（环境工程专业论文）重金属对塿土磷酸酶活性的影响研究.pdf

论文题目：重金属对塿土磷酸酶活性的影响研究 专 业：环境工程 硕 士 生：所 芳 （签名） 指导教师：贾锐鱼 （签名） 摘 要 土壤是受人类活动强烈影响的一类特殊物质，对重金属污染具有一定的缓冲能力， 它即是被污染的对象也是作物的污染源。在不同地区之间，不同类型的重金属含量存在 着显著差异，不同的土壤类型，表现的重金属污染程度也不一样。因此本文选用了塿土 作为主要的研究对象，同时以西安塿土为代表。 本文通过外源添加重金属 pb、cd、cr 盆栽小白菜实验，模拟不同浓度土壤重金属 污染对土壤磷酸酶活性的影响，得出如下结论: 1.在不同浓度的 pb 的影响下，塿土磷酸酶活性主要受到抑制作用，并随着浓度的 增加， 抑制作用增加； 未添加 pb 的土壤磷酸酶活性最高达到 51g/kg， 当浓度在 250-350 mg/kg 时达到最低，磷酸酶活性为 44.2g/kg；塿土磷酸酶活性可作为土壤重金属 pb 污 染时的酶学指标; 2.当 cd 浓度小于 0.2mg/kg 时，磷酸酶活性受抑制；在 cd 浓度为 0.2-0.7mg/kg 时， 磷酸酶活性变化波动基本在 48g/kg 左右；浓度为 0.4mg/kg 时，磷酸酶被激活达到 52 g/kg；随时间的延长，酶活性有降低趋势，降至 39.7-44.5 g/kg；塿土磷酸酶活性可作 为土壤重金属 cd 污染时的酶学指标; 3.cr 浓度为 80-110mg/kg时，酶活性相对较高达到 54g/kg；与 pb、cd 相比，cr 影响下的磷酸酶活性变化最为平缓，没有明显抑制或激活作用，塿土磷酸酶活性不能作 为土壤重金属 cr 污染时的酶学指标; 4. 在 pb、cd 的污染下，污染等级 1、2、3 的磷酸酶活性临界值分别为 53.7、46.2、 38.7g/kg；52.24、47.12、34.98g/kg； 5 . 在重金属 pb、cd、cr 单一污染下，对塿土磷酸酶活性的抑制效应顺序为 pbcd cr，随着时间的延长，酶活性越趋于稳定;小白菜生长受受抑制的顺序为 crpbcd；塿 土磷酸酶活性对小白菜生长影响不大； 关 键 词：土壤污染；塿土磷酸酶活性；重金属；小白菜 研究类型：应用研究 subject : the study of heavy metals impact on manural loessial soil phosphatase activity specialty : environmental engineering name : suo fang (signature) instructor: jia ruiyu (signature) abstract soil is a special kind of soil strongly influenced by human activities, heavy metals pollution also has a certain buffer capacity, it is an object that is contaminated crops are also sources of pollution.in different areas, different types of heavy metals there are significant differences between different soil types, the performance of heavy metal pollution are not the same.therefore, this paper selected manural loessial soil as the main object of study, to xian, manural loessial soil represented. this article by adding heavy metals pb, cd, cr, to simulate different concentrations of heavy metal pollution, study chinese cabbage and soil phosphatase sensitivity of heavy metals, conclusions were as follows: 1.the effects of different concentrations of pb, manural loessial soil mainly by inhibition of phosphatase activity. with the increase of the concentration the inhibition increased. without pb the soil phosphatase activities reached 51g/kg, when the concentration between 250-350 mg/ kg，it become the lowest 44.2 g/kg. phosphatase activity can be used as heavy metal pb contamination of the enzyme target. 2.when the cd concentration is smaller than 0.2 mg/kg, the soil phosphatase activity reduces unceasingly, during the period of concentration is 0.2-0.7 mg/kg, the phosphatase activity change fluctuation is greatly basic in 48 g/kg about; when the density is 0.4 mg/kg, the phosphatase is activated achieves 52 g/kg; but along with the raise times extension, the enzyme activity has reduces the tendency, drops to 39.7-44.5 g/kg. phosphatase activity can be used as heavy metal cd contamination of the enzyme target. 3.the cr concentration between 80 to 110mg/kg, the activity is relatively high to 54 g/kg; and compared to pb and cd, phosphatase activity under the influence of cr change in the most gentle, no significant inhibition or activation. phosphatase activity can not be used as heavy metal cr contamination of the enzyme target. 4. under the pb, cd pollution, the phosphatase activity were 53.7,46.2,38.7 g / kg; 52.24,47.12,34.98 g / kg on the pollution level of 1,2,3; 5. under a single pollution， the order of pb、 cd and cr inhibitory effects soil phosphatase activity is pb cdcr. with time, the more activity tends to stabilize; the order of cabbage growth was inhibited is crpbcd; soil phosphatase activity has little effect on the growth. key words: soil pollution soil phosphatase activity heavy metal chinese cabbage thesis : mechanism study 1 绪论 1 1 绪 论 1.1 选题背景及研究意义 1.1.1 选题背景 城市化进程不断加快的今天, 我国土壤利用强度持续增加，土壤污染问题表现的也 越来越突出， 甚至已经直接或间接地危害到人体健康 1 。 重金属污染是比较典型的污染， 由于重金属具有隐蔽性和潜伏性，不易降解，造成的后果尤其严重。众多学者在研究重 金属污染的过程中，一直寻求一个统一的量化标准来辨别土壤重金属污染的情况 2 。大 量研究结果表明，土壤酶活性对重金属污染的敏感性很强，再加上其专一性和综合性的 特点，使其有可能成为一个有潜力的土壤生物指标。尤其在确定污染或严重扰动对土壤 健康的影响方面作用十分明显，因此有许多研究者提出以土壤酶活性来判别土壤重金属 污染状况 。通过研究外源重金属对土壤酶活性的影响, 来建立评价重金属污染的酶学 指标。 土壤重金属污染具有隐蔽性和不可逆性等特点。如果农田受到常见的有毒重金属污 染，不同的作物会在不同程度的重金属富集作用下吸附在植物体内，并通过食物链直接 危害到人类的健康。塿土是人为影响下具有50cm 厚的土粪堆垫层的土壤，“塿”的意思 即土壤像楼房一样，是人堆垫形成的两层，上层为土粪堆垫层，下面是原来的黄土(图 1.1)。这个土粪堆垫层是因为长期施用大量土杂肥形成的；土粪堆垫层中有砖瓦、陶瓷 碎片、煤渣、兽骨等人为侵入体，但因为是土粪而且是逐渐堆垫与种植交替进行，故该 层的有机质含量和速效养分含量并不像菜园土的那样高。 图 1.1 西安塿土地貌 塿土主要分布在关中平原区，那里有着悠久的农耕历史和施用土杂肥的习惯。西安 市土壤以塿土为代表，本文经过野外调查和资料收集，在西安市南郊采集土壤样品，测 定了土壤基本理化性质(土壤有效磷、速效钾、有效氮及 ph 值等)，并通过外源添加重 西安科技大学硕士学位论文 2 金属，观察小白菜(拉丁文：brassica chinensis；通用名：pakchoi)的成长情况及塿土磷酸 酶活性的变化。 土壤中重金属污染来源广泛，主要包括有大气降尘、污水灌溉、工业固体废弃物的 不当堆置、矿业活动、农业和化肥等。土壤中的重金属在其累积初期，毒害作用并不明 显，因此不易被人们轻易觉察或关注，但一旦当其毒害作用表现出来，就难以消除。根 据研究表明，目前西安农田中多种蔬菜中的重金属含量都有或轻或重的超标。沈阳市张 士灌区的锡污染，造成大面积的土壤毒化、水稻矮化、稻米异味、含锡量超过食品卫生 标准。重金属污染在人们没有发觉时已经直接影响到人类身体健康，尤其有毒重金属更 为人们所关注，因此本文主要选取了常见有毒重金属 pb、cd、cr，研究常食蔬菜小白 菜在其影响下的变化情况。 土壤酶是土壤生物化学反应中的催化剂，土壤微生物和植物根系通过种类繁多的 酶，吸收各种营养成分。磷酸酶是催化磷酸，促进作物更好的吸收土壤中营养元素磷。 研究单一污染条件下，重金属对土壤磷酸酶活性的影响，有助于了解重金属污染对土壤 系统中磷循环的影响，揭示其生态风险。目前国内外对单一重金属对土壤酶活性的影响 进行了广泛的研究，而有关多种重金属单一污染与土壤酶活性关系在同一坐标里的研究 较少。本文通过培养试验，对 pb、cd、cr 单一污染针对土壤中磷酸酶活性的影响进行 初步研究，为评价 pb、cd、cr 存在土壤体系中的生态风险提供科学依据。 目前，国内外学者还对该问题在其它生化指标和重金属之间关系进行了分析，研究 的方面有：土壤代谢商与重金属之间的关系、重金属在土壤中的形态分布特征等、微生 物生物量与重金属浓度的潜在联系等等。在判别土壤重金属污染程度的研究当中，土壤 磁性可作为监测城市土壤污染的有效手段，经常使用的方法还有富集系数(efs)、潜在 生态危害指数法和内梅罗综合指数法，也有学者使用单因子污染指数法、对应因子分析 法、地积累指数法和土壤污染指数spi等。由于土壤污染的复杂性，目前评价的临界值 大都以地区重金属自然土壤元素表层背景值，或国家土壤环境质量标准值为参照，也有 学者采用世界土壤中值和欧盟土壤环境质量建议标准 4 。我国目前对于城市土壤仍无适 用于不同用途的土壤环境质量标准， 而只能借用农田土壤环境质量标准进行评价。 同时， 基于前者的研究可知，在数据分析和处理的时，通过二维分析来找出土壤中某种酶与某 金属离子在不同的时间不同的浓度下，酶活性的变化规律，最后根据回归分析或者其它 成熟的数学模型得出两者存在的某种关系 5 。在研究结果当中，磷酸酶、脲酶和过氧化 氢酶对常见的重金属较为敏感，有一定的研究价值。所以笔者选取了磷酸酶，研究了常 见重金属对其活性的效应，并通过三维空间曲面分析它们的潜在联系。 1.1.2 研究意义 ( 1 ) 理论意义 1 绪论 3 随着现代工农业的迅速发展， “三废”排放量的日益增加，土壤环境污染问题日趋 严重。土壤重金属污染防治，是生态环境修复研究领域中的重要内容之一，其中用土壤 酶活性表征重金属污染程度是重中之重 6 , 7 。 由于土壤中一些酶的活性性能较稳定、 敏感 地反映重金属对土壤的污染程度，人们开始注重探讨用土壤酶活性作为判定土壤污染程 度的生化指标 8 。但是许多环境科学家认识到在自然条件下，土壤微生物及酶活性受不 同植被、季节、灌溉、耕作等因素的影响，检测结果差异很大；同时不同实验室由于分 析方法不同，实验结果缺乏统一表示方法，也难于比较分析。为此土壤酶活性的抑制率 被更多的学者引进，因为它是酶的活性在受重金属污染的情况下，活性降低或增加的一 个比值，这样减少了一些污染前后外界因素影响造成的差异。 在本论文中，三维分析方法的使用，首先将重金属的浓度和酶活性之间潜在的关系 表现的更为明显，这不但有利于找出土壤酶活性表征重金属污染程度的特定参数，还会 使今后在评价塿土的某种重金属污染程度的工作中更便利、快捷。 ( 2 ) 现实意义 现有研究表明，重金属污染不仅降低了有机物质的微生物转化效率，使微生物在逆 境条件下，为了维持其正常生命活动需消耗更多的能量，而且还可以导致微生物群落的 结构和功能多样性的改变 9 , 1 0 ；此外，重金属对土壤酶活性存在一定的抑制作用，导致 土壤自身净化污染物的功能部分甚至完全消失, 从而加剧了污染物在土壤环境中的持久 性。多年来由于工业三废的排放、城市生活垃圾污泥及含重金属的农药化肥的不合理使 用， 使含有重金属的工业分成、固体废弃物、废水通过各种不同的方式进入土壤。含as、 cd、cu、pb、cr、ag、zn等一些化合物已做为肥料进入土壤，导致农产品品质下降， 农产品中积累的重金属可以通过食物链进入人体, 给人类健康带来潜在的危害 1 1 。 以塿土为代表的西安郊区农用地是西安市重要的作物产区，城市郊区的土壤环境质 量与当地居民的健康有着密切的联系，曾有人研究了西安污灌土与蔬菜重金属分布转移 情况，但关于西安市郊区土壤重金属含量及其土壤酶活性问题至今仍无人系统地探讨。 本论文通过详细的调查分析了西安市农田表土中的重金属含量及其污染现状，并着重研 究主要污染重金属元素与磷酸酶的活性，为建立塿土重金属污染评价的酶学指标提供依 据，便于今后土壤重金属污染的控制和管理。 1.2 国内外研究动态 1.2.1 国外研究动态 土壤酶学研究在环境科学研究中的应用，是 70 年代才出现的一个课题。当时, 国外 报道很少，国内则几乎还未涉及。到 20 世纪 80 年代国内外学者将土壤酶应用到土壤重 金属污染的研究领域中，在许多方面取得了显著的进展。由于土壤酶类对重金属离子的 西安科技大学硕士学位论文 4 抑制或激活作用比较敏感, 且其活性变化直接影响着从土中获取养分的作物的生长, 因 而土壤酶活性的测定将有助于判明土壤中重金属污染的过程。 相对于重金属而言， wilke 研究发现到砷 as 并不是土壤生化特性的强抑制剂，但是磷酸酶对其非常敏感，磷酸酶 受砷的抑制作用非常明显，这可能是因为砷酸盐和磷酸盐的结构相类似的结果。 dar 和 kandeler 的研究表明，所有的重金属都会抑制土壤中磷酸酶的活性，抑制程 度与土壤类型和重金属浓度有关。同时 juma 也证明，把 20 种重金属加到土壤中，所有 重金属均有不同程度抑制酸性、碱性磷酸酶活性。同时，所有抑制酸性磷酸酶的重金属 元素也能抑制碱性磷酸酶活性，但抑制有效性有些不同。hassan 研究发现，cd 浓度的 增加会降低酶的活性，但是降低的量并不与 cd 的加入量成正比，高浓度的 cd 会强烈 抑制碱性磷酸酶的活性。在美国马里兰的阿伯丁军队实验场研究了重金属对草地生态系 统土壤磷酸酶活性的影响， 重金属 as、 cd、 cu、 pb、 cr、 zn 浓度范围在 7.2-48.1mmol/kg。 roman 和 maragaret 研究显示污染地区碱性磷酸酶活性不易受影响，可能是由于土壤中 碱性磷酸酶的活性模式较为复杂，因此它不与任一简单的土壤因素相关联。当总金属浓 度上升到 3048mmol/kg 时，虽然总磷酸酶活性受到抑制，但碱性磷酸酶的活性反而上 升，这种现象可能是微生物群落对重金属毒性抵抗的选择性引起的。t. w. speir 等对新 西兰土壤的磷酸酶活性变化情况做了调查和研究，结果表明，结构较好的土壤中，磷酸 酶活性受重金属的影响降低至 70%，而结构较为粗糙的土壤中，大部分的金属不会对酶 活性有抑制作用。对酶的生物化学活性分析结果显示，绝大部分重金属对土壤的抑制是 通过酸化引起的，而不是重金属的直接作用。除了城市土壤和农田外，李英时(韩国)还 对射击场的土壤进行了分析 1 2 ，研究了射击造成了土壤重金属含量的增加，及土壤酶活 性的变化。目前，最新的研究也已经将细菌基因工程引入，其中有价值的属性已经通过 基因工程植入某些菌株，在某些情况下，有关细菌可以通过改变污染地区的理化条件， 降低重金属污染。 1.2.2 国内研究动态 随着环境科学研究理论、技术的日益广泛、深入的发展，以及计算机和成熟的数学 模型的在环境研究领域的应用，我国诸多的环境研究者有了更丰硕的研究成果。 在土壤受重金属污染指标研究方面，刘树庆等提出采用土壤重金属的总量、有效量 指标及综合指标、生物指标等表征和预报土壤污染水平，尽管它们在一定程度上可以反 应土壤受重金属污染程度，但仍存在结果可比性较差、操作技能和设备等缺陷和难度， 以致不能广泛的应用在实际当中 1 3 。随后沈桂琴等研究发现土壤酶的活性对重金属的污 染程度较为敏感，hg、cd、pb 对土壤脲酶、转化酶、碱性磷酸酶和蛋白酶活性有明显 的抑制作用，而 cr 具有激活作用，脲酶的反应最敏感 1 4 。杨志新等发现 cd、zn、pb 对土壤酶活性的抑制效应顺序为 cdznpb，在过氧化氢酶、脲酶、碱性磷酸酶、转化 1 绪论 5 酶中脲酶活性受重金属的抑制作用最为敏感 1 5 。周礼恺等先后提出脲酶、磷酸酶可作为 土壤污染水平的指标 1 6 。现采用土壤酶作为重金属污染指标的研究方法有：1 根据土壤 酶活性升降变化确定重金属污染指标；2 根据土壤酶活性抑制率与重金属在土壤中存在 形态的关系拟定污染指标；3 用成熟的数学模型，如多元回归、主成分分析等，通过外 源添加观察重金属在不同浓度下对土壤酶的影响，为土壤重金属污染情况做综合评价。 目前，学者们又加大了对重金属复合污染的研究力度，滕应、骆永明等研究者指出 在 cu、zn、pb、cd 复合污染条件下, 随着 pb、zn、cd 浓度的增加, 土壤脲酶、脱氢酶 动力学参数vmax(最大酶促反应速度)降低, 而随 cu 浓度的增加, 其脲酶、 脱氢酶vmax则增 加。但对酸性磷酸酶vmax的影响与脱氢酶、脲酶稍有差异, 即 cu、pb 元素对其表现出协 同作用 1 7 。 近年来，黄巧云在重金属抑制固定态酶的机制、土壤胶体矿物与微生物相互作用对 重金属吸附和形态的影响等土壤与环境生物化学领域 1 8 ，也有了重要创新性的研究工 作。中国台湾赖朝明教授，在完成彰化县农地污染控制场址现地植生修复重属污染土 壤对土壤生态系功能之影响研究成果中，表明土壤微生物生物碳含量及土壤去氢酶、 - 配醣酶、- 胺基葡萄糖苷酶、尿素酶、酸性磷酸酯酶等活性均显着提高，而底土的土 壤去氢酶与- 配醣酶活性亦显著提高，即经植生修复后，土壤生态系功能已获得显著 改善。此外，土壤去氢酶、芳香基硫酸酯酶与尿素酶活性亦可作为土壤重金属 cr、cu、 ni 及 zn 污染的指标 1 9 。杨红飞也通过对砂姜黑土中重金属 cu、cd、zn 形态分布与土 壤酶活性研究，指出了在砂姜黑土壤中,把交换态 cu、cd、zn 和脲酶中性磷酸酶的活性 共同作为评价土壤 cu、cd、zn 污染程度的主要生化指标是可行的 2 0 。 目前我国学者认为重金属对酶的作用机理分为 3 种类型：1 酶作为蛋白质，需要一 定量的重金属离子作为辅基，此时重金属的加入能促进酶活性中心与底物间的配位结 合，使酶分子及其活性中心保持一定的专性结构，改变酶催化反应的平衡性质和酶蛋白 的表面电荷从而可增强酶活性，即有激活作用；2 重金属占据了酶的活性中心或与酶分 子的巯基、胺基和羧基的结合导致酶活性降低，即有抑制作用；3 重金属与土壤酶没有 专一性对应关系，酶活性没有受到影响 2 1 。 1.3 研究内容、方法及技术路线 1.3.1 研究内容和方法 研究内容: (1)研究塿土中磷酸酶活性在重金属污染的影响下变化情况， 即通过室内实验研究随 塿土中重金属浓度的递增，磷酸酶活性的变化及其规律。 (2)根据实验研究，采用三维(重金属浓度(污染等级)、磷酸酶活性变化、时间)曲面 西安科技大学硕士学位论文 6 分析，找出可以用塿土磷酸酶的活性评价土壤重金属污染等级的重金属。 (3)通过盆栽试验， 测得小白菜中重金属含量的变化， 并观察小白菜在植株生长高度、 叶片颜色等自然生长参数的变化，分析与塿土磷酸酶活性之间的关系。 研究方法: 研究过程当中的试验方法拟采取以下内容安排： ( 1 ) 土壤的采集和预处理 用铁锹铲去土壤表面，避免地表杂质被带回实验室。每个采样区以蛇形采样法采集 10 个样点，采集 30cm 以上的作物生产用土，混合均匀土样后，待盆栽试验使用。在去 除植物残体和碎石后，将一部分新鲜土样经研磨，过空隙为 0.1cm 的尼龙网筛，装入无 菌塑料袋，以供土壤酶活性指标分析，另一部分土样置于阴凉通风处，供种植小白菜使 用 2 2 。 ( 2 ) 土壤重金属含量及基本理化性质的测定 土壤重金属 pb、cr、cd 的全量采用王水- 高氯酸消解；表层土壤(030cm)的 ph、 有效磷、速效钾等按常规方法测定 2 3 。 (3)投加重金属前后磷酸酶活性的测定 磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定，即以 24h 内 100g 土壤释放出的酚的毫克数来 表示 2 4 。 试验当中， 每种重金属的污染水平参照我国土壤环境质量标准(gb156181995) 进行，同时以无重金属施入的土壤作为对照，做两个平行样。 (4)计算机软件的数据处理 运用 matlab 和 origin 软件对数据进行处理，完成各种重金属与磷酸酶活性关系的 空间曲面图。 (5)分析各种重金属对磷酸酶活性的影响 将重金属浓度按照国家土壤环境质量标准(gb156181995)换算成污染等级， 把有显著关系的曲面放在同一坐标里进行比较( 如图 1.2)。 图 1.2 三维坐标图 (6) 投加重金属前后小白菜生长情况 小白菜中重金属含量的测定采用常用的蔬菜中重金属含量的测定方法，小白菜植株 1 绪论 7 高矮、叶片颜色、叶片多少及生长速度都通过直观法对其分析和比较。分析和讨论重金 属、小白菜生长及塿土磷酸酶活性之间的关系。 1.3.2 技术路线 本论文拟采取现场调查研究与采样、实验室内试验及分析、计算机软件分析处理的 综合研究方法，具体路线如图 1.3。 图 1.3 技术路线图 1.4 研究过程中可能遇到的问题及未来研究的设想 近几十年以来，国内外生物技术和高新技术的迅速发展，以及计算机的广泛应用， 不但带动了土壤学的研究，而且还将研究更加细化，与实际联系更为紧密。在本研究当 中，有传统的基础性研究，也有现代理论和实际应用型研究，它们推动了土壤酶学及其 地下微生态系统等相关学科的研究 2 5 。但是在研究过程当中尚存以下问题： (1)在室内模拟条件下，这与现实当中的土壤环境有一定的差距，在确定磷酸酶为某 种重金属的酶学指标时，会有一定的不准确性； ( 2 ) 数据处理过程中，应用三维曲面的分析可以将很多潜在的特征表现出来，但拟 合的方程结果只是实际情况的一个趋势。 随着研究的深入发展, 土壤学研究将不断与农业生态、环境生态、城市生态和恢复 生态等应用生态学领域结合。今后要融合土壤和整个生态系统的研究为一体，把更多的 相关学科与土壤微生态环境关系结合起来，分析探究其内在的联系和机制，加强当地调 控措施，为土壤健康提供科学基础资料 2 6 。 西安科技大学硕士学位论文 8 针对于土壤酶的研究来说，土壤酶参与包括土壤生物化学过程在内的自然界物质循 环 2 7 。有研究表明，将来对环境污染程度准确反映可能来自对生物活性物质的检测，土 壤作为外源污染物的最大受体，且基于土壤酶对周围环境变化相当敏感的特性，其活性 对各种污染物质作用的反应研究备受人们的关注 2 8 。 这是一个涉及土壤化学、 生物化学、 环境科学等多门学科，相互渗透、相互交叉的科学研究领域。因此，在今后的研究中， 将会有更多学科的融入，并成为该领域的研究热点。 2 材料和方法 9 2 材料和方法 2.1 试验材料 供试小白菜品种为奶油小白菜(东艺奶油小白菜，耐热耐旱)，供试土壤为农业大田 土壤，采自未受 cd、cr 和 pb 污染的西安市长安区兴盛村，如图 2.1 和 2.2，五角星所 在位置即为兴盛村。 图 2.1 西安市长安区 图 2.2 西安市长安区兴盛村 土壤采集根据蛇形布点法，去除表层土壤，采取植物根系通常所处的深度0-30cm的 土壤，土样装入丝袋内，带回实验室，经去杂质、充分拌匀后备用。将一部分新鲜土样 研磨过1mm尼龙网筛，装入塑料袋、贴上标签，以供土壤理化性质及土壤酶活性指标和 重金属含量测定分析，另一部分用于盆栽试验使用。 土壤基本理化性质见表2.1。 表表 2.1 供试土壤的基本理化性质供试土壤的基本理化性质 项目 ph 速效氮 /mgkg-1 速效磷 /mgkg-1 速效钾 /mgkg-1 总镉 /mgkg-1 总铬 /mgkg-1 总铅 /mgkg-1 土壤 7.2 58.09 12.92 37.80 0.001 6.3 3.7 图 2.3 西安市长安区兴盛村采取土壤 西安科技大学硕士学位论文 10 2.2 试验设计 本试验中污染物为cd、cr和pb，共设计3个污染组，分别为：pb单一污染组(十个浓 度)、cd单一污染组(九个浓度)、cr单一污染组(十个浓度)，其中均含一个空白，各组中 污染物浓度依据中华人民共和国国家标准土壤环境质量标准（gb15618-1995）中重 金属pb、cd、cr的一、二、三污染等级标准而设定投加量，见表2.2。 表表 2.2 外源添加重金属含量外源添加重金属含量 种 类 单 位 1 2 3 4 5 6 7 8 9 铅 mg/kg 35 90 150 200 250 300 350 450 500 镉 mg/kg 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.9 1 铬 mg/kg 80 90 110 150 200 230 250 300 320 其中cd以硝酸铬镉cd(no3)2.4h2o形式加入， cr以氯化铬crcl2形式加入， pb以硝 酸铅pb(no3)2形式加入。重金属化合物于6月25日均匀拌入盆栽土壤，每盆装5kg土壤， 培养3天。小白菜于2009年6月28日栽入27.5cm半径24cm塑料盆，每盆20株，2009年7 月28日收获。 试验过程当中，每隔七天左右测一次各盆栽里的磷酸酶活性，共测四次；同期每隔 七天左右测一次小白菜里的重金属含量，共测四次，同时设定两个平行样，取平均值， 通过origin软件进行数据分析。如果磷酸酶活性可以作为土壤重金属pb、cd、cr污染的 酶学指标，得出的数据通过matlab做出三维空间曲面图形，然后将对pb、cd、cr单一污 染下磷酸酶活性变化曲面坐标图中的重金属污染浓度，按照国家土壤环境质量标准值转 换为污染等级(gb15618-1995)，将曲面进行方程拟合。 2.2.1 试验场地 试验场地在西安科技大学环境工程试验楼天台，采用盆栽方式进行大田模拟实验。 2.2.2 栽培管理 重金属按照投加全量需求进行称重和添加， 缓慢搅拌均匀， 以免过分破坏土壤结构， 培养 3 天； 选择颗粒饱满的供试品种，每盆 20 粒左右，直接育苗。出苗后，多次通过间苗来 选择试验所用的样品，直至最后保留健壮秧苗 2-3 株，做为不同污染背景下，进行参比 的样品； 施肥添加常用农用肥料，在生长期间不追肥； 试验期间，根据蔬菜生长情况、天气变化、温度高低确定每天的浇水量，保持盆土 2 材料和方法 11 湿润与温度。若遇雨天，塑料袋将花盆扣住，以免雨水稀释土壤中重金属浓度。若气温 较高，阳光照射强烈，用白色编织袋搭架遮阳，浇水时使用提前晾晒过的水； 经常用小铁钉松土，避免板结，影响植物的生长；除去的杂草全部铺在面表，一来 减少土壤水分蒸发，二来防止杂草对重金属吸收后的流失； 发现害虫要及时用手工捕杀。发现病害立即采取措施，及时防治，减少各盆之间的 相互传染； 观察记载：每隔 67d 记载一次蔬菜生长情况，包括株高、叶片数、生长是否正常、 叶片有无病斑、有无卷曲，叶片色泽是否正常、叶脉有否失绿等。 2.3 样品采集及预处理 2.3.1 土壤采集及预处理 测定塿土磷酸酶活性时， 取盆栽基础土壤， 采土位置为每盆对角四个点和中心一点， 用长柄钥匙分别采集两个深度的土壤，混合、风干，取样后用玛瑙研钵磨碎分别过2.0 mm、0.25mm和0.15mm筛，于封口塑料袋中保存备用 2 9 。 2.3.2 植物采集及预处理 在小白菜收获前， 每次测量均匀采取一定的数量， 同时有间苗的作用。 洗净并称重， 去离子水迅速清洗干净，放入坩埚中，滴入2 m l 硝酸消解，盖坩埚盖，消解1 2 小时。 2.4 测定方法 2.4.1 土壤基本理化性质 (1)水分含量的测定 称取通过10目筛的风干土样510g(准确至0.01g)，置于铝盒或称量瓶中，在105oc 烘箱中烘45h，烘干至恒重。 以百分数表示的风干土样水分含量 f按下式计算，如式(2.1)： = (12/1)100% (2.1) 式中： 土样水分含量，% ； w1烘干前土样重量，g ； w2烘干后土样重量，g ； (2)ph 值的测定 25g 样+25ml 水，搅拌，静置半小时后用 ph 试纸测定。 (3)有效氮 西安科技大学硕士学位论文 12 操作步骤： 称取通过cdcr。 西安科技大学硕士学位论文 28 4 铅、镉、铬与塿土磷酸酶活性关系的空间曲面分析 为了防治土壤污染， 保护生态环境， 保障农林生产， 维护人体健康， 国家在贯彻 中 华人民共和国环境保护法 的同时， 颁布了相应的 土壤环境质量标准 (gb 15618-1995)。 本次试验在研究重金属铅、镉、铬对塿土磷酸酶活性影响时，分析出塿土磷酸酶活性可 以作为土壤重金属铅、镉污染的酶学指标。为了更好的展现它们之间的潜在规律，将以 往的平面坐标分析换为三维坐标(磷酸酶活性-时间-重金属浓度)的空间研究。 同时，为了将铅、镉对塿土磷酸酶活性影响的特征进行比较，依据国家土壤环境 质量标准(gb 15618-1995)将铅、镉的添加浓度值转换为相应的污染等级，同时把每一 等级的最大值作为该等级的代表，例如：在自然条件下，土壤环境质量标准表里将镉浓 度小于 0.2 mg/kg 时，设为等级一，因此当添加重金属镉浓度为 0.2 时 mg/kg，在坐标轴 上显示为数值 1，其他浓度按照浓度-等级所体现的线性关系进行查找。 表表 4.1 土壤环境质量标准土壤环境质量标准 (单位：单位：mg/kg) 项目 土 壤 级 别 一级 二级 三级 自然条件下 ph6.5 6.5ph7.5 ph7.5 ph6.5 pb 35 250 300 350 500 cd 0.2 0.3 0.3 0.6 1.0 4.1 重金属铅与磷酸酶活性的曲面分析 通过 matlab 软件的程序运行，并根据表 3.3 铅对磷酸酶活性影响所得的数据，得出 关系曲面(图 4.1)。 图 4.1 铅与磷酸酶活性的关系曲面 (浓度) 4 塿土磷酸酶与小白菜的关系分析 29 根据国家土壤环境质量标准(gb 15618-1995)中铅的污染等级标准，将上图所表示 的，磷酸酶活性-时间-铅浓度函数关系进行转换，转化为磷酸酶活性-时间-重金属污染 等级关系(图 4.2)。 图 4.2 铅与磷酸酶活性的关系曲面 (污染等级) 通过 matlab 软件进行编程，拟合该曲面，得到方程式 4.1： s(p,t)= -0.1023p+ 0.104t-0.0022pt+ 6.7162 (式 4.1) 式中：s重金属铬(pb)污染等级 p磷酸酶活性 t时间 在分析磷酸酶活性与时间的关系当中，随着时间的延长，磷酸酶活性越趋于稳定， 因此将变量时间 t 设定为 14(两周时间后的磷酸酶活性基本稳定，变化较小)，从而得出 磷酸酶活性与重金属铅污染等级之间的关系函数(表 4.2)。 表表 4.2 塿土磷酸酶活性表征 p b 污染等级关系表 塿土磷酸酶活性表征 p b 污染等级关系表 酶学指标 pb 污染等级 1 2 3 塿土磷酸酶活性 p(g/kg) 53.7 46.2-53.7 38.7-46.2 函数关系式明确的显示了，随着磷酸酶活性的降低，污染等级增加，这与实验分析 的总趋势一致，即在重金属 pb 的影响下，塿土磷酸酶活性主要受抑制作用。当磷酸酶 活性大于 53.7g/kg 时，塿土在重金属 pb 的污染下，其污染等级为小于 1；当磷酸酶活 性介于 46.2-53.7g/kg 时，其污染等级为 1-2；当磷酸酶活性介于 38.7-46.2g/kg 时，其 污染等级为 2-3。因此，塿土磷酸酶可以作为重金属 pb 的酶学指标，尽管与实际情况还 存在一些误差，但从总体规律上体现了两者之间的关系。 西安科技大学硕士学位论文 30 4.2 重金属镉与磷酸酶活性的曲面分析 通过 matlab 软件的程序运行，得出镉-磷酸酶活性-时间的关系曲面(图 4.3)。 图 4.3 镉与磷酸酶活性的关系曲面 (浓度) 根据国家土壤环境质量标准（gb 15618-1995）中镉的污染等级标准，将上图所表 示的，磷酸酶活性-时间-镉质量函数关系进行转换，转化为磷酸酶活性-时间-重金属污 染等级关系(图 4.4)。 图 4.4 镉与磷酸酶活性的关系曲面 (污染等级) 通过 matlab 软件进行编程，拟合该曲面，得到方程式 4.2： s(p,t)= -0.1478p-0.2388t+0.0051pt+9.002 (式 4.2) 式中：s重金属铬(cd)污染等级 p磷酸酶活性 t时间 4 塿土磷酸酶与小白菜的关系分析 31 在分析磷酸酶活性与时间的关系当中，磷酸酶活性随着时间的延长而趋于稳定，因 此将变量时间 t 设定为 14，从而得出磷酸酶活性与重金属 cd 污染等级之间的关系函数 (表 4.3)。 表 4 . 3 塿土磷酸酶活性表征 c d 污染等级关系表 表 4 . 3 塿土磷酸酶活性表征 c d 污染等级关系表 酶学指标 cd 污染等级 1 2 3 塿土磷酸酶活性 p (g/kg) 52.24 47.12-52.24 34.98-47.12 函数明确的显示了，在塿土磷酸酶活性相对较为稳定的情况下，比较磷酸酶活性的 变化，磷酸酶活性越低重金属 cd 污染等级越高。当磷酸酶活性大于 52.24g/kg 时，塿 土在重金属 cd 的污染下， 其污染等级为小于 1； 当磷酸酶活性介于 47.12-52.24g/kg 时， 污染等级为 1-2；当磷酸酶活性介于 34.98-47.12g/kg 时，污染等级为 2-3。因此，塿土 磷酸酶可以作为重金属 cd 的酶学指标，尽管还存在一些误差，但从总体规律上体现了 两者之间的关系，与实验结果相对一致。 4.3 对比重金属铅、镉与磷酸酶活性的关系 将铅、镉与磷酸酶活性的关系曲面(污染等级)进行对比，可得知在该种重金属污染 的影响下，塿土磷酸酶活性基本均在 40-54g/kg 之间。图中冷色部分显示的是污染等级 较低时磷酸酶活性的变化情况，反之，暖色部分代表了污染等级较高时磷酸酶活性的变 化。 从 pb 污染对塿土磷酸酶活性影响的图中可视，暖色区域偏向左侧，表明当污染等 级较高时磷酸酶所受到的抑制作用最强；曲面整体偏左侧倾斜，可得知从总体变化上分 析，在不同浓度的铅的影响下，塿土磷酸酶活性主要受到抑制作用，这与前面分析的一 致；由于曲面凸凹处较多，说明个别波动的数据所表现的特征也被显现出来，而在平面 坐标分析中，一般所得的拟合曲线都将其忽略，这也是三维分析的一个优点。随着时间 延长的角度分析，从图中可见不同污染等级下受影响的酶活性变化浮动不大，这与前面 所述的“时间越久磷酸酶活性越稳定”是一致的。 从 cd 污染对塿土磷酸酶活性影响的图中可视，暖色区域偏向左侧，但中间偏绿色 区域相比下端偏向右侧，表明当污染等级较高时磷酸酶所受到的抑制作用最强，而在污 染等级为 1-1.5 时，镉对磷酸酶有一定的激活作用；曲面整体偏左侧倾斜，比 pb 所表现 的特征明显，可得知从总体变化上分析，在不同浓度的 cd 的影响下，塿土磷酸酶活性 主要先有激活作用，然后在受抑制作用，这与前面分析的“当浓度较低时，磷酸酶活性 先增强，但随时间的延长，酶活性趋于直线降低。”是基本一致的；该曲面凸凹处较少， 说明塿土磷酸酶在同一浓度下活性变化小。随着时间延长的角度分析，从图中可见不同 西安科技大学硕士学位论文 32 污染等级下受影响的酶活性变化浮动不大，这与前面所述的“时间越久磷酸酶活性越稳 定”是一致的。 pb、cd 单一污染下，对塿土磷酸酶活性的抑制效应顺序为 pbcd。虽然两者在相 同的污染等级下对塿土磷酸酶活性的影响有不同趋势的作用，但整体以抑制作用为主， 且磷酸酶活性均在 40-54g/kg 之间。由于 pb、cd 对塿土磷酸酶活性的影响整体趋势类 似，所以在分析研究时为了防止曲面的叠加，未将两个曲面在同一个三维坐标里进行分 析和比较。但通过三维图的对比很清楚的得到在 pb、cd 影响下，在同样的污染等级下， 磷酸酶活性的变化趋势。同时，也为今后的研究工作提供了基础数据。本次试验数据分 析，通过有代表性的数据得到拟合曲面，根据曲面的显示，表现出了在重金属 pb、cd 污染下，种植小白菜时，重金属的污染浓度与塿土中磷酸酶活性的关系。 通过 matlab 软件进行编程，分别拟合了重金属 pb、cd-塿土磷酸酶活性-时间的曲 面方程。并根据磷酸酶活性与时间关系间的分析结果，即：随着时间的延长，塿土磷酸 酶活性越趋于稳定，因此将变量时间 t 设定为常数，从而得出磷酸酶活性与重金属污染 等级之间的关系函数。尽管关系函数中显示出了，随着磷酸酶活性的降低，污染等级增 加，塿土磷酸酶可以作为重金属 pb、cd 的酶学指标，但是还存在一些误差，与实际情 况有不符合的地方，这也是今后工作中需要深入研究的地方。 4.4 小结 通过对铅、镉、铬与塿土磷酸酶活性关系的空间曲面分析，将已得的有限数据，通 过三维曲面表现出成关系曲面，更大程度上的为各种情况提供了可参考的依据。经过上 述数据整理分析，得出如下结论： 1. 空间曲面的分析结果与坐标分析结果一致：磷酸酶活性随着时间的推移，趋于稳 定；随着重金属浓度的增加，磷酸酶活性总趋势为受抑制，抑制效应顺序为 pbcd； 2.在 pb 的污染下，当磷酸酶活性大于 53.7g/kg 时，其污染等级小于 1；当磷酸酶 活性介于46.2-53.7g/kg时， 污染等级在1-2之间； 当磷酸酶活性介于38.7- 46.2g/kg 时， 其污染等级在 2-3 之间； 3.在 cd 的污染下，当磷酸酶活性大于 52.24g/kg 时，其污染等级为小于 1；当磷酸 酶活性介于 47.12-52.24g/kg 时， 其污染等级在 1-2 之间； 当磷酸酶活性介于 34.98-47.12 g/kg 时，则污染等级在 2-3 之间。 5 实验小白菜对重金属的迁移吸收 33 5 重金属-磷酸酶活性-小白菜生长关系分析 重金属是导致土壤污染退化的重要物质之一， 它通过影响土壤养分的生物有效性而 产生间接危害。同时，土壤中的营养元素也影响重金属对作物环境效应。二者之间有着 复杂的交互作用。从环境污染方面所说的重金属是指：汞、镉、铅、铬以及类金属砷等 生物毒性显著的重金属，铅、铬、镉就属于对人体毒害最大的 5 种重金属中的三个。这 些重金属在水中不能被分解，人饮用后