 ) 1 5 2 。酶活单位：每i m i n 氧化ip m o l a b t s 所需酶量为l u 。 3 3 3 白腐真菌中漆酶活性的测定 白腐真菌分别在人工合成培养基和天然培养基中连续培养十天，恒温摇床温度控制为 2 5 。c 3 0 。c ，转速为1 5o r ：m i n ，人工合成培养基和天然培养基的p h 值均为6 0 ，每天定时 分别取粗酶液1 0 m l ，采用a b t s 法测定漆酶活性。白腐真菌在人工合成培养基和天然培 养基中分泌漆酶的变化曲线如图3 1 、图3 2 ，图中样品l 和2 均为平行样。 图3 1 人工合成培养基中白腐真菌分泌漆酶的变化情况 f i g3 1c h a n g e so fl a e e a s ea c t m t yo fw h i t er o tf u n g ii ns y n t h e f i em e d i u m 由图3 1 可知人工合成培养基中的白腐真菌的生长规律和分泌漆酶的能力呈负相关关 系，在接入白腐真菌的第一天，漆酶的活性最高达2 9 9 u l ，随着白腐真菌的生长，在第一 天到第五天之间，漆酶活性迅速降低，第五天的漆酶活性降至1 4 4 u l ，随后的五天，漆酶 的活性趋向相对稳定状态，酶活在1 6 3 u l 和1 2 5 u l 之间。微量元素c u 、f e 、z n 、m n 等，往往是酶的活性基组成成分，或者是酶的诱导剂，对酶活有很大的影响，其中对漆酶 活性最重要的的影响是c u 2 + ，很多研究都证实了c u 2 + 对漆酶分泌有很大的促进作用【5 3 丹】， 并且在c u 2 + 存在的前提下m n 2 + 对漆酶的分泌也有重要影响【5 5 】，k + 、z n 2 + 等离子均可提高 漆酶活性【5 6 1 。人工合成培养基中的微量元素为白腐真菌的漆酶分泌提供了有利保证，随着 白腐真菌的生长和能量消耗，培养基中的微量元素逐渐减少，从而使得白腐真菌对漆酶的 分泌减少，故人工合成培养基中的白腐真菌分泌漆酶动力学曲线呈现图3 1 中的趋势。 一1n)掣蜒溢缝壬醐称辩镁如h 第1 4 页武汉科技大学硕士学位论文 白腐真菌作为高等的腐生真菌，在生长过程中需要复杂成分的生长因子或生长调节剂 【5 7 1 ，而人工合成培养基难以有效的提供全面的营养成分。因此生长因子的缺乏使得白腐真 菌在人工合成培养基中处于一定的生态压力中，从而限制了其生长速度和分泌漆酶的能 力。 o 已 划 ! g 罐 媸 壬 醐 糠 鸳 h 图3 2 天然培养基中白腐真菌分泌漆酶的变化情况 f i g3 2c h a n g e so fl a c c a s ea c t i v i t yo fw h i t er o tf u n g ii nn a t u r a lm e d i u m 由图3 2 可知天然培养基中白腐真菌的生长规律和分泌漆酶的能力类似。在接入白腐 真菌后的前五天，白腐真菌迅速生长，漆酶的活性迅速增高，漆酶活性在第五天时达到最 高，为4 4 4 0 u l ，随后的五天，漆酶的活性开始降低并趋向相对稳定状态，酶活在3 0 2 2 u l 到1 9 9 5 u l 之间。在尹艳丽【5 8 】的研究中，结构和成分复杂的天然培养基能更好地诱导漆酶 分泌，并为白腐真菌提供生长的初级能源和能量，从而促进白腐真菌的生长和漆酶的分泌。 综合图3 1 和图3 2 可以看出，在培养方式相同的情况下，白腐真菌产漆酶的能力与 培养基的种类和成分直接相关，白腐真菌在天然培养基中产漆酶的能力明显高于在人工合 成培养基中产漆酶的能力。 3 3 。3 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝g 2 5 0 染色法。 ( 1 ) 蛋白质标准曲线的绘制【5 刿 准确称取1 0 0 r a g 牛血清清蛋白，溶于1 0 0 m l 蒸馏水中，即为1 0 0 0 i t g m l 的原液。称 取o 1 9 考马斯亮蓝g 2 5 0 溶于5 0 m l9 0 乙醇溶液中，再加入1 0 0 m l8 5 的磷酸，最后用 蒸馏水定容至1 0 0 0 m l 。分别吸取牛血清清蛋白原液0 、0 1 m l 、0 2 m l 、0 3 m l 、0 4 m l 、 0 5 m l 、0 6 m l 、0 7 m l 定容至1 0 m l ，得到牛血清清蛋白溶液分别为o 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、 5 0 、6 0 、7 0 l l g m l ，均取l m l 后再加入5 m l 考马斯亮蓝g 2 5 0 试剂，盖塞摇匀后以牛血 清清蛋白原液为0 的混合溶液为空白对照，分别测定其他各溶液在5 9 5 n m 处的吸光度，利 用e x c e l 对其进行线性拟合，绘制标准曲线，得到线性回归方程：y - - 0 0 0 5 2 x + 0 0 8 9 9 ， 武汉科技大学硕士学位论文第1 5 页 r 2 = 0 9 9 6 4 。 o 5 o 4 5 o 4 o 3 5 趔 ：擎0 3 娶 o 2 5 o 2 o 1 5 o 1 ol o2 03 04 0 5 0 6 07 08 0 蛋白质浓度( u g m l ) 图3 3 蛋白质标准曲线1 f i g3 - 3s t a n d e r dc u r v e1o fp r o t e i n 分别吸取牛血清清蛋白原液0 、0 1 m l 、0 2 m l 、0 3 m l 、0 5 m l 、0 6 m l 、0 7 m l 、0 9 m l 、 l m l 定容至1 0 0 m l ，得到牛血清清蛋白溶液分别为o 、1 、2 、3 、5 、6 、7 、9 、1 0 t t g m l ， 均取l m l 后再加入5 m l 考马斯亮蓝g 2 5 0 试剂，盖塞摇匀后以牛血清清蛋白原液为0 的 混合溶液为空白对照，分别测定其他各溶液在5 9 5 n m 处的吸光度，利用e x c e l 对其进行线 性拟合，绘制标准曲线，得到线性回归方程：y = 0 0 0 7 7 x - 0 0 0 2 3 ，r 2 = o 9 9 8 4 。 o 0 8 o 0 7 o 0 6 趔0 0 5 掣0 0 4 螫o 0 3 o 0 2 0 0 l o o2468 l ol z 蛋白质浓度( u g m l ) 图3 4 蛋白质标准曲线2 f i g3 4s t a n d e r dc u r v e2o fp r o t e i n ( 2 ) 白腐真菌中蛋白质含量的测定 白腐真菌分别在人工合成培养基和天然培养基中连续培养十天，每天定时分别取粗酶 液1 0 m l ，另取1 0 m l 蒸馏水作空白样，均加入5 m l 考马斯亮蓝g - 2 5 0 试剂，盖塞摇匀后 以空白做对比测定各溶液在5 9 5 n m 处的吸光度，如图3 5 0 第1 6 页武汉科技大学硕士学位论文 召 3 删 钿 肾 皿 嘲 图3 5 人工合成培养基与天然培养基中自腐真菌蛋白质含量的变化情况 f i g3 5c h a n g 姻o fp r o t e i nc o n t e n to fw h i t em tf u n 酉i l is y n t h e f i cm e d i u ma n dn a t i l r a lm e d i u m 由图3 5 中可以看出，天然培养基中粗酶液中的蛋白质含量随白腐真菌的生长而逐渐 升高，接入白腐真菌的第一天时，粗酶液中的