（微生物学专业论文）链霉菌45＃的研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对论文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明，本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：翅亟日期：丝! ：! ：! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅或借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后遵守此规定) 论文作者躲堑鸯翩魏奎蹈 日期：吐盟 山东夫学硕l 学位论文 摘要 本文对一株土壤中筛选出的可以产抗菌活性物质的链霉菌进行了研究，测定 了该菌的抗菌谱；发现该菌株对多种植物病原性真菌及细菌均有拮抗作用。通过 形态特征、培养特征、生理生化特性及抑菌谱等系列比较，发现该链霉菌菌株与 链霉菌属的黑胡桃链霉菌( s t r e p t o m y c e sn o g a l a t e r ) 的特征基本相符；通过1 6 s r 刚a 序列比对，发现该菌株1 6 sr d n a 与黑胡桃链霉菌的1 6 sr d n a 同源性达9 9 。根据多项分类原则和系统进化树的构建分析，将该菌株暂归入黑胡桃链霉菌 类。 为了选育链霉菌4 5 # 高产抗菌活性物质的菌株，利用各种理化因子进行诱变。 通过紫外线加氯化锂( u v + “c 1 ) 复合诱变得到高产菌株u v 1 0 、u v 一4 2 ； 通过硫酸二乙酯诱变得到高产菌株d e s 一1 7 、d e s - - 3 4 、d e s 一4 l 。 另外，对链霉菌4 5 # 所产的抗菌活性物质进行了性质分析，测定其对温度、 紫外线、p h 值的稳定性；利用p h 纸色谱、捷克八溶剂系统纸色谱等方法对生 物活性物质的水溶性、离子特性等性质进行了研究，结果表明该物质为强碱性、 极性较强、弱水溶性、强酯溶性，对温度、紫外线及p h 值较稳定。对其理化性 质的初步分析，为分离提取该物质提供了一定的理论依据。 鉴于链霉菌4 5 # 所产活性物质的抗菌广谱性及其高活性等优点，该菌具有潜 在的、重要的应用价值，有望丌发为一种新的农用抗生素。 。 关键词：黑胡桃链霉菌，链霉菌4 5 # ，分类鉴定，1 6 sr d n a 序列测定，系统 树构建，抑菌活性，紫外线+ l i c l 诱变，硫酸二乙酯，分离纯化 4 山穿七学确f 。学位论史 a b s t r a c t t h es t r e p t o m y c e ss t r a i n4 5 # ，w h i c hw a si s o l a t e df r o ms o i lc a np r o d u c e b r o a d s p e c t r u ma n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e sw i t hh i g ha c t i v i t i e s a n a l y s i so n t h e s ea n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e ss h o w e dt h a tt h e yh a v en o t a b l ea n t a g o n i s t i c e f f e c t s0 np h y t o p a t h o g e n sa sw e l la ss o m eb a c t e r i a ，b u tu n c o n s p i c u o u so n f u n g ic o m p a r a b l y as i m i l a r i t yo fb a s i cp r o p e r t i e sb e t w e e ns t r e p t o m y c e s s t r a i n4 5 # a n ds t r o p t o m y c e sn o g a a t e rw a sp r o v e db yas e r i e so fc o m p a r e o ft h em o r p h o l o g i c a l ，c u l t u r a lc h a r a c t e r i s t i c ，t h ep h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lp r o p e r t i e s t h er e s u l t se x h i b i t e dt h a tt h eh o m o l o g yo f1 6 sr d n a b e t w e e nt h e s et w os t r a i n sr e a c h e d9 9 ap h y l o g e n e t i ct r e ew a s c o n s t r u c t e db y c o m p a r i n g w i t hs o m ec o r r e l a t i v e p u b l i s h e d 1 6 sr d n a s e q u e n c e s a c c o r d i n gt ot h em u l t i c l a s s i f i c a t i o np r i n c i p l ea n d t h e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，t h es t r e p t o m y c e s s t r a i n4 5 # s h o u l db en o m e n c l a t u r e d a ss t r e p t o m y c e sn o g a l a t e r t oc u l t u r ea n t i b i o t i co v e r p r o d u c i n gs t r a i n s ，t h es t u d yi n c l u d eu s i n g d i f f e r e n tp h y s i c a la n dc h e m i c a lf a c t o r st oi n d u c es t r e p t o m y c e ss t r a i n4 5 # t om u t a t i o n a f t e ro r i g i n a ls t r a i nw e r em u t a g e n s i s e db yu vc o m b i n e dl i c l a n dd e s ，5 h i g h y i e l ds t r a i n sw e r eo b t a i n e d u s i n go x f o r dp l a t ea s s a y m e t h o d ，t h ea n t i b i o t i ce f f e c tm e a s u r e db yt h ed i a m e t e ro fa n t i b i o t i cc i r c l e o f m u t a t i o n a ls t r a i n si n c l u d i n gu v 一1 0 、u v 一4 2 、d e s 一1 7 、d e s - - 3 4 、d e s - - 4 1 a tt h es a m et i m e ，t h ee f f e c t so fh e a t ，p ha n du vo nt h es t a b i l i t yo ft h e b i o a c t i r es u b s t a n c ei nt h ef e r m e n t e db r o t hw e r es t u d i e d t h ew a t e r s o l u b iii t ya n di o nc h a r a c t e ro ft h ea n ti b i o t i c sw e r ea n a l y s i z e db yp hp a p e r c h r o m a t o g r a p h ya n dt h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e s t r o n g l ya l k a l e s c e n c e ，h i g h l y p o l a r i t ya n t i b i o t i c sw e r es t a b l et oh e a t ，p h a n du v ，a n dc a nh ed is s o l v e di no r g a n i cs o lv e n te a s il y ，b u th a r di nw a t e r r e a t i v e ly t h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h eh i g h 5 坐奎苎兰竺! ：兰堡堡皇 a c t i v i t ya n t i b i o t i cs u b s t a n c e sw e r es t u d i e di no r d et op r o b i d es c i e n t i f i c b a s i sf o rt h ef u r t h e ri s o l a t i o na n dp u r if i c a t i o n i na 1 1 s t r e p t o m y c e ss t r a i n4 5 # c a np r o d u c es t a b l ea n db r o a ds p e c t r u m a n t i b i o t i cs u b s t a n c e ，s oi t sah o p e f u la n t i b i o c i c sp r o d u c i n gb a c t e r i u m t h a ti t sa n t i b i o t i cs u b s t a n c ew i l lb ev a l u eo fp o t e n t i a la p p l i c a t i o ni n a g r i c u l t u r e k e y , o r d s ：s t r e p t o m y c e sn o g a a t e r ,s t r e p t o m y c e s s t r a i n4 5 # c l a s s i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n ，1 6 sr d n as e q u e n c e ，p h y l o g e n e t i ct r e e ， a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y ，u v + l i c im u t a t i o n ，d e s ，i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n 山东人学硕f 学位论文 1 农用抗生素概述 第一章前言 抗生素是一个低分子量的代谢产物，分子量约在1 5 0 - 5 0 0 0 之间，由碳、氢、 氧、氮、硫、磷或卤族元素组成( 王以光，1 9 9 8 ) ，是生物，包括微生物、植物、 和动物在内，在其生命活动过程中的所产生的( 或由其它方法获得的) 能在低微浓 度下有选择地抑制或影响它种生物功能的有机物质( 顾觉奋等，2 0 0 1 ) 。农用抗生 素是指由微生物生命活动过程中产生的对微生物、昆虫、炳类，线虫、寄生虫， 植物等其他生物在很低浓度下显示特异性药理作用的天然有机化合物( 周启等， 1 9 9 0 ) ，是抗生素在农业领域的应用，根据其应用范围可分为杀菌剂、杀虫剂、 除草剂等。抗生素的分类方法多种多样，一般按照化学结构分类，即把具有相同 基本化学结构的天然或化学半合成的抗生素分成一类，包括( i ) v 一内酰胺类 如青霉素、头孢霉素及它们的衍生物：( 2 ) 氨基糖苷类，如链霉素、春雷霉素、井 冈霉素、卡那霉素、庆大霉素：( 3 ) 四环素类如四环素、土霉素、金霉素：( 4 ) 大 环内脂类，如四抗菌素、泰乐菌素、阿维菌素；( 5 ) 多肽类，如放线菌素、多粘菌 素：( 6 ) 多醚类，如盐霉素、莫能菌素：( 7 ) 核苷类，如杀稻瘟菌素s 、多氧霉素、 庆丰霉素。 农用抗生素的抗菌作用机理大致可归纳为以下几种：( 1 ) 抑制病原菌细胞壁 合成，如作用于真菌细胞壁合成的多氧霉素d 与几丁质合成酶的底物l j d p n 一乙 酰葡萄糖胺结构相似，能竞争性地和几丁质合成酶结合，从而抑制该酶活性，抑 制真菌细胞壁的合成( h o r ie ta l ，1 9 7 4 ：c a b i b ，1 9 9 1 ) ( 2 ) 干扰菌体细胞膜功 能，作用方式又分为破坏细胞膜超微结构，造成细胞内成分流失和作为特异离子 运载体影响细胞内外离子的正常交换两种( 孙延忠等，2 0 0 3 ) 。前者如多烯类抗生 素制霉菌素( n y s t a t i n ) 、两性霉素b ( a m p h o t e r i c i nb ) 等，能选择性地与真菌 细胞膜中的麦角幽醇结合，导致细胞膜渗透性改变，引起细胞内成分外渗( 徐铮 等，2 0 0 1 ) 。后者如短杆菌肽a ( g r a m ic i n d i l 3a ) 等能结合并运转特定的阳离子通 过双脂膜，充当膜上的离子载体影响细胞内外离子的破常交换，导致细胞& 失 山东夫学硕卜学位论文 调节渗透的能力( 孙延忠等，2 0 0 3 ) ( 3 ) 抑制蛋白质合成，t a n a k a 等研究表明杀稻 瘟菌素s ( b l a s t i c i d i n s ) 通过抑制稻瘟病菌( p y r i c u l a r i ao r y r a e ) 肽基转移酶 抑制肽链延伸而抑制菌体蛋白质的合成( 蒋细良等，1 9 9 4 ) ( 4 ) 作用于能量代谢 系统，抗霉素a ( a n t i m y c i na ) 抑制细胞色素b 与细胞色素c 之间的电子传递，阻断 了呼吸链上的电子传递( b o w y e r t r u m p o w e r ，1 9 8 1 ) ( 5 ) 作用于核酸合成，研 究表明扶黄霉素( g r i s e o f u l v i n ) 能抑$ | j 4 c - 尿嘧啶和胸腺嘧啶掺入核酸。干扰真 菌细胞d n a 的合成，从而抑制真菌生长( b a n i c & l u n d e r ，1 9 8 9 ) 7 ( 6 ) 提高植物抗病 力，井冈霉素a ( j i n g g a n g m y c i na ) 能增加水稻体内过氧化物酶和苯丙氨酸解氨 酶活性，降低海藻糖活性，过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性高低与井冈霉素防 治水稻纹枯病的效果呈正相关，与海藻糖活性呈负相关( 张穗，2 0 0 1 ) 。这类抗生 素通过提高植株自身的免疫抗病能力而起到防病作用。 2 农用抗生素的研究概况 植物病害是农业生产的大敌，据联合国粮农组织( f a o ) 统计，每年植物因 遭受病害造成的减产损失平均为总产量的1 0 1 5 。目前，防治植物病害的主 要手段为化学杀菌剂。但由于化学农药的大量使用，不仅带来了环境污染和对人 类健康的潜在危害，而且还带来了对非靶标生物的影响及植物病原菌抗性的发展 等问题，使得化学农药的发展受到了来自各方面的限制。寻找广谱、高效、低毒 的生物农药已成为科研人员及农药使用者的共识。其中，农用抗生素是研究的热 点之一。农用抗生素是由微生物产生的次级代谢产物，因其具有低毒、高效、选 择性强、残留时自j 短、无三致和无公害等特点，正闩益受到世界各国的重视，如 农用链霉素、井冈霉素、春日霉素等在植物病虫害防治上已广泛应用并做出了突 出贡献。 农用抗生素的研究始于2 0 世纪5 0 年代，是随医用抗生素之后发展起来的。 早期闩本、美国、英国等先后把链霉素、土霉素、狄黄霉素等医用抗生素用来防 治植物病害，d e k k e r ( 1 9 7 1 ) 等人相继报道了一批如放线菌酮( a c t i d i o n e ) ，抗霉素 a ( a c t i m y c i n a ) 以及一些多烯类农用抗生素。1 9 5 8 年同本成功研制出杀稻瘟菌素 - - s ( b l a s t i d i n s ) ，并于1 9 6 1 年大面积应用于稻瘟病的防治，基本上取代了有机 汞制剂在防治稻瘟病上的应用。杀稻瘟菌素的发现和工业化，使农抗的歼发研究 山东人学顾t 学位论文 进入了新时期。此后不久h a m a o ( 1 9 6 5 ) ，s u z u r i ( 1 9 6 5 ) 等又丌发了像春日霉素 ( k a s u g a m y e i n ) 、多氧霉素( p o l y o x i n ) 、有效霉素( v a l i d a m y c i n ) 那样的高效低毒无 公害的新农抗。同时，我国科研人员也研制丌发了一些抗真菌农用抗生素，如井 冈霉素、春雷霉素、农抗1 2 0 等，这些农用抗生素已在全国大面积推广使用。最 近，由于一些新技术尤其生物技术在农用抗生素研制中的利用，新的研究成果不 断涌现。 3 国内外农用抗生素的发展 日本是世界上第一个大规模生产农用抗生素的国家，在农用抗生素的研究和 应用方面一直处于世界前列。国际上农用抗生素研究比较有特色的5 个机构中， 日本占3 家，分别是明治制药、北里研究所和理化研究所( 朱昌雄等，2 0 0 0 ) 。二 十世纪五十至六十年代后期，日本率先研制成功了用于防治水稻三大病害( 稻瘟 病、纹枯病、白叶枯病) 的抗生素一杀稻瘟菌素s ，春日霉素、多氧霉素和有效霉 素，并实现了产品的工厂化生产，推动了世界农用抗生素的发展。此后研制出的 灭粉霉素、奈良霉素、灭孢素、四抗菌素、米尔比霉素及双丙氨麟在工业化生产 中都获得了成功。美国从二十世纪六十年代开始在食用动物的饲料中添加抗生 素，到九十年代作为饲料添加剂的农用抗生素已超过其它各种类型的农用抗生 素，与医用抗生素产量持平。青霉素、四环素、泰乐菌素、链霉素、螺旋霉素等 都曾作为饲料添加剂而使用，此后又将多种抗生素用于植物保护( m i s r a ，1 9 8 6 ) 我国的农用抗生素研究起步于二十世纪五十年代。尹萃耘先生1 9 5 3 年从陕西 径阳分离到对棉花黄萎病有一定作用的“5 4 0 6 ”菌株，揭开了我国农用抗生素研 究的序幕。2 0 世纪7 0 年代开发出防治水稻纹枯病的井冈霉素，2 0 多年来经久不衰， 近几年来年产量达3 0 0 0 - 4 0 0 0 n 屯，防治对象也扩大到小麦、玉米等作物的纹枯病 ( 沈寅初1 9 9 6 ) 。此后相继丌发和应用了农抗1 2 0 、公主岭霉素、多效霉素等农用 杀菌抗生素。进入2 0 世纪9 0 年代后，抗尘素的研究丌发进入一个新的研究发展高 潮，中生菌素、武夷菌素、宁南霉素等一大批抗菌素得到丌发，杀虫抗生素的研 究丌发也得到迅速发展，先后成功丌发了浏阳霉素、华光霉素，阿维菌素。纵观 农用抗生素发展的历史，有三件晕程碑忭质的事件。杀稻瘟菌素s ( b l a s t i c i d i n s ) 的发现是农用抗尘素发展过程中的第一块喂柠碑。产q i 荫为灰色链霉菌 9 山东大学硕f 学位论文 ( s t r e p t o m y c e s g r i s e o c h r o m o g e n e s ) ，1 9 5 8 年由同本s e t s u o 等人研制成功，1 9 6 1 年大面积用于稻瘟病的防治，取代了化学农药有机汞制剂在防治稻瘟病上的应用 ( 蒋细良，谢德龄。1 9 9 4 ) 。杀稻瘟菌素s 的发现和工业化使农用抗生素的开发研 究进入新时期。1 9 6 7 年莫能菌素( m o r k e n s i n ) 的发现是农抗发展史上的第二块里 程碑( b u r ge ta l ，1 9 7 9 ) 。产生菌为肉桂地链霉菌( s t r e p t o p y c e s c i n n m a o n e n s t 曲，由m i c h a e a le 等分离。莫能菌素对鸡的球虫病有很强的抑制 作用，1 9 7 8 年经美国f d a 批准作为畜用抗尘素大量生产，也是目前欧共体批准的 可用于饲料添加剂的四个抗生素之一。2 0 世纪7 0 年代末至8 0 年代初阿维菌素 ( a v e n n e c t i n ) 的发现是抗生素在农业领域应用的第三个里程碑。阿维菌素是由 阿维链霉菌( s t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i s ) 产生的一组结构相似的大环内脂类抗 生素，原始菌株由日本从日本静冈县的土样中分离出，该菌株后被送到美国默克 公司( m e r c k ) 开发。阿维菌素对蜗类有很高的杀虫活性，对许多危害作物的昆虫 也有杀虫活性，杀虫范围广( f i s h e r ，1 9 9 1 ) 4 抗生素产生菌诱变育种的技术研究进展 诱变育种技术是最早在农用抗生素上应用的一种育种技术。它是通过物理、 化学因素作用于抗生菌，人为的使其遗传物质发生变异，从中选育高产菌株。由 于它操作简便，速度快、收效大而且诱变手段多样，所以是实验室及虫产上最为 常用的高产菌株的育种方式。当前，在农用抗生素生产上常用的诱变剂主要包括 以紫外线( u v ) 、x 射线( x - r a y ) 、y 射线( y - r a ”、快中子( f n ) 、c o 6 0 、激光等作 为诱变介质的物理诱变剂和以碱基类似物( 5 b u 、2 - a p 等) 、烷化剂( e m s 、d e s 等) 和吖啶类移码突变剂为主的化学诱变剂。另外近几年在微生物诱变育种领域 中新近发展的离子束注入诱变技术在农用抗生素育种上的应用也逐渐增多。由于 诱变育种操作简便、快捷，早期农用抗生素育种中主要采用此种方式。在很长一 段时间内为农用抗生素生产作出了很大的贡献。但长期使用诱变剂处理同一菌 种，由于突变的不定向性及突变的累积使得在获得高产的同时菌株在生活能力、 产孢量等方面会明显减弱。农用抗生素基因重组育种技术的发展使这一问题得以 解决。基因重组育种技术自1 9 4 6 年的大肠杆菌k 1 2 杂交试验成功以来，利用杂 交、转化和转导等遗传方法，经过基因蘑组获得具有多组合优良件状或多倍体的 1 0 山东人学锁卜学位论文 微生物菌种的技术，在微生物育种技术中一直占有相当重要的地位。经过近5 0 多年的发展，该技术己只趋成熟，发展为常规杂交育种和原生质体融合两种技术， 在生产上已经广泛的应用于细菌、放线菌及霉菌等的菌种选育。 4 1 抗生素产生菌诱变育种的目的 4 1 1 提高生产能力 从自然界分离到的抗生素产生菌的野生型菌株，生产能力通常很低，不能作 为生产菌种，但野生型菌种经过诱变选育后，生产能力往往可提高几十至几百倍。 例如：经过一系列的物化诱变处理，同时结合培养条件的优化，在4 0 多年内，青 霉素产生菌的生产能力3 0 0 多倍，达到了目前的6 0 0 0 0 8 9 0 0 0 u m l 。同时，在其他 抗生素( 如：链霉素、金霉素、地霉素等) 产生菌的选育中也取得了巨大成绩。 4 1 2 改善抗生素的品质 、 抗生素产生菌产生的抗生素，往往不是单一的，而是多组分的混合物。通过 诱变育种可将其中有毒的或活性弱的组分除去，同时也可增加有效组分或添加新 组分。柱晶白霉素产生菌的野生型菌株的菌丝有一定的毒性，四川抗菌素工业研 究所的孙益( 1 9 9 4 ) 等，利用常规理化因子对其进行诱变处理。结果不但改造了菌 株菌丝有毒性的不良性状，而且还使得发酵产品中主组分a 5 的含量显著提高。 小诺霉素是一种抗菌作用强，毒性底的广谱抗生素，但在刚投产时由于副组分含 量较高，该抗生素的品质受到了非常大的影响。后来经过多年的诱变育种及发酵 工艺调控，小诺霉素主组分的含量才逐步上升。 4 1 3 合成新的抗生素产品 诱变某些抗生素产生菌，去掉或改变抗生素母核上的某一功能团，可以得到 疗效更好的新品种，称之为突变生物合成( m u t a t i o n a ls y n t h e s i s ) 。如用亚硝基诱 变红霉素产生菌波赛链霉菌( r e p t o m y c e sp e u c e t i c u s ) ) = 舌获得一青色突变株能产生 新品种阿霉素。阿霉素是红霉素母核上1 4 位置的h 为轻基所取代，即1 4 轻基红霉 索。细霉索仅对自由病有效，而阿霉素对人类急性自咖瘸及多种实体瘤均有疗效。 山东人学倾f + 学位论文 通过诱变筛选还可以得到原抗生素母核上较复杂基团发生改变的新抗生素产生 菌。目酊，在氨基环醇类抗生素，如新霉素，庆大霉素和巴龙霉素生产菌的选育 中，正试图用所谓突变生物合成方法来达到这一目的。诱变筛选不能合成抗生素 某一组分的突变株，这类突变株只有在添加了它不能合成的组分时才能合成原抗 生素。由于次生代谢产物生物合成过程中，某些酶专一性不强，所以若添加的不 是合成原抗生素所需要的组分，而是其结构类似物，那么就有可能得到组入原抗 生素不同类似物的多种新抗生素。例如，诱变新霉素产生菌，得到一株不能合成 新霉素的一个组分2 一脱氧链霉胺的突变株，在它的培养液中加入不同的类似物 为前体，如链霉胺时，即可分别获得组入这些i j i 体的新抗生素。 4 1 4 改善抗生素产生菌的性状 通过诱变选育还可改善抗生素产生菌的某些特性，以适应生产上的设备和条 件，并可简化工艺条件，缩短发酵周期，增加设备以及原料的利用率。如土霉素 生产中选得了减少泡沫的变异菌株，从而提高了发酵罐的利用率；又如青霉素发 酵液中需要添加昂贵的苯乙酸或苯氧乙酸为前体，才能有效地合成青霉素g ，诱 变筛选氧化苯乙酸能力低，结合前体进入青霉素分子能力强的突变株，可大大提 高前体的利用率。 4 1 5 用于研究推测抗生素的生物合成途径 在研究抗生素生物合成过程和抗生素形成的遗传机制方面，抗生素产生菌的 诱变也是一种非常有效的手段。在研究抗生素的生物合成途径时，人们利用一些 常规的人工诱变方法，使抗生素产生菌失去产抗生素或其中自j 体的能力，就可分 离得到抗生素生物合成的各种不同障碍型突变株。这些突变株能够积累某种中间 代谢产物或支路代谢产物，从分析产生菌和突变株的代谢产物的化学结构上的差 异，找出这些代谢产物在合成过程中的相互关系，即可推断其生物合成的反应步 骤，再分离其反应中的特殊酶类，可判断其生化反应的特性。在这些突变株中， 抗生素阻断型突变株( 办被称为抗尘素零突变株) 便足常用的一种，它是指目标抗 生索分泌为零的突变株，历来都是判j 抗，j 三素! l 物合成途径有关基础理论研究的 好材料。例如顶头孢霹( c e p h a l o s p o r i u ma c r e m o n i u m ) 的头孢菌索c ( c p c ) ：i - 物合成 2 山东夫学硕t 学位论文 途径的阐述就是采用了若干这样的突变株。同时，零突变株如发生回复突变往往 能筛选到产抗生素能力大幅度提高的突变株，这种迂回跃进战略在抗生素高产菌 株的选育方面也是非常有效的途径。通过诱变育种便能得到这种突变体。 廖爱 芳( 1 9 9 6 ) 等对西索米星原生菌株t 一1 2 5 进行紫外线诱变后获得阻断型体绿色菌株 7 2 5 ，利用7 2 5 ，也对西索米星的生物合成途径进行了合理的推测。 4 1 6 与其他育种方法相结合 诱变育种与其他方法相结合起来，往往会使得育种效率大大提高。如：杂交 育种是将两个亲本的有利性状组合在一起而获得良种的育种方法。在杂交前先分 别诱变两个亲本，获得有利的突变型，然后再经杂交将有利的基因组合起来，比 起单纯地将原始亲本杂交更能得到理想的效果。除此之外，诱变还可获得各种类 型的突变株，除了可直接提高产量外，有的是遗传研究工作中不可缺少的标记菌 株，可应用于转化、转导、融合重组等i 同时，这些突变菌株也拓宽了微生物的 遗传种质资源，丰富了基因库的内容。 4 2 链霉菌诱变技术 4 2 1 紫外线诱变 紫外线不能引起电离，它的作用是使物质分子或原子中的轨道电子从基态跃 迁到激发态，紫外光子本身作为能量被物质吸收。由于其穿透性很弱，所以广泛 地用作微生物诱变剂。紫外辐射诱变的作用机制有很多解释，但较为确定的是紫 外辐射使d n a 分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基j 下常配对，并可能引起突变或死 亡。另外嘧啶二聚体的形成，还会妨碍双链的解丌，因而影响d n a 的复制和转 录。利用紫外诱变的方法选育出大量产量高，活性强的优良微生物菌种。周建琴 等用康乐霉素( k c ) 产生菌的自然突变株s t 9 1 为出发菌株，采用u v 诱变和自然选 育的方法，筛选出的突变株u 1 0s4 ，发酵效价比出发菌株提高4 6 0 多倍。随着原 生质体技术的发展，利用紫外线对原生质体直接诱变处理，能在较短时间较大幅 度地提高菌种的变异率。将红霉素产生菌红色链霉菌的原生质体用紫外线照射一 定的时i 玎j 后，筛选得到比对照菌株效价提1 9 2 2 5 8 的高产菌株h p 3 。紫外污变技 山东大学碗i 。学位论文 术是诱变和筛选优良菌株的常规育种方法。由于其设备简单，诱变效率高，操作 安全简便等特点而被广泛应用。此外，紫外诱变在核酸中往往造成比较单一的损 伤，所以在d n a 的损伤与修复研究中也有一定的意义。 4 2 2 电离辐射诱变 具有贯穿性能的电离辐射对细胞的作用是十分广泛和深刻的。辐射能量的吸 收和传递使细胞中精密组织的生物大分子产生激发和电离状态，特殊的生物结构 使电子转移和自由基链式反应得以进行，导致原初生化损伤。亚细胞结构损伤引 起酶的释放，代谢方向性和协调性的破坏促使原仞损伤进一步扩展。以下举两种 电离辐射作具体说明。 4 2 2 1 t 射线 y 射线与x 射线由光子组成，是间接电离辐射。一般具有较高的能量，能产 生高速运动的次级电子，因而直接或间接地改变d n a 结构。廖爱芳用青霉素、 超声波对庆大霉素产生菌棘孢小单孢菌2 3 1 8 的孢子进行预处理，再用6 0 c o 进行辐 射诱变，筛选出韵高产菌株7 9 、1 6 7 ，摇瓶发酵效价比亲株2 3 1 8 提高2 0 ，发酵 周期缩短l o d , 时，且生产能力稳定。魏赛金等采用不同剂量的6 0 c o 射线，对南昌 霉素产生菌一南昌链霉菌菌株的孢子进行处理，结果表明，3 万伦琴的诱变剂量 具有较好的诱变效应，连续四批摇瓶发酵试验突变株平均产量比出发菌株提高 5 0 以上。快中子也是间接电离粒子，快中子在组织内能量损失主要是通过与h 原子核等的弹性碰撞而产生的反冲质子使组织中的原子激发和电离，引起生物分 子中化学键的断裂。周延等利用紫外线、快中子、快中子和磁场复合、r 射线、 y 射线和磁场复合诱变，以酶活为筛子对产脂肪酶的菌株进行诱变育种，认为在 产脂肪酶菌株的诱变中快中子诱变更为有效。 4 2 2 2 离子束 重离子属带电粒子，能直接引起电离。重离子束与其它辐射( 如中子，电子、 x 射线、y 射线) 相比，在与尘物材料相匠竹j f j 中具有很好的诱变效应。例如： 应用低能n + 离子对柔红霉索产生诺i 进 ，离，t 辐照选育，获得了柔红霉素产抗尘素 4 山东人学顿十学位论文 能力提高1 5 倍的高产突变体，刘连碧等根据突变株在平板培养时所合成的红色蒽 环类物质扩散广的现象初步推断：可能是由于突变株细胞壁或细胞膜的通透性增 强，引起柔红霉素及其合成途径中的蒽环类中间体大量泄漏到培养基中，从而降 低了它们在细胞中的累积，减弱了对菌体生长的抑制作用，同时，也可能部分解 除了其整个生物合成代谢途径的反馈抑制，最终导致柔红霉素合成水平的提高。 颉红梅等用4 0 m 离子辐照庆大霉素产生菌绛红小单孢菌，所得突变株的正变率为 6 9 1 。除此之外，糖化酶生产菌、不饱和脂肪酸生产菌、维生素生产菌的离子 束诱变效果也得到充分肯定。 4 2 3 化学试剂诱变 化学诱变剂种类繁多，大致可以分三类。一类是在d n a 复制过程中能取代 正常的碱基；一类是改变静止中的d n a 碱基；一类是移码d n a 碱基。 第一类，碱基类似物如：5 一溴尿嘧啶、a 一氨基嘌呤( 2 - - 氨基嘌呤，5 一 氨基嘌呤) 。它们能在d n a 复制过程中渗入d n a 而不损坏它的复制能力，但是它 们的氢原子的分布与正常碱基不同，比正常的具有更大的不正确的配对倾向，因 此引起误义突变。5 一溴尿嘧啶是一种非天然的碱基类似物。它渗入到d n a 分子 中，必须有两个条件：一是天然碱基贫乏，二是在d n a 复制需要吸收外源碱基 以合成新的d n a 分予。这两个条件缺一不可。因此，此类诱变剂必须在创造天 然碱基贫乏的环境和菌体正处于生长繁殖过程时使用。 脱氨基诱变剂为第二类有：亚硝酸( h n 0 2 ) 羟胺( n h 2 0 h ) 等。亚硝酸能 直接与碱基起氧化脱氨基作用，因而，腺嘌呤脱氨基后成为次黄嘌呤，后者能与 胞嘧啶配对而取代腺嘌呤正常配对的胸腺嘧啶。胞嘧啶脱氨基后成为尿嘧啶，它 能与腺嘌呤配对，而取代胞嘧啶正常配对的鸟嘌呤。鸟嘧啶脱氨基后成为黄嘌呤， 它能与胞嘧啶配对，而取代鸟嘌呤正常配对的胞嘧啶。因为胸腺嘧啶( 以及r n a 中的尿嘧啶) 没有氨基，所以用亚硝酸处理时保持不变。羟胺只与胞嘧啶起反应， 使它只能与腺嘌呤配对，而不能与鸟嘌呤配对。 第三类大多数为烷化刺包括：氮芥( m m ) 、乙烯亚胺( e i ) 、硫酸二乙酯( d e s ) 、 甲基磺酸乙酯( e m s ) 、亚硝基胍( n t g ) 、亚硝堆甲基尿( n m u ) 。其主要生物 效应：( 1 ) d n a 交联( 2 ) 碱基缺失( 3 ) 引起染色体畸变( 4 ) 造成碱基对的转 山东大学硕卜学位论文 换或颠换。硫酸二乙酯( d e s ) 的作用机制主要是使d n a 的磷酸及碱基部分发生 烷基化作用，这样d n a 在复制时就产生错误，尤其是嘌呤类更容易发生烷化作 用。鸟嘌呤由于烷化作用，而使其与糖的结合键发生水解而解离，使嘌呤从d n a 中脱落下来，造成d n a 的缺损，进一步发生d n a 在复制的紊乱。 化学诱变育种的特点：与物理诱变相比，很多化学诱变剂产生了高比例的点 突变，低比例的d n a 畸变，而物理诱变由于以v 射线和x 射线为代表的电离辐射， 其穿透力较强，易被d n a 吸收，对d n a 结构具有很大的破坏性。化学诱变育种 具有以下特点：( 1 ) 诱变突变率较高，具有位点特异性；( 2 ) d n a 畸变的比例相对 较少，很少有致死型发生，对处理材料损伤轻；( 3 ) 化学诱变剂有迟效作用，即 诱变能引起生物学损伤和染色体断裂，但并不立即表现和断开；( 4 ) 存在残留药 物的后效作用，反应后对生物损伤大；( 5 ) 由于引起的突变范围广，后代选择需 要足够大的群体：( 6 ) 价格便宜，操作简单，不需要特殊设备。 4 2 4 诱变剂量的选择 对各种诱变剂的有效性( 诱变剂测定剂量对菌株的敏感性) ，更重要的是其 诱变率( 常用致死率作为微生物对诱变剂敏感性的生物参数) 。在诱变育种工作 中，用诱变剂的绝对剂量( 物理诱变剂的辐射量，化学诱变剂的浓度) 来评价有 效剂量不能直观反映诱变效果，因此常采用相对剂量，例如：致死率、形态突变 率、营养缺陷型出现率等来评价。任何诱变剂都有杀菌和诱变两方面作用，在一 般情况下，诱变处理后的细胞死亡率越高，活下来的细胞突变率也越高，故可用 致死率作为相对剂量。过去常用致死率为9 9 9 9 的剂量。而近年来多采用致死 率为7 0 一7 5 ，甚至更低的剂量。原因主要是：诱变剂的作用目的是通过提高变 异率和变异幅度，从而提高生产水平。因此，凡在高诱变率的基础上，既能扩大 变异幅度又能促进使变异向正变范围移动的剂量，就是合适剂量。在一定范围内。 诱变率往往随剂量增高而提高，但达到一定剂量后，再提高剂量反而会使诱变率 下降，许多实验表明，紫外线，x 射线和乙烯亚胺等因素的诱变效应，j 下变较多 的出现在偏低的剂量中，而负变则较多的出现于偏高的剂量中，在经多次诱变的 菌株中，更容易i 现负变。因此，现在普遍倾向于采用较低剂量柬进行诱变育种。 山东人学硕 学位论文 4 3 抗生素产生菌诱变育种的筛选方法 通过诱变处理，在微生物群体中会出现各种突变型的个体，但其中多数是负 变株，正变株所占比例极小，为在短时日j 内获得好的效果，必须设计和采用效率 较高的筛选方案及筛选方法。目i j 常用的筛选方法有随机筛选r r a l l d o ms e l e c t i o n ) 和推理选育( r a t i o n a ls e l e c t i o n ) 两种。 4 3 1 随机筛选法 随机筛选是抗生素产生菌的诱变育种中一直采用的方法，它是将菌种诱变处 理后，不加选择地随机挑选菌落，从中选出产量最高者进一步复试。这种筛选方 法较为可靠，但随机性大，需要进行大量筛选。如果突变机率很小，为了能够挑 选到优良菌株，就必须花费巨大的人力和时间，这就大大限制了筛选量，影响高 产菌株的筛出率。它主要包括以下几种。 4 3 1 1 表面培养筛选 这种筛选是以在固体培养基上生长的菌落进行的，基本可分两种方法：一种 是检测单个菌落的代谢产物分泌于培养基中形成的抑菌圈，或用一种能与菌落代 谢产物起颜色反应的化合物喷射鉴别形成的显色圈。根据抑菌圈或显色圈的大 小，可以初步判定筛选对象活性的高低，是一种初筛的方法。日本人八木( y a k 9 ) 在春雷霉素产生菌诱变处理后的筛选工作中采用了一种称之为琼脂块培养法的 方法，使得筛选的效率大为提高。高卫胜等利用此法选育林可霉素菌种亦取得了 很好的效果。另一种是把单个菌落分泌于培养基中的代谢产物洗脱到溶液中，然 后进行抗菌活力的测定。它比第一种费力，但准确性高。在生产实践中，这两种 方法常常结合在一起使用。 4 3 1 2 液体培养筛选 这是生产上一直使用的方法。它主要指将菌种诱变处理后挑选出的菌落接入 摇瓶进行发酵实验。这一方法筛选效果优于表面培养筛选，它i 叮以发计各种更接 近于乍产条什的工艺。例如，种了与发酵阶段的温度、通气、搅拌、补料和发酵 山东人学颀i 学位论史 培养过程的测定等等均可仿效生产工艺。同时，它的实际分辨力也高于固体表面 筛选。缺点是，它不能象固体表面筛选那样对大量诱变分离株进行检测，而且操 作起来工作量大，时b j 长，过程复杂。不过，近年来由于筛选工具的微型化以及 筛选过程的自动化，使该方法的筛选效率得到了极大地提高。 4 3 1 3 多级筛选 在抗生素产生菌的诱变育种中，群体中的突变率较低，其中正突变率更少， 加上操作和测试误差又较高，所以要设计多级筛选来寻找稳定高产变异株的最高 机率。多级筛选原理是分离株反复通过多次筛选，确定每一级分离株高单位的最 高比率，例如第一级( 或称初筛) 选出2 0 高单位菌株；第二级( 复筛) 选出l o ； 第三级选出1 0 ，每一级的每一株菌株使用摇瓶数分别是一只、三只和五只。 测试提高精确度仅为重演度的平方根，因此，一个多级筛选的早期阶段( 初筛) 要 测定大量单菌落，虽然分辨力低，但可排除大量低产株。在筛选后期，分离的复 试株较少，重演性逐渐提高，最后确定的高产突变株最好包括小型发酵罐试验。 4 3 1 4 迅速循环再筛选 以重演性稳定的优良高产菌株为出发菌株进行诱变选育，周而复始的迅速再 循环，可提高筛选效率。因为抗生素效价的高低是由多基因控制的，每个提高效 价基因突变的效果是累加的，所以经多代诱变选育，最终可筛选出比原始出发菌 株有较大幅度的增产的突变株。同时，建立几条线再循环伺时进行选育的优点在 于，每条线可以采用不同条件( 例如，多出发菌株，不同诱变剂，各种筛选培养 基等等) 以最大限度表达和选得各种优良突变型菌株。而且，它还建立了从不同 选育线中的最优良菌株之间进行遗传重组，更有希望获得有益基因丛的连锁或产 生带有新基因型的重组体菌株。这样的重组体如果再以多条线进行突变选育高产 突变型是很有效的。因此，迅速循环再筛选对于抗生素产尘菌的菌种改良具有重 要的价值。 山东大学硕f 学位论文 5 本论文立题意义及研究的主要内容 自抗尘素被发现以来，在人类与疾病作斗争的舞台上一直占掘着重要的角 色，新的抗生素源源不断地被发现并丌发成药物应用于临床，而对用于农业的抗 生素，却只有少数的几种( 如井岗霉素、阿弗菌素、宁南霉素等) 。由于病原微 生物的多样性及其不断产生的抗性，给农业生产带来巨大的损失，相对于生物农 药，人们还是普遍采用化学防治的措施，因为其具有防治效果高、速度快、杀虫 谱广、成本低等特点，但是，在化学防治过程中，化学农药的长期、大量和反复 使用，己给我们的土壤、水体和大气带来了严重的污染农副产品中的农药残留 带给人类身体健康的威胁已经无需多讲。因此，近年来，国内外普遍提出了包括 生物防治在内的病虫害的综合防治措施，其中由于微生物农药具有不同于化学农 药的多项优点，因此各国争相开发新产品。 我们从土壤中分离筛选出一株能产抗菌活性物质的链霉菌( 编号为4 5 ) ， 对其进行平板琼脂移块法测定，发现具有很强的抑菌活性，对其进行了抑菌谱的 测定，发现它对多种植物病原性真菌及病原性细菌都有明显的抑制效果，尤其是 对于花生青枯病病原菌具有很强的抑制作用，由于该病是一种危害很大的土传病 害，并且很难彻底根除其发生，目前大都还是使用普通化学方法进行防治，现已 发现及应用的生物农药中很少有能够对