（材料学专业论文）离子液体水体系中蛋白质晶体的生长研究.pdf

离子液体水体系中蛋白质晶体的生长研究 摘要 蛋白质晶体学是一门研究蛋白质结构与功能的边缘学科。随着生物学领 域对精确的生物大分子结构需求的日益增加，尤其是利用单晶x 射线衍射法 得到的三维结构，使得研究生物大分子晶体的生长越来越受到重视。然而， 生物大分子的结晶相当困难，从某种意义上讲这是生物大分子结构测定的限 制因素。 离子液体具有独特的结构和物理化学性质，已经成为目前化学界的热点 课题之一，而且在生命科学领域也开始得到应用，尤其是作为生物催化反应 的溶剂或共溶剂的研究更是备受关注，近年来，离子液体也开始应用于蛋白 质结晶方面。 本论文将一种新体系离子液体水用于蛋白质的结晶。在该体系中， 实现了蛋白质晶体在离子液体中的可控生长，培养了符合x 射线衍射条件的 蛋白质单晶，对离子液体在蛋白质结晶过程中的作用机理进行了探讨，并剖 析了离子液体含量与蛋白质晶体的晶型、形貌和品质间的关系。此外，从动 力学角度系统地分析了离子液体在蛋白质结晶过程中对晶体生长速率的控制 作用，进而优化结晶条件，改善晶体质量。 采用一步法和两步法分别合成了离子液体 b m i m c i ( 1 丁基3 甲基咪唑 氯化物) 、 b m i m b f 4 ( 1 丁基3 甲基咪唑四氟硼酸盐) 和 b m i m p f 6 ( 1 丁基 3 甲基咪唑六氟磷酸盐) ，借助红外光谱分析表征了其化学结构。其次，为 了进一步研究离子液体对蛋白质晶体生长过程的影响机制，采用b c a 法通过 紫外一可见分光光度计测定蛋白质在离子液体- t k 混合溶液中的溶解度，结 果表明，离子液体在体系中起到了类似无机盐类沉淀剂的作用，促进了蛋白 质分子从溶液中的析出。通过测定 b m i m b f 4 乙酸乙酸钠n a c i 离子液体双 水相体系的三元体系相图，研究了培养溶液中各组分间的溶解度关系，并将 其用于蛋白质晶体的培养，以控制了溶液的局部过饱和度。 采用悬滴法和批量法两种结晶方法，在离子液体水体系中实现了对溶菌 哈尔滨工程大学博士学位论文 酶晶体的可控生长，得到了空间群为p 4 3 2 1 2 的四方晶系晶体，并对其结构进 行了模型解析工作。考察了沉淀剂种类、溶液过饱和度、离子液体的含量、 结晶温度等实验参数的改变对溶菌酶晶型、晶体形貌和品质的影响。研究表 明， b m i m b f 4 更适于溶茵酶晶体的培养，在该体系中， b m i m b f 4 与n a c l 一起作为联合沉淀剂使用，晶体尺寸明显增大，结晶速率得以控制，晶体质 量有所改善。另外，随着 b m i m b f 4 含量的增加，晶体形貌逐渐由块状变为 棒状，且长径比也随之增大。 采用悬滴结晶法，在 b m i m b f 4 水体系中实现了对索马甜蛋白单晶体的 可控生长，得到了空间群为p 4 1 2 1 2 的四方晶系晶体，并解析了其初始模型结 构。在该体系中，f b m i m b f 4 被单独的作为沉淀剂使用，并且研究了结晶温 度、离子液体 b m i m b f 。的含量等培养条件对索马甜蛋白晶型和品质的影响。 离子液体作为一种具有特殊结构和功能的溶剂，在蛋白质结晶的过程中 具有与无机盐类沉淀剂相类似的作用。同时形成双水相体系降低溶液的局部 过饱和度，发挥了模板剂、联合沉淀剂和添加剂的多重作用，有效的控制晶 核的生成数量，提高单晶出现的几率。可以通过调节离子液体的含量来控制 蛋白质晶体的生长速率、大小和质量。 关键词：蛋白质结晶；离子液体：蛋清溶菌酶；索马甜蛋白；单晶体 离子液体水体系中蛋白质品体的生长研究 a b s t r a c t p r o t e i nc r y s t a l l o g r a p h yi sa l li n t e r d i s c i p l i n a r ys u b j e c ti nt h er e s e a r c ho ft h e s 仃u c 眦a n df u n c t i o no ft h ep r o t e i n w i t ht h ei n c r e a s i n gd e m a n d so fp r e c i s e b i o m o l e c u l a r3 - ds t r u c t u r e s ，e s p e c i a l l yp r o t e i ns t r u c t u r e sb yx r a yd i f f r a c t i o n ， p e o p l ep a ym o r ea n dm o r ea t t e n t i o n t ot h es t u d yo fp r o t e i nc r y s t a l 伊o w t h h o w e v e r ，t h ec r y s t a l l i z a t i o no fp r o t e i ni sv e r yd i f f i c u l ta n db e c o m eab o t t l e n e c k i ns 仃u c t l l r a lg e n o r n i c s t os o m ee x t e n t i o n i c l i q u i d s ( i l s ) w i t hu n i q u e s t r u c t u r ea n do u t s t a n d i n gp h y s i c a la n d c h e m i c a lp r o p e r t i e sh a v eb e c o m et h ef o c u si nt h ec h e m i s t r yf i e l d a n di ti sa l s o u s e di nt h ef i e l do fl i f es c i e n c e ，e s p e c i a l l yi nt h eb i o c a t a l y s tr e a c t i o na ss o l v e n to r c o s o l v e n t r e c e n t l y ，i o n i cl i q u i d sa r ea l s oa p p l i e di np r o t e i nc r y s t a l l i z a t i o n i n t h i sw o r k ，an e ws y s t e mo fi o n i cl i q u i d w a t e rw a st e s t e df o rt h ep r o t e i n c r y s t a l l i z a t i o n t h ep r o c e d u r eo fc r y s t a l l i z a t i o nc o u l db ec o n t r o l l a b l ec o n d u c t e di n t h i ss y s t e m t h em e c h a n i s m sf o rf o r m a t i o n so fc o n t r o l l e dg r o w t ha n dt h e r e l a t i o n s h i pa m o n gp o l y m o r p h ，m o r p h o l o g y ，q u a l i t ya n di o n i cl i q u i dc o n t e n tw e r e i n v e s t i g a t e d m o r e o v e r ，t h el i m i t a t i o ne f f e c to fi o n i cl i q u i do nt h er a t eo fc r y s t a l g r o w t hw a sd i s s c u s s e df r o mt h ev ie wo f k i n e t i c s i o n i c l i q u i d so f b m i m c 1 ， b m i m b f 4a n d b m i m p f 6w e r ep r e p a r e d t h r o u g hd i r e c tm e t h o da n dt w o s t e pm e t h o d ，r e s p e c t i v e l y a n dt h ec h e m i c a l s t r u c t u r e so ft h ef i n a lp r o d u c t sw e r ec h a r a c t e r i z e db yi n f r a r e ds p e c t r a f o rt h e f u r t h e rs t u d i e so nt h ee f f e c t so ft h ei l so nt h ec r y s t a lg r o w t h ，t h es o l u b i l i t yo f p r o t e i nw a sm e n s u r a t e dw i t hu l t r a v i o l e t - v i s i b l el i g h ts p e c t r o p h o t o m e t e rb yt h e w a yo fb c am e t h o d i tw a sf o u n dt h a t i o n i cl i q u i dh a ds i m i l a re f f e c ta s p r e c i p i t a n t so ra d d i t i o n s ，w h i c hw a sf a v o u r a b l ef o rt h es i n g l ec r y s t a l s o nt h e o t h e rh a n d ，i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h e i rd i s s o l v e dr e l a t i o n s h i pa m o n ge a c h c o m p o n e n t si nt h es o l u t i o n , t h ee q u i l i b r i u ms o l u b i l i t yo fat e r n a r ys y s t e mo f 【b m i m b f 4 ，n a c la n db u f f e ra sw e l la st h ed a t ao fl i q u i d - l i q u i de q u i l i b r i u mo f 哈尔滨工程大学博士学位论文 t h a ts y s t e ma r ed e t e r m i n e da t2 5 0 ca n da t m o s p h e r i cp r e s s u r e i tw a su s e df o rt h e p r o t e i nc r y s t a l l i z a t i o n ，a n dp l a y e dar o l ei nt h ec o m o lo f l o c a ls u p e r s a t u r a t i o n t w oc r y s t a l l i z a t i o nm e t h o d s ( h a n g i n gd r o pa n ds i t t i n gd r o pc r y s t a l l i z a t i o n ) w e r eu s e df o r t h el y s o z y m ec r y s t a l l i z a t i o ni nt h ei o n i cl i q u i d sw i t hd i f f e r e n t b u f f e r i lp r o p o r t i o n s l y s o z y m ec r y s t a lb e l o n g e dt ot h et e v a g o n a ls p a c eg r o u p p 4 3 2 1 2a n di t s3 - dm o d e lw a sa n a l y z e d t h ei n f l u e n c eo fg r o w t hc o n d i t i o n ss u c h a st h ek i n do fp r e c i p i t a n t s ，s o l u t i o ns u p e r s a t u r a t i o n ，i o n i cl i q u i d sc o n t e n ta n d t e m p e r a t u r eo np o l y m o r p h ，m o r p h o l o g ) r ，q u a l i t yo fc r y s t a l s w a sd i s c u s s e d i t s h o w e dt h a t b m i m b f 4w a sm o r es u i t a b l ef o rl y s o z y m ec r y s t a l l i z a t i o nt h a n o t h e ri l s b m i m b f 4a n dn a c lw e r eu s e da su n i o n - p r e c i p i t a n t si nt h es y s t e mo f b m i m b f 4 一w a t e r m o r el a g e rs i n g l ec r y s t a l s w i t hc o n t r o l l a b l em o r p h o l o g i e s c o u l db eo b t a i n e dd u et ot h em a n a g e a b l ec r y s t a lg r o w t hv e l o c i t y i na d d i t i o n ，t h e m o r p h o l 0 9 2 ，o fl y s o z y m ec r y s t a l sw e r ec h a n g e df r o mb o l c kt or o da n dt h el d r a t i oi n c r e a s e dw i t ht h ep r o p o r t i o no fi l f u t h e r m o r e ，t h a u m a t i nc r y s t a l ，w h i c hw a sb e l o n g e dt ot h et e t r a g o n a ls p a c e g r o u pp 4 1 2 1 2 ，c o u l db eo b t a i n e dw i t hh a n 萝n gd r o pc r y s t a l l i z a t i o n b m i m b f 4 w a su s e da sap r e c i p i t a n t ，a n dt h e e f f e c to fi o n i cl i q u i d sc o n t e n t ，t e m p e r a t u r eo n p o l y m o r p ha n dq u a l i t yo fc r y s t a l sw a si n v e s t i g a t e d o naw h o l e ，i o n i cl i q u i dw a sas o l v e n tw i t hs p e c i a ls t r u c t u r ea n df u n c t i o n m o r ei m p o r t a n t l y ，a q u e o u st w o - p h a s es y s t e mw a sa p p e a r e dw i t hd i f f u s i o no f w a t e rm o l e c u l e s a san e ws y s t e m ，i tm i 曲tp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei np r o m o t i n g t h eg r o w t ho fs i n g l ec r y s t a l sa so p p o s e dt op o l y c r y s t a l s ，i nl i m i t i n gn u c l e a t i o n ， a n di nc o n t r o l l i n gt h es u p e r s a t u r a t i o no fs o l u t i o n t h es i z e ，q u a l i t ya n dg r o w t h r a t eo fc r y s t a l sm i g h tb ec o n t r o l l e db ya d j u s t i n gc o n t e n to fi o n i cl i q u i d k e yw o r d s ：p r o t e i nc r y s t a l l i z a t i o n ；i o n i cl i q u i d s ；e g g w h i t el y s o z y m e ；t h a u m a t i n ； s i n g l ec r y s t a l 哈尔滨工程大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：本论文的所有工作，是在导师的指导下，由作者 本人独立完成的。有关观点、方法、数据和文献的引用已在文中指出， 并与参考文献相对应。除文中己注明引用的内容外，本论文不包含任 何其他个- j 或集体己经公开发表的作品成果。对本文的研究做出重要 贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本 声明的法律结果由本人承担。 作者( 签字) ：苍旋吹 日期： 2 - 0 9 罗年j 月归 哈尔滨工程大学 学位论文授权使用声明 本人完全了解学校保护知识产权的有关规定，即研究生在校 攻读学位期间论文工作的知识产权属于哈尔滨工程大学。哈尔滨 工程大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件。 本人允许哈尔滨工程大学将论文的部分或全部内容编入有关数 据章进行检索，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文，可以公布论文的全部内容。同时本人保证毕业后结 合学位论文研究课题再撰写的论文一律注明作者第一署名单位 为哈尔滨工程大学。涉密学位论文待解密后适用本声明。 本论文( 受在授予学位后且口可e 在授予学位1 2 个月后 e 解密后) 由哈尔滨工程大学送交有关部门进行保存、汇编等。 作者。( 签字) ：4 徒f r 烫- 日期： 2 夕 7 年歹月i 乙日 导师( 签字)：r 小似 三一9 7 年岁月i 乙日 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1引言 蛋白质晶体学是一个包括生物、物理、化学和计算数学等多学科交叉的 前沿学科，其中一心任务是得到适合x 射线衍射的蛋白质生物大分子晶体。随 着学科的交叉渗透和迅速发展，蛋白质晶体学正在高速发展，并己成为当前 生物学中的一个重要边缘学科。 1 9 3 4 年b e m a l 和c r o w f o o t 获得胃蛋白酶的x 射线衍射照片，这是人们 首次观测到蛋白质的x 射线衍射图象。19 5 3 年p e r u t z 发现了同晶置换法可以 解决生物大分子晶体结构测定中的相位问题，从而蛋白质晶体学开始踏上自 己发展的伟大历程。仅1 9 6 0 至1 9 9 7 年之间就有1 2 名蛋白质晶体学家在结构 分子生物学领域中由于学科上的重大突破和杰出成就而荣获诺贝尔奖。 从六十年代末进入七十年代，蛋白质晶体学从对生物大分子三维结构测 定迈入生物大分子三维结构与其生物学功能之间的关系研究，从而它既是分 子生物学研究的有力的重要手段，同时也开始为结构分子生物学的建立和发 展历程创造着条件。 但是由于种种原因，这种技术至今仍处于一种初步发展阶段，其最主要 的技术瓶颈是得不到相应的蛋白质晶体或者得到的蛋白质晶体质量不高。在 当前对生物大分子晶体需求日趋增长情况下，蛋白质晶体学变得越来越重要 的，研究如何进行蛋白质大分子晶体生长也受到越来越多的科研工作者的重 视，生物大分子晶体生长现在已经成为了现代生物科学研究的基石，具有十 分重要的作用。 1 2研究蛋白质晶体生长的意义及应用 1 2 1 研究蛋白质晶体生长的意义 结构分子生物学对生物大分子( 包括多亚基、多分子的复合物及复杂的复 合体) 三维结构及其运动的研究手段主要有：x 射线晶体衍射一蛋白质晶体学， 哈尔滨工程大学博士学位论文 二维及多维核磁共振谱，电子晶体学及电镜三维重组，中子衍射，以及应用 傅里叶变换技术的各种谱学方法。它们都各有自身特有的优越性和不足。然 而，无论从已测定生物大分子三维结构的数量上、精确度上或其发展潜力上， x 射线单晶衍射方法一蛋白质晶体学，至今及可见的将来仍将占统治地位， 都是其他手段不可相比的和不可代替的生物大分子三维结构研究手段。八十 年代迅速崛起的蛋白质工程及药物设计已充分显示蛋白质晶体学方法是处于 不可取代的重要地位，也表明结构分子生物学是生物高技术应用研究的重要 前提和保证。 随着生物技术的发展，蛋白质等生物大分子药物不断涌现，其独特的功 能特性越来越受到人们的重视。众所周知，分子的功能特性主要取决于它独 特的三维空间结构，因而，要了解确定某一生物大分子的功能，就必须研究 并测定其三维结构。另一方面，了解生物大分子的结构对于药物设计，改变 或修饰分子结构并使之具有特定的应用特性都具有非常重要的意义。 1 2 2 蛋白质晶体生长的应用基于结构的药物设计技术 蛋白质结晶学的一个重要应用就是基于蛋白质的三维空间结构，进行药 物设计，即设计一系列的小分子化合物，和蛋白质的活性位点结合，使其失 去活性。简单地说，病毒是蛋白质的一种，我们可以利用这一原理，设计某 种抑制分子，使病毒蛋白质失活，而这种抑制分子就有可能成为这种抗病毒 药物的前体。2 0 0 3 年，饶子和院士领导的研究组率先解析出s a r s 病毒主要 蛋白酶及其抑制剂复合物的三维结构，这一成果对研制抗s a r s 药物具有 重要意义。2 0 0 5 年，线粒体膜蛋白复合物i i 的精细结构又被他们首先解析出 来 2 ，填补了线粒体结构生物学和细胞生物学领域的空白，成为线粒体呼吸 链研究领域的一个新的里程碑。这一结构的解析，使人类有希望设计出相关 药物来调控线粒体的功能，也为研究线粒体相关的疾病，如嗜铬细胞瘤、副 神经节瘤和李氏症等提供重要的依据，为解决这类疑难性疾病带来新的曙光。 1 3蛋白质结晶与晶体生长 2 第1 章绪论 1 3 1蛋白质晶体结晶技术 蛋白质结晶方法很多，可分为蒸发扩散结晶( 悬滴法坐滴法) 、批量静置 结晶、平衡透析结晶( 梯度透析法微量扩散小室法) 、液一液界面扩散法、凝 胶扩散结晶、升华结晶 3 】和膜结晶 4 】等。下面介绍一些在实践中应用较成熟的 晶体培养技术。 1 3 1 1蒸发扩散结晶法 蒸发扩散结晶法 5 1 ，是目前在蛋白质生长中采用最普遍的一种方法，第 一次出现是在结晶t r n a 的实验中。该方法是将蛋白质结晶所需要的沉淀剂 浓度的平衡液和略低于这种沉淀剂浓度的蛋白质溶液置于一个封闭体系内， 由于平衡液的渗透压较大，使得蛋白质液滴中的水以水蒸气的形式蒸发扩散 至平衡液中，最后达到平衡而使蛋白质溶液内沉淀剂浓度缓慢增加，蛋白质 溶解性降低，达到过饱和而结晶。而且水分子的扩散速度可以控制，随盐浓 度的改变而变化，平衡液中溶液的浓度可调，液滴的量又可以很小。同时， 因为它的上述优点，也使它非常适合于晶体生长的条件摸索实验。 1 、悬滴法 这种方法最适用于微量的筛选结晶条件。实验通常采用2 4 - t l 自0 塑料组织 培养盒进行，如图1 1 所示。每个蛋白质溶液的样品只需2 1 0 斗l ，平衡液只 需l m l 。因此每次实验可根据需要设计，先配制一系列不同的沉淀剂溶液， 作为平衡液，然后转移到各个封闭小室内，与含有低于平衡液5 0 的沉淀剂 的蛋白质悬滴液扩散平衡( 图1 2 a ) 。最后根据实验结果筛选出一种沉淀剂浓 度作为最佳结晶条件。 2 、坐滴法 方法与悬滴法相同，不同之处仅为液滴体积增大，如5 0 9 l 或更大( 图 1 2 b ) 。这种方法较易生长出大的晶体，重复性较好，但是蛋白质用量较大， 适合于己大体知道结晶条件，或者有足够量的样品可供使用。其缺点是晶体 有时贴在容器底部而不易取出，导致损坏晶体。 哈尔滨工程大学博士学位论文 图1 12 4 孔板示意图 f i g u r e l ia v i e wo f 2 4 w e l l c r y s t a l l l z a t i o np l a t e s 【鼾k j ! ；k 璺 ( a ) 悬滴法f b ) 坐滴法 图12 蒸发扩散结晶法示意图 f i m l r e12t h ei l l u s t r a t i o no f v a p o rd i f f u s i o nc w s t a n i z a t i o n ( a h a n g i n 罢d r o p c r y s t a l l i z a t i o nf b ls i t t i n gd r o pc r y s t a l l i z a t i o n 1 3 l2 批量静置结晶法 批量法【6 】是将要结晶的蛋白质溶液与适量的沉淀剂混合在一起，并使最 终溶液中的蛋白质立即达到过饱和状态，实验装置如图13 所示。相对于悬 滴法或坐滴法，平衡液的作用和蒸发扩散结晶法中不同。它不再起到浓缩悬 滴或坐滴溶液的作用，而仅仅起到维持一个恒定的蒸气压的作用。这种方法 虽然具有操作简单、结晶速度快等优点。但是由于结晶过程是从过饱和状态 开始进行的，因此要控制溶液达到临界与过饱和状态比较困难。一般来说， 在这个阶段蛋白质与沉淀剂浓度的变化量都非常地小。完全有可能在蛋白质 第1 章绪论 - - mm | i 暑暑i 宣昌i 昌i 宣i 宣；宣；i i 宣i ；i 薯 或沉淀剂略为过量时，就使溶液达到过饱和而大量形成晶核。为了克服这种 困难以及筛选某一种合适的条件，可采取配制一系列蛋白质浓度递减和沉淀 剂浓度递增的溶液，观察在哪一种条件下产生较好的晶体。 图1 3 批量静置结晶法不意图 f i = m a r e1 3 t h ei l l u s t r a t i o no fb a t c hc r y s t a l l i z a t i o n 1 3 1 3自由界面扩散法 使用界面扩散法生长晶体是由r a ys a l e m m e 推广得以流行起来的。这种 方法又称作自由界面扩散或液一液界面扩散 7 3 。实验装置如图1 4 所示，该方 法操作简单，利用一根非常细的两端开口的管子，将蛋白样品注进去，然后 将结晶试剂溶液也加入到细管中。整个操作过程都要很小心，尽量避免结晶 试剂和样品混合。实际操作中，一般先加入密度较大的液体，这样才能保证 两者尽可能少的混合。如果操作得当，可以观察到样品与结晶试剂溶液之间 的界面。刚开始可咀加入等体积的样品和结晶试剂溶液，后面再根据结果适 当调整两者的比例以达到最优。细管中加完两种溶液以后，可以用蜡或者其 它密封剂将两端密封起来。 界面扩散法的一个优点是在细管中会形成样品与结晶试剂两者的浓度梯 度。尽管加样过程，重力，以及移动细管的操作都会影响到细管中两种溶液 的界面以及浓度梯度，但是仍然可以在不同的位置观察到不同的晶体大小和 数目。比如，很多小的晶体会在样品浓度高的部位出现，而样品浓度低的位 置就没有晶体出现。 哈尔滨工程大学博士学位论文 隧至 e 王 三三i j j 盂r 。 j a 1 p l ：”6 ；啦。 坷互三堑三! 至二玉! 二至至夏弼 ，l ：c e a g r d m 丑 二二二二二二二二二二 ：r ! s n 圈14 自由界面扩散法示意图 f i g u r e14 t h ei l l u s t r a t i o no f f r e ei n t e r f a c ed i f f u s i o nc r y s t a l l i z a t i o n 1 3 14 平衡透析法 利用半透膜允许小分子透过而不允许大分子透过的性质，来调节蛋白质 溶液离子强度或p h 值，使蛋白质溶液慢慢地接近过饱和状态”。通常是将蛋 白质母液加在小室内，上端封一半透膜，然后把小室放到相应的平衡透析液 内。蛋白质母液内的条件通过半透膜与外部溶液平衡透析而改变。图1 5 为 平衡透析法培养晶体示意罔。 一，：。：j ；* 1 】【= 、 一j 一 图1 5 平衡透析法示意图 f i g a r el5 t h ei l l u s t r a t i o no f d i a l 3 r s i sc r y s t a n i z a t i o n 第1 章绪论 这种方法的优点是：通过有控制的扩散，改变结晶的条件，从而慢慢地 到达晶核形成点。晶体的生长亦可不断地调整，已经产生的沉淀或者微晶可 通过外部条件的改变重新溶解。这种方法可以在低离子强度条件下应用传统 的盐析方法结晶，它既适用于大批量的结晶，亦可应用于微量的结晶。 1 3 2 蛋白质结晶的物理化学条件 简单地说，蛋白质结晶过程就是减小蛋白质的溶解度，使其缓慢析出的 过程。蛋白质溶液达到过饱和的时候，蛋白质在溶液中是处于亚稳态，蛋白 质就能成核并形成晶体，从溶液中析出。关键是要使这个过程足够缓慢，使 蛋白质有机会形成规则的周期排布，才能形成大晶体。如果这个过程发生的 太快，尽管晶体生长的条件已经满足，蛋白质还是完全有可能以无定形状态 或微晶从溶液中析出。 1 3 2 1蛋白质结晶的生物化学条件 蛋白质晶体生长的生化条件主要是指p h 值，离子强度，沉淀剂和添加 剂( 如有机溶剂，盐和去垢剂) 的浓度等因素。 1 、p h 值 p h 值决定着溶质分子的带电性质，是影响溶质分子溶解度的一个重要因 素【6 。一般来说，蛋白质分子带电荷越高，它的溶解性越大，当净电荷为零 时它的溶解性最小。通常情况下，结晶溶液所选用的p h 值与在同等条件下 最易使蛋白质发生沉淀的p h 值大致相同。当蛋白质净电荷等于零，即在等 电点时，其溶解度往往最小。所以，蛋白质、酶等大分子结晶的p h 值多选 在该分子的等电点附近，利用这一性质作等电点结晶。如果结晶时间较长并 希望得到较大的结晶时，p h 值可选择离等电点远一些，但必须保证这些分子 的生物活性不降低或不丧失。 2 、离子强度 蛋白质分子是一个大的多价离子，它的溶解性依赖于溶液的离子强度。 不同离子对蛋白质溶解度的影响不同，一般小的高电荷离子比大的低电荷离 哈尔滨工程大学博士学位论文 子的影响大。盐对蛋白质溶解度的影响正比于离子所带电荷及其浓度。另外， 金属离子能引起蛋白质的结晶【9 】，加速晶体的形成过程，特别是某些二价金 属离子能促进晶核长大。 3 、沉淀剂 对于蛋白质的结晶，沉淀剂的作用主要在于对溶剂( 水) 的影响而非对蛋 白质分子的影响。一般来讲，沉淀剂主要分为5 类 1 0 】：( 1 ) 盐类，如：磷酸 盐、硫酸铵等；( 2 ) 高分子直链聚合物，如：聚乙二醇p e g 、聚乙烯醇p v a 、 聚乙烯基毗咯烷酮p v p 等；( 3 ) 小分子多元醇类。如：2 甲基2 ，4 一戊二醇； ( 4 ) 有机溶剂类，如：乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、叔丁醇等：( 5 ) 磺酰类染 料。在实际工作中，通常使用混合沉淀剂以获得更好的实验效果。 4 、添加剂 在结晶过程中，在蛋白质的溶液中添加化合物会影响蛋白质的结晶。一 些研究己经表明添加剂对蛋白质溶解度有很大的影响，这些影响可能是由于 添加剂影响了蛋白质分子间的相互作用 儿12 1 、结晶过程中的热力学平衡、晶 体的表面能及蛋白质结晶的成核过程【1 3 】。某些情况下，添加剂可提高x 射线 衍射质量，扩充衍射范围。 1 3 2 2 蛋白质结晶的物理条件 这里所说的物理条件是指温度，外加物理场、激光与超声波等因素。在 生物化学条件合适的情况下，往往就可以得到结晶，物理条件掌握得好，才 可以获得大的单晶，因为物理条件控制了晶核的形成速度和晶体生长的速度。 1 、温度 这是影响蛋白质结晶的重要参数之一。o 4 是大分子最适宜的结晶 温度，几乎有1 4 0 0 种样品适合这一剧1 4 1 。大多数蛋白质在4 时比室温下 溶解度低也更稳定。低温下更慢的溶解能力的变化可以使蛋白质有足够时间 聚集为有序的晶体形式。但室温操作可使程序简化，可在2 0 一2 4 下结晶 的蛋白质也约有8 0 0 种 1 4 1 。蛋白质结晶的操作温度选择依其稳定程度而定。 8 第1 章绪论 2 、重力场 大量的研究结果表明，在微重力场条件下，获得的蛋白质晶体具有较大 的外观尺寸和较高的品质【1 5 】。这主要是由于在微重力的环境下，定程度上 消除了由于重力引起的分子间的对流和沉降，降低了晶体表面的浓度梯度变 化【1 6 】，从而优化了蛋白质分子的结晶过程，改善了晶体的质量，提高了衍射 强度。 3 、静电场 蛋白质分子表面带有不同的电荷和极性基团，当对其实施外加静电场时， 就会引起电荷在蛋白质分子表面的重新分布，改变蛋白质分子的溶解度，从 而导致结晶行为的变化。另一方面，p e n k o v a t l7 等通过对溶菌酶、血清铁蛋白 的研究发现，外加电场能引起分子间的对流，可以通过控制电场强度来调控 对流的速度，进而实现对形核速率的控制。实验结果证明，外加电场的应用 不但可以得到较大的晶体，还可以提高结晶操作的可重复性。 4 、磁场 在外部磁场的作用下，晶体的晶型、粒度的大小与分布、形状等都有不 同程度的改变。虽然关于这方面的机理研究仍不明确，但是大多数科学家都 认为，外部磁场的实施促进了蛋白质分子在溶液中的分散，降低了溶液中的 浓度梯度变化，一定程度上是对微重力场条件的模拟和再现。m o t o k a w a 掣1 8 】 将外加磁场应用于蛋白质结晶，发现磁场可以降低形核速率，形成外观尺寸 大、衍射强度高的蛋白质晶体。 5 、超声波与激光 k a k i n o u c h i 掣1 9 1 的研究结果表明，超声波可以控制蛋白质结晶的过饱和 度、提高晶核的生成速率，对簇状多晶的生成有抑制作用，有利于生成大于 临界尺寸的晶核。目前，对于激光的研究主要是利用其对蛋白质晶体进行接 种、取出、分离等机械操作，在不破坏晶体的情况下获取x 射线衍射数据。 k i t a n o 等2 0 1 利用紫外激光辐射成功的将培养的可溶性蛋白和膜蛋白取出，并 进行了x 射线衍射分析。 9 哈尔滨工程大学博士学位论文 1 3 3 蛋白质晶体生长的特点及特殊性 1 3 3 1蛋白质晶体生长的特点 由于生物大分子本身内在的因素( 固有的结构复杂性、分子本身大且柔 软、对外界敏感易变化) ，生物大分子晶体与小分子晶体相比有如下特剧2 1 卫 ： 1 、样品来之不易( 量少、昂贵) ； 2 、不易结晶( 分子大、组成复杂、结构复杂) ，只有在热力学不稳定的过 饱和溶液中结晶。结晶过程是多参数协同综合过程，条件苛刻，重复性差； 3 、生物大分子的空间群有限，因而晶体外形简单； 4 、蛋白质晶体长不大，极限限度一般 b m i m b f 4 b m i m p f 6 。 用b m i m c i 生长蛋清溶茵酶晶体时得到的溶菌酶单晶易碎，无法获得x 射线衍射数据，且结晶过程过快不易控制。实验结果表明， b m i m b f 4 更有 利于溶菌酶单晶体的生长。f b m i m j p f 6 不适宜用于溶菌酶单晶体的生长，所 得到的为多晶和无定形沉淀。 由于三种离子液体在水中的溶解度不同， b m i m b f 4 与蛋白质分子争夺 水分子不j z 1 b m l m c l 激烈，可使蛋白质分子缓慢析出，溶液的过饱和度较低， 更有利于晶体的生长。实验结果表明，在 b m i m b f 4 水体系中，2 5 时己 经可以得到符合条件的单晶，不需要通过降低结晶温度来减缓蛋白质的沉积 速度，同时j 羽 b m i m b f 4 生长蛋清溶菌酶时最佳浓度比 b m 肼 c l 的高，这都 说n b m i m b f 4 具有降低溶液过饱和度的作用。 b m i m p f 6 不溶于水，对晶 体的生长无任何贡献，而且由于其强烈的电离水解作用，导致溶液的离子强 度过高，得到的都是多晶和变质的无定形沉淀。 哈尔滨工程大学博士学位论文 4 5 2 离子液体对晶核形成的影响 成核是指溶解在溶液中的分子或非晶态的低聚体( 二聚体，三聚体等) 以 过饱和度为驱动力聚合在一起形成热力学稳态的点阵结构。d r e n t h 等8 】研究 发现，在蛋白质结晶后其溶液体系的自由能降低了1 2 2 4 k j t o o l 。另外，结晶 蛋白质与非特异性蛋白质聚集物及非晶态的蛋白质沉淀物不同，后者在从过 饱和溶液中形成的过程当中并不涉及表面积和体积之间的竞争。因此，其形 成的速率要比结晶快得多。 从过饱和溶液中形成晶态聚合物并不意味着最终会形成宏观上的晶体。 这种晶态聚合物必须超过特定的大小( 临界尺寸) 才会继续生长形成晶体；如 果其尺寸小于临界尺寸，则发生自溶现象，最终无晶体形成。蛋白质分子是 具有一定几何外形的，结构复杂，其带电的、极性的基团分布在分子的表面， 它的溶解性质可以像任何其他类型的水溶性分子一样来考虑。在溶液中，由 于水分子与蛋白质表面的带电基团和极性基团相互作用，在蛋白质分子的周 围形成一个水层。而水的介电常数较高，使得其它带电的分子的极性与相互 作用力增加，不能相互溶解而沉淀，释放出水分子，从而使蛋白质分子溶解 于水溶液之中9 1 。 根据相关文献报道，溶菌酶的最佳结晶条件是n a c l 浓度为4 、室温、p h 为4 5 的缓冲溶液 1 7 0 1 。如前3 4 3 节所述，离子液体对溶液f l 勺p h 值影响较小， 在结晶过程中，主要起到了类似于沉淀剂的作用，促进蛋白质分子从溶液中 析出。培养溶液中i j , je b m i m + 离子、 b f 4 离子和c 1 。离子可以争夺蛋白质周围 的水分子，结果导致蛋白质分子周围水化层的破坏而降低了蛋白质的溶解性， 提高了溶液的过饱和度，从而使蛋白质分子从水化层中释放出来( 如图4 1 7 所 示) 。本实验用离子液体替代一部分无机盐n a c i 起到联合沉淀剂的作用，n a c l 相对于离子液体更易溶于水，它们比离子液体更激烈的争夺水分子。因此， 在不加入离子液体的空白样品中，溶液达到过饱和更快，晶体结晶更迅速， 生成多晶、无定形沉淀或有缺陷的晶体。 另一方面，虽然在仅以n a c l 为沉淀剂的样品中，偶然有较完美的晶体出 8 2 第4 章蛋清培菌酶晶体生长的研篼 j j j 一i e j | | e e 目目j l 现，但由于蛋清溶菌酶沉淀结晶的速率较快，导致培养溶液中有较多不必要 的成核中心，常常得到数量多且体积较小的晶体。引入离子液体后，由于其 具有缓和蛋白质沉淀速率的特性，更容易形成高浓度、低过饱和度的物理化 学环境，符合x 射线衍射条件的单晶体的出现几率明显增加。 蛋虽质舟子 、 l 术膜 r b r m r r d + 菩手 。 酊吾寻 习：南子 凹言子 图41 7 离于液体争夺蛋白质分子表面的水分子示意图 f i g u r e4 1 7t h e i l l u s t r a t i o n f o r t h ep r o c e s so f p r o t e i n l o s s w l l t e l b y i o n i c l i q u i d 4 5 _ 3 离子液体对晶体生长的影响 当体系中已形成稳定的晶核后，在适宜的条件( 通常与成核条件并不相同 下，晶核开始生长。由于晶体的生长最终是在固一液界面上进行，所以固一液 界面的结构和行为对于生长机制可以起到决定性的作用 1 2 1 , 1 2 2 】。蛋白质晶体 生长状况取决于溶液过饱和动力学。对于汽相扩散的晶体生长，过饱和度的 变化又取决于溶剂水的蒸发与扩散过程。浓度差的存在是溶质扩散的本质原 因，扩散过程是限制生长速率的主要因素。 针对悬滴法晶体生长，m k o ! 等 1 2 3 】考察了悬滴与池液中的沉淀剂浓度比 生长温度、悬滴的形状和悬滴与池液表面的距离等对水扩散过程的影响。结 果表明，决定水扩散动力学的主要因素是温度、沉淀剂性质及在悬滴与池液 一 _ 一 争参 暑l。也fok_葛；tkw 。 辛 9 =鬈_葛_馨譬葛鬈_ 黛 o 哈尔滨工程大学博士学位论文 中的浓度比，以及液滴的初始表面积与体积，而悬滴与池液间的距离对水扩 散无明显影响。 由于离子液体本身具有低蒸汽压的性质，可以有效的控制水分子的蒸发 扩散速率，降低晶体生长速率。用f b m i m c 1 结晶溶菌酶时，得到的晶体易碎， 这主要是由于 b m i m c l 的溶解度大于 b m i m b f 4 ，在 b m i m c 1 的作用下， 蛋白质分子失水、沉积的速率较快，晶体质量不高。 由此可见，离子液体既对