（物理化学专业论文）几种氨基酸双保护的工艺研究.pdf

摘要 在生命科学研究中，随着人们对氨基酸、多肽、蛋白质的生物作用研究日 趋深入，活性多肽类似物的分子设计及化学合成成为研究其结构与功能关系的强 力手段，由此对氨基酸结构、品种的需求越来越繁杂，所以氨基酸己成为一个非 常活跃的研究领域。 为了避免副反应的进行，我们需要事先把不需反应的氨基进行保护，使它 们在合成过程中不会参与反应，从而避免副产物的生成。因此，肽合成的根本问 题是氨基的保护问题。然而氨基酸分子结构中往往还有其它多种活性基团，也 会在活化过程中参与反应，而不得不使用许多保护手段。有时为了满足反应的进 行，有些氨基酸不仅自身的氨基需要保护，它们所带的其他官能团也需要保护。 本论文研究的是氨基酸的双保护，主要研究对象是f m o c g l n ( t r t ) o h ， b o c - c y s ( a c m ) - o h ， f m o c - a r g ( p b f ) 一o h ，f m o c - a r g ( p m c ) 一o h f m o c - a r g ( m t r ) 一o h 。 其保护过程主要为： 1 h g i n o h - - z g i n - o h z g l n ( t r t ) 一o h f m o c - g 1 n ( t r t ) 一o h 在c b z g l n o h 的制备过程中，我们经实验发现只用水作溶剂就可以使反 应进行完全，不仅降低了成本，还节省了操作步骤，减轻了环境负担；在 c b z g l n ( t r t ) 一0 h 的制备的制各过程中，我们采用乙酸乙酯作溶剂，一方面使反 应同样能够顺利进行，降低了成本，另一方面有利于将产物从水中萃取，也大大 降低了乙酸乙酯的用量；在f m o c g i n ( t r t ) 一o h 的制备过程中，我们用丙酮作溶 剂，大大降低了成本，也得到了较高的产率。 2 h - c y s h c l 一h - c y s ( a c m ) 一o h h c l b o c c y s ( a c m ) - o h 在a c m 的制备过程中，我们采用乙酰胺和多聚甲醛熔融的制备方法，使反 应体系中不引入水，有利于反应的进行，大大提高了产率和操作性：在 h c y s ( a c m ) o h h c l 的制备过程巾，用精馏的方法回收溶剂中的三氟醋酸，使三 氟醋酸网收率可提高剑r j 一9 0 ，有效地降低了原料成本。 3 h - a r g o h z p u g o h z - a r g ( p b f ) 一o h ( za r g ( p m c ) 一o h ，z - a r g ( m t r ) - o h ) 一h - a r g ( p b f ) 一o h ( h a r g ( p m c ) - o h ，h - a r g ( m t r ) 一o h ) 一f m o c a r g ( p b f ) 一o h ( f m o c a r g ( p m c l 一o h ，f m o c a r g ( m t r ) - o h ) 在p b f c 1 、p m c c 1 以及m t r c t 的制各过程中，我们采用反应液滴入冰的 碳酸氢钠溶液中，使产物水解量大大降低：在z - a r g ( p b f ) 一c h a 、z - a r g ( p m c ) 一c h a 以及z - a r g ( m t r ) 一c h a 的制备过程中，我们在其中加入了相转移催化剂t e b a ，实 现了均相反应，使反应易于进行，缩短了反应时间，并且降低了p b f c l ( p m c c l 以及m t r - c 1 ) 的用量，大大提高了产率。 在本文的研究过程中，首先查阅了大量资料，了解国内外对研究对象的研 究状况，选择较优的路线进行改进。有时不仅仅是对目标产物的制各过程进行改 进，同时改进的还有部分保护基原料的制备过程。然后通过大量的实验，从工业 化的角度出发，通过使用替代溶剂、改善加料或后处理方式等方法，尽可能的提 高产率、降低成本、改善其可操作性，使其更适合于工业化生产。 关键词：氨基酸、双保护、工艺改进 a b s t r a c t w i t ht h ef u r t h e rr e s e a r c ho nt h eb i o l o g i c a la c t i o no fa m i n oa c i d s ，p e p t i d e ，p r i t e i n a n ds oo ni n l i f es c i e n s e ，t h es t r u c t u r a ld e s i g na n ds y n t h e s i so fp e p t i d ea sw e l la si t s d e r i v a t i v et u r n e di n t ot h ee f f e c t i v em e a n st or e s e a r c ht h e i rs t r u c t u r ea n df u n c t i o n a n d t h e nt h en e e d sf o rs t r u c t u r e sa n dk i n d so fa m i n oa c i da r em o r ea n dm o r e m i s c e l l a n e o u s t h ef i e l d so fa m i n oa c i db e c o m eq u i t ea c t i v e 1 no r d e rt oa v o i ds i d er e a c t i o n t h ea m i n ow h i c hw i l l l e a dt os i d er e a c t i o n s h o u l db ep r o t e c tb e f o r e h a n d s ot h ep r i m a r yq u e s t i o no fp e p t i d es y n t h s i si sh o wt o p r o t e c ta m i n o b u ta n o t h e ra c t i v eg r o u p se x s i s ti nt h es t r u c t u r eo fa m i n oa c i d ss u c ha s c a r b o x y l ，t h i o h y d r o x y , c a r b o x a m i d ea n ds oo n t h e yw i l la l s ol e a dt os i d er e a c t i o n i n o r d e rt oe n s u r et h er e a c t i o ns u c c e s s f u l l y , n o to n l yt h ea m i n on e e d sp r o t e c t i o n ，b u ta l s o o t h e rg r o u p s t h e nt h ep e p t i d es y n t h e s i sw i l lg oa l o n ga c c o r d i n gt oo u rd e s i r e t h i s w a yw i l l n o to n l ya v o i ds i d er e a c t i o n ，b u ta l s or e d u c et h em a t e r i a lw a s t a g ea n d s i m p l i f yt h ep r o c e s so fp u r i t i c a t i o n t h eo b j e c to ft h ep a p e ri sd i p r o t e c t i o no fa m i n oa c i d sw h i c hh a sp r o c e s sa s f c i l l o w ： 1 h g i n o h _ z g i n o h z g l n ( t r t ) 一o h f m o c lg l n ( t r t ) 一o h i nt h ep r e p a r a t i o no fz g t n - o h ，w ef o u n dt h a tt h er e a c t i o nc o u l dp e r f o r m o n l yw i t hw a t e r a st h es o l u t i o n w a t e rc a nn o to n l ym a k et h er e a c t i o np e r f o r m c o m p l e t e l y , b u ta l s or e d u c et h ec o s ta n ds i m p l i f yt h ep r o c e s s d ol i k et h i sa l s ob e n e f i t t h ee n v i r o n m e n t i nt h ep r e p a r a t i o no f z g l n ( t r t ) 一o h ，w ea d o p t e de t h y la c e t a t ea s s o l u t i o n o n es i d e ，i tm a k e st h er e a c t i o np e r f o r mf l u e n t l ya n dd e c r e a s et h ec o s t o nt h e o t h e rh a n d ，i tm a k e st h ep r o d u c t sb ee x a c t e df r o mw a t e re a s i l ya n dd e c r e a s et h e c o n s u m p t i o n i nt h ep r e p a r a t i o no ff m o c - g l n ( t r t ) 一o h ，w ea d o p t e da c e t o n ea s s o l u t i o nt oj n c r e a s et h ey i e l da n dr e d u c et h ec o s t 2 h c y s h c i _ h - c y s ( a c m ) 一o h b o c c y s ( a c m ) 一o h i nt h ep r e p a r a t i o no fa c m ，w el e ta c e t a m i d ea n dp o l y o x y m e t h y l e n em e l t t o g e t h e rt or e a c tc o m p l e t e l y i tb e n e f i t st h er e a c t i o n ，i n c r e a s et h ey i e l da n dm a k ei t e a s i l yo p e r a t e db e c a u s er i ow a t e re x s i s t i nt h ep r e p a r a t i o no fh c y s ( a c m ) 一o h w e r e c y c l e dt h et r i f l u o r o a c e t i ca c i db yt h em e a n so f r e c t i f i c a t i o n t h er e c y c l e dr a t ew a s i m p r o v e dt o8 5 t o9 0 a n dt h ec o s tw a se f f e c t i v e l yd e c r e a s e d 3 h a r g 。o h z _ a r g 。o h z - a r g ( p b f ) 一o h ( z - a r g ( p m c ) 一o h z - a r g ( m t r ) - o h ) _ h - a r g ( p b f ) o h ( h - a r g ( p m c ) - o h ，h a r g ( m t r ) 一o h ) 一f m o c - a r g ( p b f ) 一o h ( f m o c a r g ( p m c ) 一o h ，f m o c a r g ( m t r ) o h ) i nt h ep r e p a r a t i o no fp b f c 1 、p m o c 1a n dm t r c 1 ，t h er e a c t e dm i x t u r e w a sd r o p p e di n t oi c yn a h c 0 3s o l u t i o n ，w h i c hr e d u c e dh y d r o l y s i s i nt h e p r e p a r a t i o no fz - a r g ( p b f ) 一c h a 、z - a r g ( p m c ) 一c h aa n dz - a r g ( m t r ) 一c h a w ea d d t e b aa st r a n s f o r mp h a s ec a t a y s t ，w h i c hn o to n l ym a k e st h er e a c t i o n p e r f o r m e df l u e n t l yt h et i m e ，b u ta l s or e d u c e st h et i m ea n dt h e c o n s u m p t i o no fp b f c l 、p m c c i a n dm t r c 1 i nt h er e s e a r c hp r o c e s so ft h i sp a p e r if i r s t l yr e f e r e dt om a n yp a p e r st of i n do u t t h er e s e a r c hc i r c u m s t a n c e ，a n dt h e ns e l e c t e dt h ep r i o rc o u r s et oi m p r o v ea n d d e v e l o p i n o to n l yi m p r o v e dt h e p r e p a r a t i o no ft a r g e tp r o d u a i o n ，b u ta l s os o m em a t e r i a lo f p r o t e c t i o ng r o u p s a n dt h e n1d i d al o to fe x p e r i m e n t st oi n c r e a s et h ey i e l d ，r e d u c e t h ec o s t ，a n dm a k et h e me a s i l yo p e r a t e d w h a tih a v ed o n ew a st om a k et h e mf i tf o r i n d u s g i a lp r o d u a i o n k e yw o r d s ：a m i n oa c i d ，d o u b l ep r o t e c t i o n ，t e c h n i c a li m p r o v e m e n t 塑受斐亟学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 余承乏厕教疋 俄雪丢 主席 陆弛品副教授 亿馆吾 晦棚裥 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我 所知，除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成 果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 储龆蝴亟翌嘲迎垦 学位论文使用授权声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。 学位论文作者签名：胡叫j 砭 日期：趟。叠 几种氨基酸双保护的工艺研究 第一章绪论 蛋白质是生物体内一切组织的基本组成部分和生命的重要物质基础，不 论高等动物、植物还是简单的细菌和病毒都含有蛋白质。它是细胞原生质的主要 成分，与核酸起构成了生命体的物质基础。一切生命的生命现象，例如肌肉的 运动和收缩、肠胃的蠕动和等都与蛋白质密切相关。许多蛋白质和多肽具有十分 重要的生理作用，是生命中不可缺少的物质。例如，我们身体内每秒种千千万万 个化学反应的催化剂酶，就是蛋白质的化合物。生命的基本特征就是蛋白质 的不断自我更新。 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨 基酸和蛋白质之间的一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结 合而成。到现在，人们己发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研 究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意 义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构； 设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要 信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。 蛋白质和多肽是由多种氨基酸组成，人体氨基酸有二十多种，蛋白质和多 肽是由多种氮基酸组成，不同的的氨基酸排列构成不同的蛋白质和多肽。最微小 的序列变化也会引起蛋白质结构的巨大改变。即使只有一个或极少数的几个氢 基酸被取代或消除，蛋白质就不仅是看上去不同，而且活性也会改变。因此，a 氨基酸是构成蛋白质的基石。探讨蛋白质的结构和性质，首先要研究氨基酸的 化学。 ( 1 1 一氮基酸在食品工业、饲料生产和医药工业中有多种用途。如l 一谷氨酸 钠盐大量用作调昧剂；在植物蛋白中加入某些必须氨基酸能强化其营养效果； 由结晶氨基酸制备的输注液常用来补充外科手术前后的病人的营养；一些氨基酸 或其衍生物可用于药用。 这些年柬，多肽与蛋白质的人工合成，以及在此基础上进一步研究它们的 结构1 j 功能的火系已经成为蛋白质化学中中一个f j ，疗活跃的领域。而蛋白质和多 肽的基本组成r 尊位氮丛酸，自然也成了人t l j 研究的焦点。往生命科学研究 几种氨基酸双保护的工艺研究 中，随着人们对氨基酸、多肽、蛋白质的生物作用研究日趋深入，活性多肽类似 物的分子设计及化学合成成为研究其结构与功能关系的强力手段，由此对氨基酸 结构、品种的需求越来越繁杂，所以氨基酸已成为一个非常活跃的研究领域。 尽管内生或天然肽有很高的能量，但它的构想变化幅度很大，它们的柔 性降低了受体的活性。”1 由于肽易受到酶的快速降解，使得其在药物上的应用 直受到限制。另外，肽类药物生物可获得性低，不能口服。”1 因此有必要对肽或 蛋白质的结构进行修饰、改造，以提高其性能。 近年来，大量的工作集中在研究新型相似结构氨基酸的合成，以及相似 肽的分子设计。“。对于天然肽和蛋白质的改造，化学工作者提出三种方法：第一 种是n 取代的a 一氨基酸，第二种是8 ，y 等非n 一氨基酸，第三种是在氨基 上引入新的基团。* ， 当人们想合成所需的蛋白质和多肽时，从合成的理论来讲主要就是把氨 基酸按一定的顺序排列起来，利用氨基和羧基的脱水形成肽键，进而形成我们所 需要的结构。但从合成的实际反应情况来看，两个氨基酸进行排列会有两种可能： _ h 2 上 + r 1 c c c h _ h 2 r 2 八c h 一 j ：j h 。甲心_ h 2 r ，人c 删+ r 2 八c o o h r ，人c n hy 陀 o i i c o o h ( 2 ) 其中，( 1 ) 是我们所预期的产物，而( 2 ) 则是副产物。为了避免副反应的进行，我 们需要事先把不需反应的氮基进行保护，使它们存合成过程中不会参与反应，从 而避免副产物的生成。否则， 般羧基 i 化方法使反应活性提高的同时总伴随着 反应选择性下降：反之，选择性虽然改蒋，但反应活性【! | j 义不够。因此，肽合成 几种氨基酸双保护的工艺碍究 的根本问题是氨基的保护问题。 氨基酸中的氨基是一个很活泼的活性基团，在反应中很容易发生副反应。 因此，在合成前应首先对氨基进行保护在固相肽合成过程中，氨基酸的保护主 要有以下几个方面“】： ( 1 ) 抑制氨基酸内部反应 ( 2 ) 不引入新的、不必要的反应 ( 3 ) 无论在酰化过程中还是脱保护过程中，都在某一条件下稳定存在 ( 4 ) 最终可以在温和的条件下被脱掉而不会影响新的、已形成的肽键。 因而所有保护基的选定都应首先符合这些条件。 今天，氨基酸各种基团的保护得到了很大发展一般来说分烷氧羰基、酰 基和烷基三大类。其中烷氧羰基主要用于肽和蛋白质中氨基酸的保护；而酰基则 广泛应用于生物碱的合成，以及在核苷酸合成中用以保护含氮碱基腺嘌呤、鸟嘌 呤和胞嘧啶。”3 其中，烷氧羰基使用的最多，因为n 一烷氧羰基保护的氨基酸在 反应中不易发生消旋化。”。常用的烷氧羰基保护基有f m o c ( f m o c ：9 一芴甲氧羰 基) 、b o c ( b o c ：叔丁氧羰基) 午d c b z ( c b z ：苄氧羰基) 几种。这些保护基有不同 的稳定条件，脱保护的方法也不同，可以根据反应的需要来选择。最常用的有 以下三大类： ( 一) b o c ( b o c ：叔丁氧羰基) 9 h a o c h a - - g o c c h 3 b o c 是目前多肽合成中应用广泛的保护基它具有以下优点： ( a ) 较易得到结晶： ( b ) 易于酸解除去，且具有一定稳定性( b o c 一氮基酸可以长期保存而不分解) ( c ) 酸解时牛成异丁烯，小喇 来剐反虚： ( d ) 对碱和肼都稳定，对催化氧解 定“。 几种氨基酸双保护的工艺研究 因此，除个别化合物原料问题外，很多都可采用b o c 保护基来保护氨基。 b o c - - 氨基保护的试剂很多“”。“，从反应及原料的特性来看，多数选择二叔丁氧 甲酸酐( ( b o c ) ，o ) 1 ( 二) c b z ( c b z ：苄氧羰基) o | | c h 2 一o c c b z 虽然是1 9 3 2 年由贝尔格曼( b e r g m a n ) 发现的一个很老的氨基保护基 “”，但直到今天还在普遍的应用。其优点在于： ( a ) 试剂的制各和保护基的导入都比较容易。 ( b ) n 一苄氧羰基氨基酸和肽易于结晶且比较稳定。除z l e u 为油状物外， 绝大多数氨基酸的苄氧羰基衍生物都可以得到结晶。 ( c ) 苄氧羰基氨基酸在活化是不易消旋。 ( d ) 能用多种温和的方法选择性的脱去。 自由氨基酸在用氢氧化钠或碳酸氢钠控制的碱性条件下可以很容易同苄 氧羰基氯反应得到n 一苄氧羰基氨基酸。氨基酸酯同苄氧羰基氯的反应则是在有 机溶剂中进行，并用碳酸氢盐或三乙胺中和所产生的h c i 。此外，z - o n p 、z - o s u 等苄氧羰基活化酯也可用来作为苄氧羰基的导入试剂，但一般都是用苄氧羰基氯 作导入试剂。因为苄氧羰基氯很容易用苯甲醇同光气的反应来制备，在冰箱里保 存半年以上而不发生显著的分解。 有的n 一苄氧羰基氨基酸能和它的钠盐按一定比例形成共晶，共晶产物的 熔点较高，并难溶于有机溶剂。例如，苯丙氨酸经苄氧羰基化后加酸析出z p h e 时常常得到共晶产物( 熔点1 4 4 。c ) ，此共晶产物用乙酸乙酯和1 n 盐酸一道振 摇时可以完全转化为z - p h e 而溶于乙酸乙酯中。因此，除了z 一( ；1 y 和 z d l s e r ( 1 j z l ) 之外，般都是采用酸化后朋有机溶剂抽提的力法来得到纯的 n 一苄氧羰基氨丛酸。 几种氨基酸双保护的工艺婶究 ( 三) f m o c c = o 0 但是，由于b o c 、t b u 等保护基对酸敏感，人们开始尝试寻找在酸性条件 下能稳定存在的保护基。f m o c 的出现正好满足了这一要求。f m o c 同前面所讲的烷 氧羰基不同，它对酸稳定，但能用浓氨水或二氧六环一甲醇- - 4 nn a 0 h 溶液( 3 0 ： 9 ：1 ) 以及用哌啶、乙醇胺、1 ，4 一氮氧六环、吡咯烷酮等胺类5 0 二氯甲烷溶 液脱去n 6 3 。 多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固 相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出 优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。以这些氨 基保护为基础的各种氨基酸的双保护以及多肽和蛋白质的固相合成也相继出现 和发展，并仍在不断得到改造和完善。me r r i f i e l d 所建立的用b o c 保护的氨基酸 来合成肽【1 7 】是采用t f a ( 三氟乙酸1 可脱除的b o c 为a 一氨基保护基，侧链保护 采用苄醇类合成时将一个b o c 一氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用t f a 脱除 b o c ，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过d c c 活化、耦联下一个氨基酸，最 终脱保护多采用h f 法或t f ms a ( - j 氟甲磺酸1 法用b o c 法已成功地合成了许 多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等但是，在b o c 合成法中，反复 地用酸来脱保护，这种处理带来了一些问题：如在肽与树脂的接头处，当每次用 5 0 t f a 脱b o c 基时，有约1 1 4 的肽从树脂上脱落，合成的肽越大，这样的 丢失越严重；此外，酸催化会引起侧链的一些剐反应b o c 合成法尤其不适于合 成含有色氨酸等埘酸不稳定的肽炎1 9 7 8f f ，c h a n g 、m e i e n l o f e r 和a t h e n o n 等人 几种氨基酸双保护的工艺碍究 采用c a r pi n o 【1 5 l 报道的f m o c ( 9 一芴甲氧羰基) 基团作为a 氨基保护基，成功地 进行了多肽的f m o c 固相合成1 1 f m o c 法与b o c 法的根本区别在于采用了碱可 脱除的f m o c 为a 氨基的保护基侧链的保护采用t f a 可脱除的叔丁氧基等， 树脂采用9 0 t f a 可切除的对烷氧苄醇型树脂和1 t f a 可切除的二烷氧苄醇 型树脂最终的脱保护避免了强酸处理 氨基酸的分子结构中，起码有两个官能团，即氨基和羧基，另外还有一些 其他的基团，如酰氨基、巯基、胍基、b ，y 一羧基、咪唑、( 1 ) 一氨基、b ，y 一酰胺、吲哚等。氨基酸作为多肽合成、人工合成蛋白质的原料，在多肽合成过 程中氨基和羧基的连接，先要用适当的试剂处理活化才能形成肽键，当前以活化 羧基为主。 然而氨基酸分子结构中往往还有其它多种活性基团，特别是羟基、巯基以 及不希望参加反应的某些氨基和羧基也会在活化过程中参与反应，而不得不使用 许多保护手段。例如合成苯丙一甘，必须把苯丙氨酸的氨基和甘氨酸的羧基保护 起来，使肽键只能在指定的氨基和羧基之间生成，并且所选择的保护基团在肽键 生成后应易于除去，另一方面必须使欲反应的羧基或氨基活化，以使肽键的顺利 生成。此外，除甘氨酸之外的a 一氨基酸都是旋光的，因而必须注意任何一个反 应条件都构型的转化或外消旋化。多肽的合成过程必须满足以上的严格要求。有 时为了满足反应的进行，有些氨基酸不仅自身的氨基需要保护，它们所带的其他 官能团也需要保护。这样合成才能按照我们的构想进行，避免副反应的发生，减 少不必要的原料损失和分离提纯过程。 a s p 和g u 侧链羧基常用卜b u 保护，可用t f a 、t m s b r 等脱除，但是用t b u 保护仍有侧链环化形成酰亚胺的副反应发生。近年来，发展了一些新的保护基如 环烷醇酯、金刚烷醇酯等可减轻这一副反应，这些保护基可用t m s o t f ( 三氟甲磺 酸三甲硅烷酯) 除去；s e r 、t h r 的羟基及t y r 的酚羟基通常用t b u 保护，首先 s e t 制成苄氧羰基酯，再在酸催化下与异丁烯反应。s e r 和t h r 还可用苄基保护， s e r 用苄醇引入苄基、t h r 用溴苄引入苄基；a s n 和g l n 侧链的酰胺键可以用9 一 咕吨基，2 ，4 ，6 一三甲氧苄基，4 ，47 一一甲氧二苯甲基或三苯甲基等保护，这 四种基因均可用l 、f a 脱除；c y s 的- - s h 常用保护基有三类：一类用t f a 可脱除， 如对甲苄基、埘甲氧苄丛和三笨甲基等：第：类可用( c f 3 c o ) 3 t l t f a 脱除，对 几种氨基酸双保护的工艺研宪 t f a 稳定如t b u 、b o m 和乙酰胺甲基( a c m ) 等第三类对弱酸稳定，如苄基和 叔丁硫基( s t b u ) 等，c y s ( s t b u ) 可用巯基试剂和磷试剂还原，c y s ( b z l ) 可用 n a n h 3 ( 1 ) 脱保护；a r g 的胍基具有强亲核性和碱性，必须加以保护保护基分四 类：( 1 ) 硝基( 2 ) 烷氧羰基( 3 ) 磺酰基( 4 ) 三苯甲基。 因此本论文的研究对象就是氨基酸的双保护。从工业化的角度出发，对其 进行工艺上的改进与优化，尽可能的提高产率、降低成本、改善其可操作性，使 其更适合于工业化生产。 目前，国内外研究和生产双保护了的氨基酸的单位不是很多，其中大多只 停留在实验室阶段。因此如何将氨基酸双保护的合成推向工业化生产就成为一个 非常有意义的领域。国内对氨基酸双保护鲜有报道，品种较多的生产厂商主要有 上海波泰科技有限公司( f m o c 一氨基酸有5 0 几个品种，b o c 一氨基酸有7 0 几个 品种) ，上海再创科技有限公司，吉尔生化( f m o c 一氨基酸有5 0 几个品种，b o c 一氨基酸有8 0 几个品种) 等，但是它们的产品单保护居多，双保护品种很少，而 且产量不大( 均在公斤级以下) 。 几种氨基酸双保护的工艺研究 第二章f m o c - g l n ( t r t ) 一o h 制备的工艺改进 一、日u 吾 在多肽合成中，天冬酰胺( a s n ) 和谷氨酰胺( g l n ) 侧链的酰胺键在肽 合成中一般不加以保护但合成大的肽链时，侧链未被保护的g l n * g a s n 经常遇到 一些难以解决的问题： 首先，n 一保护了的天冬酰胺( a s n ) 和谷氨酰胺( g l n ) 中的羧基活化时， 会和酰氨官能团生成腈基或琥珀酸亚胺衍生物，n 一保护了的天冬酰胺( a s n ) 比 n 一保护了的谷氢酰胺( g i n ) 更容易发生这种反应“”： c 0 0 h z n h c h i | 竺一h r x 缩合剂 - - + 活化 c h 3 o = c n h 2 h 2 c 、 、c 三n 酸酐 羧酸。由于参与反应的谷氨酰胺与氮原子相连的n 碳原 子勾羰基，是吸电子基，所以氨基氮原子上的电子云密度不大，所以选用作 为酰氯的c b z c i 作酰化试剂，以提高反应活性。 反应中释放出的氯化氢可与游离胺结合生成盐，从而降低反应速度，因此反 应中需加入碱性物质中和生成的氯化氢，使氨基保持游离状态，以提高反应收率。 在该反应中，我们选用的是氢氧化钠。 在c b z - g n o h 的制备过程中，由于c b z c 1 是一种酰氯，在碱性水溶液中 极易水解( 尤其是在温度较高的情况下) ，文献采用的是c b z c 1 室温下一次性加 入，会造成大量原料损失，而且增加了产物中包夹杂质的机会。我们采用滴加而 且冰水浴下反应的方法，避免了因原料水解而造成的损失。文献采用丙酮和水作 溶剂，而我们经实验发现只用水就可以使反应进行完全，不仅降低了成本，还节 省了操作步骤，减轻了环境负担。文献在得到产品时用乙酸乙酯将产品抽提出来 再析出，我们调酸后直接析出产品，不仅降低了成本、节省了操作步骤，而且提 高了产率( 经实验发现产品在乙酸乙酯中溶解性不好，在抽提过程中会有大量损 失) 。 2 c b z g l n o h 与三苯甲醇反应生成c b z g l n ( t r t ) 一o h 的反应是一个n 一 烷基化反应，氨基上的氢原子被烷基所取代。该反应选用的烷基化试剂是三苯甲 醇。醇的烷基化活性很弱，所以反应在较强烈的情况下才能进行。所以选用强酸 ( 浓硫酸) 作催化剂，其催化作用是由于强酸离解出的质子，能与醇反应生成活 泼的烷基证离子r + ，与氮基h 氮原子的未成对电子形成中帕j 络合物，脱去质子 成为产物。其历程如下。“1 ： 几种氨基酸双保护的工艺研究 p龠 凤丫 一。肌伦7 i 诊b 川竺兮 + 、：火一z 囟 h k h ! ：3 ，兰豳一星c h 。c h 。? h n h ：+ h 洲 h + 通常情况下，由于氨基氮原子上还有未成对电子，反应结束时会有氢离子 离解出来，所以能够循环再起催化作用，继续反应 但在该反应中，由于三苯甲基的位阻效应，不会再有副反应发生。 在c b z g l n ( t r t ) 一o h 的制备的制备过程中，文献采用的是用冰醋酸做溶 剂，冰醋酸极易吸水，而这个反应需无水进行，所以需在反应日口先对溶剂进行处 理，增加了实验的工作量。我们采用乙酸乙酯作溶剂，方面使反应同样能够顺 利进行，降低了成本：另一方面有利于将产物从水中萃取，也大大降低了乙酸乙 酯的用量。山于体系中加了浓硫酸和醋酸酐，他们与水发应会放大量的热，所咀 反应结束后往水t 弘倒的时候会使体系温度升高，产物容易变质。我们把反应液直 il叫j 州一 洲 h of c h c 一心 c o i c h jnlh 0 白 一 心 一 几种氨基酸双保护的工艺研究 接倒入碎冰中，避免了这个问题。文献中是以三苯甲醇：c b zg l n o h = 2 ：i 的 比例投料的，造成极大的浪费，而且给最后反应液的处理带来麻烦。我们根据三 苯甲醇和产物在乙酸乙酯中溶解度有较大差异的特点，将反应得到的固体用乙酸 乙酯搅洗，使三苯甲醇得以回收利用，使实际参加反应的三苯甲醇：c b z g l n o h 接近于1 ：l ，不仅大大降低了原料成本，还有利于产物的提纯。 3 在f m o c g i n ( t r t ) 一o h 的制各过程中，文献采用四氢呋喃作溶剂，三乙胺 调节碱性，成本昂贵。我们用丙酮作溶剂，氢氧化钠调节碱性，大大降低了成本， 也得到了较高的产率。 几种氨基酸双保护的工艺研究 第三章b o c c y s ( a c m ) 一o h 制备的工艺优化 一、削吾 因为含有二硫键的胱氨酸肽在化学合成中牵涉两个氨基和两个羧基的选 择性保护的问题，比较困难，因此只有少数情况是采用胱氨酸的形式，一般也都 是通过半胱氨酸来合成的。而半胱氨酸的一s h 非常活泼，具有强亲核性，易被 酰化成硫醚，也易被氧化为二硫键，必须加以保护 疏基的保护在有机化学的很多领域，特别是在肽和蛋白质的合成中是很 重要的。半胱氨酸的侧链疏基非常活泼，很容易氧化并发生副反应，因此，对其 的保护在多肽合成中一直是引人注目的问题。 游离的疏基可以用硫醚或硫酯的形式加以保护，也可以氧化成能通过还原 而再生的对称二硫化物。硫醚通常是在碱溶液中由硫醇与卤化物反应形成的：裂 解方法可用钠氨还原，酸催化水解，或者先与重金属离子，如银( 1 ) 或汞( 1 1 ) 反应，随后再与硫化氢作用。硫酯的形成和裂解方法与氧酯相同，但它们对于亲 核取代反应的活性很强，常被当作“活化酯”使用。其他种类的保护基使用的范 围就比较有限了。o ” 常用保护基有三类：一类用t f a 可脱除，如对甲苄基、对甲氧苄基、二苯 甲基( d m p ) 3 3 和三苯甲基( t r t ) 3 3 、3 4 等：第二类可用( c r c o ) t 1 t f a 脱 除，对t f a 稳定如t b u 、b o m 和乙酰胺甲基( a c m ) 3 5 等第三类对弱酸 稳定，如苄基( b z l ) 3 6 、3 7 和叔丁硫基( s t b u ) 等，c y s ( s t b u ) 可用巯基试 剂和磷试剂还原，c y s ( b z 】) 可用n a n h 3 脱保护“1 s - a c m 基是目前较为常用的巯基保护基团之一。”。”3 ，它在p h ：o 1 3 的范 围内2 5 下是稳定的，而且对酸特别稳定，即使用液体h f 处理，也可不受影响。 在酸催化下，c y s 同n 一羟甲基乙酰胺( 后者用甲醛同乙酰胺反应制得) 反应可 得到s 一乙酰胺甲基半胱氨酸。s - a c m 基保护的半胱氨酸曾被用于牛胰核糖核酸酶s 蛋白和猪胰蛋白酶抑制剂i i 的合成并取得了很好的结果。 几种氨基酸双保护的工艺研究 二、实验过程 1 a c m 的制备： o g h 。皂n h + c h 2 ：o 3 c n h 2 1 _ 。九2 u 原料配比 k c 0 3 ，h 2 0 乙酰胺多聚甲醛碳酸钾 0 4 m o l0 4 m 0 1催化量 o i l g h 3 c n h c h 2 0 h 反应： ( 1 ) 2 4 克乙酰胺、1 2 克多聚甲醛和o 2 5 克碳酸钾混合后加热至9 5 1 0 0 。c 融熔。 ( 2 ) 继续在此温度下反应1 小时，t l c 检测反应完全( 展开剂：乙酸乙酯：甲 醇- - - - 4 ：1 ) 。 ( 3 ) 上述溶液冷至5 0 。c 时加, k o 0 5 m l 的1 2 n 的k o h ，搅拌均匀后放置冰箱过 夜，得到油状的a c m 约3 6 克。( 经高效液相色谱测定：有效含量9 4 ) 。 - - 3 0 。c 下得到固体约2 5 9 ( 产率6 9 0 ，文献 3 3 1 4 5 ) 本文操作文献操作( 1 ) 4 0 1 4 1 1 文献操作( 2 ) 【4 2 】 乙酰胺与多聚甲醛反 乙酰胺与甲醛水溶液反乙酰胺与多聚甲醛反 应应应 1 0 0 下反应1 小时加热回流3 5 小时1 0 0 下反应1 小时 直接投入下步反应反复除水后，超低温超低温一3 0 得到产 一3 0 得到产品 品 表( 叫j 改进：( 见表( 四) ) 方法( 1 ) 反应终止点难以摔制、反j 越1 3 “u j 平肖长就会发生副反应。片反、 在水中进行，“：物却与水难以分离，致使后处理过程y t j 麻烦。 几种氨基酸双保护曲工艺研究 方法( 2 ) 中得到固体a c m 需在超低温条件下，对能量的消耗很大。而实际上 a c m 无须得到纯的固体，可将反应结束时所得的粗品固体直接用于下一步的合成， 有效含量按9 0 计算。( 经h p l c 检测，其纯度在9 4 以上) 由于体系中没有引入水， 因此无须像方法一中那样，加入干燥剂处理。 2 h - c y s ( a e r a ) - o h h c i 的制备： o | | c h 3 c n h c h 2 0 h 原料配比 h s c h f 一9 h c 0 2 h + n h 3 g i - h c y s o h h c l a c m 0 0 4m o l0 0 5 6 m o l o | i c h 3 c n h c h 2 s c h f 一早h c 0 2 h + n h 3 g i 反应： ( 1 ) 在5 0 m l 的单1 2 1 锥形瓶中加入原料( l - ) c y s - h c l h 2 07 克( 0 0 4m 0 1 ) ，三 氟醋酸2 0 m l 。 ( 2 ) 在1 5 。c 水温磁力搅拌下加入5 克a c m ( 约0 0 5 6 m 0 1 ) ，反应4 0 分钟，t l c g i 踪 展开剂：( 正丁醇：乙酸：水= 1 0 ：2 ：3 ) 。 后处理： ( 1 ) 在2 5 0 m l 的单口瓶里加入1 0 0 m 1 丙酮，冰水浴下缓慢滴加上述反应液，剧烈搅 拌，过程中析出白色固体，继续搅拌充分析出。 ( 2 ) 过滤，少量丙酮洗涤后压干得粗品9 克。在反应得到的约9 克粗品中，j j i l k 6 5 m l 异丙醇和3 m l 水，升温搅拌至回流全溶，然后再加入6 m l 异丙醇，冷却至5 5 时 滴加丙酮约5 m l 至反应液略显浑浊。冷却析出白色固体，过滤，洗涤，约6 5 克， 收率大于7 5 ，( 文献：7 1 ) 熔点：1 6 7 1 6 9 ( 文献1 6 7 1 6 9 ) ( 3 ) 滤液经精镏回收三氟醋酸。 【a 】2 5 5 8 9 3 0 7 。c ( c = 1 ，h 2 0 ) ； 几种氨基酸双保护的工艺碍究 l 本文操作文献操作( 1 ) 【4 3 文献操作( 2 ) 【4 2 】文献操作( 3 ) 4 4 】 三氟醋酸做溶盐酸做溶剂二氧六环做溶剂三氟醋酸做溶剂 剂 反应1 小时反应1 2 d 时反应0 5 d , 时 反应1 小时 先析出产品，后乙醇带水除水低温减压回收溶低温减压回收溶 精镏回收溶剂剂剂 产率7 5 产率3 1 产率2 3 产率7 1 表( 五) 改进：( 见表( 五