（发酵工程专业论文）黄曲霉毒素b1快速检测试剂盒的研制.pdf

摘要 黄曲霉毒素b i 具有很强的毒性，1 9 8 8 年被国际癌症机构列为a 类致癌物质。黄曲霉 毒素会降低动物的产奶产蛋量，危害人类的健康，对经济也造成一定的影响。为了对黄曲 霉毒素进行有效监控，必须有灵敏、特异、快速、可靠、容易普及的方法进行检测。本项 研究应用杂交瘤技术制备抗黄曲霉毒素b i 的单克隆抗体，为建立e l i s a 方法检测a f t b i 奠定基础。 本研究改进江湖等人报道的e d c 法制备了检测抗原a f t b i o v a 。接下来实施免疫方 案，初次免疫为a f t b i b s a 结合完全弗氏佐剂，足挚免疫，问隔四周后结合不完全弗氏 佐剂加强免疫小鼠，最后一次免疫后三周通过尾静脉或腹腔冲击免疫小鼠，- - - - - n 四天后耿 脾进行细胞融合。 在免疫方案实施的同时，确立检测方法，以棋盘滴定试验确定抗原i ：1 0 0 包被，免疫 鼠血清1 ：5 0 0 0 稀释作为阳性对照( p c ) ，正常鼠血清l ：1 0 0 稀释作为阴性对照洲c ) ，辣根过 氧化物酶标记羊抗鼠i g g l ：4 0 0 稀释。 利用杂交瘤技术将免疫b a n & 小鼠得到的脾细胞与s p 2 0 小鼠骨髓瘤细胞融合，白j 接 e l i s a 方法筛选阳性细胞株。经过八次融合，多次筛选，都得不到稳定的阳性细胞株，故 而进行了多克隆抗体的制备。 通过免疫家兔，获得阳性血清，以j 下辛酸硫酸铵沉淀方法纯化血清，用免疫印迹实验 证明了该血清是抗黄曲霉毒素b t 的多抗，间接e l i s a 法测得纯化后的多抗效价为2 5 6 1 0 5 ，自j 接性竞争法测得该抗体对黄曲霉毒素b i 的最低检出浓度为0 0 5 m l 。 关键词：黄曲霉毒索b i ：单克隆抗体；多克隆抗体；e l i s a 3 a b s t r a c t a f l a t o x i nb i ( a f t b 0 h a ss t r o n gt o x i c i t y , w h i c hw a sr a n k e dac a r c i n o g e nb yi n t e r n a t i o n a l c a n c e ro r g a n i z a t i o ni n1 9 8 8 t h ep r o d u c t i o no fm i l ka n de g g sw i l lb ed e c r e a s e dw h e na n i m a l s i n t a k ef o d d e rp o l l u t e db ya f t b t a f t b ji sh a r mt ot h ep e o p l e ，a n di ta l s oi n f l u e n c et h ee c o n o m y i ti sn e c e s s a r yt od e v e l o pas e n s i t i v e ，s p e c i f i c ，q u i c ka n dr e l i a b l ed e t e c t i o nm e t h o di no r d e rt o m o n i t o rt h ec o n t e n tl e v e lo fa f l a t o x i nb i t h ea i mo fo u rs t u d yi st op r e p a r et h em o n o c l o n a l a n t i b o d i e sa g a i n s ta f t b la n dl a yaf o u n d a t i o no fd e v e l o p m e n te l i s am e t h o df o rd e t e c t i o no f a f t b t t h i ss t u d yc o n s u l t e dm a n yd o c u m e n t s ，i m p r o v e dt h e i rm e t h o d s ，a n dp r e p a r e da f t b ia n do v a c o m b i n a t i o n ，w h i c hw a su s e df o rc l i n i a li ni n d i r e c te l i s a m i c eu s e df o rp r o d u c t i o no f h y b f i d o m a sw e r es i x - w e e k - o l db a l b cm i c ea n dw e r ei m m u n i z e d 鹊f o l l o w s m i c ew e r e i n o c u l a t e df e e t - p a dw i t h1 0 u ga f t b t b s aa n t i g e ni nc o m p l e t ef r e u n d sa d j u v a n ta n d4w e e k s l a t e rw i t ha f t b i b s ai ni n c o m p l e t ef r e u n d sa d j u v a n t a tl e a s t3w e e k sa f t e rt h el a s ti n j e c t i o n t h em i c ew e r ei n j e c t e di n t r a v e n o u s l yo ri n t r a p e r i t o n e a l l y ( i p ) a n d3 - 4d a y sl a t e rt h es p l e e n sw e r e h a r v e s t e d t e s tm e t h o do fh y b r i d o m a sm u s tb ee s t a b l i s h e db e f o r ei m m u n i t yp r o g r a m m ec o m p l e t e d t h e s t u d yd e f i n i t e ds o m er e a c t i o nc o n d i t i o n st h r o u g hc h e s s - b o a r dt e s t ，s u c ha s ，c o a t i n ga n t i g e n l ：1 0 0 。m o u s ea n t i a f t b is e r u ml ：5 0 0 0a sp c ，m o u s en o r m a ls e r u m 1 ：1 0 0a sn c ，h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s ec o m f u g a t e dg o a ta n t i m o u s ei g gl ：4 0 0 u s i n gt h ef u s i o no fm u r i n es p l e n o c y t e sw i t hs p 2 0p l a s m a c y t o m ac e l l st oo b t a i nm o n o c l o n a l m o u s ea n t i b o d y ( m c a b ) a g a i n s ta f t b t ，i n d i r e c te l i s at of i l t r a t em a s c u l i n ec e l l s w ec o u l d nt o b t a i ns t a b l ym a s c u l i n ec e l l st h r o u g h8f u s i o n sa n dm a n yt i m e sf i l t r a t e ，a n dw eh a dt op r e p a r e p d y c l o n a la n t i b o d y ( p a b ) a f t b i - b s au s e df o ri m m u n i z a t i o no fr a b b i t s ，c o l l e c t e d $ e m m t h ep a bw a so b t a i n e db y p u r i f yt h ea s c i t i cf l u i dw i t hs e d i m e n tm e t h o d t h ec h a r a c t e r so fp a bw e r ed e t e c t e da sf o l l o w s t h ep a bw a ss p e c i f i c i t ya g a i n s ta f t b ib yw e s t e r nb l o t t i n g t h et i m e so fp a bi s l ：2 5 6 1 0 5m e a s u r e db yi n d i r e c te l i s a t h r o l ：l 曲i n d i r e c tc o m p e t i t i o n m e t h o d ，w eg o tt h el e a s td e t e c t i o nc o n c e n t r a t i o no f a f t b i ，o 0 5 p g m 1 4 k e yw o r d s ：a f t b i ，m o n o c l o n a la n t i b o d y , p d y c l o n a la n t i b o d y , e l i s a 第一章前言 第一章前言 2 0 世纪6 0 年代初，在英国东南部一些农场，约有l o 力只火鸡幼仔在几个月内死亡于一 种原因不明的以肝坏死为特征的疾病。事隔不久，非洲的肯尼亚和乌干达也在大批小鸭中发 生类似的疾病。后经系统调查和研究证实，这是出于火鸡吃了含有霉变花生饼的饲料引起 的，因而发现了黄曲霉毒素( a f l a t o x i n ，a f t ) “。 1 1 黄曲霉毒素的理化性质 黄曲霉菌最适宜生长温度为1 2 4 1 ，相对湿度为8 6 8 7 。在4 8 小时内黄曲霉菌 很快生长，当霉菌处于干燥、低温或与其它霉菌竞争的应激情况时，就会产生黄曲霉毒素 ( a f ) 嘲。在众多霉菌毒素中，黄曲霉毒素被认为是潜在的对人类危害极为突出的一类强 致癌诱变剂。它们是由黄曲霉( a s p e r g i l l u s f l a v u s ) 和寄生曲霉( h s p e r g i l l u s p a r a s i t i c u s ) 等产生的一类结构类似的化合物，其基本结构都含有一个二氢呋喃和香豆素，在紫外线照射 下都产生荧光，产生蓝色荧光者为b 族( 4 2 5 n m ) ，发绿色荧光者为g 族( 4 5 0 r i m ) 。根据 荧光颜色r r 值及其结构等分别命名为b 、& 、g 、g 。、m 、地、p 。、q 、毒醇、g m 等，在黄曲 霉毒素中，已知毒性大小的排列顺序为b b ： g m ， g z ”。 已发现的黄曲霉毒素有2 0 多种，目前已明确结构的有l o 多种，其中以黄曲霉毒素b 含量最多，毒性最强“1 。它多生长在未收割的农作物及贮藏的粮食上，特别是玉米、稻谷、 花生、棉籽、豆类、麦类、酒糟、油饼类、酱油渣上，禽畜食用了被黄曲霉毒素污染的饲 料后，即可引起中毒。通常所浣的a f t 是指a f t b i 。黄曲霉毒素b l 在生物体内可以转化 为七种代谢产物，黄曲霉毒素m l ( a f m l ) 是黄曲霉毒素b i 的一种代谢产物，能在摄入黄 曲霉毒素b i 奶牛的鲜乳中检测到：绵羊和小鼠摄入污染黄曲霉毒素的饲料后，在其肝脏、 肾脏、尿中也能检测到a f m i ”1 。 黄曲霉毒素是无色，无味，无臭的晶体物质，在水中溶解度较低，浓度范围为 1 0 m g - 2 0 m g l 。易溶于油和一些有机溶剂，如氯仿和甲醇。不溶于乙醚、石油醚和乙烷。这 类毒素因含有大环共轭体系，热稳定性非常好，2 8 0 。c 高温下j 裂解，故在通常的烹调条件 下不易被破坏。碱性条件下，黄曲霉毒素极易降解：紫外线辐照也容易便黄曲霉毒素降解 而失去毒性。但是在酸性条件下，黄曲霉毒素比较稳定，以辐照过的肉糜做为培养基，研 i 第一章前言 究p e d i o c o c c u s 、l a c t o b a c i l l u s 菌对a s p e r g i l l u sp a r a s i t i c u s 产生黄曲霉毒素的影响， 发现添加乳酸的培养基中黄曲霉毒素的量大于对照组。乳酸对黄曲霉毒素有稳定作用，阻 止了p e d i o c o c c u s 、l a c t o b a c i l l u s 对其吸附和降解作用f 1 o 黄曲霉毒素的理化性质和结 构分别如表l 和图l 所示。许多研究报道了谷物、饲料的霉变引起的黄曲霉毒素中毒，其浓 度范围从l 肛g ，l 【g 到l o lup j k g 。由黄曲霉毒素引起的畜禽中毒，已成为当前危害畜牧业发 展的主要中毒病。1 9 6 0 年首次于英国伦敦郊区发现至今已近4 0 年，但它对人类的危害依然 存在叫。 表1 - 1 黄曲霉毒素的理化性质 黄曲霉分子式分子质旋光熔点( 分解)克分子消光系 最人荧光 r f 毒素鼙l a i d 数( p ) 3 6 2 波kn l n近似 3 6 3n l u b lc 1 7 h 1 2 瓯3 1 2- 5 5 82 6 8 2 6 9 2 1 8 0 04 2 50 5 6 b 2c ，7 h 。仉3 1 4- 4 9 22 8 6 2 8 92 3 4 0 04 2 50 5 3 ( 3 9 3 ) g lc 【棚t 2 0 7 3 2 8 - 5 5 6 2 4 4 2 4 61 6 1 0 04 5 00 4 8 g 2c i t h 0 73 3 04 7 32 3 7 2 4 02 1 0 0 04 5 00 4 6 m l c 1 7 h 1 2 0 ,3 2 8- 2 8 02 9 91 9 0 0 04 2 5 o 3 4 ( 3 5 7 n m )( 9 1 ) 地 c t 7 h “西3 3 02 9 32 1 0 0 00 2 3 ( 3 5 8 n m ) g m tc 1 7 h i 8 3 4 4 2 7 61 2 0 0 0 0 1 2 ( 3 5 8 n m ) b 2 ac i t h 岛 3 3 0 2 4 0 2 0 4 0 0o 1 3 ac 。7 h 仉3 4 61 9 01 8 0 0 00 1 0 r oc i7 h l 以b3 1 42 3 0 2 3 41 4 1 0 04 2 50 5 4 b 3c 埘“仉3 0 22 1 79 7 0 00 4 4 ( 2 3 3 2 3 4 ) 2 第一章前言 捌雒捌拟 裂款嘏帅裂 m 。矾 g i t b 图i - i 黄曲霉毒素的结构1 a f m 。和a f m 。是a f b 和a f b ：的羟基化衍生物，家畜摄食被a f b 。和a f b 。污染的饲料后， 在乳汁和尿中可检测出其代谢产物a f m 和a f m ：。a f m 。的毒性和致癌性比a f b 。低一个数量级。 动物摄入a f b 。后，经过代谢产生的a f m 除了乳汁和尿中排出外，还有部分存留在肌肉中。 用含a f b 。1 0 0 p g k g 的饲料喂鸡，鸡肉中可测出0 1 的a f m 。用含a f b 。l o o l a g k g 的饲料喂 奶牛，可测出牛乳中l 垤k g 的a f m 。a f 的衍生物中以a f b 。的毒性及致癌性最强，在食品 中的污染也最普遍，有些国家和地区主要以a f b 。作为污染指标。 1 2 黄曲霉毒素的毒理性质 h e r r y 等为j e c f a ( 食品添加剂联合专家委员会) 第4 9 次会议起草的有关a f 的报告 中，详细，全面地叙述了近年来有关a f 的毒理学。生物化学，流行病学等研究概况“。 1 2 1 黄曲霉毒素的急性毒性 a f 的急性毒性实验研究主要是在2 0 世纪6 0 年代和7 0 年代进行的。根据e a t o n 和 g r o p m a n 的综述，有关a f b 。的急性毒性没有新的报道，表i - 2 为a f b 。对各种动物经口的 l d * ( m e d i a nl e t h a ld o s e 半数致死量) 。由表卜2 中可见各种动物对a f b 的敏感度不同， 其敏感性依动物的种类、年龄、性别、营养状况有很大差别。动物的a f 中毒主要表现为 食欲不振、体重下降、生长迟缓、繁殖能力降低，产蛋及产奶量减少等。中毒病变主要在 肝脏，表现为肝细胞变性、坏死、出血、胆管增生等。急性中毒后期，动物出现体温升高、 3 第一章前言 血性腹泻、心脏出现出血淤点和淤斑、胆囊壁增厚、门脉周围纤维化、胆淋巴结节形成及 空泡形成、胆管增生等。动物抵抗力降低，对细菌、病毒及寄生虫疾病更为敏感“1 。表1 3 为鸭口服各种黄曲霉毒素的半致死量。 表卜2a f b ，对各种动物经口的l d 。( 以体重计) 1 动物种类l d s o m g k g 雏鸭 兔 熊猫 绵羊 雄鼠 雌鼠 鸡胚 猫 火鸡 猪 恒河猴 小鼠( 1 d 小鼠( 2 1 人( 成年 0 3 3 5 o 3 o 6 2 1 o 7 2 1 7 9 0 0 2 5 ( g g e a c h ) 0 5 5 o 5 0 6 2 2 2 1 0 )5 0 l o 表1 - 3各种黄曲霉毒素的半致死量( 鸭口服) “5 黄曲霉毒素 l d m ( m g k g ) b 眺 g ， g 2 m 。 0 3 6 1 7 0 7 8 3 5 3 2 1 2 4 第一章前言 1 2 2 黄曲霉毒素的生殖毒性 每日经饲料给妊娠d d y 小鼠0 8 n g k g ( 以体重记，下同) a f b 和4 8 n g k g a f g 或同时给 予a f b 。和a f g ，继续给与出生后的仔鼠以相同剂量的毒素至六月龄。a f g 实验组动物肝脏 中性脂肪显著积蓄，血清甘油三酯稍升高，肝和肾出现严重炎症、坏死和胆管增生。而a f b 。 可引起肝脏中性脂肪和脂肪酸蓄积，显示a f b 。对肝和肾细胞的毒性作用。虽然a f g 的水平 是a f b 。的6 倍，但可观察到a f b 对肝肾的毒性作用比a f g 。严重得多”。 1 2 3 黄曲霉毒素的遗传毒性 分别给大鼠和小鼠一次剂量为0 0 1 - 1 0 1 1 9 k g ( 以体重记，下同) 的a f b 。，结果显示， 给予a f b o 1 l “g k g 的大鼠骨髓染色体畸变率和微核率明显升高：而小鼠最高剂量组( 即 1 o g k g 组) 染色体畸变率略有升高。在a f b 最高剂量中，大鼠染色体畸变率比小鼠的高 l o 倍，说明大鼠对a f b 明显比小鼠敏感”j 。 1 2 4 黄曲霉毒素的致癌性 a f 是目前己知的最强的致癌物，广泛的研究证明，长期持续摄入低剂量的a f 或短期 摄入大剂量的a f ，均可诱发大多数种属动物的原发性肝癌1 。诱发肝癌成功的动物有大鼠、 小鼠、豚鼠、雪貂、鸭雏、狗、猫、兔、猴等，其中以大鼠和鳟鱼更敏感。用含1 5 p g k g a f b 的饲料饲喂雄性大鼠，经6 8 周，1 2 只大鼠全部出现肝癌：雌性大鼠，经8 2 周，1 3 只全 部出现肝癌。据n e w b e r n 和r o g e r 报道，每r 在大鼠的饲料中加入l g g k g a f b ，连续饲喂 两年，大鼠肝癌的发生率高达1 0 【l ”。 1 2 5 黄曲霉毒素的毒理机制 同其它化学致癌物一样，a f b ，需要经过体内代谢活化爿表现出毒性。它在体内经细胞 色素p 4 5 0 催化生成m 、p 、q 或a f b 。一8 ，9 一环氧化物，该环氧化物与谷胱甘肽转移酶作用 生成a f b t s g ，与环氧化物酶作用生成a f b 一鸟嘌呤。公认的看法是这种具有商致癌性的 毒素首先由肝微粒体中与细胞色素p 4 5 0 有关的多功能氧化酶催化，形成一种具有高反应 性的、亲电性的环氧化物。该环氧化物一部分可出于形成生物大分子结合物，如与谷胱甘 第一章前言 肽转移酶( g s t ) 、尿苷二磷酸一葡糖醛酸基转移酶( u d p - g t ) 或磺基转移酶的结合，从而 受环氧化物酶( e h ) 催化水解而被解毒：另一部分则与生物大分子的亲核中心反应，生成 d n a 、r n a 以及蛋白质和类脂的结合物，与蛋白质( 包括酶) 、类脂的结合可引起细胞的死 亡而表现为急性毒性；与核酸的结合可引起突变而表现为慢性毒性。近年来随着分子生物 学技术的发展，对a f t 的致癌研究已深入到分子水平。基因学研究表明，a f b 诱发肝癌的 部分原因是：a f b 诱交代谢物a f b ，- 8 ，9 - 坏氧化物与d n a 中的鸟嘌呤结合，形成鸟嘌呤黄 曲霉毒素b 。，并诱致外显予7 的第2 4 9 密码子第3 个碱基的颠换，即a g g a g t ，使应表达 的精氨酸误表达为丝氨酸，从而引起p 5 3 肿瘤抑制基因的突变，最后导致肝癌的发生“1 。 黄曲霉毒素在体内的代谢过程如图卜2 所示。 囊变致，聋 骂 霜麟器焉篡意霹7 l g s t l 罂f - g t细胞牡 le i 。 l 非活性代 嘲产物 图1 - 2 黄曲霉毒素在体内代谢过程” 1 3 黄曲霉毒素对人类健康的影响 1 3 1 黄曲霉毒素急性中毒 a f 引起人类急性中毒的报道较少。1 9 7 4 年度西部的g u j a r a t 和r a j a s t a n 两个邦的许 多村庄发生了因食用严重污染a f 的玉米引起的中毒性肝炎，共有3 9 7 人中毒，1 0 6 人死亡， 病死率高达2 6 7 。病人食用的玉米中测出a f b ，的含量为6 2 5 1 5 6 m g k g ，平均含量为 6 o m g k g 。 非洲一名1 5 岁儿童食用污染a f 的木薯引起急性中毒死亡，经检验木薯中含 a f i 7 m g k g 。另一起为一名体重1 0 k g 儿童食用污染a f 的米饭2 天后死亡。经检验米饭中 含6 m g k g a f b “”。 我国台湾发生一起霉大米引起的急性中毒，2 5 人中毒，3 人死亡，霉大米中含 a f 2 2 5 9 p g k g 。 1 9 8 8 年l o 月在马来西亚半岛的p e r a k 州西北部有1 3 名华人儿蕈死于急性肝性脑病， 6 第一章前言 主要症状为呕吐、呕血、癫痫发作、腹泻、发热和腹痛，所有患儿肝功能均异常，天冬氨 酸氨基转移酶升高，丙氨酸氨基转移酶水平大于i o o i u l 。该起中毒症不同于以往印度、 肯尼亚和泰国发生的中毒症，平均潜伏期为8 h ：在肯尼亚和印度发生的中毒症是因摄食严 重污染的食物如玉米。而流行病学调查表明，马来西亚儿章是死亡前几小时摄食了面条， 进食面条中毒的明显高于未进食者( p o 0 0 0 1 = 尸检发现有a f ，但未测定面条中有a f ) 1 。 1 3 2 黄曲霉毒素致人类肝癌作用 动物试验已证明a f b 。可诱发多数动物发生原发性肝癌。大量的流行病学调查表明。a f b 。 暴露量与肝癌发病的增加有相关性。”。在肝癌发病率高的地区( 如非洲、东南亚及中国南 方等) ，当地食品严重污染a f b 。a f 在人和实验动物体内被代谢成一种环氧化物，这种环 氧化物被认为是最终反应的中自j 体。有一些证据证明对人的实际危险性比实验动物低， j e c f a 通过流行病学调查发现并提出， f 只有在其它因素( 如乙型肝炎病毒感染存在的情 况下) 才能造成危害“”。目前证在连续进行的研究可以进一步提高评估摄入a f 人类造成危 害的可靠性。最值得注意的是上海、泰国和江苏省启东的研究以及网比亚、台湾省和启东 进行的乙型肝炎疫苗的试验，这些项目完成后，j e c f a 可能要对a f 对人类的危害重新进行 评价m 1 。 有一些因素影响原发性肝癌的危险性，其中明显的是经确定血清中含有乙肝病毒表面 抗原的携带乙肝病毒者，对同时患有乙型肝炎的病人，a f 的作用明显增强。这种相互作用 的现象，使流行病学研究很难把a f 看作是单一的主要的危险因素“”。 丙型肝炎病毒的鉴定对于肝癌病因的认识是一个重要的新的进展。目前有两项研究调 查了丙型肝炎感染、a f 和肝癌之间的相互关系，但目前尚无定论。据估计，有5 0 - - - 1 0 0 的肝癌病例与持续的乙型肝炎或丙型肝炎感染有关。 j e c f a 极力主张膳食中a f 的摄入量应降低到尽可能低的水平，以尽可能的减少其潜在 危害。国际癌症研究中心( i r a c ) 召集的一个工作小组也得出“天然存在的a f 是人类致 癌物”的结论。第4 6 次j e c f a 会议，考虑到a f 的潜在危害及对人群的危险性评估，要求 进一步完善分析资料并提供最新的毒理学评价资料，此次会议出版的专著评审了有关a f 的实验数据联系了治病力与摄入量估计值。并讨论了样品数量及其对危险性的评估m ，。 j e c f a 多次对黄曲霉毒素等进行过评价，并于2 0 0 1 年5 月在只内瓦首次评价了黄曲霉 毒素眠。在此次会议上对真菌毒素的分析方法采样要求，食物消费量的资料与膳食有 关的其它资料以及防治及控制措施等进行了讨论，并提出了意见和建议。 7 第一章前言 在我国，对黄曲霉毒素从毒理，防霉去毒、污染调查、分析方法、制定限量标准等方 面进行了比较广泛的研究。 1 4 黄曲霉毒素在食品中的污染及限量标准 1 4 1 黄曲霉毒素是生物性污染 食品污染是指食品受到有害物质的侵袭，造成食品安全性、营养性或感官性状发生改 变的过程。随着科学技术的不断发展，各种化学物质的产生和应用，使有害物质的种类和 来源也进一步繁杂。食品污染大致可分为：l 食品中存在的天然毒物；2 环境污染物：3 食 品添加剂的滥用；4 食品加工、储存、运输及烹饪过程中产生的有害物质，或工具、用具 中的污染物迁移到食品中。根据污染物的性质，食品污染可分为3 个方面：l 生物性污染， 2 化学性污染，3 放射性污染。所谓生物性污染是指生物及其毒素，主要是细菌及其毒素， 霉菌及霉菌毒素等：病毒对食品的污染也j 下引起重视：寄生虫及其虫卵如囊虫、绦虫、蛔虫 等，通过病人病畜的粪便或经过环境转化，最后通过污染食品而造成危害“”。 根据以上分类黄曲霉毒素属于生物性污染。 1 4 2 黄曲霉毒素在我国食品中的污染和检测情况 由于a f 的毒性和致癌性，世界各国都很重视对食品中a f 的监测。 我国于2 0 世纪7 0 年代初，组织了2 2 个省、市的卫生防疫部门对当地的花生、花生 油、玉米、小麦和豆类等粮油食品共约3 0 0 0 0 0 份样品用t l c 法测定了其中的a f b ，。调查 发现，花生、花生油和玉米中a f b 污染最严重，大米、小麦和豆类a f b 的污染比较轻。南 方的谷物受a f b t 的污染比北方谷物严重。1 9 8 3 年我国农村实行联产承包责任制后，农业 生产操作有了很大改善，收获后的粮油作物很快干燥可以有效避免真菌生长产生毒素，使 a f 的污染大大降低。1 9 7 7 年测定了广西南宁2 0 7 份玉米，有1 6 5 份为a f b ，阳性样品。阳 性率为7 9 7 。1 9 7 8 年玉米的污染率为4 0 1 9 8 3 年和1 9 8 4 年分别为1 4 9 和1 8 8 ，a f 8 。 的平均水平依次为3 1 0 o l - t g k g 、4 4 o l a g k g 、1 6 4 心k g 和6 8 1 1 9 k g ，1 9 8 3 年和1 9 8 4 年 的玉米中a f b t 的平均水平已低于我国a f b 限量标准2 0 1 1 9 k g 。1 9 9 2 年的污染调查表明，a f b 。 水平为5 o i i o l “g k g ，均来超过我国规定的限量标准，仍有5 5 6 的花生油检出a f b ， 但含量范围仅为5 o - i i i t l g k g ，有5 6 的玉米样品检出a f b 。，含量达到规定标准。 e 第一章前言 林景涛( 1 9 9 5 年) 采集了福州市5 0 份鲜奶和5 3 份奶粉用薄层层析法进行了a f m 检测， 结果鲜奶中检出率为4 0 ，奶粉中检出率为1 3 1 9 ( 浓度范围为0 0 6 - 0 2 1 t g k g ) ，a f m 的检出与喂养饲料中高含量的a f b ，有关。褚兴橡( 1 9 9 1 年) 对上海地区的5 7 份牛奶和1 5 份 奶粉进行了a f m 。的检测，检测方法为反相h p l c 法，检出率分别为7 3 7 和2 6 7 ( 浓度范围 在0 0 2 5 - 0 9 5 “g k g ) ，检出率较高，但具体的产生原因没有探讨。 1 4 3 黄曲霉毒素的限量标准 表卜5 我国标准规定的黄曲霉毒素的限量标准 项目食品种类指标( pg k g ) a f b lg b 2 7 6 1 8 1玉米，花生 ：花生油2 0 a f b lg b 2 7 6 l 一8 l玉米及花生f ：制晶2 0 ( 按原料折算) a f b lo b 2 7 6 1 8 l大米及其它食用油l o a f b lg b 2 7 6 1 8 l其它粮食、豆类发酵制品5 a f b lg b 2 7 6 1 8 1 娶) l 4 e 孚l 晶不得检出 a f mlg b 9 6 7 6 8 8 牛乳0 5 ( 按含牛乳鼙计算) a f m 1g b 9 6 7 6 8 8 乳制品o 5 ( 按含牛乳鼙计算) 1 5 黄曲霉毒素的预防1 防霉是阻止黄曲霉毒素污染的最根本措施，也是防止黄曲霉直接污染食品和粮食的一 种最经济、最方便、最有效的方法。最主要的防霉措施是控制温度、湿度。 1 )降低粮食、油料和其他食品中的水分 改进粮食种植和收获方法，的品质。一般 谷物的安全水分为1 2 一1 4 ( a 为0 6 0 0 6 4 ) ；丽花生仁的安全水分在8 以下；而大多数 霉菌生长的最低a 为0 7 3 0 9 4 ；而黄曲霉生长的最低a 为o 8 0 。降低水分的方法有同晒、 风干、烘干以及采用远红外线干燥、微波干燥等技术。 2 ) 降低食品贮存环境中的温度和湿度粮库应有通风设备，贮粮前库房要清洁干燥，根 据粮温、库温及湿度采取降温降湿措施。密闭贮粮可使粮堆的氧气降至o 2 以下，抑制大 多数霉菌的活动，基本达到防霉的目的。另外。在粮堆中充二氧化碳或充氮气都能抑制霉 菌生长繁殖，延长粮食贮藏期限。 9 第一章前言 3 ) 使用化学防霉剂在粮油贮存期闯，在食品生产加工、贮存、运输和销售的过程中， 可使用苯甲酸钠、水杨酸等防霉剂，但要注意其使用浓度及其在食品中的残留量不应超过 国家规定标准。 4 ) 选育抗霉农作物品种目前各国对这一工作都很重视，不断进行研究，培育筛选一些 抗霉能力强、高产、质量好的花生品种，如湛秋4 8 、桂花2 2 、粤油5 8 等品种。 1 6 去毒措施“2 1 粮油被黄曲霉污染后产尘毒素，一般的烹调加工温度不能达到去霉的目的，应设法将 毒素破坏或去除，常用以下几种方法。 1 6 1 挑选霉粒法 因黄曲霉毒素在食品中分布很不均匀，主要集中在霉坏、破损、皱皮、变色和虫蛀等 粮粒，将其去除可使毒素含量大为降低。 1 6 2 碾压加工法 一般适用于受污染的大米和玉米，因毒素主要存在于谷皮及胚部，因此在碾压加工过 程中，毒素随米糠去掉。如将玉米制成淀粉，可使毒素降至原来的1 0 。此外，大米在淘洗 时反复搓洗，也可去除部分毒素。 1 6 3 吸附法 含有黄曲霉毒素的植物油可加活性白陶土或活性炭等吸附剂，然后搅拌，静止，毒素可 被吸附而去毒，如广西用此法处理花生油，加入1 5 f i q 白陶土，可使花生油中黄曲霉毒素由 原来的l o o g g k g 降至l o p g k g 。 1 6 4 辐射处理法 利用黄曲霉毒素在紫外光照射下不稳定的性质，可用紫外光照射去毒。紫外光照射去毒 的方法，对液体食品( 如植物油) 效果较好，而对固体食品( 如花生粉) 效果不明显。但 要注意照射的剂量和照射时间，以不影响食品的感官和理化性质为宜。 0 第一章前言 1 6 5 化学去毒法 1 6 5 i 碱处理法 碱炼本身就是油脂精炼的一种加工方法，黄曲霉毒素在碱性条件下，内酯环破坏，形成 香豆素钠盐由于后者溶于水，故加碱后再用水洗可将毒素去除，加碱水洗可使油中黄曲霉 毒素降至标准含量以下，甚至不能检出。 1 6 5 2 有机溶剂萃取法 黄曲霉毒素为脂溶性毒素，易溶于有机溶剂，所以可用有机溶剂进行提取分离。常用 溶剂有：水合乙醇、异丙醇、丙酮、正己烷和水的混合物进行去毒。提取需反复3 - 5 次， 去毒效果在9 0 以上，其中以丙酮和水( 9 0 ：1 0 0 ) 混合液效果最好，处理后的食品挥干溶 荆后方可食用。 1 6 5 3 氯化降解法 氧化剂可以迅速将黄曲霉毒素氧化去毒。常用的氧化剂有漂白粉、氯气、双氧水、臭 氧等，其中以漂白粉去毒效果最强，高度污染的花生粉可用5 漂白粉处理几秒钟就可以全 部去毒。用氧化剂处理过的粮食经火鸡喂养实验证明无毒 1 6 5 4 中草药去毒法 1 9 7 6 年我国首次发现山苍子中的挥发油可以彻底除去食品中的黄曲霉毒素。主要是挥 发油中的某些成分与黄曲霉毒素发生加成和缩合反应，从而改变其分子结构，达到去毒目 的。实验证明，黄曲霉毒素超过国家标准2 0 倍的玉米、稻谷或超标2 5 0 0 倍的花生经大剂 量山苍子芳香油处理可一举去毒。此法简便易行，特别适合家庭应用，并对食品质量和营 养成分无任何影响。另外，甘草、葫芦巴、羽扁豆、茴香及血香粉、大蒜也都有去除黄曲 霉毒素的作用。 1 6 6 生物控制法。州 益生菌作用于黄曲霉毒索主要是通过抑制黄曲霉毒素的产生和吸附去除已存在的黄 i l 第一章前畜 曲霉毒素两种途径。 1 6 6 1 抑制黄曲霉毒素的产生 益生菌对黄曲霉毒素的产生有很强的抑制作用，它一方面抑制曲霉菌的生长益生菌 对其它菌的生长有抑制甚至是杀灭作用。益生菌的抗菌机理非常复杂，涉及其本身的竞争 抑制及其生长过程中产生的各种代谢产物，包括酸性物质、细菌素、二氧化碳和过氧化氢 等：另一方面影响曲霉菌的代谢过程，抑制曲霉菌产生黄曲霉毒素，关于这方面的机理还 不清楚，但实验证实益生菌与曲霉菌共同培养或将益生菌代谢产物添加到曲霉菌培养基 中，均能明显抑制产生黄曲霉毒素。 1 6 6 2 去除黄曲霉毒素 益生菌去除黄曲霉毒索主要是通过吸附作用来实现的。益生菌解毒机理是益生菌可以 吸附黄曲霉毒素，形成益生菌一黄曲霉毒素复合体，当益生菌形成复合体后，自身的吸附 能力下降，从而与黄曲霉毒素一起排出体外这是目前最为人接受的理论。 1 7 黄曲霉毒素的分析方法h 3 1 国内外检测a f 的方法有微柱法、薄层色谱法( t l c ) 、液相色谱法( l c ) 、e l i s a 法等。 r o m e r 微柱法于1 9 7 5 年首次通过，1 9 8 8 年最后通过作为a o a c 的法定方法。该法适用 于检测食品及饲料中的总a f 。可检测舍仁中5 心k g 的总a f ( b i + b 2 + g i + g 2 ) ；白玉米、 黄玉米、花生及棉予粉，花生酱、丌心果及饲料中l o “g k g 的总a f 。h o l a d a y v e l a s c o 微柱法于1 9 7 9 年首次通过，1 9 8 8 年最后通过a o a c 法定方法。该法适用于检测白玉米、黄 玉米生的去壳花生中l o p g k g 的总a f 。 t l c 是检测a f 常用的方法。a o a c 的t l c 法有检测花生和花生制品中a f 的c b 法和b f 法，这两种方法均作为法定方法于1 9 8 8 年首次通过。还有检测椰子、干椰子和椰子粉、 玉米、鲜咖啡、歼心果、大豆、鸡蛋、奶及奶制品、肝等食品中测定a f a f b 。a 剐，的t l c 法也作为法定方法于1 9 8 8 年最后通过。 2 0 世纪9 0 年代a o a c 开始将免疫学用于检测a f 的法定方法。免疫学方法大多已商品 化并在市场销售，如1 9 9 0 年首次通过t 9 9 4 年最后通过用于测定玉米、棉子、花生和花 生酱中的a f b 、a f b ：和a f g 。的酶联免疫吸附试验试剂盒( t m m o n o d o ts c r e e nc u p ) 1 9 9 1 年 首次通过、1 9 9 6 年最后通过测定花生酱中总a f 的酶联免疫吸附试验试剂盒( b i o k i t s ) 、1 9 9 1 1 2 第一章前言 年首次通过的检测玉米、生花生和花生酱中的a f 的免疫亲和柱( a f l a t e s t ) 法以及1 9 9 0 年 首次通过的检测玉米和炒花生中的a f b 酶联免疫吸附试验试剂盒( a g r i s c r e e n ) 筛选法等。 这一时期，检测a f 的方法还有1 9 9 0 年首次通过、1 9 9 4 年最后通过检测玉米和花生酱的液 相色谱法。 我国于2 0 世纪7 0 年代初建立检测各种食品中a f 的方法。测定a f b 。的t l c 法已通过 作为国标方法( 6 b t 5 0 0 9 2 2 - 1 9 9 6 ) ：该方法适用于粮食、花生及其制品、薯类、豆类、发 酵食品及酒类等各种食品中a f b 。的测定：a f b 。与a f m 。的t l c 法( g b t 5 0 0 9 2 4 1 9 9 6 ) 适用于 测定牛乳及其制品黄油及新鲜猪组织( 肝、肾、血及瘦肉) 等食品中的a f b t 和a f m 、a f b 7 、 a f g 、a f g ：的t l c 法( g b t s 0 0 9 2 3 - 1 9 9 6 ) 适用于各种食品中的总a f 的测定。a f b t 、a f b 。、 a f g 、a f g ：的微柱筛选法( g b t 5 0 0 0 0 9 2 3 - 1 9 9 6 ) 可用于测定各种食品中总a f 。除上述方法 外，还建立了应用多克隆抗体或单克隆抗体为基础，测定各种食品中a f 的e l i s a 法以及 h p l c 法等，检测方法的建立为食品中a f 的污染监测提供了技术支撑”1 。 1 8 课题研究的依据 目前常用的检测方法是薄层层析法，它是根据黄曲霉毒素是一种能在紫外线区域发生 强烈特殊荧光的物质，样品经提取、浓缩、薄层分离后，在紫外光下观察其在薄层上显示 荧光强度来确定含量。酶联免疫吸附法( e n z y m el i n k e di 哪u n o s o r b e n ta s s a y ，简称e l i s a ) 是通过抗黄曲霉毒素的抗体与酶标抗原、待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应 相结合，来检测黄曲禧毒素的含量。但是薄层层析法的灵敏度差，仅能半定量操作而且操 作人员要直接接触毒素，因此以酶联免疫吸附法为代表的免疫学方法由于灵敏度高、可定 量、操作人员可不直接接触毒素等优点而越柬越被人们所重视和采纳”1 。 黄曲霉毒素b 的分子量是3 1 2 0 6 ，是小分子物质，是只有反应原性而无免疫原性的半 抗原不能直接刺激动物分泌抗体，只有与牛血清蛋白( b s a ) 、卵清白蛋白( o r ) 、钥孔 血蓝蛋白( k l h ) 、多聚氨基酸( 通常为多聚赖氨酸p l ) 等载体连接后才能转化为既具有反 应原性又具有免疫原性的完全抗原，刺激动物分泌抗体”1 。黄曲霉毒索b 。本身的性质不话 泼，不具有能和蛋白质连接的活性基团。因此首先要将其它活性基团引入黄曲霉毒素b 。中 以活性基团作为桥梁爿能将毒素与裁体蛋白连接起来，然后将其免疫小鼠，提取单克隆抗 体。由此建立一种以单克隆抗体为基础的e l i s a 法，并以此原理，生产e l i s a 试剂盒“圳“。 第二章单克窿抗体技术及e u s a 方法与应用特点 第二章单克隆抗体技术及el | s a 方法与应用特点 2 1 单克隆抗体技术的简介 2 1 1 单克隆抗体的发现 单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y ) 技术( 简称单抗) ，又被称为肿瘤“生物导弹”，是 能直接导向肿瘤的药物。1 9 7 5 年英国科学家k o h l e r 和m i i s t e i n 将产生抗体的淋巴细胞同 肿瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体技术，因此在1 9 8 4 年获得诺贝尔医学和生理学 奖嘲。 人体的b 淋巴细胞是专门用以产生抗体的。实际上每一个b 淋巴细胞( 浆细胞) 只能 识别一种抗原并产生针对这种抗原的抗体。但天然抗原是以复合物的形式存在的，通常含 有多种不同性质的抗原分子，即使是只用纯一的一种抗原分子作抗原，但分子上往往存在 许多抗原决定基，因此，人体或动物受抗原刺激后，可使许多具有不同特异性的b 淋巴细 胞被活化增殖。产生的抗体也是由多种抗体组成的混合物，即多克隆抗体( p o t y c l o n a l a n t i b o d y ) 。但人们希望获得由一株b 淋巴细胞系产生的针对某一抗原或抗原决定基的有 专一特